KR101200402B1

KR101200402B1 - 신규한 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법

Info

Publication number: KR101200402B1
Application number: KR1020110085676A
Authority: KR
Inventors: 안미영; 황재삼; 윤형주; 윤은영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2012-11-14
Also published as: KR20110107309A

Abstract

본 발명은 곤충글라이코자미노글라이칸의 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방 용도와 곤충글라이코자미노글라이칸 제조방법을 제공한다. 본 발명의 곤충글라이코자미노글라이칸에 의해 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방할 수 있으며, 본 발명의 제조방법에 의해 곤충글라이코자미노글라이칸을 효과적으로 제조할 수 있다.

Description

신규한 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법{A novel method of producing glycosaminoglycans derived from insect}

본 발명은 곤충글라이코자미노글라이칸의 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방 용도와 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법에 관한 것이다.

곤충글라이코자미노글라이칸은 곤충유래의 글라이코자미노글라이칸으로, 상기 글라이코자미노글라이칸(Glycosaminoglycan, GAG)은 우론산과 글루코자민이 반복되고, 부분적으로 설페이트화된 구조를 가지며 이러한 복잡한 화학구조에 의해 여러 종류의 생물활성을 나타낼 수 있게 된다. 현재까지 알려진 바에 의하면, 이러한 다양한 생물활성은 고유의 특정 서열이 존재함에 기인한 것으로 보인다.

동물류의 GAG류로는 히얄우론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate), 케라틴 황산(keratin sulfate), 헤파란 황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. GAG류는 생체내에서 프로테오글리칸(Proteoglycan)의 형태로 존재하며 이러한 프로테오글리칸은 프로테아제와 글리코시다제에 의해 분해되어 당부분이 유리된다. GAG류의 생리적 역할에 대해서 아직까지 많이 밝혀져 있지 않으나 생체내의 단백질들과 결합하여 생리활성을 나타내는 것으로 보인다.

곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법이 대한민국특허 제10-0847889호에 개시되어 있으며, 상기 방법으로 제조된 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 고혈압 등에 효과가 있음이 개시되어 있으나, 본 발명자들은 아직 알려지지 않은 곤충글라이코자미노글라이칸의 용도를 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방을 위한 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 곤충글라이코자미노글라이칸 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 곤충글라이코자미노글라이칸의 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제 용도, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방 용도를 제공한다.

본 발명은 곤충글라이코자미노글라이칸을 함유하는 소염용 조성물을 제공한다. 상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸, 서양뒤영벌여왕벌(Queen of B. terrestris) 글라이코자미노글라이칸, 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, 쇠등에 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 호박벌여왕벌(Queen of B. ignitus) 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 '곤충글라이코자미노글라이칸'은 곤충 유래의 글라이코자미노글라이칸을 의미하며, 각 곤충의 글라이코자미노글라이칸은 각 곤충 유래의 글라이자미노글라이칸으로, 예를 들어, 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸은 쇠똥구리 유래의 글라이코자미노글라이칸을 의미한다.

본 발명에서 ‘쇠똥구리’는 Catharsius 계열 즉 Catharsius molossus 및 애기뿔쇠똥구리 등 Copris 계열을 포함한다.(생약명 강랑의 정의에 준함, 곤충류 약물도감, 최정, 안미영등, 도서출판 신일)

상기 곤충글라이코자미노글라이칸은 곤충으로부터 본 발명의 제조방법 또는 공지의 방법(예를 들어, 대한민국 특허 제10-0847889호에 개시된 방법)으로 제조한 것일 수 있다.

상기 쇠똥구리는 생약명으로 강랑이며, 상기 강랑은 쇠똥구리를 수세하여 건조시킨 것이고, 상기 쇠등에는 생약명 맹충으로, 상기 맹충은 쇠등에를 수세하여 건조시킨 것이다.

상기 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸은 쇠똥구리에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-2S-[1-4]GlcN(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-[1-4]glucosamine)의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 매미눈꽃동충하초에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 chondroitin sulfate(ΔUA-[1-.3]-N-acethylgalactosamine-N-sulfate 계열) 일부를 포함하는 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-GlcNS(glucuronic 또는 galacturonuc acid-N-glucosamine-N-sulfate 계열) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-2S-GlcN(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-glucosamine)의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸은 귀뚜라미에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-GlcNAC(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-acetylglucosamine) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-acetylglucosamine-4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-sulfo-glucosamine) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS-UA-GlcNAC6S(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-acetylglucosamine-4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-sulfo-glucosamine-4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-N-acethyl-6-sulfo-glucosamine) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

본 발명에서 ΔUA 또는 δUA는 4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid를 의미하고, GlcN은 D-glucosamine을 의미하고, Ac는 Acetyl을 의미하고, NS, 2S, 6S는 각각 N-sulfo, 2-sulfate 또는 6-sulfate로 각각의 위치에 황산기가 붙은 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물, 식품용 조성물 또는 화장품용 조성물이다.

본 발명은 또한 곤충글라이코자미노글라이칸을 함유하는 항당뇨용 조성물을 제공한다. 상기 항당뇨 작용에 의해 당뇨병 등의 치료 및/또는 예방이 가능하다. 상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 매미눈꽃동충하초(Isaria sinclairii) 글라이코자미노글라이칸, 귀뚜라미, 쇠등에 및/또는 쇠똥구리글라이코자미노글라이칸이다. 상기 쇠똥구리는 생약명으로 강랑이며, 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸은 쇠똥구리에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-2S-[1-4]GlcN의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다. 상기 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 매미눈꽃동충하초에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 chondroitin sulfate(ΔUA-[1-.3]-N-acethylgalactosamine-N-sulfate 계열) 일부를 포함하는 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-GlcNS(glucuronic 또는 galacturonuc acid-N-glucosamine-N-sulfate 계열) 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-2S-GlcN(4-deoxy-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic acid-2-sulfo-glucosamine)의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 쇠등에는 생약명 맹충으로, 상기 맹충은 쇠등에를 수세하여 건조시킨 것이다.

본 발명은 또한 곤충글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 항응혈용 조성물을 제공한다. 상기 항응혈 작용에 의해 혈전용해 작용을 나타낼 수 있어 관상동맥 질환(협심증 등)과 뇌혈관 질환을 포함하는 혈전 관련 각종 질환 등의 치료 및/또는 예방이 가능하다.

상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, 쇠등에 글라이코자미노글라이칸, 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸, 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸, 서양뒤영벌 여왕벌 글라이코자미노글라이칸, 누에(Bomyx mori) 글라이코자미노글라이칸, 누에수번데기(Bomyx mori의 수번데기)글라이코자미노글라이칸 및/또는 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸이다.

본 발명에 있어서, '귀뚜라미'는 약용곤충으로 솔슬(곤충류 약물도감, 최정, 안미영들, 도서출판 신일)로 불리는 곤충, Gryllus bimaculatus(아열대산 귀뚜라미), Teleogryllus emme (국내산귀뚜라미) 등을 포함하는 분류학상 귀뚜라미상과의 의미이다.

또한, 본 발명에 있어서, '쇠등에(소등에)'는 생약명으로 맹충(Tabanus, 곤충류약물도감, 신일출판, 최정, 안미영 등)에 준하는 등에(Tabanus bivittatus)를 포함하며, 분류학적으로 등에과(Family Tabanidae)의 의미이다.

상기 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸은 쇠똥구리에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-2S-[1-4]GlcN의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 매미눈꽃동충하초에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-GlcNS 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-2S-GlcN의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 쇠똥구리는 생약명으로 강랑이며, 상기 강랑은 쇠똥구리를 수세하여 건조시킨 것이고, 상기 쇠등에는 생약명으로 맹충이며, 상기 맹충은 쇠등에를 수세하여 건조시킨 것이다.

본 발명은 또한 곤충글라이코자미노글라이칸을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 누에 글라이코자미노글라이칸, 광대노린재(노린재류, Poecilocoris lewisi) 글라이코자미노글라이칸, 쇠똥구리 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸은 귀뚜라미에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는 ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS-UA-GlcNAC6S 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다.

상기 광대노린재 글라이코자미노글라이칸은 광대노린재에서 추출한 글라이코자미노글라이칸인 이상 제한되는 것은 아니며 조(crude)상태의 것 등일 수 있으나, 바람직하게는ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 △UA-GlcNS 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸이다 (본원 도 23 광대노린재 반복구조(P)의 △UA-GlcNS 기재 및　 설파이트기NSO₃ ^-구조식 참조).

상기 조성물은 이로써 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 자궁암 및/또는 대장암 치료 및 예방용 약학조성물이다.

본 발명은 또한 곤충글라이코자미노글라이칸을 포함하는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 고혈압, 뇌졸중, 뇌출혈, 허혈성 심질환, 및 레이노병 중에서 선택된 하나 이상의 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 및/또는 쇠등에 글라이코자미노 글라이칸이다.

본 발명은 또한 곤충글라이코자미노글라이칸을 포함하는 혈관신생억제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 구체적으로 혈관신생에 의해 매개되는 암의 성장과 전이, 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물일 수 있다.

상기 곤충글라이코자미노글라이칸의 바람직한 예는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, 및/또는 쇠등에 글라이코자미노글라이칸이다.

본 발명의 조성물은 약학조성물, 식품조성물, 또는 화장품용 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 유효성분 이외에 추가로 약학, 식품학적 및/또는 미용학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 제제화 할 수 있다.

약학, 식품학적 및/또는 미용학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 용매, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제를 부가적으로 첨가할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적절한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 제약상 적합한 부형제인 고상, 준고상 또는 액상희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형보조물을 첨가하여 제제화 가능하며, 바람직한 제형으로는 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제(pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제, 시럽, 즙, 점적제, 주사 가능한 액제, 서방출형 제제 및 분무제 등이 포함된다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면 (a) 충진제 및 중량제(예: 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코오스, 만니톨과 규산) (b) 결합제(예: 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈) (c) 흡습제(예: 글리세롤), (d) 붕해제(예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해지연제(예: 파라핀) (f) 흡수촉진제(예: 4급 암모늄 화합물), (g) 습윤제(예: 세틸알코올 및 글리세롤모노스테아레이트), (h) 흡착제(예:고령토 및 벤토나이트), 및, (i) 윤활제(예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스타레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기(a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효화합물 또는 화합물들을 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 피막을 입힐 수 있으며, 장관특정부위에 유효화합물만 방출시키도록 할 수 있으며, 필요한 경우 고분자 등을 사용하여 서방형으로 제제화할 수도 있고 미세캡슐화할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 주사제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 좌제는 유제화합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오지방 등의 지방, 고급에스테르(예: C₁₆-지방산을 갖는 C₁₄-알코올), 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 라우린지 및 글리세롤젤라틴 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효화합물 이외 통상의 부형제, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제로는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로풀루오로히드로카본을 더 함유할 수 있으며, PEG-4000과 글리세린을 함유하는 비강분무제로도 제제화할 수 있다.

액제 및 에멀젼제는 유효 성분 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 물, 에칠알콜, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에칠아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포롬아미드 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유, 글리세롤, 테티라히드로푸로푸릴 알코올, 포리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균형태로 제제할 수 있다.

현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상희석제(예: 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 현탁제(예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및/또는 소르비탄 에스테르), 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 또한 발색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유 및 유칼리유 및 감미제(예: 사카린)를 함유할 수 있으며, 본 발명에 의한 화합물 이외에 다른 제약상의 유효한 화합물을 함유할 수 있다.

상기 제형은 공지된 방법, 예를 들면 유효성분을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다. 유효성분은 상기 제형에 있어서 전체 혼합물의 약 0.1 내지 99.5 중량 %, 바람직하게는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유된다.

본 발명에 있어서, 곤충글라이코자미노글라이칸 및 그를 포함하는 조성물은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명에 있어서, 각각의 곤충글라이코자미노글라이칸 및 그를 포함하는 조성물은 곤충글라이코자미노글라이칸 기준으로 투여량은 체중 60kg 성인기준으로 1일 0.1 mg/kg ~ 900mg/kg의 범위 내에서 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 및 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 담체와 함께 건조한 후 캡슐화하거나 기타 정제, 과립, 분말, 음료, 죽 등의 형태로 제형화할 수 있으며, 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태로 제조 가능하다.

본 발명의 화장품 조성물의 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 적당한 담체를 이용하여 로션제, 크림제 등의 형태로 제형화 할 수 있으며, 상기 기재한 것 외에도 모든 화장품 형태로 제조 가능하다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물에 함유되는 글라이코자미노글라이칸 또는 본 발명의 조성물을 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제방법, 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료 및/또는 예방방법을 제공하며, 본 발명의 조성물에 함유되는 글라이코자미노글라이칸 또는 본 발명 조성물의 소염제, 항당뇨제, 항응혈제, 항암제, 혈관신생억제제, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환 치료제 제조 용도를 제공한다.

본 발명의 조성물에서 언급된 내용과 모순되지 않는 한 동일한 내용이 본 발명의 치료 및/또는 예방방법과 본 발명의 제조 용도에 적용된다.

본 발명은 또한 (a) 곤충을 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸알콜, 에틸알콜, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴, 클로로포름 및 디클로로메탄 등 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 가능한 유기용매에 1~4일 침지하여 지방류를 제거하고 여과하여 걸러지지 않는 잔사를 건조하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 건조된 잔사를 100~300메쉬 입경으로 분쇄하는 단계; (c) 상기 (b)단계에서 수득한 분쇄물을 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에서 단백분해제로 처리하여 분쇄물 중 단백질을 분해하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 분해된 단백질을 트리클로로아세트산(5중량%)으로 원심분리에 의해 제거하는 단계; (e) 상기 (d)단계에서 단백질 제거 후 남은 잔사를 에탄올과 포타슘 아세테이트 또는 소듐 아세테이트로 당을 공침시키고, 다시 침전물을 세틸피리디늄에 침전시킨 후, 다시 침전물을 에탄올에 침전시키는 단계; 및 (f) 상기 (e)단계에서 생성된 침전을 증류수로 투석하는 단계를 포함하는 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법을 제공한다.

상기 (a)단계에서 프로테오글라이칸을 분리하기 위하여 지방류를 제거하며, 1~4일 경과시 지방을 충분히 제거할 수 있다.

상기 (b)단계에서 건조된 잔사를 100~300메쉬의 입경을 갖도록 볼밀 또는 햄머밀로 분쇄함으로써, 이후 단계에서 단백분해를 촉진할 수 있다. 300메쉬 초과 입경은 효소분해가 늦어질 염려가 있고, 100메쉬 미만 입경은 원심분리시 상등액에 유입될 염려가 있다.

상기 (c)단계의 단백분해제는 바실루스유래(Bacillus licheniformis등) 단백분해효소인 알카라제{예를 들어, Novozyme(시그마사)} 및/또는 Aspergillus oryzae의 protease(단백분해효소)인 Flavourzyme{예를 들어, 시그마사(미국) 또는 아피스바이오텍(한국)} 등일 수 있고, 식용 발효된 간장 또는 된장발효에 들어가는 발효균 액상물, 또는 요구르트 종균액상물 등을 사용할 수 있다. 이 때 단백분해(발효) 소요 시간은 3~7일로, 실온 이상에서 단백질 분해를 촉진할 수 있고, 44℃ 가온시 반응을 촉진할 수 있다. 상기 단백분해제를 2~5중량% 사용함으로써, 곤충 껍질의 단백질을 효과적으로 제거할 수 있다. 2중량% 미만에서 곤충껍질의 단백질을 충분히 분해하는 것이 어려울 염려가 있고, 5중량% 초과시 효소사용량에 비해 분해는 충분하지 않을 염려가 있다.

상기 (f)단계에서 증류수로 투석함으로써, 잔존 염려가 있는 트리클로로아세트산 등을 제거할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 상기 (a) ~ (f)단계를 반복하여 산성당 분획을 수집하여 순도를 전기영동에 의해 결정하고, 이온교환크로마토그라피를 거치고 염경사(salt gradient; 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 정제한 후 우론산을 포함하는 분획을 수집하는 단계를 추가로 거칠 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 곤충의 바람직한 예는 쇠똥구리, 귀뚜라미, 매미눈꽃동충하초, 쇠등에, 누에수번데기, 누에, 서양뒤영벌 여왕벌, 호박벌여왕벌, 및/또는 광대노린재이다.

본 발명의 곤충글라이코자미노글라이칸에 의해 소염, 항당뇨, 항응혈, 항암, 혈관신생억제, 및/또는 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환을 치료 및/또는 예방할 수 있으며, 본 발명의 제조방법에 의해 곤충글라이코자미노글라이칸을 효과적으로 제조할 수 있다.

도 1은 매미눈꽃동충하초, 맹충, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(조)에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 2는 귀뚜라미, 맹충(쇠등에), 광대노린재 글라이코자미노글라이칸의 이온교환크로마토그래피에 의한 정제 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 3은 강랑(쇠똥구리), 누에수번데기, 누에, 서양뒤영벌여왕벌, 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸의 이온교환크로마토그래피에 의한 정제 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 4는 조 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸의 MALDI-TOF 매스 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 조 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 MALDI-TOF 매스 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 조 맹충 글라이코자미노글라이칸의 MALDI-TOF 매스 크로마토그래피 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 효소분해된 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸에 대한 MALDI-TOF 결과(7분 피크)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 효소분해된 맹충 글라이코자미노글라이칸에 대한 MALDI-TOF 결과(9분 피크)를 나타낸 그래프이다.
도 9는 효소분해된 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸에 대한 MALDI-TOF 결과(8분 피크)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸에 대한 HPLC 크로마토그람 결과를 나타낸다.
도 11은 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸에 대한 HPLC 크로마토그람 결과를 나타낸다.
도 12는 맹충 글라이코자미노글라이칸에 대한 HPLC 크로마토그람 결과를 나타낸다.
도 13은 헤파란 황산계열 표준품에 대한 HPLC 크로마토그람 결과를 나타낸다.
도 14는 매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸을 효소분해시킨 반응물을 강이온교환컬럼 HPLC주입시 나오는 크로마토그람으로서 표준품인 헤파린이당류에 해당하는 retention time 확인을 기록한 그림이다.
도 15는 강랑 글라이코자미노글라이칸의 1H-NMR결과이다.
도 16은 강랑 글라이코자미노글라이칸의 2D COSY NMR 결과이다.
도 17은 광대노린재 글라이코자미노글라이칸의 1H-NMR결과이다.
도 18은 광대노린재 글라이코자미노글라이칸의 2D COSY NMR 결과이다.
도 19는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 1H-NMR결과이다.
도 20은 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 2D COSY NMR 결과이다.
도 21은 누에 글라이코자미노글라이칸의 1H-NMR결과이다.
도 22는 누에 글라이코자미노글라이칸의 2D COSY NMR 결과이다.
도 23은 귀뚜라미, 강랑, 광대노린재, 매미눈꽃동충하초에 대한 글라이코자미노글라이칸 올리고머의 구조를 나타낸 도이다.
도 24는 강랑 글라이코자미노글라이칸 항당뇨 효과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 곤충 글라이코자미노글라이칸 투여시 시간에 따른 혈당량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 26은 곤충 글라이코자미노글라이칸 1달 투여 후 혈당량 감소를 나타낸 그래프이다.
도 27은 곤충 글라이코자미노글라이칸의 실험동물 투여시 소염효과를 나타낸 그래프로, 시간 경과에 따른 발 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 28은 대조군, CFA 단독 투여군, 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸 투여군, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 투여군, 맹충 글라이코자미노글라이칸 투여군, 조 강랑 글라이코자미노글라이칸 투여군, 인도메타신 투여군에 대한 병리조직을 촬영한 사진이다.
도 29는 곤충 글라이코자미노글라이칸의 실험동물 투여시 소염효과를 나타낸 그래프로, 시간 경과에 따른 발 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 30은 대조군, CFA 단독 투여군, 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸 투여군, 강랑 글라이코자미노글라이칸 투여군, 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸 투여군, 인도메타신 투여군의 혈청 중 IL-6 수치를 나타낸 그래프이다.
도 31은 대조군, CFA 단독 투여군, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 투여군, 맹충 글라이코자미노글라이칸 투여군, 인도메타신 투여군의 혈청 중 IL-6 수치를 나타낸 그래프이다.
도 32는 곤충글라이코자미노글라이칸의 eNOS 활성을 나타낸 결과이다.
도 33은 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸과 맹충 글라이코자미노글라이칸의 처리군별 NO산생량을 나타낸 그래프이다.
도 34는 곤충글라이코자미노글라이칸의 혈관내피세포에 대한 VEGF 활성을 나타낸 결과 그래프이다.
도 35는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸과 맹충 글라이코자미노글라이칸 투여군의 mTNF-α 농도를 나타낸 그래프이다.
도 36은 귀뚜라미, 맹충, 매미눈꽃동충하초 투여군의 mTNF-α 농도를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 제조

①강랑(쇠똥구리)(중국 연길 구입), ②귀뚜라미(충북 음성 사육농가에서 구입), ③매미눈꽃동충하초, ④맹충(쇠등에), ⑤누에수번데기, ⑥누에, ⑦서양뒤영벌여왕벌, ⑧여왕벌호박벌여왕벌, ⑨광대노린재 7종의 곤충(농촌진흥청 국립농업과학원에서 입수함)을 각각 ①1.3 kg, ②2 Kg, ③2.5kg, ④2 kg, ⑤2 kg, ⑥1.8 kg, ⑦2kg, ⑧1 kg, ⑨100 g을 마쇄 후 동량이상의 부피의 에탄올 또는 아세톤에 3일간 침지하여 지방류를 제거하고 여과하여 걸러지지 않는 잔사(곤충껍질 등)를 잘 건조시켰다.

벌껍질은 얇고 작으면서 치밀하여 단백분해제에 의해 분해가 지연되는 경향이 있다. 따라서 건조된 잔사를 분쇄기(ball mill 또는 hammer mill)로 분쇄(100~300메쉬)하였다. 그 후 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에 단백분해효소로는 바실루스유래(bacillus lichenformis)의 시그마 알카라제 2.5% 중량으로 44℃에서 4일간 발효하여 단백질을 분해시킨 후 냉장보관한 50% 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid)를 전체액농도가 5%되게 첨가하여 4℃ 3시간 방치하여 단백질을 침전시키고 8천 rpm이상 원심분리방법으로 분해 단백질을 제거하고, 잔사를 2배량의 에탄올(100%)과 potassium acetate로 당을 공침시키고, 다시 침전물을 배량의 cetylpyridinium(5중량%)에 침전시킨 후, 다시 침전물을 2배량의 에탄올에 침전시킨 후, 증류수로 분자량 3500 이상의 투석막으로 방법으로 투석 후 동결건조하여 각각 ①1.1g, ②3.4g, ③3,9g, ④0.617g, ⑤1.5g, ⑥0.2g, ⑦2.21g, ⑧4.89g, ⑨0.27g의 조(crude) 곤충 글라이코자미노글라이칸을 얻었다.

이러한 과정을 반복하면서 산성당 분획을 모아서 순도를 전기영동에 의하여 결정하고, 이온교환크로마토그라피(Sephadex DEAE A-25)를 거쳐서 염경사(salt gradient; 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 더욱 정제하여 우론산을 가지는 분획을 수집하여 곤충 글라이코자미노글라이칸 분획을 각각 제조하였다.

<실험예1> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 분석

1) 전기영동

실시예 1에서 제조한 글라이코자미노글라이칸에 대해 전기영동을 실시하였다. 전기영동은 1% 아가로스젤에서 TBE(Tris Borate EDTA)완충용액을 이용하였고, 전기영동 후 Azue A 염색을 실시하였다. 매미눈꽃동충하초, 맹충, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(조)에 대한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1 중 1레인의 IS는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸 1M 에 대한 결과이고, 2레인의 Tb는 맹충글라이코자미노글라이칸(조, crude), 3레인의 Gb는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(조), 4레인의 IS는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸(조), 5레인의 Heparin은 표준품(시그마)으로 사용한 헤파린에 대한 결과로 헤파린 평균 분자량 13KD이다. 그 결과, 각각의 곤충 글라이코자미노글라이칸을 정성적으로 확인할 수 있었으며 대략분자량 또한 확인하였다.

2) 이온교환 크로마토그래피에 의한 곤충글라이코자미노글라이칸 정제 프로파일

실시예 1에서 제조한 글라이코자미노글라이칸의 분획에 대한 정제 프로파일을 하기와 같은 방법으로 작성하였다. 즉, GAG분해효소(대한민국 특허 제10-2057168호의 HJ-15(수탁번호 KCCM-10096) 생산 분해효소)의 대사산물 분석방법에 의하였다. 이온교환크로마토그래피에 의해 정제한 각각의 분획 중 강랑(쇠똥구리), 귀뚜라미, 맹충(쇠등에), 누에수번데기, 누에, 서양뒤영벌여왕벌, 호박벌여왕벌, 광대노린재의 조글라이코자미노글라이칸에 대한 결과를 도 2, 도 3에 나타내었다.

그 결과 다양한 곤충의 조 글라이코자미노글라이칸은 용출시키는 염의 농도에 따라 곤충글라이코자미노글라이칸이 분별되어 정제됨을 알 수 있다.

3) 글라이코자미노글라이칸의 함량

실시예 1에서 제조된 글라이코자미노글라이칸의 함량을 측정하였다. 귀뚜라미, 맹충, 매미눈꽃동충하초, 강랑, 호박벌여왕벌, 누에수번데기, 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸의 함량을 하기 표 1과 2에 나타내었다. 표 1은 각각의 곤충에서 얻어진 글라이코자미노글라이칸의 함량(mg)을 분획별로 나타낸 것이고, 표 2는 각각의 곤충에서 얻어진 조 글라이코자미노글라이칸 함량과 분획별 함량을 나타낸 것이다.

글라이코자미노글라이칸의 함량은 각 분획을 동결건조 후 양으로 표기하였고, 우론산 함량은 글루쿠로노락톤을 표준당으로 하여 사붕산나트륨(0.025M)을 진한황산에 녹인 용매에 시료를 넣고 10분 끓는 물에 담근 후 꺼내 carbazole가열 후 UV(530 nm)측정방법으로 구하였다.

[표1]

중성당함량은 D-glucose 1 mg/ml를 표준당으로 농도를 희석하여 농도희석글루코스 액을 만들고, 시료 또한 0.5 ml에 녹이고 페놀 5% 0.3 ml. 진한황산 2 ml를 가하고 실온에 30분방치 후 484nm에서 UV(Jasco, V-550, 일본)흡광도를 측정한 후, 글루코스검량곡선에 의해 산출하였다.

아미노당함량은 hexosamine 함량을 산출하는데, 10 mg/ml 시료에 진한HCl(100ul)를 넣어 100℃ 4시간 가온 후 진공펌프를 사용하여 말린 후 시료 또는 글루코자민(갈락토자민도 가능)을 100ul 물에 녹이고 1.5M HCl 25ul 첨가하여 교반 후 0.7M 탐산나트륨을 첨가한 2,4-pentanedione(250ul) 첨가 후 뚜껑 닫고 20분간 100℃ 가열 후 차가운 물에 냉각 후 2 ml 90% 에탄올을 넣고 500ul Ehrlich 시약(N,N-dimethyl-p-aminobenzaldehyde, 100mg을 3.2ml perchloric acid에 녹인 후 95% 에탄올로 100ml)을 가한 후 교반하고, 20℃ 1시간 incubation후 535 nm에서 UV흡광도를 측정한 후 검량곡선에 의해 산출하였다.

[표2]

표에서 m은 평균값을 의미하고, SE는 표준오차를 의미한다.

상기 결과로부터 다양한 곤충으로부터 곤충 글라이코자미노글라이칸을 함유하는 조성물을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

4) 분자량 측정

실시예 1에서 제조한 곤충 글라이코자미노글라이칸의 분자량을 MALDI-TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) 매스로 측정하였다.

MALDI-TOF 분석은 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization(MALDI) Mass spectrometer (Voyager-DE STR, Applied Biosystems, USA)를 사용하였으며, 질량분석은 EI (electron ionization)-mode, Electron 70eV DIP (Direct Inlet Probe) mode를 사용하여 분석하였다.

조 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸, 조 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, 조 맹충 글라이코자미노글라이칸에 대한 결과를 각각 도 4~ 도 6에 나타내었다. 상기 도 4~6은 각각의 글라이코자미노글라이칸의 MALDI-TOF 매스 크로마토그래피로, 고분자폴리머인 곤충 글라이코자미노글라이칸의 분자량을 확인할 수 있다.

5) 곤충 글라이코자미노글라이칸을 구성하는 당 구조 분석

글라이코자미노글라이칸 분해효소 또는 산을 실시예 1에서 제조한 곤충 글라이코자미노글라이칸에 처리하여, 당으로 분해하여, MALDI-TOF로 분자량을 측정하고, NMR과 GC분석을 하였다. 또한 효소처리 배양 후 상등액을 주입하여 당의 구조를 HPLC-AT ECD검출기로 확인하였다. 상세한 과정은 하기와 같다.

(5-1) 효소 가수분해

분해효소 반응조건은 실시예 1에서 제조한 조 곤충 글라이코자미노글라이칸 1mg당 분해효소{헤파리나제 I, II(Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37, 684-690의 방법으로 제조한 것의 recombinant), chondroitin sulfate lyase(시그마, 미국)} 각 10mU와 50ul, 50mM 트리스염산 완충용액/NaCl (pH 7.4)을 가하여 전체 용액을 1ml로 조정하였고, 반응온도는 37℃로 고정하였다. 효소의 반응이 완전히 진행되었을 때 반응물 분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 실시하였다. 즉, 강음이온교환컬럼(4.6X250nm, 미국 페노미녹스)을 이용하여 염화나트륨 농도구배(0.1M?1.6M)에 의해서 1.0ml/min의 유속으로 시료를 분리하여 모아 측정에 사용하였다.

(5-2) MALDI-TOF

상기 (5-1)의 MALDI-TOF로 효소분해된 글라이코자미노글라이칸의 분자량을 측정하였다. MALDI-TOF 측정방법은 상기 4)와 동일하다. 그리고, 헤파린 디싸카라이드 표준품(I-S, II-H, I-A, II-S, III-H, III-S, Ⅳ-A, Ⅳ-H, I-H, I-P, III-S; sigma, 미국)과 피크를 비교하였다.

매미눈꽃동충하초, 맹충, 귀뚜라미에 대한 MALDI-TOF 결과를 도 7~9에 나타내었다. 도 7~9는 각각 효소분해된 매미눈꽃동충하초(7분 피크), 맹충(9분 피크), 귀뚜라미(8분 피크) 글라이코자미노글라이칸의 분자량 분석 결과이다.

(5-3) 곤충글라이코자미노글라이칸을 구성하는 단당류 분석-GC/MS

상기 (5-1)의 효소분해물의 성분분석을 위해 시료에 메탄올용매로 녹인 3M HCl에 시료를 녹인 후 120℃ 2시간 가온 후 실온으로 식힌 후 질소가스하 40℃에서 건조 후 0.3 ml 아세트 무수물(acetic anhydride)를 가한 후 30분 동안 실온에서 방치한 후 40℃에서 질소가스 하에서 건조한 후 P₂O₅ 하에서 진공 펌프로 완전히 건조시킨 후 50 ㎕의 피리딘/N,O-비스(트리메틸시릴)트리플로로아세트아마이드(2:1, v/v)를 가하여 30분 동안 80℃에서 시릴(silyl)화를 시키고 시릴화가 이루어진 시료를 가스크로마토그라프{5973N 매스 디텍터를 구비한 Agilent 6890(Agilent Technologies)}로 분석을 하였다. 칼럼은 미국 휴렛팩커드사의 HP-5모세관 칼람으로 규격은 0.53 mm x 30m로 주입부의 온도는 250℃, 검출기의 온도는 280℃를 각각 유지하며 칼럼의 온도는 180℃에서 1분당 10℃씩, 220℃로 1분당 2℃씩, 300℃로 분당 100℃ 증가되도록 프로그램하여 분석하였다. 시약은 분석시약 등급을 사용하였으며, D-글루코자민 하이드로클로라이드, N-아세틸-D-갈락토자민, D-글루쿠론산, D-(+)-갈락토자민 하이드로클로라이드, Myo-inositon 표준품, BSTFA{N,O-Bis(trimethylsilylation) trifluoroacetamide with trimethylchlorosilane}는 시그마사(미국)에서 구입한 것을 사용하였다. 메탄올 무수물, 아세트산 무수물, 피리딘 무수물은 시그마-알드리치(미국)에서 구입한 것을 사용하였다.

A) GC/MS 분석을 위한 TMS유도체화된 단당류의 여러 피크별 분석조건확립

곤충글라이칸 내에서 amino sugar를 분석하기 위해 유도체화 과정을 걸친 후에 GC/MS로 분석하는 TMS (Trimethylsilylation)의 유도체화 방법으로 amino sugar를 분석하였다(Analytical biochemistry 347 (2005) 262-274의 방법 참고).

TMS 유도체화 과정을 거친 다당류는 α and β- anomer와 pyranose와 furanose ring 구조로 변하기 때문에 GC-MS를 사용하여 분석하였을 경우 여러 개의 피크로 분리되어진다. 따라서 표준시약을 개별적으로 분석하여 내부표준물질에 기준 하여 분리되는 시간을 찾아내었으며 또한 피크들의 상대적인 세기를 정리하였다.(표 3) 다음과 같은 조건의 표준시료를 GC/MSD(가스크로마토그라프{5973N 매스 디텍터를 구비한 Agilent 6890(Agilent Technologies)}로 분석 결과에서 나온 피크들을 구분하기 위해 질량 스펙트럼을 얻어냈으며 ion값을normalized하여 비교하였다(표 4). Amino sugar의 스펙트럼에서 나타나는 m/z 73은 [Si (CH₃)₃]가 나타난 것이며 m/z 147 ion은 [(CH₃)₃ SiOSi - (CH₃)₂]이 나타난 것이다. 특히 glucuronic acid에서 pyranose 구조는 m/z 204의 intensity가 m/z 217 보다 더 크다는 것을 확인 할 수 있었다(J. Chromatogr. A 720 (1996) 27-49참고).

[표3] 표준당의 retention time과 peak 비율 검량조건설정

[표 4] 표준당의 retention time 해당 peak의 fragment검량조건설정

B) 가수분해하여 중성당 조성비 조사

실시예 1에서 제조한 곤충 글라이코자미노글라이칸을 염산(산가수분해)으로 가수분해하여 GC/MS로 분석하고, TMS중성 단당류의 표준품(시그마)과 일치하는 시료 GCMS peak를 정량하였다.

귀뚜라미(sample 1), 맹충(sample 2), 매미눈꽃동충하초(sample 3), 강랑(sample 4) 글라이코자미노글라이칸(조)에 대한 결과를 하기 표에 나타내었다.

[표 5] 곤충글라이코사미노글라이칸 시료내 각 중성당들의 함량(백분율%)

상기 결과로부터 곤충글루코자미노글라이칸으로서 산성당과 아미노당비율이 높고 중성당인 meso-inositol의 함량만 높을 뿐 대개 중성당은 적은 함량을 가짐을 알 수 있다.

C) 가수분해하여 아미노당 분석

상기 B)의 시료 내에서 아미노당을 분석하기 위해 유도체화 과정을 거친 후 GC시료에서의 GC/MS 분석하였다. 먼저 표준시료 실험에서 실험방법에 대한 정당성을 검증한 후에 각 시료에 대해 적용하였다. 정량 계산방법은 표준시료를 분석하였을 때 검출된 피크의 면적을 모두 더하였으며, 시료 내에서는 머무른 시간과 ion의 비율을 비교하여 구분지었다. 컬럼은 휴렛팩커드사의 HP-5MS를 사용, 정량범위는 최대 0.002mg까지 적용하였으며 Linearty는 0.988이상으로 나타났다.

[표 6]

a: mg/0.015 mg; b: not detected

시료3 매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸은 글루코자민과 갈라토자민을 적게 가지며, 시료 모두 글루쿠로닉산을 갖는다. 쇠등에(맹충)글라이코자미노글라이칸은 N-아세틸-갈락토사민 또는 글루코사민과 글루쿠로닉산이 결합된 이당류를 가지는 반복구조를 가진다 (표 6, sample 2, 맹충글라이코자미노글라이칸 GC-MS 분석결과 참조).

(5-4) 효소가수분해에 의한 이당류 분석-HPLC 분석

상기 (5-1)의 효소가수분해에 의한 산물(2당류, 4당류, 6당류 곤충글라이코자미노글라이칸)을 고속액체크로마토그라프(HPLC)를 이용하여 분석하였다.(Glycobiology vol. 8 no. 9 pp. 869-877, 1998Determination of the structure of oligosaccharides prepared from acharan sulfate)

효소의 반응이 완전히 진행되었을 때 반응물의 분석은 고속액체크로마토그라프(HPLC)를 이용하여 실시한다 강음이온교환칼럼(4.6×250nm, 미국 페노미녹스 제품)을 이용하여 염화나트륨 농도 구배에 의해서 1.0ml/min의 유속으로 시료를 분리하여 모아 NMR 분석을 한다.

heparin disaccharide 표준품으로 헤파란 황산계열 표준품(시그마 heparin dissacharide I-S, II-H, I-A, II-S. III-H, III-S, IV-A, IV-H, I-H, I-P, III-S)를 사용하여 retention time을 대조로 확인하였다.

귀뚜라미, 매미눈꽃 동충하초, 맹충 글라이코자미노글라이칸에 대한 결과를 도 10~12에 나타내었다. 또한, 헤파란 황산계열 표준품(시그마)에 대한 HPLC 크로마토그람을 도 13에 나타내었다. 각 표준품의 retention time은 내부표준물질의 retention time 기준으로 산정되어졌다.

도 10~12는 귀뚜라미, 매미눈꽃 동충하초, 맹충 글라이코자미노글라이칸에 대한 HPLC 크로마토그람 결과를 나타낸다.

도 10~12의 retention time과 헤파란 황산계열 표준품의 retention time(도 13)을 비교한 결과 서로 일치하여 곤충 글라이코자미노글라이칸을 구성하는 이당류는 헤파란황산 이당류로 추정하였다.

도 14는 매미눈꽃동충하초글라이코자미노글라이칸을 효소분해시킨 반응물을 강이온교환컬럼 HPLC주입시 나오는 크로마토그람으로서, 표준품인 헤파린 이당류에 해당하는 retention time을 기록한 그림이다.

(5-5) NMR 분석

실시예 1에서 제조한 곤충 글라이코자미노글라이칸에 대한 NMR분석을 하였다.

약 1mg의 시료를 99.96%의 D₂O에녹여서 고자장핵자기공명(NMR)을 이용하여 분석하였다. 사용된 NMR은 고자장 1H-, 13C- 2-COSY NMR (Avance 600 147FT, Brucker, 독일)제품으로 VAX32컴퓨터가 연결된 600MHz스펙트로미터를 사용하여 실시하였다. 케미칼 시프트는 내부 표준 물질인 3-트리메틸실릴[2H4]프로피온산나트륨에 대해서 ppm으로 나타내었다.

강랑 글라이코자미노글라이칸(0M), 광대노린재 글라이코자미노글라이칸(0.5M), 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(0.5M), 누에 글라이코자미노글라이칸(1M)에 대한 1H-NMR과 2D COSY NMR을 각각 도 15~22에 나타내었다. 도 15, 17, 19, 21은 각각 강랑, 광대노린재, 귀뚜라미, 누에 글라이코자미노글라이칸의 1H-NMR결과이고, 도 16, 18, 20, 22는 각각 강랑, 광대노린재, 귀뚜라미, 누에 글라이코자미노글라이칸의 2D COSY NMR 결과이다.

곤충에서 분리정제한 글라이코자미노글라이칸은 분자량이 5천이상의 거대분자로서 NMR 분석시 수많은 피크를 일일이 J value 정산하는 것은 쉽지 않으므로, 본 실시예에서는 분리정제한 조글라이코자미노글라이칸의 헤파란 황산 계열과 일반적인 패턴과 일치하는 것을 확인하였으며 저분자량의 글라이코자미노글라이칸을 제조하여 구조분석을 도모하였다. 저분자화후 고성능액체크로마토그라피를 위한 곤충글라이코자미노글라이칸의 시료전처리과정은 3가지로 나누어져 이루어졌다. 첫 번째로 산성당분석 방법으로서 0.1M HCl에 녹인 후 80도씨에서 1시간 반응시켜 냉각후 질소가스로 건조하여 산성당 시료분석법과, 2번째 방법으로서 6N HCl에 시료를 녹인 후 100℃에서 4시간 반응후 냉각 후 질소가스로 건조하여 아미노당 시료를 분석하는 방법과, 3번째 방법으로서 2M 삼불화초산(trifluoroacetic acid, TFA)에 시료를 녹인 후 100℃에서 4시간 반응 냉각 후 질소가스로 건조하여 중성당 시료를 전처리하여 HPLC(Dionex, Summit, 미국)에 주입하여 분석하였다. 이때 컬럼은 강이온교환 컬럼(페노믹스, 미국), 염화나트륨 0.1M-1.6M 구배, 232nm UV 검출기 또는 다이넥스, Carbopac PA1(단당류), Carbopac PA10(이당류이상 올리고당), 16mM-0.3M 수산화나트륨구배 ECD 검출기(ED50, 금전극, Dionex, 미국)로 단당류, 이당류 등 올리고당분석을 실시하였다. 표준품으로는 전부 시그마제품으로 D-글루코자민 하이드로클로라이드, N-아세틸-D-갈락토자민, D-글루쿠론산, D--갈락쿠론산, D-(+)-갈락토자민 하이드로클로라이드, N-아세틸-D-글루코자민, N-아세틸-D-글루쿠론산,N-아세틸-D--갈락쿠론산, N-acetylneuramic acid(=sialic acid), N-acetylmuramic acid 등을 사용하여 컬럼을 통과하여 검출기에 인식되는 retention time을 곤충 글라이코자미노글라이칸 가수분해물과 비교분석하였다.

(5-6) 구조분석

상기 HPLC 데이터로부터는 글라이코자미노글라이칸 분해효소처리 후 HPLC 에 주입하여 표준품과 일치를 확인한 heparin 이당류구조와 산가수분해(HCl 0.1M)시켜 SAX-HPLC (UV232 nm), HPLC-ECD, GC-MS로 분석한 단당류구조를 표준품과 비교하면서 얻어진 단당류, 이당류 retention time과 GC-MS의 fragement로부터 실시예 1에서 제조한 곤충 글라이코자미노글라이칸의 구조를 분석하였다.

귀뚜라미, 강랑, 광대노린재, 매미눈꽃동충하초에 대한 글라이코자미노글라이칸 올리고머의 구조를 도 23에 나타내었다. 도 23의 Gb는 귀뚜라미, CA는 강랑, P는 광대노린재, IS는 매미눈꽃동충하초를 의미한다. 그 결과 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및 ΔUA-GlcNAC-UA-GlcNS-UA-GlcNAC6S 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸 중에서 선택된 하나 이상으로 이루어지고, 강랑 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-2S-[1-4]GlcN의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸으로 이루어지고, 광대노린재 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-GlcNAC 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및 ΔUA-GlcNS의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸 중에서 선택된 하나 이상으로 이루어지며, 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸은 ΔUA-GlcNS 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸, 및 ΔUA-2S-GlcN의 반복구조를 갖는 글라이코자미노글라이칸 중에서 선택된 하나 이상으로 이루어짐을 알 수 있다.

<실시예 2> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 항암 효과

실시예 1에서 제조한 누에 글라이코자미노글라이칸(조)과 광대노린재 글라이코자미노글라이칸(0.1M, 0.5M분획), 강랑 글라이코자미노글라이칸(0M분획), 귀뚜라미글라이코자미노글라이칸(0.5M) 분획을 멸균생리식염수에 녹여 1 mg/ml, 100μg/ml, 10 μg/ml농도로 사용하였다. 각각의 글라이코자미노글라이칸의 대장암세포(CT-26 세포주; 서울대암센타 세포주은행), 자궁암 세포(L929세포주; 서울대암센타 세포주은행)와 정상세포(CHO세포주; 서울대암센타 세포주은행)에 대한 독성을 측정하기 위해 XTT[sodium 3'-[1-(phenylamino-carbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzene sulfonic acid hydrate kit solution(Boehringer Mannheim)]어세이로 2일 배양 후 세포 생존율을 분석하였고, 그 결과값을 IC₅₀(50% inhibitory concentration)로 환원하였다. 상기 각각의 세포주는 5% CO₂, 37℃의 조건으로 배양하여 사용하였다.

그 결과를 하기 표에 나타내었다. 참고로 표에서 0.5M-1, 0.5M-2 분획은 같은 peak 분획을 튜브에 모을때 한튜브에 부피가 커서 다른 튜브로 담아 동결건조하여 시료로 사용할 때 부가하는 분획튜브별 번호이다. 상기 결과로부터 누에 글라이코자미노글라이칸, 광대노린재 글라이코자미노글라이칸, 강랑 글라이코자미노글라이칸, 귀뚜라미글라이코자미노글라이칸은 각각 정상세포에 독성을 나타내지 않는 반면, 암세포는 저해하여 항암 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 특히 광대노린재 글라이코자미노글라이칸 0.5M분획과 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 0.5M 분획, 누에 글라이코자미노글라이칸 1M분획이 CHO 세포(정상세포)에는 독성이 적고 암세포에 독성이 강하여 유효한 항암활성을 가짐을 알 수 있다.

[표 7] 곤충글라이코자미노글라이칸의 암세포저해 효과

<실시예 3> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 항응혈 효과 확인

실시예 1에서 제조한 호박벌여왕벌, 서양뒤영벌 여왕벌, 강랑, 누에 수번데기, 매미눈꽃동충하초, 맹충, 귀뚜라미, 누에 글라이코자미노글라이칸를 용매 인산완충액식염수(PBS)에 용해시킨 용액을 시료(sample)로 하여 활성된 부분 트롬보플라스틴시간(Activated Partial Thromboplastine Time; APTT)과 트롬빈 시간(thrombin time)을 측정하여 항응혈 효과를 확인하였다.

1) 활성된 부분 트롬보플라스틴 시간(Activated Partial Thromboplastin Time; APTT) 측정

APTT시약(시그마 Allexin)을 37℃에서 가온한 후, 플라즈마와 시료를 2:1로 섞어 APTT를 넣고 37℃에서 항온배양(incubation)한 후, 0.02M CaCl2를 넣고 응고시간을 측정하였다.

2) 트롬빈 시간(thrombin time; TT) 측정

피브리노겐(시그마 제품) 250ul를 미리 37℃로 가온한 후, 트롬빈(시그마 제품, 10U/ml)과 시료를 1:1로 섞어 37℃에서 반응시킨 후 피브리노겐에 넣고 응고시간을 측정하였다. 비교물질로는 헤파린을 사용하였고, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.

3) Antithrombin(AT) III time 측정

트롬빈시간측정에서 사용하는 시료 30 ul대신 27ul시료에 Antithrombin 10U/ml 3 ul 첨가하여 트롬빈시간측정 조작을 같게 하였다.

[표 8]

표 중 BiQGAG는 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸, BtQGAG는 서양뒤영벌 여왕벌글라이코자미노글라이칸, CmGAG는 강랑(쇠똥구리)글라이코자미노글라이칸, PswG는 누에수번데기 글라이코자미노글라이칸을 의미하며, control은 대조군으로 용매이며, Crude는 조 글라이코자미노글라이칸, Separation Solvent Conc.는 조글라이코자미노글라이칸을 염경사구배 정제시 나오는 분획의 농도를 의미한다.

상기 결과로부터 다양한 곤충 글라이코자미노글라이칸이 항응혈시간(APTT, TT)을 연장시켜 항응혈 효과를 가지며, CmGAG>BiQGAG>PswG>BtQGAG 순으로 효과적임을 알 수 있다.

또한, 하기 표에 결과를 나타내었다.

[표 9]

표 중 IsGAG는 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸, TbGAG는 맹충글라이코자미노글라이칸, GbGAG는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, SWG는 누에 글라이코자미노글라이칸을 의미하며, control은 대조군으로 용매이며, Crude는 조 글라이코자미노글라이칸, Separation Solvent Conc.는 분획의 농도를 의미한다. 모든 실험결과는 Student's t-test로 통계처리하였으며, *는 p<0.5인 경우, **는 p<0.01인 경우를 의미한다. 상기 결과로부터 다양한 곤충 글라이코자미노글라이칸이 항응혈시간(APTT, TT)을 연장시켜 항응혈 효과를 가지며, GbGAG>TbGAG>IsGAG>SWG 순으로 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 4> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 항당뇨 효과 확인

1) 강랑 글라이코자미노글라이칸 항당뇨 효과

6주령 당뇨쥐(중앙실험동물, 대한민국)를 충분히 당뇨병이 발현될 수 있도록 4주간 사육하여 36.44±1.39g의 10주령 당뇨쥐(C57BLKS/j-db/db)를 준비하였다. 상기 쥐를 군당 7마리씩 3군으로 나누어, 투여첫날(1st day)에 20mg/kg, 익일(2nd day) 10mg/kg 용량으로 시료를 경구 투여하였다. 시료는 실시예 1의 조 강랑글라이코자미노글라이칸을 인산완충액식염수(PBS)에 용해시켜 사용하였다.

대조군(control)엔 생리식염수를 상기 시료와 동일 용량으로 경구투여하였으며, 나머지 한 군에 대해서는 다이아벡스(Diabex, 염산메트폴민, 머크상품-대웅제약판매)를 PBS에 용해시켜 30mg/kg용량으로 상기 시료와 동일한 방법으로 경구투여하였다. 각각의 군에서 투여첫날과 익일 각각 투여후 2시간 경과 후 혈당을 측정하였다. 혈당의 측정은 혈당 키트(로쉬사)를 사용하여 사용설명서에 따라 실시하였다.

그 결과를 도 24에 나타내었다. 도의 세로축의 Blood glucose는 혈당을 의미하며, 가로축은 처리군을 의미한다. 그 결과 강랑 글라이코자미노글라이칸(CmG)은 418.1mg/dl에서 153.7mg/dl로 63.24% 혈당을 감소시키는 효과를 나타냄을 알 수 있다. 이와 달리 다이아벡스(Diabex)는 480.9mg/dl에서 464.0mg/dl로 3.61% 낮추는데 그쳤다.

2) 매미눈꽃동충하초, 귀뚜라미, 및 맹충 글라이코자미노글라이칸의 항당뇨 효과

평균체중 38.36±0.62g인 10주령 당뇨마우스(C57BL db/db; 중앙실험동물, 대한민국)가 14주령될 때까지 군을 나누어 한 달간 실시예 1에서 제조한 조 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸, 조 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, 조 맹충 글라이코자미노글라이칸을 5 mg/kg 용량으로 경구투여하였다. 대조군에 대하여 동일한 용량으로 생리식염수를 경구투여하였다. 혈당측정은 상기 1)과 동일한 방법으로 측정하되, 측정시간을 투여 후 1시간으로 하여 측정하였다.

그 결과를 도 25와 도 26에 나타내었다. 도 25는 조 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸(ISG) 투여시 시간에 따른 혈당량 변화를 나타낸 그래프이고, 도 26은 한달 경과시 각각의 글라이코자미노글라이칸 투여에 따른 혈당량 감소를 나타낸 그래프이다.

그로부터, 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸(IsG)이 21.23%감소, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(GbG)이 5.12%증가, 쇠등에(맹충) 글라이코자미노글라이칸(TbG)이 0.2% 증가하였음을 알 수 있다.

또한, 혈액을 채취하여 녹십자의료재단에 의뢰하여 혈청학적 검사를 실시하였다. 중성지질은 Bayer(USA) kit, Lipase, GK, GPD, 발색법으로; total, Cholesterol은 Bayer(USA) kit, cholesterol 시약을 이용하고; HDL cholestrol은 Bayer(USA) kit, direct HDL-Cholesterol시약을 이용하여 분석기기(ADVIA 1650, Bayer, Japan)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.

[표 10] 한달간 곤충글라이코자미노글라이칸을 당뇨쥐(db)에 경구투여한 후 혈청변화

a CON : PBS 인산완충식염수 단독투여군

b ISG: 매미눈꽃동충하초(Isaria sinclairii)글라이코자미노글라이칸5 mg/kg

cGbG: 귀뚜라미(Gryllus bimaculatus) glycosaminoglycan 5 mg/kg

dTbG: 맹충(Tabaus bivittatus) glycosaminoglycan 5 mg/kg

곤충글라이코자미노글라이칸을 5 mg/kg씩 당뇨(db/db) 마우스에 한달간 경구투여한후 도태시켜 혈청을 채취하여 분석한 결과 중성지질(triglyceride)은 대조군 대비 투여군에서 감소하고 , HDL-Chol: 고밀도리포프로테인-콜레스테롤은 별차이 없으면서 T. Chol(토탈콜레스테롤)은 대조군 대비 투여군에서 감소하는 것으로 나타났다. 이 결과로서 콜레스테롤을 저하시키면서 중성지방을 억제하면서 당뇨를 개선하는 상당히 진보된 당뇨약의 기전을 보여주었다.

모든 실험결과는 Student's t-test로 통계처리하였으며, 상기 표의 결과는 P<0.05이다.

이 결과로부터 대조군 대비 중성지질의 감소는 본 발명의 곤충 글라이코자마노글라이칸이 항당뇨 효과를 가짐을 나타낸다.

<실시예 5> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 소염 효과 확인 I

1) 실험동물 및 사육조건

7주령 226.5±20.5g의 SD 랫 숫컷(샘타코)을 온도 23±2도, 습도 55±10%, 12시간 조명주기의 조건하에서 사육하여 실험동물을 준비하였다. 이 때 물과 사료는 자유로이 섭취할 수 있도록 하였다. 1주간 적응 후 군당 7마리씩 체중을 비슷하게 군을 나누어 실험하였다.

2) 검액의 제조 및 시료 투여

생리식염수 0.9% NaCl를 복강에 주사기로 투여한 군을 음성대조군으로 하였다. 실험적 만성염증모델을 위해 CFA(complete Freund's adjuvant, Sigma사) 100 ㎕를 랫 발바닥의 표피 내로 주사하여 염증을 유발하였다.

약물처리군은 모두 CFA 주사 30분 전에 약물을 복강 투여하였다. 시료는 실시예 1의 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸(1M 분획), 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(0.5M분획), 맹충 글라이코자미노글라이칸(0.5M 분획), 조 강랑 글라이코자미노글라이칸 각각을 2 mg/kg의 비율로 생리 식염수에 녹여 투여 시료로 사용하여 7일간 반복 연속 복강투여하였다.

양성대조물질로 인도메타신(indomethacin)을 사용하였으며, 1 mg/kg 용량으로 100mM 탄산나트륨에 녹인 후 생리식염수에 희석하여 복강투여하였다.

3) 발바닥 부종측정

발바닥 부종의 측정은 왼쪽 뒷발에 CFA로 염증을 유도한 후 시간별로 대조군, 염증군과 약물군으로 나누어 발바닥 가로 크기를 digmatic caliper(Mitutoyo Corporation, Japan) 재어서 비교하였다. 측정시간은 CFA 염증유발 당일 1시간, 3시간, 5시간, 그 다음날인 2일, 3일, 4일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 14일로 하여 CFA 투여 전에 측정값을 대조군으로 삼아 부종의 변화를 그래프로 표시하였다. 그 결과를 도 27에 나타내었다. 도 27은 시간 경과에 따른 발 크기 변화를 나타낸 그래프로, 모든 데이타는 P<0.01이었다.

상기 결과로부터 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸{1M 분획, ISG(1M)}, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸{0.5M분획, GbG(0.5M)}, 맹충 글라이코자미노글라이칸{0.5M 분획, TbG(0.5M)}, 조 강랑 글라이코자미노글라이칸(CAG) 모두 발바닥 부종을 감소시키며, TbG>GbG>ISG>CAG 순서로 효과적임을 알 수 있었다.

4) 조직병리학적 관찰

14일째, 관련 염증 유발쪽 발신경이 연결된 5번 요추 척수신경절(DRG)과 척수(spinal cord), 5번 요추와 연결된 염증발쪽 뼈와 반대 발쪽 뼈를 실험군마다 적출하여, 중성포르말린에 고정 후 H&E(Hematoxylin-eosin) 염색한 후, 현미경으로 병리조직을 관찰하고 촬영하였다. DRG에 대한 결과를 도 28에 나타내었다.

도 28은 대조군(CON), CFA 단독 투여군(CFA), 매미눈꽃 동충하초 글라이코자미노글라이칸 투여군(ISG), 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 투여군(GbG), 맹충 글라이코자미노글라이칸 투여군(TbG), 조 강랑 글라이코자미노글라이칸 투여군(CAG), 인도메타신 투여군(IND)에 대한 병리조직을 촬영한 사진이다.

상기 사진으로부터 CFA투여에 의해 관절면이 파괴된 것을 관찰할 수 있으며, ISG, GbG, CaG 투여군은 치료된 것을 관찰할 수 있고, TbG, IND 투여군에선 불완전한 상태로 일부 치료된 것을 확인할 수 있다.

따라서, 곤충 글라이코자미노글라이칸이 소염작용을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 6> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 소염 효과 확인 II

실시예 1에서 제조한 조 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸, 조 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸, 조 강랑 글라이코자미노글라이칸을 각각 5mg/kg씩 14일간 매일 투여한 것을 제외하고, 상기 실시예 5의 1)~3)과 동일한 방법으로 실시하였다.

그 결과를 도 29에 나타내었다. 도 29는 시간 경과에 따른 발 크기 변화를 나타낸 그래프로, 모든 데이타는 P<0.001이었다.

상기 결과로부터 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸(BtQG), 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸(BiQG), 강랑 글라이코자미노글라이칸(CaG) 모두 발바닥 부종을 감소시키며, 특히 서양뒤영벌 글라이코자미노글라이칸 투여시 우수한 소염(발부종 억제)효과를 확인하였다.

<실시예 7> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 소염 효과 확인 III

실시예 1에서 제조한 조 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸, 조 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸, 조 강랑 글라이코자미노글라이칸을 각각 5mg/kg씩, 조 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸과 조 맹충 글라이코자미노글라이칸을 각각 2 mg/kg씩 14일간 매일 투여한 것을 제외하고, 상기 실시예 5의 1)~2)와 동일한 방법으로 실시하였다.

그 후, 실험동물에게서 혈액을 채취한 후, 혈청 중 IL-6를 IL-6 측정용 키트(R&D시스템즈, 미국)를 이용하여, 제조자의 사용설명서에 따라 측정하였다. 상기 IL-6는 숙주방어, 급성기 반응, 면역반응, 혈구생성의 중요 역할을 하는 다기능성 싸이토카인으로 정상 및 변형된 림파구와 비임파구세포의 다양성에 의해 발현되어진다. 올라간 혈청 중 IL-6 수치는 박테리아나 바이러스 감염, 진전, 자가면역질환, 염증과 악성종양 등의 병적 증상에서 보여져 왔다(Hirano, T.(1988)"Interleukin 6" in The Cytokine Handbook, 3rd ed. Academic Press, New York, p197).

그 결과를 도 30과 도 31에 나타내었다. 도 30은 군별 혈청 중 IL-6수치를 나타낸 것으로, CON은 대조군, CFA는 CFA 단독 투여군, BtQG는 서양뒤영벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸 투여군, CmG는 강랑 글라이코자미노글라이칸 투여군, BiQG는 호박벌여왕벌 글라이코자미노글라이칸 투여군, Indomethacin은 인도메타신 투여군을 의미한다. 도 31 역시 군별 혈청중 IL-6 수치를 나타낸 것으로, CON은 대조군, CFA는 CFA 단독 투여군, GbG는 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸 투여군, TbG는 맹충 글라이코자미노글라이칸 투여군, IND는 인도메타신 투여군을 의미한다.

상기 결과로부터 다양한 곤충 글라이코자미노글라이칸이 IL-6 분비를 억제함을 알 수 있고, 특히, 호박벌여왕벌글라이코자미노글라이칸그로부터 우수한 소염효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

<실시예 8> 곤충글라이코자미노글라이칸의 혈관 확장 효과 확인

(1) eNOS(Endothelial nitric oxide synthase) 활성 측정

내피세포의 산화질소합성효소 증가에 의해 혈관이 확장되므로, 곤충 글라이코사미노글라이칸 투여시 내피세포성 산화질소합성효소(Endothelial nitric oxide synthase) 활성을 하기와 같이 실험하였다.

인간복강벽혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell; HUVEC)을 Clonetics EBM-2와 ECM-2 singlequots(CAMBREX (Walkeresvillie, MD, USA) 배지로 계대배양하여 세포가 성장단계에 이르면 세포를 긁어모아 세포현탁액(2x10⁶cells/ml)을 만들고, 이 현탁액에 상기 실시예 1에서 제조한 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 0.5, 1, 2.5M분획, 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획을 각각 20mg/ml의 용량으로 첨가하여 96well plate에서 37℃, 5% CO₂ 및 가습 조건으로 40시간 배양한 상등액 중에서 내분비된 내피세포성 산화질소합성효소(Endothelial nitric oxide synthase; eNOS) 활성을 측정키트(R&D 시스템즈, 미국)로 측정하였다. 또한, 시료와 동일 용량의 heparin을 처리하여 양성대조군으로 하였고, heparin 및 시료 처리를 하지 않고 HUVEC를 배양한 세포 배지에 대하여 동일한 방법으로 측정하여 대조군으로 하였다.

그 결과를 도 32에 나타내었다. 도 32는 곤충글라이코자미노글라이칸의 eNOS 활성을 나타낸 결과로 G0.5, G1, G2.5는 각각 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 0.5, 1, 2.5M분획, T0.1, T0.5, T1, T2.5는 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획을 의미한다. Heparin은 heparin 처리군이고, Media는 대조군을 의미한다.

상기 결과로부터 귀뚜라미, 쇠등에 글라이코사미노 글라이칸이 내피세포성 산화질소합성효소 활성을 증가시켜 NO산생을 촉진시키고 그로 인해 혈관의 확장을 촉진시킴을 알 수 있다.

(2) NO 산생효과

NO 산생은 Nims 등(Nims, et al. Methods 7, 48-54, 1995)의 방법에 따라, 그리스(Grieiess) 시약을 사용하여, 세포배지에서 아질산이온축적으로 측정하였다. 즉, HUVEC(사람 배꼽아래 복부혈관내피세포) 현탁액(10ul/100ul cell)에 실시예 1에서 제조한 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(조, 0.5M분획, 1M분획, 2.5M분획G), 맹충 글라이코자미노글라이칸(0.1M, 0.5M분획, 1M분획, 2.5M분획)을 각각 20 mg/ml 용량으로 처치하여 20시간 배양하고 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 아질산나트륨량의 흡광도를 측정하여 계산하였다. 대조약물로 생체내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside dihydrate (SNP)를 사용하였다.

그 결과를 도 33에 나타내었다. 도 33은 각 곤충글라이코자미노글라이칸 처리군별 NO산생량을 나타낸 그래프로, GbGcrude, GbG0.5, GbG1, GbG2.5는 각각 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 조, 0.5M 분획, 1M 분획, 2.5M분획 처리군을 의미하며, T0.1, T0.5, T1, T2.5는 각각 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1M분획, 0.5M분획, 1M분획, 2.5M분획 처리군을 의미한다. 또한, Heparin은 헤파린 처리군, cell은 시료 또는 헤파린 등을 처리하지 않은 대조군을 의미한다.

상기 결과로부터 귀뚜라미, 쇠등에 글라이코사미노 글라이칸이 혈관내피세포의 NO산생을 촉진시키고 그로 인해 혈관의 확장을 촉진시킴을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 곤충글라이코자미노글라이칸은 혈관확장 작용을 나타냄을 알 수 있으며, 구체적으로 혈관확장반응의 기능장애로 인한 질환인 고혈압, 뇌졸중, 뇌출혈, 허혈성 심질환, 및/또는 레이노병 등의 예방 및/또는 치료 작용을 갖는다(대한민국 특허 제10-0519950 참조).

<실시예 9> 곤충글라이코자미노글라이칸의 혈관신생 억제 효과 확인

곤충글라이코자미노글라이칸의 혈관신생(angiogenesis)과 관련된 암 등의 질환 치료 및/예방 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험하였다(안미영, 비장세포로부터 cytokine 분비에 미치는 영향, 생약학회지, 37, 110-115, 2006, 2006년 6월 30일 참조).

인간복강벽혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial cell; HUVEC)을 Clonetics EBM-2와 ECM-2 singlequots(CAMBREX (Walkeresvillie, MD, USA) 배지로 계대배양하여 세포가 성장단계에 이르면 세포를 긁어모아 세포현탁액(2x10⁶cells/ml)을 만들고, 이 현탁액에 상기 실시예1에서 제조한 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸의 0, 0.1, 1, 2.5M분획, 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 0.5, 1, 2.5M분획, 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획을 각각 20mg/ml의 용량으로 첨가하여 96well plate에서 37℃, 5% CO₂ 및 가습 조건으로 48시간 배양한 상등액 중에서 분비된 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)를 Quantikine VEGF Immunoassay kit (R&D systems, Minneapolis, USA)로 측정하였다. 또한, 시료와 동일 용량의 heparin을 처리하여 양성대조군으로 하였고, heparin 및 시료 처리를 하지 않고 HUVEC를 배양한 세포 배지에 대하여 동일한 방법으로 VEGF를 측정하여 대조군으로 하였다.

그 결과를 도 34에 나타내었다. 도 34는 곤충글라이코자미노글라이칸의 혈관내피세포에 대한 VEGF 활성을 나타낸 결과로 I0, I0.1, I1, I2.5는 각각 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸의 0, 0.1, 1, 2.5M분획을 의미하고, G0.5, G1, G2.5는 각각 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 0.5, 1, 2.5M분획, T0.1, T0.5, T1, T2.5는 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획을 의미한다. Heparin은 heparin 처리군이고, Media는 대조군을 의미한다.

활성에 관여하는 곤충글라이코자미노글라이칸은 없었으며, 특히 귀뚜라미, 쇠등에 글라이코사미노 글라이칸들이 혈관내피성장인자를 촉진시키지 않았다.

따라서, 본 발명의 곤충글라이코자미노글라이칸은 혈관신생 억제효과를 나타냄을 알 수 있으며, 구체적으로 혈관신생에 의해 매개되는 암의 성장과 전이, 혈관종, 혈관섬유종, 관절염, 당뇨병성 망막증, 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막질환, 퇴화반, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및/또는 치료 작용을 갖는다(대한민국 특허 제10-0500298호 참조).

<실시예 10> 곤충 글라이코자미노글라이칸의 염증성 매개인자 TNF-α 억제 효과 확인

염증의 진행정도와 밀접하게 관련되어 있는 염증성 매개인자인 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)의 활성을 하기와 같이 측정하여 곤충 글라이코자미노글라이칸의 소염활성을 측정하고자 하였다.

쥐(BALB/c, 6주령, 암컷, 중앙실험동물, 대한민국)에서 분리한 비장세포의 현탁액 200uL당 실시예 1에서 제조한 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸(조, 0, 0.1, 1M분획), 맹충 글라이코자미노글라이칸(조, 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획), 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸(조, 0.5, 1, 2.5M분획)을 20ul씩 1mg/ml, 100ug/ml, 10ug/ml용량으로 96웰(well)에 투여하여 24시간 5% 이산화탄소 배양기에 배양 후, mTNF-α(mouse Tumor necrosis factor alpha) 활성을 Quantikine Mouse TNF-αImmunoassay kit(R&D systems, USA)로 제조자가 제공한 사용설명서에 따라 측정하였다.

그 결과를 도 35, 36에 나타내었다. 도 35와 도 36은 투여군별 mTNF-α 농도를 나타낸 것으로, I0M, I0.1M, I1M은 각각 매미눈꽃동충하초 글라이코자미노글라이칸의 0, 0.1, 1M분획을 의미하고, T0.1, T0.5, T1, T2.5는 맹충 글라이코자미노글라이칸의 0.1, 0.5, 1, 2.5M분획을 의미하고, G0.5, G1, G2.5는 각각 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸의 0.5, 1, 2.5M분획을 의미하고, TbG는 조 맹충 글라이코자미노글라이칸, GbG는 조 귀뚜라미 글라이코자미노글라이칸, ISGAG는 조 매미눈꽃동충하초를 의미하며, 각 군의 막대그래프는 좌에서 우로 1mg/ml, 100ug/ml, 10ug/ml 용량 투여군을 의미한다.

그 결과, 다양한 곤충 글라이코자미노글라이칸은 농도의존적으로 TNF-α(Tumor necrosis factor alpha)의 활성을 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 곤충 글라이코자미노글라이칸은 TNF-α를 억제함으로써, 소염작용 등을 나타냄을 알 수 있다.

Claims

(a) 쇠등에, 서양^-뒤영벌 여왕벌 또는 호박벌여왕벌 중에서 선택된 곤충을 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸알콜, 에틸알콜, 프로판올, 부탄올, 아세토니트릴, 클로로포름 및 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용매에 1~4일 침지하여 지방류를 제거하고 여과하여 걸러지지 않는 잔사를 건조하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 건조된 잔사를 볼밀(ball mill)로 100~300메쉬 입경으로 분쇄하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 수득한 분쇄물을 탄산수소나트륨용액(pH 9.0)에서 2 내지 5 중량%의 단백분해제로 처리하여 분쇄물 중 단백질을 분해하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 분해된 단백질을 트리클로로아세트산(5중량%)으로 원심분리에 의해 제거하는 단계;
(e) 상기 (d)단계에서 단백질 제거 후 남은 잔사를 에탄올과 포타슘 아세테이트 또는 소듐 아세테이트로 당을 공침시키고, 다시 침전물을 세틸피리디늄에 침전시킨 후, 다시 침전물을 에탄올에 침전시키는 단계; 및
(f) 상기 (e)단계에서 생성된 침전을 증류수로 투석하는 단계를 포함하는 곤충글라이코자미노글라이칸의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) ~ (f)단계를 반복하여 산성당 분획을 수집하여 순도를 전기영동에 의해 결정하고, 이온교환크로마토그라피를 거치고 염경사(salt gradient; 0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl in phosphate buffer)로 정제한 후 우론산을 포함하는 분획을 수집하는 단계를 추가로 거치는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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