KR20230156265A - 신규 펩타이드 및 이의 항염 및 재생 용도 - Google Patents

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김용훈
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노정란
강은정
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김병찬
박혜연
서윤정
이인복
장동호
최영근
최정현
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Abstract

본 발명은 신규 펩타이드 및 이의 항염 및 재생 용도에 관한 것이다.

Description

신규 펩타이드 및 이의 항염 및 재생 용도{Novel peptide and its use for anti-inflammation and regeneration}
본 발명은 신규 펩타이드 및 이의 항염 및 재생 용도에 관한 것이다.
염증은 유해한 외인성 및 내인성 신호 또는 병원균을 제거하고 치유 과정을 시작하기 위한 면역 체계의 복잡한 생물학적 반응이다. 박테리아 및 바이러스, 자외선, 중금속, 콜레스테롤, 석면 및 많은 나노 물질과 같은 다양한 감염 요인은 염증을 유발한다. 염증 반응은 감염이나 상처 치유 과정에서 회복되기 위해서는 필수적이지만, 조절되지 않는 염증 반응이나 만성 염증은 관절염, 대사성 질환, 간염, 장염, 위염, 위궤양, 식도염, 피부염 등의 질환뿐 아니라 뇌염, 우울증, 불안장애, 인지장애, 기억장애, 퇴행성 뇌질환 및 발달장애를 유발하기도 한다.
한편 염증반응은 종종 세포, 조직, 기관의 기능 저하를 유발하여 손상을 유발하는 하나의 원인이 되기도 한다. 예를 들면 피부 노화, 근력 손실, 탈모 등의 질환은 조직이 손상되어 발생하는 질환으로, 최근 이러한 조직의 손상을 효과적으로 억제할 수 있는 치료제 개발에 관심이 집중되고 있다.
본 발명자들은 최근 현대인들에게서 발병이 높아지고 있는 염증 질환, 조직 손상 관련 질환의 발병 및 악화를 효과적으로 억제할 수 있는 치료제를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 끝에, 본 발명의 펩타이드를 개발하고, 항염 및 조직 재생 효과가 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
WO2014-200651 WO2020-127904
본 발명의 목적은 하기 일반식 1 또는 2의 서열을 포함하는 펩타이드를 제공하는 것이다:
[일반식 1]
X-Gly-Ala-Tyr
[일반식 2]
Ala-X-Ser
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는, 조직 손상 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 건강기능식품 조성물, 사료 조성물, 동물 의약품, 의약외품 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 조직 재생 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 일반식 1 또는 2의 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다.
[일반식 1]
X-Gly-Ala-Tyr
[일반식 2]
Ala-X-Ser
일 구현예로, 상기 일반식 1 또는 2의 X는 임의의 아미노산일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 일반식 1에서 X는 비극성(Nonpolar), 염기성(Basic) 또는 극성(Polar) 아미노산으로 분류되는 아미노산일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 일반식 1에서 X는 Ala, Arg, Ile, Ser 및 Val 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 일반식 2에서 X는 비극성(Nonpolar), 산성(Acidic) 또는 극성(Polar) 아미노산으로 분류되는 아미노산일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 일반식 2에서 X는 Gln, Gly 및 Ile 중에서 선택되는 어느 하나의 아미노산일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 하기 표 1의 펩타이드 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나(consisting essentially of), 또는 구성될 수 있다.
서열번호 펩타이드 명칭 서열
1 PEP006 AGAY
2 PEP007 RGAY
3 PEP008 IGAY
4 PEP009 SGAY
5 PEP010 VGAY
6 PEP011 AQS
7 PEP012 AGS
8 PEP013 AIS
그러나 이에 제한되지 않고, 상기 서열과 동일한 활성을 나타내는 펩타이드는 제한 없이 포함된다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 펩타이드 합성 방법에 따라 생산될 수 있다. 일 예로, 생리적 조건하에 본 발명의 펩타이드 분자로 전환되는 것일 수 있다. 일 예로, 고상 합성 과정 및 액상 합성 과정에 따라 본 발명의 펩타이드를 합성할 수 있다. 즉, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 상기 펩타이드 분자를 구성할 수 있는 부분적 펩타이드 또는 아미노산, 합성되어야 하는 펩타이드 그리고 나머지 부분을 원하는 순서에 따라 반복 축합시킴으로써 생산될 수 있다. 바람직한 순서를 갖는 생산물이 보호기를 갖는 경우, 목적 펩타이드는 보호기를 제거함으로써 생산될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 그의 염 형태를 포함한다. 이와 같은 염의 예는 금속 염, 암모늄 염, 유기 염기와의 염, 무기 산과의 염, 유기 산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염, 및 기타 등등을 포함한다. 금속 염의 바람직한 예는 알칼리 금속 염 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염 및 기타 등등; 알칼리성 토류 금속 염 예컨대 칼슘 염, 마그네슘 염, 바륨 염 및 기타 등등; 알루미늄 염 및 기타 등등을 포함한다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드에 상응하는 기능을 가지는 펩타이드 유사체 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 용어 "펩타이드 유사체"는 비-천연 발생 아미노산 서열, 또는 변형된 천연 발생 아미노산 서열을 지칭한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 사슬모양으로 길게 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)이며, 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 본 발명에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 펩타이드를 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 재조합 벡터는 세포 내에 도입하여 본 발명의 펩타이드를 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 캐리어 물질이 연결된 형태일 수 있다.
본 발명에 사용가능한 캐리어 물질의 예를 일부만 들자면 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
PEG는 목적 펩타이드의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 이에 더하여 외래 펩타이드에 PEG를 결합시키면 때로는 외래 펩타이드에 존재하는 항원 부위가 면역세포에 의해 인식되는 것을 저해할 수 있다. 구체적으로는 펩타이드의 항원제시세포(antigen-presenting cell)에 의한 대식작용 및 세포 내 분해작용(proteolysis)을 저해하여 펩타이드가 항원으로 작용할 가능성을 낮출 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 상기 캐리어 물질과 링커를 통해 연결될 수 있다. 상기 링커는 펩타이드성 또는 비펩타이드성 중합체일 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 중합체의 예를 일부만 들자면 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이 기술 분야에 이미 알려진 전술한 예시 비펩타이드 중합체의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 PEG, 단당류, 형광단, 발색단, 방사성 화합물 및 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 모이어티에 추가로 접합될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위에서, 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 펩타이드는 글리코실화, 페길화(PEGylation), 아미드화, 에스테르화, 아실화, 아세틸화 및/또는 알킬화 된 형태로 존재하는 것일 수 있다.
그러나 전술한 예시에 제한되지 않는다.
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 항염 및/또는 재생 작용을 가지는 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태는 본 발명의 펩타이드의 염증질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 본 발명의 펩타이드의 조직 재생 용도를 제공한다.
본 발명에서 "항염(anti inflammation)" 은 염증을 억제하는 것을 말하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체 조직의 방어반응의 하나로서, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식을 병발할 수 있는 복잡한 병변을 말한다.
염증은 선천성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기로 인식하고 병원체를 공격한다. 병원균이 신체의 물리적 장벽을 깨고 들어온다면 염증 반응이 일어날 수 있다. 염증반응은 면역학적 방어기전의 일부이지만, 과도하거나 지속적으로 발생되면 급성 또는 만성 염증질환이 유발된다.
염증 발생은 호르몬 분비, 사이토카인, C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP) 등 체내 여러 기전에서 이루어지며, 관련된 물질도 매우 많다. 이 중 면역세포에서 분비되는 다양한 사이토카인은 면역계를 조절하며, 일부는 염증을 촉진 시키기도 한다. 따라서, 세포 내 사이토카인의 발현량이 염증 반응 활성화의 지표가 될 수 있다.
본 발명에서 "염증질환"은 염증반응에 의해 발생하는 질환을 의미한다.
상기 염증질환은 예를 들어 Tnfα, Il-1β, Il-6, Cox2, iNos, CCl2, Cd11b, F4/80, Ifnγ 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 염증성 마커 발현 증가; 및/또는 Il-10 및 Il-1rn으로 이루어지는 항염 마커의 발현 감소에 의해 발생하는 것일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염증질환은 관절염, 대사성 질환, 간염, 장염, 위염, 위궤양, 식도염, 피부염, 뇌염, 우울증, 불안장애, 인지장애, 기억장애, 퇴행성 뇌질환 및 발달장애로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다
본 발명의 염증질환은 급성 또는 만성 질환을 모두 포함한다.
본 발명의 "관절염"은 관절에 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 관절염은 골관절염, 류마티스성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 타박성 관절염, 통풍성 관절염, 위축성 관절염, 만성 염증성 관절염, 변형성 관절염, 감염성 관절염, 폐경기 관절염, 단절성 관절염, 비대증 관절염, 화농성 관절염을 포함한다.
본 발명의 "대사성 질환" 은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환을 질환을 총칭하는 것이다. 상기 대사성 질환은 장내 방어막(intestinal barrier)의 기능 변화, 혈중 LPS의 농도 변화, 장내 염증 발생, 장내 점액질 변화, 인슐린 저항성 증가, 인슐린 민감도 감소, 공복혈당 증가, 인슐린 내성 증가, 글루코스 내성 증가, 혈중 크레아티닌, 요소 질소(BUN), 요산, 크레아틴 키나제 농도 증가 중 1 이상의 현상을 나타내는 것이거나, 상기 현상으로 인한 것 내지는 상기 현상을 전조 증상으로 하는 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 대사성 질환은 인슐린 저항성 질환, 비만, 당뇨병, 지방간, 비알콜성 지방간, 고지혈증, 신장 손상, 동맥경화증, 이상지질혈증 및 고혈압으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있고, 예를 들어 비만, 당뇨, 인슐린 저항성 및 이상지질혈증 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "간염"은 간에서 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 간염은 급성 또는 만성 간염, 간경변, 지방간, 간부전, 간암, 알코올성 지방간, 비알코올 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH), 간섬유화 (Liver fibrosis) 및 간경화 (Liver cirrhosis)를 포함한다. 간세포 및 간 조직 염증이 지속되면 장기간에 걸쳐 간세포가 파괴되고 재생하는 과정이 반복되어 간에 섬유조직과 재생 결절이 증가하고, 간경변 또는 간경화가 진행될 수 있다. 예를 들어 상기 간염은 급성 간염 또는 비알코올성 간염일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비알코올성 간염은 알코올 이외의 원인으로 발병하는 것은 제한없이 포함하며, 예를 들어 비만, 당뇨, 이상지질혈증, 대사증후군 등의 대사질환을 원인으로 하거나, 상기 대사질환의 원인인 고지방식이에 의해 발생하는 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 "장염"은 장에서 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 "장염"은 "염증성 장질환"과 동일한 의미로 사용되며, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Chrohn's disease), 장형 베체트병(intestinal Bechet's disease), 출혈성 직장 궤양, 및 회장낭염을 포함한다.
본 발명의 "위염"은 위에 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 위염은 위경련, 위염, 위궤양, 십이지장염, 십이지장궤양과 같은 위질환을 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 "식도염" 은 식도에 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 식도염은 세균 감염이나, 위의 내용물 또는 위산 역류, 약물 등 다양한 원인에 의해 발생하는 것을 모두 포함하며, 일 예로 역류성 식도염 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 "피부염"은 피부에 발생하는 염증 질환을 의미한다. 상기 피부염은 알러지성 접촉 피부염, 두드러기, 무피지성 피부염 (하퇴상의 건조한 피부), 아토피 피부염, 접촉 피부염, 이를 테면 자극 접촉 피부염 및 옻-유도 접촉 피부염, 습진, 인력(gravitational) 피부염, 화폐상 피부염, 외이도염, 구강 주위 피부염 및 지루성 피부염을 포함한다.
본 발명의 "뇌염" 은 뇌에서 발생하는 염증 질환을 의미한다. 뇌에서 염증세포가 과하게 활성화 되면 염증성 싸이토카인의 분비가 많아지고 이러한 뇌염증 반응의 과활성화에 의해 뇌세포 손상이 유발될 수 있다. 따라서 상기 뇌염은, 인지장애, 기억장애, 퇴행성 뇌질환과 밀접한 관련을 가진다. 상기 뇌염은 신경 염증(neuroinflammation)을 포함한다.
본 발명의 "우울증"은 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 의미한다.
본 발명의 "불안 장애"는 정신 질환의 일종으로서 광범위하게 매우 불쾌한, 그리고 막연히 불안한 느낌으로, 관련된 신체 증상 (가슴 두근거림, 진땀 등)과 행동 증상 (과민성, 서성댐 등)을 동반한다. 불안할 때 뇌 전체는 각성(arousal) 상태에 들어가며, 따라서 불안 장애로 인해 말초 행동, 자율신경계, 감각, 지각 등에 지장이 생긴다. 또한 불안 장애는 실제적인 위험에 기인하지 않고 공격(공황 장애)이나 지속적인 상태(일반화된 불안 장애)로서 나타나는 심리적이고 육체적인 불안 징후들의 다양한 조합과 관련될 수 있다.
본 발명의 "인지장애"는 뇌 손상에 의해 기억능력, 시공간 파악능력, 판단력, 언어능력 또는 계산능력 등의 인지기능(인지능력)이 저하되어 유발된 질환을 의미한다. 본 발명의 "기억장애"는 사물을 기억하거나 과거의 경험을 생각해내는 일이 어렵거나 아주 불가능한 병적인 상태로서, 기억력 저하에 의해 발생하는 질환, 예를 들어 건망증, 순간기억상실, 단기기억상실, 장기기억상실, 일과성 기억장애를 포함한다. 그러나 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 본 발명의 펩타이드는 기억력 및/또는 인지능력의 개선에도 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)" 은 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환을 의미한다. 일 예로, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머, 파킨슨병, 루게릭병, 경도 인지장애, 뇌졸중, 헌팅턴 병을 포함한다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "발달장애 (Developmental Disability)"는 정신, 신체적인 발달에서 나이만큼 발달하지 않은 상태로서 발달 선별 검사에서 해당 연령의 정상 기대치보다 25% 정도 뒤쳐져 있는 경우를 의미한다. 발달장애의 공통적인 증상은 언어를 이해하고 사용하는데 어려움을 겪으며, 사회적 상황의 전반적인 이해와 인간 관계 형성에서 어려움을 보이며 특정 사물에 특이하게 집착하고, 일정한 행동 절차를 반복하는 패턴을 보인다. 본 발명에서의 발달장애는 지적 장애, 뇌성마비, 전반적 발달장애, 발달성 언어장애, 시각 또는 청각을 포함하는 특수 감각의 기능장애, 학습장애, 주의력결핍 과잉행동장애, 뇌전증 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 전반적 발달장애는 자폐범주성장애, 아스퍼거 증후군, 아동기 붕괴성 장애(Childhood Disintegrative Disorder), 레트 증후군(Rett Syndrome), 비정형 자폐범주성장애 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 밖에도 발달장애는 지각, 인지, 운동, 언어 등의 발달영역에서 발생하는 모든 장애를 포함할 수 있으며, 학습장애, 의사소통장애, 운동기능장애, 뇌성마비(Cerebral Palsy), 유전장애, 염색체장애(Down Syndrome; 다운 증후군, Fragile X Syndrome) 등 발달이나 기능에서 지체가 있는 모든 발달장애를 포함할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는, 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드, 염증질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 "예방" 이란 본 발명에 따른 펩타이드 투여에 의해 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 "치료"는 본 발명에 따른 펩타이드 투여에 의해 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에, 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 용어, "개선"이란, 본 발명의 펩타이드 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물에서 포함할 수 있는 필수 성분으로 본 발명에서 제공하는 펩타이드 외에 다른 성분에는 특별히 제한이 없으며 통상의 식품과 같이 여러가지 생약추출물, 식품 보조 첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 상기 식품 보조 첨가제는 당업계에 통상적인 식품 보조 첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외에 향미제로서 천연 향미제(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 이의 염, 알긴산 및 이의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 건강보조식품은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.
상기 건강 기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 인지기능 장애, 신경 염증의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
상기 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.
본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박 류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 "개체"는 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등의 모든 동물을 의미한다. 또한 본 발명의 개체에서 인간은 제외될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 질환을 치료하는 방법에 있어서 상기 펩타이드의 투여는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 일 예로 상기 펩타이드는 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법에 있어서 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 단독으로 투여하는 방법뿐만 아니라 병용 요법 또한 고려될 수 있다. 상기 병용 요법에 사용되는 다른 제제는 염증질환의 예방 또는 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있는 것이면 제한없이 포함 될 수 있으며, 염증질환의 예방 또는 치료에서 원하는 결과를 생산하는 데에 효과적인 양으로 제공될 수 있다. 일 예로 본 발명의 치료방법은 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 제1 치료제제와, 선택적으로, 제2 치료제제 또는 인자의 치료적 유효량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 이는 양쪽 치료제제를 모두 포함하는 단일 조성물 또는 약제학적 제형을 투여하거나, 하나의 조성물이 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하고 다른 것이 제2 치료제제를 포함하는 2개의 별개 조성물 또는 제형을 동시 혹은 순차적으로 투여함으로써 달성될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의해 유효성분이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 일 예로 상기 약학 조성물은 위에서부터의 분해로 보호되도록 장용 코팅(enteric coating)된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 본 발명의 펩타이드 투여에 의해 염증성 사이토카인 발현 억제, 항염 사이토카인 발현의 증가 및 염증에 조직 손상이 억제되는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 펩타이드를 염증질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 동물 의약품 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 염증질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 동물은 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등의 모든 동물을 의미하며, 일 구현예로 인간을 제외한 동물 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물을 동물의약품 조성물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 사용하거나 다른 의약품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.
본 발명에서 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 상기 의약외품 조성물은 바디 클렌저, 폼, 비누, 마스크, 연고제, 크림, 로션, 에센스 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로션 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 본 발명의 펩타이드 함량은 염증질환의 예방 또는 개선이라는 효과를 달성하기에 유효한 양으로 포함될 수 있다. 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 구체적으로는 약 0.01~10중량%의 함량으로 함유될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물의 제형은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 또는 스프레이일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 무기염류, 색소, 산화방지제, 살균제, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명에서 제공하는 펩타이드는 재생(regeneration) 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 하나의 양태는 전술한 본 발명의 펩타이드의 조직 재생 용도를 제공한다.
일 구현예로, 상기 조직은 피부, 근육, 모발, 모낭 및 모근 중에서 선택되는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 조직 재생은 피부 재생, 근육조직 재생, 상처 치유, 근력 증진, 탈모 방지, 양모 촉진, 발모 촉진, 손상 모발 개선 및 모발 재생 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "재생" 이란 세포, 조직, 기관의 기능 저하를 억제하거나 저하된 기능을 회복하는 것을 의미한다. 세포, 조직, 기관의 기능 저하는 세포, 조직, 기관의 손상으로 인한 것일 수 있다. 이러한 손상은 방사선치료, 약물치료, 수술, 감염, 염증, 퇴행성 질환, 자가면역질환, 노화 등 다양한 요인에 의해 발생할 수 있다. 한편 상기 "재생"은 세포 분화 촉진에 의해 달성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 노화 및/또는 이를 원인으로 하는 노인성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
일 구현예로 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 근육 조직 재생능을 갖는 것일 수 있다.
상기 근육 조직의 재생은 근원세포 분화에 의해 달성될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "근원세포"는 분화되지 않은 상태에 있는 근육세포로, 근원세포가 골격근세포로 분화되면 근육조직이 형성되므로 근원세포의 분화는 근발생(myogenesis)이라고도 칭한다. 이러한 근원세포의 분화에 관여하는 인자는 Mef2, SRF(Serum response factor), MyoD, Myf5, Myf6, 마이오제닌(myogenin) 및 미오신헤비체인(myosin heavy chain) 등이 있으며, 이들 인자의 발현수준을 측정하여 근원세포 분화 여부를 판단할 수 있다.
다른 예로, 상기 근육 조직의 재생은 근원세포 위축 억제에 의해 달성될 수 있다. 일 예로 근위축 관여 인자인 atrogin1 및 MuRF1의 발현 수준을 측정하여 근원세포의 위축 억제 여부를 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 포함하는 조직 재생용 조성물을 제공한다.
상기 조직 재생용 조성물은 조직 손상 관련 질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 하나의 양태는 전술한 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조직 손상 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 약학적 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 구현예로 본 발명의 조직은 근육조직일 수 있으며, 조직 손상 관련 질환은 근육 관련 질환일 수 있다.
일 예로, 상기 근육 관련 질환은 근디스트로피 (muscular dystrophy), 근위축증(muscular atropy), 근감소증 (muscular sarcopenia), 근육염 (Myositis), 다발성 근육염 (polymyositis), 말초혈관 질환 (peripheral vascular disease) 및 섬유증 (fibrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로 본 발명에서의 조직은 모발, 모낭, 모근에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 조직 재생용 조성물은 탈모 방지, 양모 촉진, 발모 촉진, 손상 모발 개선, 모발 재생 등의 효과를 나타내는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 재생용 조성물은 탈모 예방, 치료 또는 개선용 조성물로 사용될 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명에서의 조직 재생은 상처 치유 일 수 있다. 상기 상처 치유는 세포의 손상으로 인한 상처를 치료하는 것을 의미하며, 상기 상처는 생체가 손상된 것을 모두 아우르는 의미로서, 창상(創傷)이라고도 한다. 상기 상처 치유는 본 발명의 조성물을 상처가 난 개체에 투여하여, 상처가 악화되는 것을 억제 또는 지연시키거나, 상처의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 재생용 조성물은 상처 또는 창상의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있다.
상기 상처는 예를 들어 피부 조직에 발생한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 피부 노화 억제 및/또는 개선 효과를 나타낼 수 있다. 피부 노화의 억제 및/또는 개선은 "피부 재생" 으로도 지칭할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 재생용 조성물은 피부 재생용 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 "피부 노화"는 피부에 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있다. 상기 피부 노화는 세월의 흐름에 따라 자연적으로 나타나는 내인성 노화 및 자외선으로 인해 피부에 생기는 광노화를 모두 포함한다. 본 발명의 피부 노화에 의해 피부 세포에서는 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan) 피브로넥틴 및/또는 그 전구체의 합성량 감소, 상기 성분의 분해효소의 발현 증가 또는 상기 성분의 합성효소의 발현 감소 등의 현상이 나타날 수 있다.
본 발명의 "피부노화 억제"는, "피부 재생"으로도 지칭할 수 있으며, 피부 세포의 콜라겐 또는 그 전구체의 합성량 증가를 포함할 수 있다. 상기 피부 세포는 피부 각질 세포 및 피부 섬유아세포를 포함한다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 피부노화의 억제는 콜라겐 합성효소 활성의 증가 및/또는 콜라겐 분해효소 활성의 억제를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 콜라겐 합성효소는 Col1a1 및/또는 Col3a1 일 수 있다. 일 예로, 상기 콜라겐 분해효소는 MMP-1 및/또는 MMP-3 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 피부노화의 억제는 피부 보습 증가, 피부 탄력 증진, 피부 두께 증가, 피부 주름 개선, 피부 자극 완화, 피부 손상 회복 및/또는 피부 색조 개선을 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 조직 재생 및 건강기능식품에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조직 재생용 동물 의약품 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 조직 재생, 사료 및 동물 의약품에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조직 손상 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조직 재생 방법을 제공한다.
본 발명의 치료방법에 있어서 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 단독으로 투여하는 방법뿐만 아니라 병용 요법 또한 고려될 수 있다. 상기 병용 요법에 사용되는 다른 제제는 조직 재생 효과가 있는 것으로 알려져 있는 것이면 제한없이 포함 될 수 있으며, 조직 재생에서 원하는 결과를 생산하는 데에 효과적인 양으로 제공될 수 있다.
상기 펩타이드, 개체, 투여, 조직 손상 관련 질환 및 예방 또는 치료방법에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 구체예에서는 본 발명의 펩타이드 투여에 의해 세포 분화 촉진에 따른 조직 재생 및 분화 관련 유전자의 발현증가를 확인하였고, 이에 따라 근조직, 피부조직 및 모발, 모근 조직이 재생되는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 펩타이드를 조직 관련 질환 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 조직 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드, 조직 재생, 의약외품 조성물 및 화장료 조성물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 펩타이드는 항염 및 조직 재생 효과를 가지는 바, 염증질환의 예방, 개선 및 치료 및/또는 조직 재생 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 무릎 관절 두께 (A, B) 및 체중 부하 측정 결과 (C, D) 비교 분석 결과이다 (***p<0.001 PEP006 vs. vehicle군, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 PEP007 vs. vehicle군, $$p<0.01, $$$p<0.001 PEP008 vs. vehicle군, ∫p<0.05, ∫∫p<0.01, ∫∫∫p<0.001 PEP009 vs. vehicle군, †p<0.05, ††p<0.01, †††p<0.001 PEP010 vs. vehicle군 (Student's t-test)).
도 2는 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및PEP013 투여에 의한 체중 부하 측정 비교 분석 결과이다. (###p<0.001 PEP0011 vs. vehicle군, $$p<0.01, $$$p<0.001 PEP0012 vs. vehicle (Student's t-test))
도 3 및 도 4는 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006(도 3), PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 (도 4)투여에 의한 Safranin O 염색을 통한 무릎 관절 연골 손상 변화 비교 결과이다. (*p<0.05 vs. vehicle군)
도 5는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006 투여에 의한 일자별 관절염 지수 변화 (A) 발목 관절 두께 (B) 및 부종의 변화 (C) 비교 분석 결과이다. (*p<0.05 PEP006 vs. vehicle군 (Student's t-test))
도 6은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 일자별 관절염 지수 변화 (A) 발목 관절 두께 (B) 및 부종의 변화 (C) 비교 분석 결과이다. ##p<0.01 PEP007 vs. vehicle군, $p<0.05, $$p<0.01 PEP008 vs. vehicle군, ∫p<0.05, ∫∫p<0.01 PEP009 vs. vehicle군, ††p<0.01 PEP010 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 7은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 실험기간 종료 후 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 H&E 염색결과 (A) 및 조직병리학적 관절염 지수 (B) 변화 비교 결과이다. **p<0.01 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 8은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및PEP013 투여에 의한 일자별 관절염 지수 변화 (A) 발목 관절 두께 (B) 및 부종의 변화 (C) 비교 분석 결과이다. #p<0.05, ##p<0.01 PEP011 vs. vehicle군, $p<0.05, $$p<0.01 PEP012 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 9는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에서 실험기간 종료 후 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 H&E 염색결과 (A) 및 조직병리학적 관절염 지수 (B) 변화 비교 결과이다. **p<0.01 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 10은 노화 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006 투여에 의한 피부 표피 두께 및 모낭수 분석 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test)
도 11은 노화 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 피부 표피 두께 및 모낭수 분석 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test)
도 12는 노화 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 피부 표피 두께 및 모낭수 분석 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test)
도 13은 TPA 유도 피부염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006 투여에 의한 마우스 귀 홍반 및 부종의 변화 촬영한 사진 (A) 귀 두께 (B) 및 일정면적당 무게 변화 (C) 비교 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 14는 TPA 유도 피부염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 마우스 귀 홍반 및 부종의 변화 촬영한 사진 (A) 귀 두께 (B) 및 일정면적당 무게 변화 (C) 비교 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 15는 TPA 유도 피부염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 마우스 귀 홍반 및 부종의 변화 촬영한 사진 (A) 귀 두께 (B) 및 일정면적당 무게 변화 (C) 비교 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 16 내지 18은 TPA 유도 피부염 동물모델에서 PEP006 (도 16), PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 (도 17), PEP011, PEP012 및 PEP013 (도 18) 투여에 의한 조직병리학적 마우스 귀 조직의 H&E 염색 결과이다.
도 19는 HCl/ethanol 유도 위염/위궤양 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 위 점막 손상 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 20은 HCl/ethanol 유도 위염/위궤양 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 위 점막 손상 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 21은 고지방 식이 유도 당뇨/대사질환 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 인슐린 저항성 개선 분석 결과이다. #p<0.05 PEP007, $p<0.05 PEP008, †p<0.05 PEP010 vs. vehicle군; *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 22는 고지방 식이 유도 당뇨/대사질환 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 인슐린 저항성 개선 분석 결과이다.
도 23 및 도 24는 고지방 식이 유도 당뇨/대사질환 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009, PEP010 (도 23) 및 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 (도 24) 투여에 의한 이상지질혈증 개선 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 25는 자연노화 동물모델에 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010과 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 새로운 사물에 대한 인지테스트 (novel object recognition test; NORT, A)와 Y-미로 테스트 (Y-maze alteration test, B)에서의 인지 기능 및 기억력 개선 효과 분석 결과이다. A, 새로운 물체 탐지 횟수; B, 변경행동력 (spontaneous alteration, %). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student's t-test).
도 26 및 도 27은 노인성 근감소증 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 (도 26), PEP011, PEP012 및 PEP013 (도 27) 투여에 의한 악력 개선 분석 결과. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 28 및 도 29는 노인성 근감소증 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 (도 28), 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 (도 29) 투여에 의한 근육량 개선 분석 결과이다. (Student's t-test).
도 30은 ConA 유도 급성 간염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 간손상 변화 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 31은 고지방 식이 유도 비알코올성 간질환 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 의한 간손상 개선 분석 결과이다.
도 32는 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 동물모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여에 따른 간내 염증 관련 유전자 발현 변화 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 33은 고지방 식이 유도 비알코올성 간질환 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 간손상 개선 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 34는 고지방 식이 유도 비알코올성 지방간염 동물모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 따른 간내 염증 관련 유전자 발현 변화 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 35는 발달 장애 동물모델인 BTBR 마우스에 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010과 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013의 투여 후, 두 마리의 마우스 간의 사회적 상호작용 및 사회적 호기심의 정도를 확인하기 위한 상호작용 행동 (sniffing behavior)의 시간 분석 결과이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (Student's t-test).
도 36 및 도 37은 LPS 유도 우울증 모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006(도 36) 및 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 (도 37) 투여에 의한 TST 및 FST 부동자세 시간 분석 결과이다.
도 38은 LPS 유도 우울증 모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의한 TST 및 FST 부동자세 시간 분석 결과이다. *P<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 39는 전층 피부결손 창상 유발 동물 모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006 도포에 따른 일자별 창상 치유 효과를 비교하여 나타낸 사진과 그래프이다 *p<0.05, **p<0.01 PEP006 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 40은 전층 피부결손 창상 유발 동물 모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 도포에 따른 일자별 창상 치유 효과를 비교 분석한 결과이다. #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 PEP007 vs. vehicle군, $$p<0.01, $$$p<0.001 PEP008 vs. vehicle군, ∫∫p<0.01, ∫∫∫p<0.001 PEP009 vs. vehicle군, †p<0.05, ††p<0.01, †††p<0.001 PEP010 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 41은 전층 피부결손 창상 유발 동물 모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 도포에 따른 일자별 창상 치유 효과를 비교하여 나타낸 사진과 그래프이다. #p<0.05, ###p<0.001 PEP011 vs. vehicle군, ∫p<0.05 PEP013 vs. vehicle군(Student's t-test).
도 42는 소장 오가노이드 모델에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 처리에 의한 오가노이드의 발아 정도 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 43은 소장 오가노이드 모델에서 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 처리에 의한 오가노이드의 발아 정도 분석 결과이다. *p<0.05 vs. vehicle군 (Student's t-test).
도 44는 신규 펩타이드의 발모 촉진 효과를 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 한편 본원발명의 실시예에서, PEP006은 서열번호 1(AGAY), PEP007은 서열번호 2(RGAY), PEP008은 서열번호 3(IGAY), PEP009는 서열번호 4(SGAY), PEP010은 서열번호 5(VGAY), PEP011은 서열번호 6(AQS), PEP012는 서열번호 7(AGS), PEP013은 서열번호 8(AIS)를 지칭한다.
실시예 1. 퇴행성 관절염 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 1-1: 실험 방법
MIA 유도 퇴행성 관절염 모델은 9주령의 특정 병원체 부재 (specific pathogen free, SPF) 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 마취하고 오른쪽 무릎관절 주변을 깨끗이 제모한 후, MIA 용액 (Monosodium iodoacetate 0.5 mg in 10μl 0.9% sterile saline)을 10μl씩 무릎관절 강 내에 주입하여 관절염을 유도하였다.
MIA 용액 주입 3일 전부터 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 6.7 μM 농도로 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 복강으로 주사하였다. 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 후 3일째 (0 day)에 MIA 주입 1시간 전 추가 1회 복강 주사 하였으며, MIA 주입 후 1일 1회 동일 시간에 약물을 복강 주사하고, MIA 주입 30일째 실험을 종료하였다. 대조군에는 PBS 완충액 동일량을 복강으로 주사하였다.
MIA 주입 후 2일 간격으로 7일 동안 (0, 1, 3, 5, 7 days) 캘리퍼스를 이용하여 무릎관절의 직경을 측정하여 관절의 염증성 변화로 일어나는 부종을 평가하였다.
MIA 주입 후 2주에 인카파시턴스 시험기 (incapacitance tester)를 사용하여 뒷다리 체중 부하 (weight bearing)를 측정함으로서 관절염의 유발 및 진행정도를 간접적으로 평가하였다. 이때 관절염이 심할수록 해당 다리의 체중 부하가 감소한다. 양쪽의 발의 체중 부하 무게 (g)를 각각 측정하고, 본 실험에서 그 값은 전체 뒷다리에 대한 관절염이 유발된 오른쪽 뒷다리 비율 (%)로 나타내었다.
Figure pat00001
실험 종료 후 시험동물을 희생시킨 후, 마우스의 무릎 관절 조직을 10% 중성완충 포르말린으로 고정하고 0.5 M EDTA 용액으로 뼈에서 석회질을 제거하는 과정을 진행하였다. 그 다음 관절 조직을 파라핀에 포매하여 5 μm의 관절 절편을 준비하고, 사프라닌 O (Safranin O) 염색을 진행하여 조직병리학적으로 연골 조직의 손상 정도를 분석하였다. 이 때 연골 조직의 손상 정도는 절편의 사프라닌 O 염색 정도를 확인하여 평가하였고, OARSI (Osteoarthritis Research Society International grade) 가이드 라인에 따라 점수화하였다. OARSI 가이드 라인에 따른 점수 기준은 다음과 같다 (표 2).
Figure pat00002
실시예 1-2: 실험 결과
분석 결과, MIA 유도 퇴행성 관절염 모델에서 MIA 주입 후 2일 간격으로 7일 동안 캘리퍼스를 이용한 무릎 관절의 직경 측정 시 MIA 주입 후 1일째에는 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP007과 PEP008을 투여한 군에서 유의하게 감소하였고 PEP009 및 PEP0010 투여군은 감소하는 경향을 보였다. MIA 주입 후 3일째에는 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여한 군은 무릎 관절의 두께가 유의하게 감소하였으며, 5일째에는 무릎 관절의 두께가 PEP008과 PEP010 투여에 의해 유의하게 감소하였고 PEP007과 PEP009 투여에 의해 감소하는 경향을 보였다. MIA 주입 후 7일째에는 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여한 군은 무릎 관절의 두께가 유의성 있게 감소하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 1).
MIA 주입 2주후 incapacitance tester를 이용한 체중 부하 측정 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008 및 PEP010을 투여한 군은 MIA 주입에 의한 체중 부하율의 감소가 유의하게 증가하였고 PEP009을 투여한 군에서 유의한 수준에 근접하게 증가하는 경향을 보였다. MIA 주입 4주후 incapacitance tester를 이용한 체중 부하 측정 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군은 MIA 주입에 의한 체중 부하율의 감소가 유의하게 증가하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 1C, D).
트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여에 의해서 MIA 주입 2주와 4주후 incapacitance tester를 이용한 체중 부하를 측정한 결과에서 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012을 투여한 군이 MIA 주입에 의한 체중 부하율의 감소가 유의하게 개선되었고 (p<0.05, Student's t-test), PEP013 투여군에서는 체중 부하율을 개선하는 경향을 볼 수 있었다 (도 2).
또한, 마우스 무릎 관절 조직에 대하여 사프라닌 O 염색을 통한 조직병리학적 소견을 확인한 결과에서, PBS 완충액 투여군은 사프라닌 O 염색 및 연골 두께의 뚜렷한 감소를 보인 반면에 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군은 연골 부위에 사프라닌 O의 약간의 소실만 보였으며 전체 연골 형태가 유지됨을 관찰할 수 있었다. 아울러 연골파괴 정도를 OARSI score에 의해 정량적으로 수치화하였을 때에는 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP009 및 PEP010을 투여한 군은 OARSI score가 유의하게 감소하였으며 (p<0.05, Student's t-test), PEP006, PEP007 및 PEP008 투여에 의해서는 유의한 수준에 근접한 수준으로 감소된 것으로 나타났다 (도 3, 4).
이를 통해 본 발명의 펩타이드가 관절염 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 2. 류마티스 관절염 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 2-1: 실험 방법
콜라겐 유도 류마티스 관절염 (collagen induced arthritis, CIA)모델은 소의 2형 콜라겐 (CII)을 2 mg/ml이 되도록 0.1 M 아세트산 용액에 녹인 후 식염수 완충액 (phosphate buffered saline)으로 투석하여 M. 투베르쿨로시스 (tuberculosis)를 함유하는 Complete Fred's Adjuvant (CFA, Chondrex)와 동량으로 혼합하여 에멀젼화 (emulsification)한 후, 에멀젼화된 콜라겐 용액을 8주령의 수컷 DBA/1J 마우스의 꼬리 기저부에 마리당 100 μl씩 (즉 100 μg/100 μl) 피내 주사하여 1차 면역을 유도하였다 (1차 면역). 1차 면역 후 21일째에 동일한 CII를 동량의 CFA와 섞은 후 100 μl씩 (즉 100 μg/100 μl) 마우스의 꼬리 기저부에 피내 주사하여 2차 면역 반응을 유도하였다 (2차 면역). 1차 면역 후 28일째에 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)를 마리당 40 μg씩 복강 주사하여 boosting 반응을 유도하였으며, 1차 면역 후 35일째에 실험을 종료하였다.
1차 면역 후 18일째부터 실험종료일까지 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 6.7 μM 농도로 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 복강으로 주사하였다. 대조군에는 PBS 완충액 동일량을 복강으로 주사하였다.
1차 면역 후 18일째부터 실험종료일까지 2일 간격으로 관절 염증의 위중도를 평가하였다. 이때 관절염 평가는 네 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합산하여 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수 기준은 다음과 같다 (표 3).
Figure pat00003
실험 종료일에 발목 관절의 두께를 캘리퍼스로 측정하고, 시험군별 사진을 촬영하였으며, 시험동물을 안락사시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 중성완충 포르말린으로 고정하고 0.5 M EDTA 용액으로 뼈에서 석회질을 제거하는 과정을 진행하였다. 그 다음 마우스 뒷발조직을 파라핀에 포매하여 5 μm의 관절 절편을 준비하고, 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 에오신 (Eosin)으로 (H&E) 염색하고, 조직병리학적으로 관절 염증의 위중도를 평가하였다. 이때 관절염 평가는 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 평균하여 사용하였다. 관절염 평가에 따른 점수 기준은 다음과 같다 (표 4).
Figure pat00004
실시예 2-2: 실험 결과
분석 결과, 신규 테트라펩타이드 PEP006을 투여한 군에서 관절 염증의 위중도는 PBS 완충액 투여군에 비해 관절염 지수가 CII 1차 주사 후 28일째 유의하게 감소하였고, 30일째부터 실험종료일까지 감소하는 경향을 보였다. 또한 실험 종료시점의 발목 관절의 두께를 측정한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP006 투여군에서 발목 관절의 두께가 유의하게 감소하였고, 육안사진 촬영 결과에서도 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP006을 투여한 군에서 뒷발의 부종이 완화됨을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 5).
신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 관절 염증의 위중도를 평가한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP007 투여군은 CII 1차 주사 후 28일째부터 실험 종료일까지 관절염 지수가 유의하게 감소하였고, PEP008 투여군은 CII 1차 주사 후 30일째부터 32일까지 관절염 지수가 유의하게 감소하였고, PEP009 및 PEP010 투여군은 CII 1차 주사 후 30일째부터 실험 종료일까지 관절염 지수가 유의하게 감소하였다. 또한 실험 종료시점의 발목 관절의 두께를 측정한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 발목 관절의 두께가 유의하게 감소하였고, 육안사진 촬영 결과에서도 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 뒷발의 부종이 현저히 개선됨을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 6).
또한, 마우스 뒷발 조직에서 H&E 염색을 통해 조직병리학적 소견을 확인한 결과, PBS 완충액 투여군은 중등도의 염증세포 침윤, 활막의 명확한 증식 및 관절강 내 pannus 형성이 관찰된 반면 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서는 PBS 완충액 투여군에서 관찰된 조직병리학적인 변화들이 뚜렷하게 감소되었으며, 조직병리학적인 관절염 지수 또한 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 유의하게 감소되었다 (p<0.05, Student's t-test) (도 7).
신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및PEP013을 투여한 군에서 관절 염증의 위중도를 평가한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP011 투여군은 CII 1차 주사 후 30일째부터 실험 종료일까지, PEP012 투여군은 CII 1차 주사 후 32일째부터 실험 종료일까지 관절염 지수가 유의하게 감소하였고 PEP013 투여군은 관절염 지수가 낮아지는 경향을 보였다. 또한 실험 종료시점의 발목 관절의 두께를 측정한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP011 및 PEP012 투여한 군에서 발목 관절의 두께가 유의하게 감소하였고 PEP013 투여에 의해 감소하는 경향을 보였다. 육안사진 촬영 결과에서도 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군에서 뒷발의 부종이 전체적으로 완화됨을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 8).
또한, 마우스 뒷발 조직에서 H&E 염색을 통해 조직병리학적 소견을 확인한 결과 PBS 완충액 투여군은 중등도의 염증세포 침윤, 활막의 명확한 증식 및 관절강 내 pannus 형성이 관찰된 반면 신규 트리펩타이드 PEP011을 투여한 군은 PBS 완충액 투여군에서 관찰된 조직병리학적인 변화들이 뚜렷이 감소하였으나 PEP012 및 PEP013 투여에 의해서는 PBS 완충액 투여군과 유사한 양상을 보였으며, 정량적인 조직병리학적인 관절염 지수 역시 PBS 완충액 투여군에 비해 PEP011을 투여한 군은 유의하게 감소하였고 PEP012 투여군에서는 저하되는 경향을 보였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 9).
이를 통해 본 발명의 펩타이드가 관절염 예방 및 치료 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 노화 동물모델에서 신규 펩타이드의 항피부노화 효능 검증
실시예 3-1: 실험 방법
노화 동물모델은 19~22개월령 C57BL/6J 자연 노화마우스를 이용하였으며 실험 당일까지 고형 사료와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 명/암 주기의 환경을 유지하며 실험에 사용하였다. 자연 노화마우스에게 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013를 10주간 농도가 0.2 ug/150 ul가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
투여 10주 째 되는 날 조직병리분석을 위하여 마우스의 등으로부터 조직의 일부분을 적출하여 10% 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정하였다.
고정된 피부 조직을 파라핀으로 포매하여 5 ㎛ 두께의 절편을 준비하고, 피부 표피 두께 및 모낭수를 분석하기 위하여 피부 절편을 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신 (Eosin)으로 H&E 염색하였다.
실시예 3-2: 실험 결과
분석결과, 노화 동물모델에서 나이가 증가함에 따라 감소하는 피부 표피의 두께를 수치화 하였을 때, 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011 및 PEP012 투여군이 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 증가되었고, PEP013 투여에 의해 유의한 수준에 근접하게 두꺼워졌다 (p<0.05, Student's t-test) (도 10, 11, 12).
또한, 노화 동물모델에서 나이가 증가함에 따라 모낭의 위축과 섬유화가 심해져서 전체적으로 모낭의 수가 줄어들게 되는데, 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP012 및 PEP013 투여군이 PBS 완충액 투여군에 비해 증가하는 경향을 보였다 (도 10, 11, 12).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 피부 조직 재생능을 가지고 피부 노화를 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 피부염 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 4-1 : 실험 방법
신규 펩타이드의 피부염 예방 및 치료 효능을 확인하기 위하여, TPA (12-otetrade-canoyl-phorbol-13-acetate)로 유도되는 피부염 모델을 이용하여 실험을 수행하였다. TPA 유도 피부염 모델은 시료 적용 하루 전 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스의 양쪽 귀를 제모 한 후 마우스의 오른쪽 귀에 25 μl 아세톤에 용해된 TPA 2.5 μg를 도포하여 피부 부종 및 염증을 유도하였고, 왼쪽 귀는 TPA 용매인 아세톤 25 μl을 도포하여 음성 대조군으로 이용하였다.
TPA 도포 3일 전부터 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 6.7 μM 농도로 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 복강으로 주사하였다. 투여 3일째 (0 day)에 TPA 도포 30분 전 1회 복강 주사 하였으며, TPA 주입 후 3시간째에 약물을 추가 1회 복강 주사하였다. 대조군에는 PBS 완충액 동일량을 복강으로 주사하였고 TPA 도포 26시간 후 실험을 종료하였다.
TPA 도포 26시간 후 귀의 부종 및 염증 완화 정도를 확인하고자 귀의 두께를 측정하고, 시험군 별 양쪽 귀를 사진 촬영하였다. 실험동물을 치사시킨 후 귀의 일정 면적당 무게를 측정 하였고, 마우스의 귀를 10% 중성완충 포르말린에 24시간 이상 상온에서 고정한 후 파라핀으로 포매하여 5 μm 두께의 절편을 준비하고 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 에오신 (Eosin)으로 (H&E) 염색하였다. H&E 염색된 조직 절편을 광학현미경으로 귀의 부종 및 염증세포 침윤 정도를 확인하였다.
실시예 4-2: 실험 결과
TPA 유도 피부염 모델에서 TPA 도포 26시간 후 귀 육안사진 촬영, 귀 두께 및 무게 측정 결과, PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군에서 귀의 홍반 및 부종이 전체적으로 감소됨을 확인하였고, 귀 두께 및 무게 또한 감소하는 경향을 보였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 13, 14, 15).
또한, 마우스 귀 조직에서 H&E 염색을 통해 조직병리학적 소견을 확인한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군은 TPA 도포에 의한 귀 조직의 부종 및 염증 세포의 침윤이 뚜렷하게 감소하였다 (도 16, 17, 18).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 피부염 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 5. 위염/위궤양 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 5-1: 실험 방법
급성 위염/위궤양 동물모델은 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 유도 3일 전부터 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013의 농도가 0.15 μg/150 μl (PEP006) 또는 0.2 μg/150 μl (PEP007, PEP008, PEP009, PEP010, PEP011, PEP012 및 PEP013)가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
위염/위궤양 유발을 위해 0.3 M HCl/60% ethanol을 각 0.2 ml씩 경구로 투여하고 1시간 후 조직을 적출하여 위장 내면의 사진을 찍고 위의 손상 정도를 비교하였다.
위염/위궤양 지표의 측정은 점막 손상 정도에 따라 점수를 매겨 환산하였다. 손상이 없을 경우는 0점, 5 mm 미만 정도의 미미한 원모양의 출혈 부식 한 부위에는 1점, 5 mm 보다 큰 길이의 출혈 부식 한 부위에는 2점, 2점에 해당하는 출혈 부식 부위가 하나 이상일 때는 3점, 5 mm 이상의 길이 및 2 mm 이하 넓이의 출혈 부식에는 4점, 4점에 해당하는 출혈 부식이 2-3개인 경우 5점, 4-5개인 경우는 6점, 6개 이상인 경우에는 7점 그리고 위 점막 전체적으로 출혈 부식이 있는 경우 8점을 부여하였다.
실시예 5-2: 실험 결과
분석 결과, HCl/ethanol을 이용한 위염/위궤양 모델에서 위 점막 손상 정도를 점수화하였을 때, 신규 테트라펩타이드 PEP006 및 PEP010을 투여한 군의 위 점막 손상 정도가 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 저하되었고, PEP007, PEP008 및 PEP009 투여군의 위 점막 손상 정도가 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 유의한 수준으로 감소하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 19).
또한, 위염/위궤양 모델에서 위 점막 손상 정도를 점수화하였을 때, 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군의 위 점막 손상 정도가 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 유의하게 개선되었다 (p<0.05, Student's t-test) (도 20).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 위염 및 위궤양의 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 6. 대사질환 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 6-1: 당뇨 및 만성 염증이 동반되는 대사 질환 동물모델에서의 효과 검증
당뇨 및 만성 염증이 동반되는 대사질환 동물모델은 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 고지방 식이를 32주, 50주 또는 53주간 자유 급이함으로써 유도하였다. 32주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이를 급이함과 함께 신규 테트라펩타이드 PEP006을, 그리고 50주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을, 또는 53주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 농도가 0.15 μg/150 μl (PEP006) 또는 0.2 μg/150 μl (PEP007-PEP013)가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 동일 시간에 시험 종료 시까지 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
모든 동물에 대하여 투여 개시시 투여 직전 일반증상을 관찰하였으며, 시험물질 투여 개시 후 3주차에 4시간 절식시킨 마우스에 인슐린 (휴마로그, 1 unit/kg)을 복강주사 후 30분, 60분, 90분 및 120분의 혈당을 꼬리 끝부분의 상처를 통해 확보한 소량의 혈액에서 ACCU-CHECK (Roche)을 이용하여 측정함으로써 인슐린 부하 실험 (insulin tolerance test, ITT)을 실시하였다.
분석 결과, 인슐린 저항성 실험에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군의 혈당이 인슐린 투여 30분부터 120분까지 PBS 완충액 투여군에 비해 유의한 수준으로 감소하였으며, 인슐린 저항성 실험의 그래프를 AUC (area under the curve)로 환산한 결과 AUC 수치가 PBS 완충액 투여군 대비 PEP008 투여군에서 유의하게 저하되었고 PEP006, PEP007, PEP009 및 PEP010 투여군에서 유의한 수준에 근접하게 감소되는 등 고지방 식이에 의한 인슐린 저항성 개선에 효능을 확인할 수 있었다 (p<0.05, Student's t-test) (도 21).
또한, 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군의 혈당이 인슐린 저항성 실험에서 인슐린 투여 30분부터 120분까지 PBS 완충액 투여군에 비해 유의한 수준에 근접하게 저하 되었으며, 인슐린 저항성 실험의 그래프를 AUC로 환산한 결과 AUC 수치가 PBS 완충액 투여군 대비 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군에서 유의한 수준에 근접하게 감소되는 등 고지방 식이에 의한 인슐린 저항성 개선에 효능을 확인할 수 있었다 (도 22).
실시예 6-2: 이상지질혈증 동물 모델에서의 효과 검증
이상지질혈증 동물모델은 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 고지방 식이를 32주, 50주 또는 53주간 자유 급이함으로써 유도하였다. 32주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이를 급이함과 함께 신규 테트라펩타이드 PEP006을, 그리고 50주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을, 또는 53주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 농도가 0.15 μg/150 μl (PEP006) 또는 0.2 μg/150 μl (PEP007-PEP013)가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 동일 시간에 시험 종료 시까지 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
시험 종료시 16시간 절식시킨 마우스의 안와정맥총에서 heparin 처리된 capillary tube를 이용하여 채혈하였다. 채취한 혈액은 즉시 10,000 rpm (4℃)에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 자동혈액생화학분석기를 통해 혈액 이상지질 지표인 total cholesterol (TC), low density lipoprotein-cholesterol (LDL-C) 및 high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)을 분석하였다.
이상지질혈증 관련된 혈중 지질 지표들을 분석한 결과, TC 농도는 신규 테트라펩타이드 PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 감소하는 경향을 보였고, LDL-C 농도가 PEP008 및 PEP009 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 저하되었다 (도 23).
또한 신규 트리펩타이드 PEP012를 투여한 군에서 혈중 TC 농도는 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 저하되었고 PEP011 및 PEP013 투여에 의해 감소하는 경향을 보였으며, LDL-C 농도가 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 저하되는 등 PEP011, PEP012 및 PEP013에 의한 이상지질혈증 개선 효능을 관찰할 수 있었다 (p<0.05, Student's t-test) (도 24).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 대사 질환의 예방 및 치료 효과를 가지는 것을 확인하였다.
실시예 7. 인지/기억력 장애 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 7-1: 실험 방법
자연노화에 따른 인지 및 기억력 장애에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013의 투여 효능을 확인하기 위해, 19개월령 암컷 C57BL6/J 마우스에 각 펩타이드를 매일 0.2 ㎍을 주 5일 동안 경구 투여하여 8주간 투여하였다. 이때 펩타이드는 PBS 완충액에 녹였으며 마리당 0.2 ㎍/150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 경구로 투여하였다. Vehicle 군에는 PBS 완충액을 동일한 양으로 경구 투여하였다. 이때, 4개월령의 암컷 C57BL6/J 마우스를 젊은 대조군으로 사용하였다.
신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013이 투여된 자연 노화 마우스에서 인지기능 개선 효과를 테스트하기 위해 새로운 물체 인지 및 기억력 테스트 (novel object recognition test, NORT)와 공간지각능력 및 기억력 증진 효과를 확인하기 위해 Y-미로 테스트 (Y-maze alteration test)를 수행하였다. NORT는 24시간 전에 본 물체와 새로운 물체를 제공하였을 때 새로운 물체에 대한 탐색 시간 및 탐색 횟수를 측정하여 인지 및 기억력을 테스트하였다. 그리고 Y-미로 테스트는 Y 자형의 각 미로 (A, B 및 C)에 들어가는 순서를 측정하여 변경행동력 (spontaneous alteration, %)을 평가하였다. 세 곳의 다른 영역에 순차적으로 들어간 경우 1점 (실제변경: actual alteration, ABC, BCA, CAB 등의 순서)으로 인정하였고, 연속되게 들어가지 않은 경우는 점수로 인정하지 않았다. 상기 변경 행동력은 총 변경행동 수/(총 입장 회수 - 2) Х 100으로 산출하여 나타내었다.
실시예 7-2: 실험 결과
NORT 분석 결과, 젊은 마우스가 새로운 물체에 대한 인지 및 기억력이 현저히 차이가 나는 것에 반해 PBS 완충액을 투여한 자연 노화 마우스는 새로운 물체에 대한 인지 및 기억력이 현저히 감소하여 새로운 물체 (Novel object)와 익숙한 물체 (Familiar object)를 잘 구분하지 못하는 것을 확인하였으나, 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP009 및 PEP010 투여 시 인지 및 기억력이 유의미하게 개선되었고, PEP008 투여군에서는 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 새로운 물체를 잘 구분하는 경향을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 25A).
이때, 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군은 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 새로운 물체를 잘 구분하는 경향을 나타냄을 관찰화였다 (도 25A).
Y-미로 테스트 분석 결과, PBS 완충액을 투여한 자연 노화 마우스에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP008 및 PEP010의 투여는 행동 변경력을 유의미하게 개선함을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 25B).
실시예 8. 노인성 근감소증 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 8-1: 실험 방법
노인성 근감소증 동물모델은 76-78주령의 자연 노화 암컷 C57BL/6J 마우스를 이용하였다. 자연 노화 마우스에 추가 12주간 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 또는 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 농도가 0.2 μg/150 μl가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 동일 시간에 시험 종료 시까지 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
모든 동물에 대하여 투여 개시시 투여 직전 일반증상을 관찰하였으며, 근력 노화도 분석을 위해 투여 11주차에 악력 (grip strength) 측정을 수행하였다. 악력 측정은 마우스가 grip strength meter의 근력 probe에 연결된 철망을 네 발로 붙잡도록 한 후, 꼬리를 뒤쪽 방향으로 천천히 잡아당겨 철망을 잡고 버티는 순간의 최대 악력을 측정하였다.
시험 종료시 마우스 양쪽 뒷다리의 tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GC) 및 soleus 근육을 분리하여 무게를 측정하였다.
실시예 8-2: 실험 결과
분석 결과, 악력은 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 증가하였고, PEP007 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 유의한 수준으로 높아짐을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 26).
신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 투여한 군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 악력이 유의하게 증가함을 확인하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 27).
신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여가 근육량에 미치는 영향을 분석하기 위해 근육 무게를 분석한 결과, TA 및 GC 근육의 경우 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 높아지는 경향을 보였다 (도 28A와 B).
또한, soleus 근육의 경우 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 PEP007 투여군에서 유의한 수준으로 증가하였고, PEP006, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 높아지는 경향을 나타냈다 (도 28C).
추가적으로, 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여가 근육량에 미치는 영향을 분석하기 위해 근육 무게를 분석한 결과, TA, GC 및 soleus 근육이 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 군에 비해 높아지는 경향을 보였다 (도 29).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 근감소증의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 9. 간염 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 9-1-1: 실험 방법
ConA 유도 급성 간염 모델은 8주령의 특정 병원체 부재 (specific pathogen free, SPF) 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 ConA를 1.5 mg/ml이 되도록 PBS 완충액 (phosphate buffered saline)에 녹인 후 100 μl/10 g 기준으로 마우스 체중에 대비하여 꼬리 정맥을 통해 주사함으로써 유도하였다. 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010는 ConA 투여 3일 전부터 0.2 μg/150 μl가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 복강으로 주사하였고, ConA 주사 30분 전에 추가 1회 복강주사 하였으며, ConA 정맥주사 9시간 후에 실험을 종료하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일 방법으로 정맥주사 하였다.
ConA 정맥주사 9시간 후 실험종료 시점에 안와정맥총에서 heparin 처리된 capillary tube를 이용하여 채혈 하고, 채취한 혈액은 즉시 10,000 rpm (4℃) 에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후, 자동혈액생화학분석기 (Beckman Coulter AU480 automatic analyzer, Beckman Coulter)를 통해 간손상 지표인 alanine aminotransferase (ALT) 및 aspartate aminotransferase (AST)를 분석하였고, 간을 적출하여 그 일부를 10% NBF에 24시간 이상 상온에서 고정한 후 파라핀으로 포매하여 5 μm 두께의 절편을 준비하고 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 에오신 (Eosin)으로 (H&E) 염색하였다.
실시예 9-1-2: 실험 결과
분석결과, ConA 유도 급성 간염 모델에서 간손상 지표인 ALT와 AST 중 ALT는 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP007과 PEP010을 투여한 군에서 유의성 있게 감소하였고 PEP008과 PEP009 투여군에서 감소하는 경향을 보였으며, AST는 PEP010을 투여한 군에서 유의한 수준에 근접하게 저하되었고 PEP007과 PEP009 투여에 의해 감소하는 경향을 보였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 30).
또한, 간조직에서 H&E 염색을 통해 조직병리학적 소견을 확인한 결과 PBS 완충액 투여군에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 ConA 유도 급성 간염 발생에 따른 간내 염증세포 침윤 및 간 실질의 괴사소가 뚜렷하게 감소하였다 (도 30).
실시예 9-2. 고지방 식이 유도 비알코올성 간염 (nonalcoholic steatohepatitis) 동물모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 9-2-1: 실험 방법
비알코올성 간질환 동물모델은 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이용하여 고지방 식이를 32주, 50주 또는 53주간 자유 급이함으로써 유도하였다. 50주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을, 또는 53주간 고지방 식이를 급이한 마우스에 추가 3주간 고지방 식이 급이와 함께 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 농도가 0.2 μg/150 μl가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 동일 시간에 시험 종료 시까지 마우스 경구로 투여하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다.
모든 동물에 대하여 투여 개시시 투여 직전 일반증상을 관찰하였으며, 시험 종료시 16시간 절식시킨 마우스의 안와정맥총에서 heparin 처리된 capillary tube를 이용하여 채혈하였다. 채취한 혈액은 즉시 10,000 rpm (4℃)에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후 자동혈액생화학분석기를 통해 혈액 간손상 지표인 ALT 및 AST를 분석하였다.
실험 종료시 적출한 간의 일부를 Trizol을 넣고 균질화하여 RNA를 추출하였다. 확보한 RNA에 역전사효소 (reverse transcriptase)를 첨가하고 반응시켜 cDNA를 합성하고 SYBR Green과 프라이머를 첨가하여 정량적 실시간 PCR (RT-qPCR)을 진행한 뒤 Tnfα, Il-1β, Il-6 및 Ifnγ 등의 유전자 발현 정도를 정량화하였다.
실시예 9-2-2: 실험 결과
분석 결과, 혈중 간손상 지표인 ALT 및 AST 농도는 신규 테트라펩타이드 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 투여한 군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 감소하는 경향을 나타냄을 확인하였다 (도 31).
고지방 식이 유도 비알코올성 간염 모델의 간조직에서 유전자 발현을 확인한 결과 고지방 식이 유도 비알코올성 간염시 증가하는 염증성 지표들 중 Tnfα는 신규 테트라펩타이드 PEP007과 PEP008 투여군에서 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 감소하였고 PEP006, PEP009 및 PEP010 투여군에서 저하되는 경향을 보였으며, Il-1β 는 PEP008, PEP009 및 PEP010 투여군에서 유의하게 감소하였고, PEP007 투여군에서 낮아지는 경향을 보였으며, Il-6는 PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 투여군에서 저하되는 경향을 보였고, Ifnγ는 PEP008 투여군에서 유의한 수준에 근접하게 감소하였으며 PEP007, PEP009 및 PEP010 투여군에서 저하되는 경향을 보였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 32).
신규 트리펩타이드 PEP012를 투여한 군에서 혈중 간손상 지표인 ALT 및 AST 농도는 PBS 완충액 투여군에 비해 유의하게 저하되었고 PEP011 및 PEP013 투여에 의해 감소하는 경향을 관찰할 수 있었다 (p<0.05, Student's t-test) (도 33).
고지방 식이 유도 비알코올성 간염 모델의 간조직에서 유전자 발현을 확인한 결과 고지방 식이 유도 비알코올성 간염시 증가하는 염증성 지표들 중 Il-1β 는 PEP013 투여군에서 유의하게 감소하였고, PEP011과 PEP012 투여군에서 낮아지는 경향을 보였으며, Ifnγ는 PEP011과 PEP013 투여군에서 낮아지는 경향을 보였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 34).
이를 통해 본 발명의 펩타이드가 간염의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 10. 발달 장애 동물모델 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 10-1: 실험 방법
발달 장애 (자폐증)에 대한 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011 및 PEP013의 효능을 검증하기 위하여, 실험동물로서 발달 장애 모델인 BTBR T+Itpr3tf/J (BTBR) 마우스를 사용하였다. 3주령의 수컷 BTBR 마우스에 대해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011 및 PEP013을 0.2 μg/150 μl가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 동일 시간에 주 5일 동안 경구 투여하였으며, 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 경구 투여 하였다. 투여 4주 후 마우스의 사회성 행동을 관찰하여 행동학적 평가를 수행하였다. 이때, 정상군으로 같은 주령의 수컷 C57BL6/J 마우스 (B6 control)를 사용하였다.
발달장애 마우스의 사회성 행동을 분석하기 위해 다른 마우스와의 상호작용 행동 (sniffing behavior)을 3분 동안 관찰하여 sniffing 하는 시간을 측정하였다.
실시예 10-2: 실험 결과
분석 결과, BTBR 마우스에 PBS 완충액을 투여한 그룹에 비해 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP009 및 PEP010을 경구 투여한 마우스의 사회성 행동이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였으며, PEP007 및 PEP008 투여군에서는 높아지는 경향을 관찰하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 35).
또한, 신규 트리펩타이드 PEP013 투여군에서 PBS 완충액을 투여한 그룹에 비해 사회성 행동이 유의미하게 높아졌으며, PEP011과 PEP012 투여에 의해 마우스의 사회성 행동이 증가하는 경향을 관찰하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 35).
실시예 11. 우울증 동물모델에서 신규 펩타이드의 항우울증 효능 검증
실시예 11-1: 실험 방법
우울증 동물모델은 무게가 20~22 g인 수컷 7주령의 C57BL/6J 마우스를 대한바이오링크로부터 공급받았으며, 동물은 실험 당일까지 고형 사료와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 명/암 주기의 환경을 유지하며 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
우울증을 유도하기 3일 전부터 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013의 농도가 0.2 ug/150 ul가 되도록 PBS 완충액에 녹인 후 마리당 150 μl씩 1일 1회 동일 시간에 마우스 경구로 투여하였다.
3일 째 되는 날 우울증을 유도하기 위하여 PBS 완충액에 용해된 Lipopolysaccharide (LPS)를 0.8 mg/kg 농도로 복강 내 주사하였다.
우울증에 미치는 영향을 분석하기 위한 꼬리 현수 시험법 (Tail suspension test, TST)은 하얀색의 아크릴로 제작된 20 cm x 25 cm x 30 cm 규격의 오픈된 상자에 꼬리 현수 장치를 설치하고 우울증을 유도한 실험동물을 꼬리가 바닥에 닿지 않을 높이로 매달아 놓은 뒤 6분 동안 같은 환경에서 관찰하면서 부동자세 (immobility)를 유지하는 시간을 측정하였다. 분석은 최종 4분 동안 이루어졌으며, 비디오 카메라로 녹화한 후, 마우스의 전체적인 움직임을 분석하였다.
또한, 강제 수영 시험법 (Forced swim test, FST)을 실시하여 발과 꼬리가 닿지 않는 깊이의 실린더에서 마우스의 부동성을 측정하였으며, 우울 증상인 절망의 정도를 확인하는 것으로, 25℃ 내외의 물을 아크릴로 된 투명한 원통 (45 cm 깊이 x 18 cm 직경)의 바닥으로부터 30 cm까지 채우고 마우스를 물에 노출시켜 6분 동안 수영하면서 부동자세 (immobility)를 유지하는 시간을 측정하였다. 분석은 최종 4분 동안 이루어졌으며, 비디오 카메라로 녹화한 후, 마우스의 전체적인 움직임을 분석하였다.
실시예 11-2: 실험 결과
분석결과, LPS 우울증 모델의 꼬리 현수 시험에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군이 꼬리를 매달아 거꾸로 된 상태에서의 부동자세 시간이 PBS 완충액 투여군보다 감소하는 경향을 보였다 (Student's t-test) (도 36, 37, 38).
LPS 우울증 모델의 강제 수영 시험에서 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013 투여군이 꼬리를 매달아 거꾸로 된 상태에서의 부동자세 시간이 PBS 완충액 투여군보다 감소하는 경향을 보였다 (도 36, 37, 38).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 우울 및 불안 장애의 예방 및 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 12. 신규 펩타이드의 조직 재생 효능 검증
실시예 12-1: 실험 방법
신규 단백질 단편의 피부 상처 치유 및 재생 효능을 확인하기 위하여, 마우스 꼬리의 전층 피부결손으로 유도되는 창상 유발 모델을 이용하여 실험을 수행하였다.
전층 피부결손 창상 유발 모델은 9주령의 특정 병원체 부재 (specific pathogen free, SPF) 수컷 C57BL/6J 마우스를 마취한 후 전층 상처 (full-thickness wounding)을 나타내기 위하여, 마우스의 꼬리 기저부에서 약 1.0cm 떨어진 마우스 꼬리의 등 부분에 10Х3mm 크기로 무균상태의 해부용 매스 10호를 사용하여 전층 상처를 만들었다. 상처를 압박하여 출혈을 멈추게 하였고, 상처를 필름 분무 드레싱 (film spray dressing; Cavilon, 3M)으로 덮었다.
창상 유발 당일부터 28일 동안 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 120 μM 농도로 vehicle (50% 에탄올, 20% 프로필렌글라이콜, 30% 물)에 녹인 후 마리당 25 μl씩 1일 1회 창상 부위에 도포하였다. 대조군에는 vehicle (50% 에탄올, 20% 프로필렌글라이콜, 30% 물) 동일량을 창상 부위에 도포하였다. 창상 유발 29일째에 시험을 종료하였다.
창상 치유 효과를 관찰하기 위해서 창상 유발 당일부터 7일 간격으로 28일 동안 상처로부터 일정한 높이에서 디지털카메라를 이용해 각 시험군의 동물들의 창상 부위를 개별적으로 촬영하였고, Image J Soft 프로그램을 이용하여 창상 면적을 측정하였다.
분석결과, 전층 피부결손 창상 유발 동물모델에서 육안상으로 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011 및 PEP013을 도포한 군에서는 Vehicle 도포군에 비해 상처 크기가 빠르게 감소하는 것을 확인하였다. 또한 창상 면적 측정 결과 vehicle 도포군에 비해 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011 및 PEP013을 도포한 군에서는 유의하게 창상 면적이 감소하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 39, 40, 41).
실시예 13. 소장 오가노이드 (organoid) 모델에서 신규 펩타이드의 효능 검증
실시예 13-1: 실험 방법
소장 오가노이드 (organoid) 모델을 수립하기 위해 15주령의 수컷 C57BL/6J 마우스의 소장 근위 단부 (proximal end)로부터 원위 단부 (distal end)까지 세로 방향으로 자르고, 약 5 mm 길이의 조각으로 가로 방향으로 잘라 얻어진 소장 조직을 1% 페니실린이 첨가된 냉장 PBS로 세척 하였다. 이후, 세척된 소장 조직을 dissociation buffer로 처리한 후 cell strainer로 여과하여 crypt를 분리하였다. 분리된 crypt는 마트리젤과 Organoid Growth Medium (IntesticultTM) 을 1:1의 비율로 섞어 배양하였으며, 12 well plate에 마트리젤을 37℃에서 20분 고형화시킨 후 배지 (500 μl/well)를 첨가하였다. 배지는 4일 뒤에 교체하였으며 7일 차에 계대 배양을 실시하였다.
신규 펩타이드 스크리닝을 위해 배지와 메트리젤 지지체 안에서 3D 배양된 오가노이드를 12 well plate를 사용하여 군당 3개의 well에 각 well 당 50개의 오가노이드를 분주하였다.배양 0, 2, 4일 차에 상기한 바와 같이 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 16 nM 농도로 처리하여 배양 5일 차에 발아된 오가노이드의 엽 개수를 확인하여 비교 분석하였다. 대조군에는 PBS 완충액을 동일한 방법으로 처리 하였다.
실시예 13-2: 실험 결과
분석 결과, 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010을 처리한 군에서 PBS 완충액 처리군에 비해 발아된 오가노이드의 엽 개수가 유의하게 증가하게 나타났다 (p<0.05, Student's t-test) (도 42).
또한, PBS 완충액을 처리한 군에 비해 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 처리군에서 발아된 오가노이드의 엽 개수가 유의하게 증가함을 관찰하였다 (p<0.05, Student's t-test) (도 43).
이를 통해, 본 발명의 펩타이드가 장 조직의 재생에도 효과가 있으며, 염증성 장질환을 비롯한 다양한 장 질환의 예방 및 치료 활용 가능성을 확인할 수 있었다.
실시예 14. 신규 펩타이드의 모발 재생 및 발모 촉진 효능 검증
실시예 14-1: 실험 방법
발모촉진 효능을 확인하기 위하여, 등쪽 피부의 색이 핑크색을 보이는 휴지기 체모의 8주령 C57BL/6 마우스를 사용하였다. 마우스를 마취한 후 동물용 전기제모기를 이용하여 마우스 등판의 털을 제거하고 털이 제거된 부위에 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008, PEP009 및 PEP010 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 30 μM 농도로 vehicle (50% 에탄올, 20% 프로필렌글라이콜, 30% 물)에 녹인 후 마리당 200μl씩 피펫 (pipette)을 이용하여 28일 간 매일 1회 피부 도포하였다. 대조군에는 vehicle (50% 에탄올, 20% 프로필렌글라이콜, 30% 물) 동일량을 피부 도포하였다.
각 군의 발모촉진 효과를 육안적으로 평가하기 위해 실험 시작 후 28일 째 마취한 후 모발성장을 관찰하였고 디지털 카메라를 이용하여 발모부위를 촬영하였다. 육안적으로 피부색 및 모발의 밀도를 관찰하여 다음 표 5의 스코어링 기준에 따라 점수화하여 그래프로 나타내었다.
육안적 발모정도 평가 점수화 기준
판정 기준 점수
전혀 자라지 않음 0
제모부위의 30% 미만으로 피부색이 어두워짐
제모부위에서 모발은 자라지 않음		 1
제모부위의 30-70% 정도 피부색이 어두워짐
제모부위에서 모발은 자라지 않음		 2
제모부위의 70% 이상 피부색이 어두워짐
제모부위에서 30% 미만으로 자라남		 3
제모부위의 70% 이상 피부색이 어두워짐
제모부위에서 30-70% 정도 자라남		 4
제모부위의 70% 이상 피부색이 어두워짐
제모부위에서 70% 이상 자라남		 5
제모부위에서 90% 이상 자라남 6
실시예 14-2: 실험 결과
도포 후 21일 째 육안적으로 발모현상을 관찰하여 스코어링 한 결과 신규 테트라펩타이드 PEP006, PEP007, PEP008 및 PEP009 그리고 신규 트리펩타이드 PEP011, PEP012 및 PEP013을 도포한 군은 Vehicle 도포군에 비해 전체 면적 중에 모발이 자란 부위의 비율이 증가하는 양상을 나타내었다 (도 44).
이를 통해 본 발명의 펩타이드가 조직 재생에 효과가 있으며 특히 모발 재생 및 발모에 효능이 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

  1. 하기 일반식 1 또는 2의 서열을 포함하는 펩타이드:
    [일반식 1]
    X-Gly-Ala-Tyr
    [일반식 2]
    Ala-X-Ser.
  2. 제1항에 있어서, 상기 일반식 1의 X는 Ala, Arg, Ile, Ser 및 Val 중에서 선택되는 어느 하나인, 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 일반식 2의 X는 Gln, Gly 및 Ile 중에서 선택되는 어느 하나인, 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염증질환은 관절염, 대사성 질환, 간염, 장염, 위염, 위궤양, 식도염, 피부염, 뇌염, 우울증, 불안장애, 인지장애, 기억장애, 퇴행성 뇌질환 및 발달장애로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조직 재생용 조성물.
  8. 제7항에 있어서 상기 조직 재생은 피부 재생, 근육조직 재생, 상처 치유, 근력 증진, 탈모 방지, 양모 촉진, 발모 촉진, 손상 모발 개선 및 모발 재생 중에서 선택되는 것인, 조직 재생용 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 조성물로,
    상기 조성물은 건강기능식품, 사료, 동물 의약품, 의약외품 또는 화장료 조성물인 것인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는 조직 재생용 조성물로,
    상기 조성물은 건강기능식품, 사료, 동물 의약품, 의약외품 또는 화장료 조성물인 것인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 염증질환 예방 또는 치료방법.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 조직 재생방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
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