CN114177273A - 一种含有神经毒素的液体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有神经毒素的液体制剂及其制备方法，还包括稳定剂和水，所述稳定剂包括氯化钠和氨基酸，液体制剂中氯化钠和氨基酸相互配合，产生协同增效作用，使得神经毒素的稳定性显著提升，极大缓解了神经毒素的降解，保持神经毒素为95％以上生物活性的时间明显延长。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种含有神经毒素的液体制剂及其制备方法。
背景技术
中华眼镜蛇(Naja atra)，又名舟山眼镜蛇，在广东、广西、中国香港俗称饭铲头，中国台湾则称之为饭匙倩、饭匙铳、膨颈蛇。中华眼镜蛇属于眼镜蛇科，是我国十大毒蛇之一，分布于中国南部、中国台湾和中南半岛的中低海拔地区，常栖息于平原、丘陵和低山，多见于耕作区、路边、池塘附近、住宅院内，习惯在白昼活动。中华眼镜蛇体色一般为黑褐或暗褐，背面有或无白色细横纹，成蛇体全长为1.5-2米。中华眼镜蛇属沟牙类毒蛇，受惊扰时常竖立前半身，颈部平扁扩大，作攻击姿态，同时颈背露出呈双圈的“眼镜”状斑纹，咬伤后会迅速分泌蛇毒，刚开始局部症状不明显，流血少、红肿热病轻微。但是伤后数小时内出现急剧的全身症状，出现兴奋不安，痛苦呻吟，全身肌肉颤抖，吐白沫，吞咽困难，呼吸困难，最后卧地不起，全身抽搐，呼吸肌麻痹而死亡。眼镜蛇毒为眼镜蛇科动物眼镜蛇毒腺分泌的毒液，用于致猎物于死地的剧毒物质，眼镜蛇神经毒素的干物质中90％以上是蛋白质，是其毒性和生物学活性的主要成分，此外，蛇毒中约含二十多种酶类和毒素，并且还含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂类、核苷、生物胺类及金属离子等。目前可从蛇毒中分离出神经毒素、心脏毒、磷脂酶、眼镜蛇毒因子、神经生长因子、细胞色素、直接溶解因子等活性成分，在临床上可用于抗肿瘤、抗炎、抗血栓、镇痛及移植排斥反应和其他自身免疫性疾病等的治疗。
蛇毒成分十分复杂，不同蛇毒的毒性、药理及毒理作用各具特点。其中蛇毒神经毒素是蛇毒中一类重要的活性组分，主要分布在眼镜蛇科、海蛇科及蝰科的响尾蛇蛇毒中，是该类蛇伤人致死的主要成分。随着人们对蛇毒神经毒素深入研究发现，神经毒素可分为3类：突触前神经毒素(β- 神经毒素)、突触后神经毒素(α-神经毒素)和类神经毒素，前两者主要抑制运动终板处的神经肌肉传导，造成肌肉麻痹和呼吸衰竭，而后者可以阻断平滑肌收缩和离子通道，表现出类神经毒活性。通过不断对眼镜蛇α-神经毒素的研究过程中也逐渐发现其有镇痛、戒毒作用，也有降低免疫排斥抗肿瘤的作用。1936年Macht提出肌肉注射微量眼镜蛇毒具有类似吗啡的中枢镇痛作用。美国Hynson，Westcott&Dunning公司对眼镜蛇粗毒进行初步分离，制成Cobroxin和Nyloxin两种神经毒素制剂，用于治疗顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛。这两种药物已列入美国药物局方。自1952年起，我国开展对蛇毒的镇痛作用研究，开发了蛇毒粗毒制剂和蛇毒神经毒素制剂，用于临床治疗疼痛，其中以中科院昆明动物研究所研制的眼镜蛇毒α-神经毒素制剂“克痛宁(后改名为科博肽注射液)”为代表，用于治疗坐骨神经痛、三叉神经痛、神经血管性头痛以及风湿痛、癌症疼痛等顽固性疼痛，疗效显著且副作用少。目前镇痛机制还未明确，有多数学者认为神经毒素通过作用于胆碱能系统、内源性阿片系统来缓解恶性肿瘤疼痛、神经性疼痛、顽固性疼痛和关节痛，但也有部分人认为通过补体旁路途径来达到镇痛作用。眼镜蛇神经毒素剂量依赖性显著提高小鼠疼痛性刺激阈值，镇痛作用持久且无依赖性、戒断成瘾性等副作用，有望成为媲美美沙酮替代吗啡且无戒断效应的镇痛药物，亦可投入戒毒治疗；神经毒素可在临床上诊断重症肌无力等神经性疾病，治疗神经性疼痛、神经硬化症及急性中毒昏迷等；现在越来越多的人支持器官移植技术，而器官移植面临的一个重大挑战就是免疫排斥反应。当移植器官发生免疫排斥反应时，通常伴随炎症反应的发生，而眼镜蛇毒神经毒素能有效的降低炎症反应，发挥免疫抑制作用。眼镜蛇毒神经毒素抗免疫排斥可能与其作用于毒蕈碱受体(M 受体)有关，将T细胞抑制在G0/G1期，进而降低细胞免疫的发生。而且还有发现长期给予神经毒素也未发现相关的不良反应，极大可能成为新一代免疫抑制剂；眼镜蛇毒也有抗肿瘤作用，其中的α-神经毒素可抑制肿瘤细胞增殖，也可诱导肿瘤肿瘤细胞凋亡。其作用机制复杂，至今尚未明确，但有研究表明，神经毒素可通过影响线粒体功能、阻滞细胞周期，导致细胞凋亡；亦可通过抑制烟碱乙酰胆碱受体，抑制细胞外信号调节激酶磷酸化，触发线粒体凋亡，从而抑制肿瘤生长；还可通过调节Ca2+，破坏膜结构，导致细胞溶解、死亡。
新鲜的蛇毒为略带腥味的蛋清样粘稠液体，呈黄色、淡黄色、绿色，甚至无色。新鲜时呈中性或弱酸性反应，放置稍久可变成碱性，含水量 50％-75％，比重在1.030-1.080之间。新鲜毒液接触空气易产生泡沫，室温下放置24小时易腐败变质，丧失其毒性。冰箱中可以保持15-30天，在-40℃保存时间较久，经过真空干燥或冷冻干燥处理后的蛇毒可于室温下保存 20-30年，但毒性强度和一些酶的活性会不同程度的降低，遇水仍能溶解。蛇毒经紫外线及加热后毒性消失。凡能使蛋白质沉淀变性的强酸、强碱及重金属盐类，均能破坏蛇毒。蛇毒还易受氧化剂、还原剂、蛋白水解酶类等的分解、破坏，从而失去其毒力。经甲醛处理后也会丧失其毒性，但抗原仍能保留。
眼镜蛇神经毒素是眼镜蛇毒中最主要的致死成分，以突触后神经毒素为主。此类神经毒素属小分子蛋白，有长链和短链之分。短链含60-62氨基酸残基组成的多肽单链，通过4对二硫键连接形成一个致密的内核，由此核心伸展出三环就象三个手指，因此又被形象地称为三指蛋白(three-finger protein)。它们的分子量为6-7kKD；长链神经毒素的分子量为7-9KkD，有 70-74个氨基酸残基，五对二硫键链接而成，而肉毒杆菌毒素是由100kD 的重(H)链和50kD轻(L)链通过一个双硫链连接起来，由于分子量大于约 150kD被认为含有非毒血凝素蛋白质，可起到防止肉毒杆菌毒素分子变性稳定作用，其中A型肉毒毒素毒力最强且最稳定，作用最持久且易制备和保存。肉毒杆菌毒素需在-5度以下冷冻保存，配制后2-8度保存，并且4 小时之内使用完。而经蛇毒提取出的神经毒素具有极强的引湿性和亲水性易溶于水，因此保存条件更苛刻，粉末应在≤-10℃干燥暗处放置，用普通溶液溶解后在-20℃的条件下进行保存，一星期内用完。神经毒素在现有条件的溶液中稳定性较差不适合长期储存，且需要专门的储存运输冷链，保证药物始终处于规定的低温环境下,以减少药物损耗、保证质量。若神经毒素在储运或使用过程中分解变质，导致药效降低或失效，故药物稳定性对保证药物安全起着至关重要的作用。另外，神经毒素已基本实现规模化生产，若因产品不稳定而变质，则会造成经济上的巨大损失。
目前提高蛋白质、多肽稳定性的方法有：1.定点突变，通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，提高多肽的稳定性。2.化学修饰，PEG与多肽结合后能改善多肽的溶解性，可以进行生物相容性调节，提高热稳定性，抵抗蛋白酶的降解，降低抗原性，延长体内半衰期。选择合适的修饰方法和控制修饰程度可体质或提高原生物活性。3.添加剂，通过加入添加剂，如糖类、多元醇等，在低浓度下迫使更多的水分子围绕在蛋白质周围，保护蛋白质不易被水解；表面活性剂如SDS、 Tween、Pluronic acid，能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀；亦可在蛋白质中加入一些小分子物质如甘油和蔗糖、金属离子螯合剂如EDTA、其他蛋白如BSA、不带电荷的氨基酸如甘氨酸和丙氨酸、底物、辅助因子或者竞争性抑制剂提高多肽及蛋白质的稳定性。4.冻干，多肽发生的一系列化学反应如脱酰胺、β-消除、水解等都需要水参与，冻干不仅可以使药品水含量降低，减少化学反应发生来达到提高蛋白的稳定的目的。由于定点突变、化学修饰、冻干提高蛋白质及多肽稳定性的方法，具有改变多肽结构、设备结构复杂，造价昂贵的缺点，大幅度提高了生产成本。
因此，迫切需要开发一种成本低廉的包括神经毒素的液体制剂，以提高神经毒素的稳定性，降低其在储运或使用过程中变质、降解的风险，保证用药的安全性和有效性。
发明内容
因此，本发明的发明目的在于提供一种成本低廉的包含神经毒素的液体制剂，以提高神经毒素的稳定性，降低其在储运或使用过程中变质、降解的风险，保证用药的安全性和有效性。
本发明研究发现神经毒素(科博肽)在pH值较大的溶液中稳定性不佳，在pH低的溶液中稳定性好。但采用现有技术即使降低pH值，科博肽保存时间也达不到临床使用要求。
为此，本发明提供了一种含有神经毒素的液体制剂，还包括稳定剂和水，所述稳定剂包括氯化钠和氨基酸。
进一步地，所述神经毒素为眼镜蛇α-神经毒素，例如市售产品科博肽。
本发明研究发现，α-神经毒素(科博肽)在磷酸缓冲对溶液和Tris-Hcl 缓冲液中的在同样pH值和温度条件下稳定性没有差别，在氯化钠溶液中的稳定性明显优于磷酸缓冲液。而且，α-神经毒素(科博肽)在同样pH值和温度条件下用组氨酸-甘氨酸缓冲溶液调节pH值的稳定性明显优于磷酸。
本发明研究发现，液体制剂中氯化钠和氨基酸相互配合，产生协同增效作用，使得α-神经毒素的稳定性显著提升。
进一步地，所述氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或者多种。
进一步地，所述氯化钠在液体制剂中的质量百分数为0.3-1.8％(0.9％)，尤其是0.6％-0.9％，为了等渗，更优选0.9％。
进一步地，本发明通过氨基酸调节液体制剂的pH为3-6。本发明发现眼镜蛇α-神经毒素在pH为3-6之间，生物活性没有改变。
进一步地，所述氨基酸在液体制剂中的浓度为≤10mM，优选为 0.004-1mM。
本发明研究发现，所述α-神经毒素在液体制剂中的浓度≤1mg/mL时，在同样pH、温度条件下，对稳定性没有影响；所述α-神经毒素在液体制剂中的浓度为1-1000μg/mL优选地，为了保证α-神经毒素足够的生物活性，所述α-神经毒素在液体制剂中的浓度为35-1000μg/mL，更有选为 1-200μg/mL。
本发明研究发现，神经毒素(科博肽)在同样pH值和温度条件下加苯扎氯铵防腐剂对其稳定性没有提升效果。
本发明研究发现，α-神经毒素(科博肽)溶液中加入保护剂，如甘油、麦芽糖和木糖醇与未加保护剂相比对其稳定性没有提升效果。
本发明研究发现，α-神经毒素(科博肽)溶液中加入还原剂如维生素 C,NADPH，维生素E与未加还原剂剂相比对其稳定性没有提升效果。
本发明中的α-神经毒素(科博肽)稳定性的具体研究，对其改善科博肽制剂稳定性以及延长使用时间有现实意义和应用价值。
进一步地，所述液体制剂的pH为3-6，优选为3-5.5。
本发明还提供了一种液体制剂的制备方法，包括，取神经毒素、氯化钠、氨基酸与水，混合，即得。
进一步地，所述制备方法包括：取氨基酸，采用氯化钠水溶液溶解，制得氨基酸溶液，取该氨基酸溶液与氯化钠水溶液混合，得到混合溶液，采用该混合溶液与α-神经毒素混合，溶解，制得液体制剂。
进一步地，所述制备方法包括：取神经毒素溶解于水中，采用第一氨基酸调节pH值为2.5-3.0，得到溶液A；或者，取神经毒素溶解于水中，采用第一氨基酸pH值调节至2.5-3.0，加水定容，得到溶液A；
将溶液A于50℃以下放置，取溶液A用水稀释，加入氯化钠，用第二氨基酸调节pH值为3.0-6.0，加水定容，即得。
在某些优选的实施方式中，将溶液A置于30-50℃下放置2-5h，可以使神经毒素快速灭活。
进一步地，所述第一氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种，优选天冬氨酸，所述第二氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种，优选组氨酸、赖氨酸或者精氨酸。
进一步地，其原料组成为：
神经毒素0.1-100重量份，氯化钠300-1800重量份，氨基酸0.0004-0.1 摩尔份，水100体积份；
当所述重量份的单位为mg时，所述体积份的单位为mL，所述摩尔份的单位为mmol。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的含有神经毒素的液体制剂，除了包括α-神经毒素之外，还包括稳定剂和水，所述稳定剂包括氯化钠和氨基酸，液体制剂中氯化钠和氨基酸相互配合，产生协同增效作用，使得α-神经毒素的稳定性显著提升，极大缓解了α-神经毒素的降解，保持神经毒素为95％以上生物活性的时间明显延长。
2.本发明提供的含有α-神经毒素的液体制剂，所述氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或者多种，均可与氯化钠相互配合使得α-神经毒素的稳定性显著提升，尤其是采用天冬氨酸与赖氨酸，天冬氨酸与组氨酸，组氨酸与谷氨酸，甘氨酸与谷氨酸组成的混合氨基酸时效果更佳，其中，在温度为4-8℃、0.9％氯化钠、且加入天冬氨酸-赖氨酸配制的缓冲对溶液中，神经毒素稳定性较好；神经毒素稳定性至少能稳定6个月以上(95％以上纯度)。
3.本发明提供的含有神经毒素的液体制剂，可在25℃温度可稳定保存 18天(HPLC纯度≥95％)，极大降低了储运及使用时神经毒素降解或失效的风险，可使神经毒素可在4-8℃温度中保存180天以上(HPLC纯度≥95％)。在满足可科博肽注射剂溶液国家标准pH值和其它条件下，通过控制储存温度在4-8℃、pH 5.5(或4.0)、0.9％氯化钠、添加天冬氨酸-赖氨酸稳定剂，达到延长稳定性的目的，对提高科博肽临床用药安全性和有效性意义重大。
4.本发明提供的含有α-神经毒素的液体制剂的制备方法，研究发现两步法配置即先采用第一氨基酸调节pH至2.5-3.0，再采用第二氨基酸调节pH 值到3.0-6.0能够明显提高液体制剂的稳定性。在25℃温度下分步加入氨基酸(两步法配置)可稳定保存至28天(HPLC纯度≥95％)，而一步加入氨基酸只可稳定保存24天(HPLC纯度≥95％)，故两步法配置优于一步法配置。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
其中，下述α-神经毒素稳定性试验中，液体制剂中α-神经毒素的纯度通过高效液相法测定，色谱条件如下：
色谱柱：型号Sepax Bio-C18 4.6×150mm；检测波长：280nm；流动相 A：乙腈；流动相B:0.1％三氟乙酸；流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃。按下表梯度洗脱：
进样序列：按以下次序取空白溶剂、供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。空白≥1针，供试品溶液1针。
在样品色谱图中，计算神经毒素色谱峰的面积占所有色谱峰面积百分比即为其面积归一化法计算神经毒素的纯度。
实施例1
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，组氨酸0.035 mM，甘氨酸0.035mM和氯化钠0.9％(w/v)的水溶液，其pH为5.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取组氨酸和甘氨酸，采用纯水溶解，制得含组氨酸50mM和甘氨酸50mM的氨基酸缓冲对溶液。
(2)取神经毒素(科博肽)用纯水溶解，制得神经毒素浓度为0.7 mg/mL的母液，取2.5mL母液用47mL纯水稀释，加入0.45g氯化钠溶解，用35μL上述氨基酸缓冲对溶液调节pH值为5.0，用纯水定容到 50mL，制得含组氨酸0.035mM，甘氨酸0.035mM，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液，神经毒素浓度为35μg/mL的液体制剂。
其中最后加水定容步骤对溶液pH的影响很小，在±0.2的误差范围内可以忽略不计。
实施例2
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，组氨酸0.004 mM，甘氨酸0.004mM和氯化钠0.9％(w/v)的水溶液，其pH为4.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取组氨酸和甘氨酸，采用纯水溶解，制得含组氨酸50mM和甘氨酸50mM的氨基酸缓冲对溶液。
(2)取神经毒素(科博肽)用纯水溶解，制得神经毒素浓度为0.7 mg/mL的母液，取2.5mL母液用47mL纯化水稀释，加入0.45g氯化钠溶解，用4μL上述氨基酸缓冲对溶液调节pH值为4.0，用纯水定容到 50mL，含组氨酸0.004mM，甘氨酸0.004mM，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液，神经毒素浓度为35μg/mL的液体制剂。
实施例3
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，组氨酸0.1 mM，甘氨酸0.1mM，甘油20％(v/v)和氯化钠0.9％(w/v)的水溶液，其pH为6.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取组氨酸和甘氨酸，采用纯水溶解，制得含组氨酸50mM和甘氨酸50mM的氨基酸缓冲对溶液。
(2)取神经毒素(科博肽)纯化水溶解，制得神经毒素浓度为1 mg/mL的母液，取母液7mL，加入40mL甘油，加入1.8g氯化钠溶解，采用152mL纯化水稀释，加入400μL上述氨基酸缓冲对溶液调节pH值为6.0，采用纯水定容到200mL，得到神经毒素浓度为35μg/mL，pH为6.0的液体制含组氨酸0.1mM，甘氨酸0.1mM，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液，神经毒素浓度为35μg/mL的液体制剂。
实施例4
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，甘氨酸0.005 mM，谷氨酸0.005mM和氯化钠0.9％(w/v)的水溶液，其pH为4.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取谷氨酸和甘氨酸，采用纯水溶解，制得含谷氨酸50mM和甘氨酸50mM的氨基酸缓冲对溶液。
(2)取神经毒素(科博肽)用纯水溶解，制得神经毒素浓度为0.7 mg/mL的母液，取2.5mL母液用47mL纯化水稀释，加入0.45g氯化钠溶解，用5μL上述氨基酸缓冲对溶液调节pH值为4.0，用纯水定容到 50mL，制得含谷氨酸0.005mM，甘氨酸0.005mM，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液，神经毒素浓度为35μg/mL的液体制剂。
实施例5
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，甘氨酸0.004 mM，谷氨酸0.004mM，甘油20％(v/v)和氯化钠(0.9％，w/v)的水溶液，其pH为4.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取谷氨酸和甘氨酸，采用纯水溶解，制得含谷氨酸50mM和甘氨酸50mM的氨基酸缓冲对溶液。
(2)取神经毒素(科博肽)纯水溶液溶解，制得神经毒素浓度为1 mg/mL的母液，取7mL母液加入40mL甘油，加入1.8g氯化钠溶解，加入157mL纯水稀释，用20μL上述氨基酸缓冲对溶液调节pH值为4.0 纯水定容到200mL，含谷氨酸0.005mM，甘氨酸0.005mM，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液，神经毒素浓度为35μg/mL的液体制剂。
实施例6
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，天冬氨酸0.28 mM，赖氨酸0.38mM，和氯化钠(0.9％，w/v)的水溶液，其pH为5.5。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于10mL纯水中，用7mL 摩尔浓度为20mM的天冬氨酸水溶液调节pH值，纯化水定容至25mL，得到神经毒素浓度为0.7mg/mL，pH值为3.0的母液，置于40℃，放置 3h；
(2)取5mL母液用92.7mL纯化水稀释，加入0.9g氯化钠粉末溶解，用1.9mL摩尔浓度为20mM赖氨酸调节pH，纯化水定容至100mL，制得神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，赖氨酸0.38mM， pH为5.5，氯化钠浓度为0.9％的液体制剂。
对比例1
本对比例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL的水溶液。其制备方法包括：称取α-神经毒素(科博肽)纯化水溶解定容，制得含神经毒素35μg/mL的水溶液。
对比例2
本对比例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，氯化钠0.9％ (w/v)的水溶液，其pH为3.95。
(1)称取0.9g氯化钠于100mL容量瓶中，纯化水溶解定容，即得0.9％氯化钠溶液。
(2)称取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于25mL容量瓶中用0.9％氯化钠溶液溶解定容，得到母液，取2.5mL母液于50mL容量瓶中用 0.9％氯化钠溶液稀释定容到50mL，得到终浓度为0.35μg/mL的神经毒素液体制剂。
对比例3
本对比例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，天冬氨酸0.28 mM和赖氨酸0.46mM，其pH为5.5。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于10mL纯水中，用7mL 摩尔浓度为20mM天冬氨酸水溶液调节pH值，用纯化水定容至25mL，得到神经毒素浓度为0.7mg/mL，pH值为3.0的母液，置于40℃，放置 3h；
(2)取5mL母液用92.7mL纯化水稀释，用2.3mL摩尔浓度为 20mM赖氨酸调节pH，纯化水定容至100mL，制得神经毒素浓度为35 μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，赖氨酸0.46mM，pH为5.5的液体制剂。
对比例4
本对比例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，天冬氨酸0.28 mM，赖氨酸0.46mM和甘油10％(v/v)，其pH为5.5。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)取神经毒素(科博肽)17.5mg于10mL纯水中，用7mL摩尔浓度为20mM天冬氨酸调节pH值，纯化水定容至25mL，得到神经毒素浓度为0.7mg/mL，pH值为3.0的母液，置于40℃，放置3h；
(2)取5mL母液用80mL纯化水稀释，加入甘油10mL，用2.3mL 摩尔浓度为20mM赖氨酸调节pH，纯化水定容至100mL，制得神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，赖氨酸0.46mM，pH为5.5 的液体制剂。
对比例5
本对比例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，磷酸85％ (v/v)和氯化钠溶液(0.9％，w/v)，其pH为4.0。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)采用20mM磷酸调节质量百分数为0.9％的生理盐水的pH值为4.0，制得pH值为4.0，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液；
(2)取α-神经毒素(科博肽)用步骤(1)制得的氯化钠溶液溶解，制得神经毒素浓度为1mg/mL的母液，取母液采用步骤(1)制得的氯化钠溶液溶解稀释，得到神经毒素浓度为35μg/mL，pH为4.0的液体制剂。
对比例6
本对比例提供了一种液体制剂，其为含神经毒素0.7mg/mL，天冬氨酸5.6mmol/L，pH为3.0的水溶液。
其制备方法，包括如下步骤：
(1)配制20mM的天冬氨酸溶液；
(2)称取神经毒素35mg，用35mL纯水溶解，测定pH为3.26，加入14mL浓度为20mM的天冬氨酸溶液调节pH至3.0，用纯水定容至50mL，即得。
实验例1
将实施例1-3以及对比例5的神经毒素液体制剂分别分装于EP管中。分别放于25℃稳定性试验箱中，在下面表格中不同天数的同一时间取样检测，结果见下表所示。
表2神经毒素的稳定性及降解时间
实验在纯度降低到95％以下结束
由上表结果可知，在相同pH值下，相比于对比例5采用磷酸调节 pH得到的液体制剂，本发明实施例1-3采用氨基酸调节pH得到的液体制剂中的α-神经毒素的稳定性得到显著提升，极大缓解了α-神经毒素的降解，保持α-神经毒素为95％以上生物活性的时间明显延长。
实验例2
将实施例4-7和对比例1-4的神经毒素液体制剂分别分装于EP管中。分别放于4℃稳定性试验箱中，每月同一时间取样检测，结果见下表所示。
表3神经毒素的稳定性及降解时间
实验放置12个月或者在纯度降低到95％以下结束
由上表结果可知，相比于对比例1-4，本发明实施例4-7通过采用氯化钠和氨基酸为稳定剂的液体制剂中的α-神经毒素的稳定性得到显著提升，极大缓解了α-神经毒素的降解，保持α-神经毒素为98％以上生物活性的时间延长至12个月。
实验例3不同溶液对神经毒素稳定性的影响
1、Tris-Hcl与磷酸缓冲液
(1)准备试剂A：0.2mM磷酸二氢钠100mL，试剂B：0.2mM磷酸氢二钠100mL，取96mL试剂A与4.1mL试剂B混合，即得pH为 5.5磷酸缓冲液。
(2)配置0.1mM Tris溶液100mL，用0.1mM Tris溶液到50mL，加0.1mM盐酸26.2mL，加水定容到100mL，得到Tris-Hcl缓冲液。
(3)称取神经毒素(科博肽)17.5mg于25mL容量瓶中用磷酸缓冲液溶解定容，得到母液，取2.5mL母液于50mL容量瓶中用磷酸缓冲液稀释定容到50mL，得到终浓度为35μg/mL，pH值为5.5的α-神经毒素液体制剂(见表4“磷酸缓冲液”)。
(4)称取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于25mL容量瓶中用Tris-Hcl 缓冲液溶解定容，得到母液，取2.5mL母液于50mL容量瓶中用Tris-Hcl 缓冲液稀释定容到50mL，得到终浓度为35μg/mL，pH值为5.5的α- 神经毒素液体制剂(见表4“Tris-Hcl”)。
将上述两种神经毒素液体制剂分别分装于EP管中。于25℃稳定性试验箱中，每天同一时间取样检测，结果见下表所示。
表4神经毒素在Tris-Hcl、磷酸缓冲液下的稳定性及降解时间
实验在纯度降低到95％以下时结束。
从表4可知，α-神经毒素(科博肽)在磷酸缓冲液和Tris-Hcl缓冲液中的在同样pH值和温度条件下稳定性没有差别。
2、磷酸缓冲液与氯化钠溶液
(1)准备试剂A：0.2mM磷酸二氢钠100mL，试剂：0.2mM磷酸氢二钠100mL。取38mL试剂A与62mL试剂B混合，即得pH为7.0 的磷酸缓冲液；
(2)称取0.9g氯化钠于100mL容量瓶中，纯化水溶解定容，即得0.9％氯化钠溶液，pH为7.0。
(3)称取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于25mL容量瓶中用pH 为7.0的磷酸缓冲液溶解定容，得到母液，取2.5mL母液于50mL容量瓶中用pH为7.0的磷酸缓冲液稀释定容到50mL，得到终浓度为35 μg/mL的α-神经毒素液体制剂(见表5“磷酸缓冲液”)。
(4)称取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于25mL容量瓶中用0.9％氯化钠溶液溶解定容，得到母液，取2.5mL母液于50mL容量瓶中用0.9％氯化钠溶液稀释定容到50mL，得到终浓度为0.35μg/mL，pH值为 7.0的α-神经毒素液体制剂(见表5“0.9％氯化钠”)。
将上述两种神经毒素液体制剂分别分装于EP管中。于25℃稳定性试验箱中，每天同一时间取样检测。结果见表5。
表5神经毒素在0.9％氯化钠、磷酸缓冲液下的稳定性及降解时间
实验在纯度降低到95％以下时结束。
从表5可知，α-神经毒素(科博肽)在浓度为0.9％的氯化钠溶液中的稳定性明显优于磷酸缓冲液。
实验例4不同的pH调节剂对神经毒素稳定性的影响
1、天冬氨酸-赖氨酸、天冬氨酸-组氨酸与天冬氨酸-精氨酸的比较(原交底实验10)
(1)称取α-神经毒素17.5mg于10mL纯化水中，加入7mL的20 mM天冬氨酸溶液纯水定容到25mL，得到神经毒素浓度为0.7mg/mL， pH为3.0的母液；
(2)取5mL母液，用92.7mL纯水稀释，加入2.3mL的20mM 赖氨酸溶液调节溶液的pH，得到α-神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，赖氨酸0.46mM，pH为5.5的液体制剂1；
(3)取5mL母液，用89.8mL纯水稀释，加入5.2mL的20mM 组氨酸溶液调节溶液的pH，得到神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，组氨酸1.04mM，pH为5.5的液体制剂2；
(4)取5mL母液，用92.2mL纯水稀释，加入2.8mL的20mM 精氨酸溶液调节溶液的pH，得到神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，精氨酸0.56mM，pH为5.5的液体制剂3。
将上述液体制剂1-3于25℃温度下考察，每天同一时间取样测定，最终样品纯度降低到95％以下。结果见表6。
表6神经毒素在不同稳定剂、不同温度下的稳定性及降解时间
实验在纯度降低到90％时结束
从表6可以发现液体制剂1的稳定性优于液体制剂2，液体制剂2 的稳定性优于液体制剂3。
实验例5
本实施例提供了一种液体制剂，含神经毒素35μg/mL，含天冬氨酸 0.28mM，赖氨酸0.46mM，和氯化钠(0.9％，w/v)的水溶液，其pH 为5.5。
其采用下述两种制备方法分别制备，包括如下步骤：
(1)一步法配置：取天冬氨酸和赖氨酸，采用质量百分数为0.9％的生理盐水溶解，制得含天冬氨酸7.5mM和赖氨酸4.1mM的氨基酸缓冲对溶液，取60mL生理盐水，用60.78mL上述氨基酸缓冲对溶液调节 pH值，制得pH值为5.5，质量百分数为0.9％的氯化钠溶液；取7mgα- 神经毒素(科博肽)用10mL上述溶液溶解，制得α-神经毒素浓度为0.7 mg/mL的母液，随后取母液采用上述溶液稀释，得到α-神经毒素浓度为 35μg/mL，含天冬氨酸3.1mM，赖氨酸1.7mM，pH为5.5的液体制剂。
(2)两步法配置：取α-神经毒素(科博肽)17.5mg于10mL纯水中，用20mM天冬氨酸调节pH值，纯化水定容至25mL，得到α-神经毒素浓度为0.7mg/mL，pH值为3.0的母液，放置3h；取5mL母液用纯化水稀释，加入氯化钠粉末，用2.3mL20 mM赖氨酸调节pH，纯化水定容至100mL，制得神经毒素浓度为35μg/mL，含天冬氨酸0.28mM，赖氨酸0.46mM，pH为5.5，氯化钠浓度为0.9％的液体制剂。
(3)取上述两种方法制得的溶液分别放置于25℃下，分别在0d、4d、8d、12d、16d、21d、26d取样，检测纯度考察其稳定性。
表10一步法配置和两步法配置对稳定性影响
实验在纯度降低到95％以下结束
从上表可知，在25℃温度下分步加入氨基酸(两步法配置)可稳定保存至28天(HPLC纯度≥95％)，而一步加入氨基酸只可稳定保存24天 (HPLC纯度≥95％)，故两步法配置优于一步法配置。
实验例6
取对比例6制得的液体制剂，将其置于35℃烘箱，分别于180min，240 min取样检测纯度，结果见表11。
表11α-神经毒素溶液在35℃下的稳定性及降解时间
| 时间(min) | 纯度(％) |
| 0 | 96.37 |
| 180 | 96.42 |
| 240 | 96.49 |
实验在进行4小时后结束
从表11可知，α-神经毒素溶液可在35℃保存4h。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种含有神经毒素的液体制剂，其特征在于，还包括稳定剂和水，所述稳定剂包括氯化钠和氨基酸。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其特征在于，所述神经毒素为眼镜蛇α-神经毒素，优选为科博肽。
3.根据权利要求1或2所述的液体制剂，其特征在于，所述氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种或者多种。
4.根据权利要求1-3中任一所述的液体制剂，其特征在于，所述氨基酸选自天冬氨酸与赖氨酸，天冬氨酸与组氨酸，组氨酸与谷氨酸，甘氨酸与谷氨酸组成的混合氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一所述的液体制剂，其特征在于，所述氯化钠在液体制剂中的质量百分数为0.3-1.8％。
6.根据权利要求1-5中任一所述的液体制剂，其特征在于，所述氨基酸在液体制剂中的浓度为≤10mM，优选为0.004-1mM。
7.根据权利要求1-6中任一所述的液体制剂，其特征在于，所述液体制剂的pH为3-6，优选为3-5.5。
8.根据权利要求1-7中任一所述的液体制剂，其特征在于，所述神经毒素在液体制剂中的浓度为1-1000μg/mL，优选为1-200μg/mL。
9.一种液体制剂的制备方法，其特征在于，取神经毒素、氯化钠、氨基酸与水，混合，即得。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取神经毒素溶解于水中，采用氨基酸溶液调节pH值，加水定容，制得液体制剂；或者，包括如下步骤：
取神经毒素溶解于水中，采用第一氨基酸调节pH值为2.5-3.0，得到溶液A；或者，取神经毒素溶解于水中，采用第一氨基酸pH值调节至2.5-3.0，加水定容，得到溶液A；
将溶液A于50℃以下放置，取溶液A用水稀释，加入氯化钠，用第二氨基酸调节pH值为3.0-6.0，加水定容，即得。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述第一氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种，优选天冬氨酸，所述第二氨基酸选自精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、甘氨酸中一种，优选组氨酸、赖氨酸或者精氨酸。
12.根据权利要求9-11中任一所述的制备方法，其特征在于，其原料组成为：
神经毒素0.1-100重量份，氯化钠300-1800重量份，氨基酸0.0004-0.1摩尔份，水100体积份；
当所述重量份的单位为mg时，所述体积份的单位为mL，所述摩尔份的单位为mmol。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN118557529A (zh) * | 2024-07-30 | 2024-08-30 | 苏州人本药业有限公司 | 一种含有神经毒素的冻干粉和鼻用制剂 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1245434A (zh) * | 1996-12-24 | 2000-02-23 | 拜奥根有限公司 | 稳定的液体干扰素制剂 |
| CN1552440A (zh) * | 2003-06-06 | 2004-12-08 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 去白蛋白神经生长因子制剂 |
| CN102351951A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-02-15 | 贵州益佰制药股份有限公司 | 一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂 |
| CN107660149A (zh) * | 2015-04-21 | 2018-02-02 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种神经生长因子组合物及注射粉剂 |
| CN108079285A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-05-29 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 用于蛇毒酶制剂的门冬氨酸稳定剂及制备方法 |
| CN109640954A (zh) * | 2016-08-26 | 2019-04-16 | Ab生物科技股份有限公司 | 含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法 |
| CN111939179A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-11-17 | 苏州人本药业有限公司 | 眼镜蛇蛇毒或其提取物在制备降尿酸和/或抗痛风性关节炎的药物中的应用 |
-
2021
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1245434A (zh) * | 1996-12-24 | 2000-02-23 | 拜奥根有限公司 | 稳定的液体干扰素制剂 |
| CN1552440A (zh) * | 2003-06-06 | 2004-12-08 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 去白蛋白神经生长因子制剂 |
| CN102351951A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-02-15 | 贵州益佰制药股份有限公司 | 一种眼镜蛇蛇毒神经毒素的提纯方法、提取物及其制剂 |
| CN107660149A (zh) * | 2015-04-21 | 2018-02-02 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 一种神经生长因子组合物及注射粉剂 |
| CN109640954A (zh) * | 2016-08-26 | 2019-04-16 | Ab生物科技股份有限公司 | 含有肉毒杆菌毒素和稳定剂的液体制剂及其制备方法 |
| CN108079285A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-05-29 | 昆明龙津药业股份有限公司 | 用于蛇毒酶制剂的门冬氨酸稳定剂及制备方法 |
| CN111939179A (zh) * | 2020-08-24 | 2020-11-17 | 苏州人本药业有限公司 | 眼镜蛇蛇毒或其提取物在制备降尿酸和/或抗痛风性关节炎的药物中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 殷方臣等: "蛇毒神经毒素研究进展", 动物医学进展, no. 08, pages 67 - 70 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118557529A (zh) * | 2024-07-30 | 2024-08-30 | 苏州人本药业有限公司 | 一种含有神经毒素的冻干粉和鼻用制剂 |
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