KR100847889B1 - 곤충유래 글라이코자미노글라이칸 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 곤충에서 유래한 글라이코자미노글라이칸 및 그 추출 방법을 제공한다. 매미눈꽃동충하초의 글라이코자미노글라이칸을 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid N-acethyl glucosamine 와 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid glucosamine의 dimer가 반복하여 결합하여 올리고머를 형성한 후 폴리머를 형성함을 분리동정하고 이를 선천성고혈압쥐에 투여한 결과 dose response[(2 mg/kg i.v.]하게 자연고혈압쥐의 수축기압을 정상쥐 수준으로 유의적으로 유지함을 증명하였다. 따라서 곤충유래 글라이코자미노글라이칸 화합물(의 유도체)들은 직접 관계가 되는 물질로 순수분리 하여 순환기 개선 의약품소재로 이용 가능하다고 본다.
곤충, 글라이코자(사)미노글라이칸, 동충하초, 귀뚜라미
Description
도1은 당 전기영동(1%아가로스젤, , TBE 완충용액, Azura A 염색)을 나타낸 것이다(lane 1: 저분자량 헤파린( 분자량 3KD), lane 2:정제한 매미눈꽃동충하초의 글라이코사미노글라이칸(분자량 3-5만 내외) lane 3: 헤파린(분자량 29KD)).
도2는 정상쥐(WKY)에서 매미눈꽃동충하초에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸(2 mg/kg)을 한달 투여시 혈압과 심장박동의 안전성을 나타낸 것이다.
도3은 선천성고혈압쥐(SHR)에 매미눈꽃동충하초에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸(2 mg/kg)을 한 달간 반복투여시 정상으로 돌아온 수축기혈압을 나타낸 것이다.
도4는 매미눈꽃동충하초에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸을 그 분해효소로 짤라 단위 반복구조를 HPLC로 동정한 크로마토그람을 나타낸 것이다.
도5는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 20 mg/ml, 2 mg/ml, 200 μg/ml를 인간 (배꼽과 연결되는) 복강벽혈관내피세포HUVEC에 2일 처치 배양하여 VEGF양을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도6은 매미눈꽃동충하초의 알콜추출물을 투여시 NO 생성 효과(혈관확장능)를 나타낸 것이다.
도7은 귀뚜라미의 글라이코자미노글라이칸 분리동정을 위한 강이온교환컬럼-HPLC로 분석결과를 나타낸 것이다.
도8은 귀뚜라미(Gb)글라이코자미노글라이칸(GAG) 처리 후 형질 감염세포에서의 NF-kB활성을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적은 약용곤충, 바람직하게는 동충하초에서 글라이코자미노글라이칸을 분리하여 심장 및 맥압에 무리가 없는 혈압강하, 혈관내피세포과성장 조절, 세포염증 억제 조성물을 제공하는 것이다.
글라이코사미노글라이칸(GAG)은 생체내에서 프로테오글라이칸의 형태로 존재하며 프로테아제와 글라이코시다제에 의해 분해되어 당부분이 유리된다. 생체내에서 GAG류와 결합하는 단백질은 (1) 프로테아제 저해제(혈액응고방지), (2) 혈장의 리포단백질(헤파린과 콘드로이틴이 대표적인 혈장리포단백질로 동맥경화 발생조절에 관여), (3) 성장인자(헤파린과 헤파린황산이 염기성 섬유아세포, bFGF에결합하여 bFGF가 분해되는 것을 방지하여 성장과 분화에 중요한 역할을 수행), (4) 지질분해효소(저밀도 리포단백질(LDL) 분해효소와 중성지방효소를 혈장세포내로 유리시켜 혈중지방을 분해시켜 동맥경화예방), (5) 외피세포결합체 단백질(피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 트롬보스폰딘 등으로 세포부착, 세포간의 정보전달, 세포분화, 세포성장에 관여) 등 크게 5개로 분류될 수 있다.(특허257168호, 2000). GAG의 용도로는 상어연골, 달팽이에서 분리정제한 콘드로이친 황산계열은 글루코자민이란 상품으로 관절염치료보조요법제로 사용되며 미생물에서 발효정제시킨 히얄우론산은 화장품 첨가물, 돼지피의 헤파린은 외과 수술시 항응고제로 쓰이며 그외 면역계 보체활성, 말초혈관형성, 항바이러스작용, 염기성 섬유세포성장인자로 작용한다.
인도네시아 전통 (콩)발효식품 템퍼(Tempe)로부터 혈전용해 단백질 및 그 제조방법(특허출원2000-42164호)이나 달팽이로부터 글라이코자미노글라이칸 제조 및 그를 분해하는 장내미생물(등록번호 257168호)등 동물조직에서 글라이코자미노글라이칸을 분리정제할 수 있는 기술이 공지되어 있지만 그 반복단위가 헤파란황산, 아카란 황산, 케라틴황산, 및 콘드로이틴황산 등으로 다르고 또 저분자반복다당의 개수(-mer)와 분자량이 달라 가공의 어려움이 있다. 이에 본 발명자들은 약용곤충에서 글라이코자미노글라이칸을 분리동정한 결과 그 중 강력한 혈압강하 및 순환기 개선 효과를 동충하초의 글라이코자미노글라이칸에서 규명하여 본 발명을 완성하였다.
종래기술로서 동충하초 특히 애매미유충눈꽃동충하초를 유효성분으로 하는 약품조성물(특허제10-505217호), 식품조성물(특허제10-559998호), 혈압강하(안등, Arch . Pharm . Res, 2007, in press) 및 체중조절(안등, J. Toxicol . Environ . Health, 2007, in press)등의 기전에 유효하다는 것을 증명되어 왔다. 그러나 곤충의 유효성분 추출공정인 물, 유기용매추출 제조시(특히 알콜 추출물) 나오는 성분은 핵산성분으로 아데노신등 저분자 이차대사산물이 유효성분으로 규명되어 왔으며 이전 특허는 곤충 자체(껍질, 추출물 둘다 포함), 추출물(곤충 외피, 껍질은 포함 안함) 등으로 분류될 수 있으며, 곤충 껍질 외피에서 추출되는 성분은 고분자물질로서 일반 용매로 분리가 어려운 문제가 있다.
본 발명은 곤충 껍질 외피 및 근접점막세포에 해당하는 성분에서 글라이코자미노글라이칸을 분리하고자 하며, 상기 성분은 일반 용매로 잘 분리되지 않은 고분자 물질인 프로테오글라이칸으로서 강력한 단백질 분해효소의 작용으로 분리하는 방법 및 글라이코자미노글라이칸을 제공하고자 한다.
더욱 상세하게는 본 발명자들은 기존의 약용곤충의 추출물의 한계(투여량 수십~ 수백 mg/kg, 유효성분 및 작용기전의 모호함, 약리독성 예견보완가능함)를 극복하고 보다 유용한 혈관계조절물질을 얻고자 용매추출시 버려지는 곤충 껍질(외피)에서 지방을 제거하고 단백분해효소로 프로테오글라이칸에서 단백질을 제거하여 글라이코자미노글라이칸을 생산하고, 생체적용가능한 약리활성을 제공하고자 한다.
본 발명의 글리코자미노글라이칸의 혈압강하작용은 동물실험결과 우수하였으며 혈관내피성장억제(조절), 세포전사조절인자인 NFκB의 활성억제로 염증(비정상 상태 세포)억제의 약리활성을 얻었으며, 이는 약용곤충의 껍질에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸이 헤파란 황산 및 콘드로이틴 황산으로 구성되어 세포의 치료제로서의 가능성을 제공할 수 있다.
본 발명은 인간의 글라이코자미노글라이칸 분해효소를 처지하여 배양분해시켜본 결과 재조합한 헤파리나제 I에 분해되었으며 강음이온 교환 당분석컬럽을 통 하여 HPLC를 실시한 결과 그 반복구조가 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid N-acethylglucosamine 과 UA-GLcNA 와 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid glucosamine의 dimer가 반복하여 결합하여 올리고머를 형성한 후 폴리머를 형성함을 알 수가 있었다. 현재 동충하초의 순환기개선 효과에 관계한다고 하는 D-manitol 등의 자실체함유 다당류는 흡수되어 혈중의 내압을 내리며 이뇨작용을 하며 지방을 함께 배설시키는 역할을 하지만 이러한 단순한 이뇨작용으로 순환계 개선 효과를 설명하기에 어려움이 있다. 따라서, 다당체 중에서도 세포리셉터에 잘 붙는 점액다당류(글라이코자미노글라이칸) 및 그 반복 구성단위를 완성하여 본 특허를 제공하게 되었다.
본 발명은 곤충유래 동충하초의 글라이코자미노글라이칸을 고혈압쥐에 경구 투여시 2 mg/kg용량의존적으로 수축기혈압의 강하를 나타내었으며 유의적인 수축기압의 감소(183→105)를 보여주었으며 심장의 무리는 약하게(367→350)하며 혈전을 용해하며 순환기 개선효과를 가짐을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 의약적 조성물이나 건강보조식품 등으로 이용가능하며 공지된 형태의 기술로 제제화 또는 식품화될 수 있다.
비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형보조물이다. 바람직한 제형으로는 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제(pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다.
정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면(a) 충진제 및 중량제(예: 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코오스, 만니톨과 규산) (b) 결합제(예: 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈) (c) 흡습제(예: 글리세롤), (d) 붕해제(예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해지연제(예: 파라핀) (f)흡수촉진제(예: 4급 암모늄 화합물), (g) 습윤제(예: 세틸알코올 및 글리세롤모노스테아레이트), (h)흡착제(예:고령토 및 벤토나이트), 및, (i) 윤활제(예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스타레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기(a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효화합물 또는 화합물들을 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 피막을 입힐 수 있으며, 장관특정부위에 유효화합물만 방출시키도록 할 수 있으며, 필요한 경우 polymer 또는 붕매제 조성물을 사용 서방형으로 제제화할 수도 있다고 미세캡슐화할 수도 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 주사제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 좌제는 유제화합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오지방 등의 지방, 고급에스테르(예: C16-지방산을 갖는 C14-알코올), 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 라우린지 및 글리세롤젤라틴 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효화합물 이외 통상의 부형제, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제로는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로풀 루오로히드로카본을 더 함유할 수 있으며, PEG-4000과 글리세린을 함유하는 비강분무제로도 제제화할 수 있다.
액제 및 에멀젼제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 물, 에칠알콜, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에칠아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포롬아미드 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨우, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테티라히드로푸로푸릴 알코올, 포리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균형태로 제제할 수 있다.
현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상희석제(예: 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 현탁제(예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르), 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.
상기제형들은 또한 발색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유 및 유칼리유 및 감미제(예: 사카린)를 함유할 수 있으며, 본 발명에 의한 화합물 이외에 다른 제약상의 유효한 화합물을 함유할 수 있다.
상기제형은 공지된 방법, 예를 들면 유효화합물을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다. 치료학적 유효화합물은 상기제약제형에 있어서 전체혼합물의 약 0.1 내지99.5 중량 %, 바람직하기로는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유되어야 한다.
더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 동충하초에서 유래한
글라이코자미노글라이칸의
제조 및 혈압강하효과
(1) 시료제조
건조시킨 약용곤충(애매미눈꽃동충하초) 1 kg을 아세톤을 비롯한 지방용해가능한 유기용매(예를 들어, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸알콜, 에틸알콜, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 디클로메탄등)에 방치하여 지방류를 제거하고 건조한 후, 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에 단백분해효소인 알카라제(1.4%)로 단백질을 분해시킨 후 5 % Trichloroacetic acid(TCA) 농도로 분해 단백질을 제거하고 에타놀 침전과 5% cetylpyridinium 침전을 거친 후 다시 에탄올 침전 후 증류수로 투석하여 1.1g(yield=1.1%)을 얻었다.
상기 과정을 반복하면서 산성당 분획을 모아서 순도를 전기영동에 의하여 결 정하고 이온교환크로마토그라피(Sephadex DEAE A-25)를 거쳐서 salt gradient(0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 더욱 정제후 우론산을 가지는 분획을 수집하여 동물 및 세포처치용 글라이코자미노글라이칸으로 사용하였다. 이것에 대한 구조 결정은 NMR과 또한 글리코사미노글리칸류의 분해효소를 처리한 후 HPLC에 의하여 분리, 정제한다.
(2) 시료투여
7주령의 선천성고혈압쥐(SHR)와 정상쥐(WKY)을 2주간 동물실에서 안정화시킨후 2주간의 용량설정예비시험을 거쳐 안전유효량을 결정하고 선천성(자연) 고혈압쥐(SHR, 체중285±10g)와 정상쥐(WKY,체중300±10g ) 12주령부터 경구(존대로) 투여를 시작하여 모든 투여군은 한달간 매일 동일용량으로 반복투여하였다. 체중 200 g당 1 ㎖의 비율로 생리 식염수에 녹여 투여시료로 사용하였다. 무처치대조구로서 생리식염수만을 경구용 존대로 투여하였고, 시험군[애매미유충눈꽃동충하초(=매미눈꽃동충하초) 글라이코사미노글라이칸 투여군, 2 mg/kg], 또한 비교시험군으로 [매미눈꽃동충하초 알콜(메탄올 또는 에탄올)추출물 투여군, 30 mg/kg],양성대조군으로 시판 중인 안지오텐신 전환 효소 억제제(angiotensin converting enzyme inhibitor)인 캡토푸릴(captopril) 40 mg/kg을 경구투여 하였다.
음성 대조군으로는 생리식염수를 경구용 존대를 사용하였고, 시험군(동충하초 글라이코사미노글라이칸 투여군)으로는 애매미유충 눈꽃동충하초에서 글라이코사미노글라이칸을 분리정제하여 예비실험을 2주간 실시하여 확인한 안전유효량을 2 mg/kg의 용량으로 한달간 자연고혈압쥐에 경구투여하였다. 혈압은 투여직전과 투 여한 1시간 후에 혈압(수축기 및 확장기압) 및 심박동을 측정하였다.
(3) 혈압측정
혈압은 blood pressure monitoring system을 이용하여 비마취 혈압간접 측정법으로 수축기혈압(systolic blood pressure), 확장기혈압(diastolic blood pressure) 및 심박동(heart rate)을 측정하였다. 혈압측정시 랫트를 고정틀에 넣어 적당한 크기의 tail cuff sensor를 꼬리에 끼운 다음 5분 정도 환경에 적응시키고 나서 혈압 및 심박동을 측정하였다. 혈압측정 chamber내의 온도는 33℃로 고정하였고 4~6회 측정하여 평균값을 기록하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
투여군 | 수축기 혈압 | 확장기 혈압 | 심장박동률 |
대조(무처치)군 | 183.3±4.41 | 148.3±4.41 | 366.7±3.33 |
알콜추출물(30mg.kg) | 116.3±11.43** | 90.00±13.39* | 355.00±15.00 |
글라이코사미노글라이칸(2 mg/kg) | 105.00±7.26* | 80.00±20.00* | 350.00±30.00 |
캡토푸릴(40 mg/kg) | 131.70±7.26** | 100.00±20.00* | 360.00±11.55 |
*p<0.05, **P,0.01 vs SHR control, GAG: 매미눈꽃동충하초에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸
(4) 체중 측정
체중 170g(7주령)인 선천성 고혈압쥐(SHR)와 정상쥐(WKY)를 동물실에서 충분히 적응시킨 후, 어른 쥐가 된 후 평균 무게 285±10g인 12주령 웅성 선천성 고혈압 쥐 및 정상쥐에 대해 체중을 매일 시료(상기 기재한 동일시료인 애매미유충 눈꽃동충하초에서 글라이코사미노글라이칸 2mg/kg)를 존대로 경구투여 후 저울로 체중을 측정하였다.
(5) 통계학적인 분석
모든 실험결과는 Student's t-test로 통계처리하였으며, p<0.05인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.
투여일 | 대조군 | 알콜추출물 (30 mg/kg) | 글라이코자미노글라이칸 (2 mg/kg) | 캡토푸릴 (40 mg/kg) |
1 | 286.0±10.53 | 287.8±13.15 | 287.2±14.98 | 279.0±4.32 |
2 | 283.8±9.50 | 286.7±11.13 | 277.1±14.70 | 288.8±6.45 |
3 | 287.8±7.33 | 285.0±11.43 | 272.4±17.15 | 287.4±6.55 |
4 | 287.6±7.46 | 281.2±12.18 | 266.6±17.18 | 284.4±7.13 |
5 | 289.5±6.10 | 274.9±13.37 | 260.4±15.62 | 278.9±10.31 |
6 | 291.2±5.95 | 269.0±12.72 | 258.3±16.96 | 277.2±11.27 |
7 | 292.3±8.57 | 263.8±13.43 | 251.3±10.12 | 273.8±11.04 |
8 | 293.4±6.70 | 259.2±13.45 | 249.6±9.64 | 271.6±14.32 |
9 | 296.0±7.16 | 257.5±14.63 | 250.3±8.92 | 267.6±15.14 |
10 | 299.3±6.55 | 260.4±14.16 | 253.3±7.29 | 267.3±16.88 |
12 | 297.1±4,16 | 260.3±17.96 | 252.8±9.49 | 265.6±16.32 |
13 | 302.3±6.12 | 263.1±16.57 | 248.2±7.24 | 265.9±26.49 |
15 | 309.3±5.22 | 270.7±15.89 | 256.3±2.56 | 273.3±25.11 |
16 | 309.8±6.41 | 269.3±15.55 | 257.2±4.37 | 272.4±22.73 |
17 | 309.0±8.36 | 269.7±15.34 | 255.7±6.88 | 273.9±26.31 |
18 | 313.8±8.10 | 268.6±16.47 | 257.0±6.21 | 273.7±28.29 |
19 | 313.3±9.38 | 269.8±16.38 | 257.4±4.52 | 271.7±33.26 |
20 | 317.3±6.48 | 272.0±13.98 | 259.8±0.49 | 274.1±31.80 |
22 | 321.6±9.87 | 277.9±16.57 | 263.6±0.07 | 279.5±31.44 |
23 | 321.4±9.82 | 278.1±14.09 | 264.5±0.21 | 276.3±33.13 |
24 | 323.5±9.78 | 282.6±13.91 | 268.2±2.26 | 270.2±41.90 |
25 | 326.5±12.02 | 282.8±13.84 | 268.1±2.05 | 271.1±47.96 |
26 | 325.3±11.79 | 281.7±13.64 | 266.2±4.66 | 290.0±10.41 |
27 | 323.2±10.49 | 279.4±13.42 | 267.2±4.10 | 288.5±7.37 |
29 | 327.7±13.07 | 282.5±12.57 | 270.4±7.07 | 289.9±7.91 |
31 | 340.2±6.98 | 292.4±11.17 | 276.0±6.71 | 298.5±15.14 |
대조대비 모든처치군 P<0.01
표2에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 매미눈꽃동충하초에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸 2mg/kg 한달투여시 체중이 정상대비 19% 감소(정상: 340.2 g→글라이코자미노글라이칸:276.0 g)함을 확인할 수 있었다.
(6) 시료동정(전기영동 및 HPLC분석)
고분자량동정 및 가수분해 효소처리 후 단위구조와 oligomer 구명하고자 고분자폴리머인 글라이코자미노글라이칸은 당전기영동(1% agarose gel)에 시료로딩 후 당염색으로 확인할 수 있으며 GPC 컬럼을 이용한 HPLC 또는 MALDI-TOF로 분자량을 확인할 수 있다. 고분자인 글라이코자미노글라이칸의 반복단위구조를 구명하고자 저분자올리고머를 만드는 데 여기에 Lyase효소(글라이코자미노글라이칸 분해효소)를 사용한다. 즉 헤파리나제I, II는 Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37, 684-690의 방법으로 제조한 것의 recombinant를 사용하였고 chondroitin sulfate lyase는 sigma 것을 사용하여 다음과 같이 배양분해 강이온교환컬럼-HPLC로 분석하였다. 즉 효소의 반응이 완전히 진행되었을 때 반응물의 분석은 고속액체크로마토그라프(HPLC)를 이용하여 실시한다. 강음이온교환칼럼(4.6×250nm, 미국 페노미녹스 제품)을 이용하여 염화나트륨 농도 구배에 의해서 1.0ml/min의 유속으로 시료를 분리하여 모아 NMR 및 GC-MS 분석을 한다.
이상의 결과로부터 매미눈꽃동충하초의 글라이코자미노글라이칸을 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid N-acethylglucosamine 과 UA-GLcNA 와 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid glucosamine의 dimer가 반복하여 결합하여 올리고머를 형성한 후 폴리머를 형성함을 분리동정하고 이를 선천성고혈압쥐에 투여한 결과 dose response[(2 mg/kg i.v.]하게 자연고혈압쥐의 수축기압을 정상쥐 수준으로 유의적으로 유지함을 알 수 있었다.
실시예
2: 동충하초에서 유래한
글라이코자미노글라이칸의
인간내피세포에서의
혈관성장 억제효과(
anti
-
angiogenesis
)
세포수준에서 항암작용의 기전으로 관련 가능성이 있는 면역 조절 기능을 확인하기 위해 매미눈꽃동충하초의 글라이코자미노글라이칸이혈관내피세포에서의 혈관확장 및 혈관 내피 성장 인자 분비에 관련이 있는지 관련성을 살펴보았다(Young, H, Hardy K : Role of interferone-gamma in immune cell regulation, J. Leukoc. Biol.,58, 373-381 (1995)). 특히, 고형암의 성장은 많은 부분 미리 존재하는 혈관으로부터 신생혈관을 만들어나가는 혈관신생(angiogenesis)에 의존하는 것으로 알려져 있다. 암의 성장을 저지하기위해서 혈관신생을 억제하는 접근은 암을 치료하는 데 중요한 역할을 할 수 있고 따라서 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 분비를 조절하는 것은 물질이 항암 효과를 나타내는 한 기전으로 파악 될 수 있을 것이다(The Cytokine Handbook 2nd ed., edited by Angus Thomson, Academic Press, 1994)
(1)혈관내피세포에 대한 VEGF(혈관내피세포성장인자) 활성조사
Human Umbilical Vein Endothelial cell (HUVEC)을 Clonetics EBM-2와 ECM-2 singlequots(CAMBREX (Walkeresvillie, MD, USA) 배지로 계대배양하여 세포가 성장단계에 이르면 세포를 긁어모아 세포현탁액(2x106 cells/ml)을 만들고, 이 현탁액에 상기 실시예1에서 제조한 시료를 20, 2, 0.2 mg/ml로 첨가하여 96well plate에서 37℃, 5% CO2 및 가습 조건으로 48시간 배양한 상등액 중에서 분비된 암의 전이인자의 하나인 VEGF를 ELISA assay kit (R&D systems, Minneapolis, USA)로 측정하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도5에서 알 수 있듯이 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 20 mg/ml, 2 mg/ml, 200 μg/ml를 인간 (배꼽과 연결되는) 복강벽혈관내피세포HUVEC에 2일 처치 배양하여 VEGF양을 조사한 결과 용량의존적으로 감소한 결과 혈관내피세포성장을 억제함을 확인하였으며, 이는 약물 및 독성물질에 의한 혈관내피세포의 정상화에 기여함으로써 항암기전의 일부(혈관신생억제)를 시사한다고 볼 수 있다.
(2) 혈관내피세포에 대한 NO 산생능 조사
NO 산생은 Griess 시약을 사용하여 세포배지로 아질산이온축적으로 측정되어진다. 즉, HUVEC(사람 배꼽아래 복부혈관내피세포)에 상기 실시예1에서 제조한 글라이코자미노글라이칸을 20 mg/ml을 처치하여 24시간 배양하고 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 아질산나트륨량을 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조약물로 생체내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside, dihydrate (SNP)를 사용하였다. 매미눈꽃동충하초의 글라이코자미노글라이칸을 20 mg/ml, 2 mg/ml, 200 μg/ml투여기 540 nm에서 흡광도수치가 0.095전후로서 NO 산생을 하지 못하였다. 그러나 매미눈꽃동충하초의 알콜추출물(ISMC)의 혈관내피세포의 혈관확장효과는 도6에 나타내었다. 도6에서 알 수 있듯이 100㎕ 소혈관내피세포(CPAE)에 20㎕씩 0.05 mg, 0.15 mg, 0.2 mg 매미눈꽃동충하초의 알콜추출물을 투여시 NO 생성 효과(혈관확장능)는 용량의존적으로 증강하였다.
(3) 통계처리
분석결과의 통계는 실험군 당 평균치와 표준편차로 계산하였고 군 간의 차이는 Student's t-test를 이용하였다.
실시예
3:
귀뚜라미에서
유래한
글라이코자미노글라이칸
(1) 귀뚜라미의 글라이코자미노글라이칸 분리동정
건조 귀뚜라미 1 kg을 아세톤에 방치하여 지방류를 제거한 후 건조하여 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에 단백분해효소인 알카라제(1.4%)로 단백질을 분해시킨 후 5 % Trichloroacetic acid(TCA) 농도로 분해 단백질을 제거하고 에타놀 침전과 5% cetylpyridinium 침전을 거친 후 다시 에탄올 침전 후 증류수로 투석하여 1.1g(yield=1.1%)을 얻었다. 상기 과정을 반복하면서 산성당 분획을 모아서 순도를 전기영동에 의하여 결정하고 이온교환크로마토그라피(Sephadex DEAE A-25)를 거쳐서 salt gradient(0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 더욱 정제후 우론산을 가지는 분획을 모아 세포처치용 글라이코자미노글라이칸으로 사용하였다. 즉 헤파리나제I, II는 Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37, 684-690의 방법으로 제조한 것의 recombinant를 사용하였고 chondroitin sulfate lyase는 sigma 것을 사용하여 다음과 같이 배양효소 분해후 강이온교환컬럼-HPLC로 분석하였다. 귀뚜라미 점액다당류의 올리고당 제조 및 구조 동정한 결과 도7에 나타낸 바와 같이 △UA-GlcNAC, △UA-GlcNS, △UA-GlcNAC6S 로 반복단위구조로 되어 있었다.
(2) 귀뚜라미(Gb)글라이코자미노글라이칸(GAG) 처리 후 형질 감염세포에서의 NF-kB활성
가. 실험방법
p-NF-kB-SEAP vector를 형질 감염시킨 HaCaT세포주(human keratinocyte, 인간 각질형성세포주)를 T-25에 3X106 세포수로 분주하고, 선택마커로서 제네티신(500 ㎍/㎖)을 넣어 CO2 배양기에서 24시간동안 세포수를 키워 세포배지를 버리고 D-PBS로 2번 정도 닦아준다. 새로운 세포배지와 제네티신(500 ㎍/㎖)을 넣어준 후, 각각의 T-25에서 55㎕을 취하여 microcentrifuge tube에 담는다. 이때 Sampling한 시간을 0(Zero)시간으로 설정한다. microcentrifuge tube에 담은 Sample을 endogenous alkaline phosphatase을 제거하기 위해 65℃에서 5분 30초 끊여주고, 바로 -20℃에 보관한다. 0(Zero)시간으로부터 24시간에 지난 후(24hr)에 각각의 T-25에서 55㎕을 취하여 microcentrifuge tube에 담아 적정농도의 추출물을 배지를 사용하여 녹인 후에 각각의 T-25에 넣어주며 대조군은 처리하지 않은 것으로 설정한다. 천연물을 처리하고 난 후에 T-25를 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 24시간동안 Cells을 키워준다. 24시간에 지난후(48hr)에 각각의 T-25에서 55㎕을 취하여 microcentrifuge tube에 담고 현미경을 이용하여 형질감염 HaCaT 세포들의 cytomorphology를 관찰한다(현미경 관찰로서 cytotoxicity가 보이는 T-25는 NF-KB Activity 측정에서 제외시킨다). 여기서 취한 microcentrifuge tube에 담은 시료를 65℃에서 5분 30초간 끊여주고, 바로 -20℃에 보관한다. 유전자의 발현은 자극이나 화학물질에 대해서 세포가 반응하는 분자수준에서의 작용기전에 관한 연구를 통하여, 전사 수준에서 또는 다양한 전사 조절인자의 협동에 의해서 조절된다는 것이 알려져 있다. 이러한 전사 조절인자 가운데 NF-κB는 염증이나 면역반응에 관여하는 유전자의 조절에 중요한 역할을 하고 있다. NF-κB는 평소에는 저해 단백질인 I-κB와 세포질 내에서 결합한 형태의 복합체를 형성하고 존재하다가 세포가 다양한 NF-κB 활성물질, 예를 들면 종양괴사인자(tumor necrosis factor), 인터루킨-I, 리포다당류(lipopolysaccharide) 그리고 자외선 등에 노출되면 저해 단백질인 I-κB의 인산화가 유발되어 결국 I-κB가 분해된다. I-κB가 분해되면 NF-κB가 세포핵 내부로 이동하게 되고 여기에서 목표 유전자의 발현을 야기시킨다. 피부세포주에 자외선을 쬐었을 때 NF-κB의 발현이 상당히 활성화되므로 추출물을 처리하였을 경우에 NF-κB의 발현양상이 억제를 보이면 피부가 자외선노출에도 추출물에 의해서 보호받았음을 알 수 있다.
UV (mj/Cm2, 8hr) | Treatment Test materials | Dose(μg/ml) | NF-κB activity (RLU)(inhibition %) |
0 | Control | 0 | 7.30±0.44(100) |
60 | Reference (UV treatment) | 0 | 15.91±4.89(0) |
60 | Gb GAG | 30 | 5.40±0.16*(122.0) |
60 | H2O fraction | 30 | 6.96±0.71*(103.8) |
60 | MeOH fraction | 30 | 17.21±3.60(-15.0) |
60 | EtOAC fraction | 30 | 12.09±1.36(44.3) |
*P<0.01 vs UV-stimulated cells(Reference)
표3에 나타낸 바와 같이 p-NF-kB-SEAP vector를 형질 감염시킨 HaCaT세포에 귀뚜라미에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸(Gb GAG), 귀뚜라미물분획(유기용매추출모식도에 따른 헥산→에칠아세테이트→부탄올→물분획을 말함), 메탄올분획(추출물), 에칠아세테이트 분획을 각각 30 ㎍/ml 투여 후 자외선(UV) 조사시 무처리군에서 NF-κB의 활성이 증가한다. 그러나 귀뚜라미의 글라이코자미노글라이칸 투여에 의해서 NF-κB의 활성을 억제하여 UV조사(손상)으로부터 보호하여 UV조사전 인간 각질형성(HaCaT)세포로 상태로 되어 있음을 알 수 있었다.
상기 방법으로 매미눈꽃동충하초 추출물투여시 UV 보호효과(표4) 조사한 결과 글라이코자미노글라이칸의 피부보호효과(표3)가 알콜추출물보다 탁월하게 원래 정상피부세포수준이상으로 피부보호효과가 좋아 글라이코자미노글라이칸이 각질형성세포의 UV 손상[자외선 조사에 의한 피부손상으로 케라티노(각질)세포가 멜라닌(기미, 죽은깨)세포로 변해감]을 억제함을 알 수 있다.
시험군 | NF-κB activity(RLU) | 피부보호효과(%) |
정상군 | 9.14** | 100 |
UV조사군 | 23.53 | 0 |
물추출물(HC) | 12.69* | 75.27 |
알콜추출물(MC) | 12.06** | 75.74 |
*control: 정상군; UV: 자외선조사군; HC: 애매미유충눈꽃동충하초 물추출물; MeC: 애매미유충눈꽃동충하초의 알콜추출물 30mg/ml
**P,0.01 and *P,0.05 vs UV-stimulated cells
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이 본 발명의 효과적으로 곤충으로부터 글라이코자미노글라이칸 추출 방법을 제공한다. 매미눈꽃동충하초의 글라이코자미노글라이칸을 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid N-acethyl glucosamine 와 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid glucosamine의 dimer가 반복하여 결합하여 올리고머를 형성한 후 폴리머를 형성함을 분리동정하고 이를 선천성고혈압쥐에 투여한 결과 dose response[(2 mg/kg i.v.]하게 자연고혈압쥐의 수축기압을 정상쥐 수준으로 유의적으로 유지함을 증명하였다. 따라서 곤충유래 글라이코자미노글란이칸 화합물(의 유도체)들은 직접 관계가 되는 물질로 순수분리 하여 순환기 개선 의약품소재로 이용 가능하다고 본다.
Claims (9)
- 곤충에서 유래한 글라이코자미노글라이칸을 제조하는 방법에 있어서,(1) 건조시킨 곤충을 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸알콜, 에틸알콜, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴 및 디클로메탄으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유기용매에 방치하여 지방류를 제거한 후 건조하는 단계;(2) 단계(1)에서 제조된 곤충을 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에서 단백분해효소인 알카라제(1.4 무게%)로 단백질을 분해시키는 단계;(3) 단계(2)에서 분해된 단백질을 5 무게% Trichloroacetic acid(TCA)로 제거하고 에탄올 침전과 5 무게% cetylpyridinium 침전을 거친 후 다시 에탄올 침전하는 단계;(4) 단계(3)에서 생성된 침전을 증류수로 투석하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 단계(1) 내지 단계(4) 과정을 반복하여 분획을 수집하여 이온교환크로마토그라피를 거치고 salt gradient(0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸 제조방법.
- 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의해서 제조되는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸.
- 제 3항에 있어서, 매미눈꽃동충하초에서 유래한 △UA-GLcNA와 △UA-Glc의 반복단위구조를 가지는 것을 특징으로 하는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸.
- 제 3항에 있어서, 귀뚜라미에서 유래한 △UA-GlcNAC, △UA-GlcNS 및 △UA-GlcNAC6S의 반복단위구조를 가지는 것을 특징으로 하는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸.
- 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의해서 제조되는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 혈압강하용 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의해서 제조되는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 체중조절용 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의해서 제조되는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물.
- 제 1항 또는 제 2항의 방법에 의해서 제조되는 곤충유래 글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 피부세포의 UV손상 억제용 조성물.
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