KR101546752B1

KR101546752B1 - 산화질소생성을 유도하는 자이리톨유도체의 반복단위구조를 가지는 뒤영벌유충 유래 다당폴리머

Info

Publication number: KR101546752B1
Application number: KR1020120140500A
Authority: KR
Inventors: 안미영; 황재삼; 윤형주; 윤은영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2015-11-23
Also published as: KR20140073000A

Abstract

본 발명은 산화질소생성을 유도하는 자이리톨유도체의 반복단위구조를 가지는 뒤영벌 유충 유래 다당폴리머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서양뒤영벌 유충을 마쇄한 후, 암모늄황산을 처리하여 단백질을 침전시킨 다음, 원심분리하여 침전물과 상등액을 겔여과 크로마토그라피, 음이온교환 크로마토그라피, 증류수 투석 및 동결건조를 거쳐서 제조된 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당체의 반복단위구조를 가지며 벌집구조상배열을 이루는 산화질소 생성 유도 활성을 가지는 다당폴리머, 및 상기 다당폴리머를 이용한 산화질소 생성제 또는 혈관 확장 및 이완제에 관한 것이다.

Description

산화질소생성을 유도하는 자이리톨유도체의 반복단위구조를 가지는 뒤영벌유충 유래 다당폴리머{THE GLYCAN POLYMER DERIVED FROM E.TERRESTRIS LARVAE INDUCED PRODUCTION OF NITRIX OXIDE, HAVING REPEATING UNIT OF ZYLITOL DERIVATIVES}

본 발명은 세포에서 산화질소생성을 유도하는 자이리톨 유도체의 반복단위구조를 가지는 뒤영벌 유충 유래 다당폴리머 및 이의 용도에 관한 것이다.

일산화 질소(nitric oxide, 이하 'NO'라 함)에 관한 연구는 Furchgott)와 Zawadszki에 의해 1980년에 시작된 후, 급속도로 발전된 연구분야 중 하나이다. NO의 생합성 등에 대한 기본적인 사항은 1990년대 초에 이르러 많이 밝혀졌고, 최근 수년에 걸쳐서는 질병의 병태나 치료의 측면에서 일산화질소(NO) 연구가 급격하게 증가하여, 현재는 의학연구가, 임상의들이 가장 큰 관심을 두고 있는 분야 중의 하나라 할 수 있다.

일반적으로 NO와 질환 간의 관계를 말한다면, NO에 대한 연구의 시작이 혈관순환계에서 비롯된 것임에도 불구하고, 현재 NO는 자율신경, 내분비계, 중추신경계, 면역관계 및 신생물을 망라한 의학의 전분야에서 연구 및 임상에의 응용이 시도되고 있다. 질환치료의 임상에서는 120년 이전부터 니트로글리세린(nitroglycerin)이 협심증의 치료약으로 유효하다는 보고가 있은 이래, 그 작용기전은 불명확하나 NO를 공급하는 약물을 심장병의 치료약으로 사용하여 왔다. 또한 NO 및 NO 관련물질은 사람의 본태성고혈압, 폐성고혈압과 신성고혈압을 경감시키는 작용을 하며, 사람의 관상동맥질환(허혈성 심질환)의 치료를 위해서는 필수적으로 조제되어지는 물질이다.

현재 NO 생성약물(NO donor)이 치료 약물로 인정되고 있는 질환으로는 대표적으로 협심증, 심근경색, 고혈압 등이 있으며, 내복약 이외에 주사제, 패치제(patch), 설하제, 스프레이제, 흡입제 등의 응용도 시도되고 있다. 그 외에도 남성의 임포턴스도 일산화질소(NO)와 연관이 있는데, 최근에 파이자(社)에 의해 개발되어 사회의 이목을 집중시킨 바이아그라 또한 NO와 직접적으로 관련이 있는 약물이다. 앞으로의 연구 테마는 NO를 생성시킬 수 있는 물질 중 저렴하고 안정성 및 안전성 높은 물질을 발견하는 방향으로 점차 집중되고 있다.

대표적인 NO 생성약물의 용도는 혈관 이완제인데, 일반적으로 순환기 계통의 장애로 인하여 발생하는 고혈압, 뇌일혈, 동맥경화, 혈액순환 장애, 신경통, 성기능 장애, 기억력 장애 등 질환에 대한 예방 및 치료에 있어서 혈관 이완제는 가장 필수적 처방이다. 따라서 전세계적으로 지금까지 수많은 혈관 이완제가 개발되어 왔으며, 최근에는 이를 응용하여 바이아그라 등 성기능 장애를 극복하는 용도로만 한정하여 시판하는 약제도 다수 개발되어 있는 상태이다. 이러한 혈관 이완제는 크게 화학적 약품과 생약으로 크게 대별할 수 있다.

그러나 종래의 NO 생성제 또는 혈관 이완제는 생체 내에서 의도하지 않았던 부작용, 예를 들면 내피 손상, 용혈, 급성 독성이나 어독성 등과 급성 신장염, 심장마비 등을 발생시키는 경우가 많고, 생산 공정이 매우 까다로워서 대량 생산이 곤란한 점이 있었다. 특히 그 중 바이아그라 등 화학적 혈관 이완제 약품은 심장마비 등 몇 가지 생명에 치명적인 부작용이 보고되고 있는 형편이어서 현재로서는 안전한 사용을 보장할 수 있는 상태는 아니라 할 수 있다.

한편, 뒤영벌은 벌목(Hymenoptera), 꿀벌과(Apidae), 뒤영벌아과(Bombidae), 뒤영벌족(Bombini)에 속한다. 북반구의 온대와 아한대를 중심으로 서식하며, 한랭 다습한 기후에 적응한 사회성 곤충으로서 전세계적으로 약 239종이 분포되어 있다. 화분 매개 곤충인 뒤영벌은 대부분 유럽, 아시아 및 북미의 온대지역을 중심으로 널리 서식하고 있다. 뒤영벌은 크기가 크고 활동적이어서 꽃가루 수정 능력이 탁월하고 흐리거나 추운 날씨, 온실과 같이 좁은 공간에서도 활동성이 높아 환경적 제약이 적다. 또한 꿀이 나지 않는 무밀식물에 대하여도 수정 능력이 뛰어나고, 공격성이 약하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 뒤영벌로 수정시킨 과일은 열매가 크고 당도와 신도가 증가하여 품질이 향상되므로 뒤영벌에 의한 화분 매개 작물은 농가 수익에 크게 기여한다.

지금까지 벌 유충 또는 이의 추출물에 대해서, '벌 유충 또는 그 추출물을 함유하는 식품조성물'(대한민국 등록특허번호 10-523247), '벌 유충 또는 그 추출물을 함유하는 조성물'(대한민국 등록특허번호 10-0576972)은 벌 유충 포함 봉군, 벌집을 사용하였다고 기재하고 있으며, '소염 효과를 가지는 벌목곤충 추출물'(대한민국 등록특허번호 10-1071155)은 여러 세대를 반복 계대 사육 후 나오는 호박벌여왕벌과 서양뒤영벌 여왕벌을 에탄올로 초음파추출 농축 후 건조하여 나오는 추출물에 대하여 실험동물 랫트 쥐 발바닥 부종을 complete Freund's adjuvant로 유발시킨 후 시료투여를 8일간 실시하고 염증억제 효과가 있음을 기재하고 있다. 또한, 예전에는 호리병벌을 '열용'이라는 한약재명으로 중국에서 부르고 성충을 데쳐 옹종에 사용한 기록이 있다(곤충류약물도감, 2002년, 신일출판사, 최정, 안미영, 이영보, 류강선).

이에, 본 발명자들은 서양뒤영벌 유충의 유용한 용도에 대해 연구하던 중, 서양뒤영벌 유충을 마쇄, 침지, 초음파투과에 의한 저분자 용출을 극대화시킨 후, 암모늄황산에 의한 단백질을 침전시킨 다음, 원심분리 후 상기 침전물과 상등액을 겔여과 크로마토그라피, 음이온교환 크로마토그라피, 증류수 투석 및 동결건조를 거쳐서 자일리톨 유도체인 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당체의 반복단위구조를 가지며 벌집구조상배열을 이루는 다당폴리머를 정제하였으며, 상기 다당폴리머가 우수한 일산화질소 생성 유도 효과를 가지는 것을 확인함으써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 뒤영벌 유충으로부터 분리 및 정제된, 산화질소 생성에 관여하여 혈관 이완 및 확장을 유도하며, 독성이 없는, 다당체의 반복단위가 환 구조를 가지는, 뒤영벌 유충 유래 다당폴리머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 다당폴리머를 이용한 일산화질소 생성제 조성물 또는 혈관 이완 및 확장을 위한 강장제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서양뒤영벌(Bombus terrestris Larvae) 유충의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정용 건강식품을 제공한다.

본 발명은 세포 또는 조직에서 산화질소(NO) 분비에 의한 수축 및 이완 조절제이며 신호전달매개체로 사용될 수 있고, 독성이 없는, 경제적이면서 생체안전한 서양뒤영벌 유충 유래 다당폴리머를 제공한다. 본 발명은 화분매개용으로 도입되는 서양뒤영벌의 폐봉속에 잔존하는 유충과 화분매개의 소기 목적을 달성한 후 얻을 수 있는 뒤영벌 유충의 경제적 가치를 증대시킬 수 있다. 본 발명은 껌, 파스 등의 패치 제제 개발의 조성성분이면서 산화질소를 잘 생산하여 혈관확장을 시켜 조직을 이완시키는 기제로 사용될 수 있으면서 금속 등과 혼합하여 신호전달에 기여할 수 있는 복합신소재를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol)의 구조식을 나타내는 그림이다.
도 2는 서양뒤영벌 유충의 조추출물을 겔여과 크로마토그라피를 실시하여 분리한 분획들에 대하여 비장 및 HUVEC 세포에 대한 산화질소 생성 수준을 나타내는 그래프이다.
도 3은 도 2의 분획들 중 산화질소 생성 수준이 우수한 분획 78 ~ 91을 음이온교환 겔여과 크로마토그라피를 실시하여 분리한 분획들에 대하여 비장 및 HUVEC세포에 대한 산화질소 생성 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 도 3의 분획들 중 산화질소 생성 수준이 우수한 분획 8 ~ 15에 대하여 IEF(Isoelectroric Focusing)을 수행하여 pI(Isoelectric Point)이 6.5인 것을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 5는 도 4의 분획 8 ~ 15에 대하여 SDS-PAGE를 수행한 결과 31 kDa와 45 kDa에서 밴드가 나타나는 것을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.
도 6은 도 4의 분획 8 ~ 15 및 표준(자일리톨)에 대하여 LC/MS 분석 결과의 스펙트럼(spectrum)을 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서양뒤영벌(Bombus terrestris Larvae) 유충의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성제를 제공한다.

상기 추출물은 서양뒤영벌 유충을 물, 알콜, 알콜 수용액 또는 유기용매로 추출한 조추출물인 것이 바람직하고, 황산암모늄으로 추출한 조추출물인 것이 더욱 바람직하나, 상기 용매의 종류 및 추출방법에 한정되지 않는다.

상기 분획물은 서양뒤영벌 유충의 조추출물을 겔여과 또는 이온교환 크로마토그래피로 분리한 분획인 것이 바람직하나, 상기 크로마터그래피에 한정되지 않는다.

상기 추출물 및 분획물은 1,5-anhydro-xylitol, β-D-Xylopyranosyl-β-D-xylopyranoside 및 3-O-β-D-Glucopyranosyl-D-xylose가 포함되는 것이 바람직하고, 1,5-anhydro-xylitol을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 다당폴리머는 황산암모늄 분획(ammonium sulfate fractionation), 겔 여과(gel filtration), 및 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)의 조합을 통해 분리 및 정제할 수 있다.

상기 다당폴리머는 1,5-anhydro-xylitol의 반복단위로 구성되고, 벌집구조의 육각환 구조로 형성되어 있는 것이 바람직하나 상기 구조에 한정되지 않는다.

상기 다당폴리머는

1) 서양뒤영벌 유충을 분쇄한 후, 황산암모늄(ammonium sulfate)을 처리하여 단백질을 침전시킨 다음, 상등액을 제거하여 침전물을 분리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 침전물을 겔 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 정제물을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으나, 상기 제조방법에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 서양뒤영벌 유충을 마쇄 후 암모늄황산 처리로 단백질을 침전시켜 얻은 침전물과 상등액에 대하여 오픈 겔-여과 액체크로마토그라피를 실시하고 HUVEC 내피 세포 및 비장 세포에서 각각의 NO 활성 분획을 포집한 후, 음이온교환 젤여과크로마토그라피를 실시하여 NO 증강 활성분획을 추적한 결과 상등액에서 유효한 NO 증강 물질이 존재하였으며, LC/MS로 구조동정한 결과, 단일물질로서 1,5-anhydro-xylitol의 반복단위구조를 가지며 벌집구조상 배열을 가지는 다당폴리머를 확인하였다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정제를 제공한다.

본 발명에 따른 서양뒤영별 유충의 조 추출물, 이의 분획물, 이의 정제물, 또는 1,5-안하이드로-자일리톨 다당폴리머는 우수한 일산화질소 생성 유도 활성을 가지므로, 일산화 질소 생성 유도에 의한 혈관 확장 및 이완 조절에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면(a) 충진제 및 중량제(예: 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코오스, 만니톨과 규산) (b) 결합제(예: 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈) (c) 흡습제(예: 글리세롤), (d) 붕해제(예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해지연제(예: 파라핀) (f)흡수촉진제(예: 4급 암모늄 화합물), (g) 습윤제(예: 세틸알코올 및 글리세롤모노스테아레이트), (h)흡착제(예:고령토 및 벤토나이트), 및, (i) 윤활제(예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스타레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기(a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효 화합물들을 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 피막을 입힐 수 있으며, 장관 특정부위에 유효 화합물만 방출시키도록 할 수 있으며, 필요한 경우 polymer또는 붕매제 조성물을 사용 서방형으로 제제화할 수도 있다고 미세캡슐화할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 주사제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 좌제는 유제 화합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오지방 등의 지방, 고급에스테르(예: C16-지방산을 갖는 C14-알코올), 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 라우린지 및 글리세롤젤라틴 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효화합물 이외 통상의 부형제, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제로는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로풀루오로히드로카본을 더 함유할 수 있으며, 폴리에틸렌글리콜-4000(PEG-4000)과 글리세린을 함유하는 비강분무제로도 제제화할 수 있다.

액제 및 에멀젼제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 물, 에칠알콜, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에칠아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포롬아미드 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨우, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테티라히드로푸로푸릴 알코올, 포리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균형태로 제제할 수 있다.

현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상희석제(예: 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 현탁제(예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르), 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 또한 발색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유 및 유칼리유 및 감미제(예: 사카린)를 함유할 수 있으며, 본 발명에 의한 유효 화합물 이외에 다른 제약상의 유효한 화합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 공지된 방법, 예를 들면 유효 화합물을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다.

치료학적 유효 물질은 상기 제약 제형에 있어서 전체 혼합물의 약 0.1 내지99.5 중량 %, 바람직하기로는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 일산화질소 생성용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 보조식품 또는 건강 기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 필수 성분으로서 본 발명의 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당체 폴리머를 유효성분으로 함유하고, 산화질소 생성 조절에 관계하는, 금속 또는 유사금속의 산화질소 신호전달물질의 복합소재를 제공한다.

이하에서는 본 발명의 실시예 및 제조예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 제조예로만 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 서양뒤영벌 유충으로부터 조추출물의 분리 및 정제

서양뒤영벌 유충 170 g을 100 mM NaCl을 포함하는 40 mM Tris-HCl (pH 7.4) 500 mL에 현탁한 후, 4℃에서 30분 동안 8,000 xg에서 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다. 그런 다음, 상등액의 60%까지 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 첨가한 후, 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 다시 90%까지 황산 암모늄을 첨가하여 원심분리한 후 상등액을 분리하였다. 이때, 상기 상등액을 '조추출물'로 명명하였다.

< 실시예 2> 서양뒤영벌 유충 유래 조추출물로부터 활성 분획물의 분리 및 정제

상기 <실시예 1>에서 분리한 상등액 및 침전물을 각각 100 mM NaCl을 포함하는 40 mM Tris-HCl (pH 7.4) 15 mL에 현탁하여 제조한 용액을 Bio-Gel P-60 컬럼(88 x 2.5 cm)(Bio-Rad, Hercules, CA)에 적재한 후 4℃에서 100 mM NaCl을 포함하는 40 mM Tris-HCl (pH7.4) 완충용액으로 평형화한 다음, 20 mL/h의 흐름율로 상기 완충용액으로 용출하여 분획(No. 1 ~ 111)을 분리하였다.

그런 다음, 상기 각각의 분획들(No. 1 ~ 111)을 일산화탄소 분석법(NO assay)를 수행하여 흡광도(280 nm, 214 nm)를 측정하여 혈관내피세포에 대한 일산화탄소(NO) 생성 활성을 분석하였다.

설명하면, NO 산생은 Griess 시약(Cayman, MI, USA)을 사용하여 세포 배지내로 아질산이온의 축적양을 측정하였다. 즉, 에탄올추출물을 인간혈관내피세포(HUVEC)에 0.2 mg을 기준으로 10배씩 희석해가면서세포에 처치하여 24시간 배양하고 VERSAmax microplate reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 아질산나트륨량을 흡광도를 측정하여 계산하였다(Nims et al., 1995). 대조약물로는 생체 내에서 NO를 산생하여 혈관이완에 관여하는 sodium nitroprusside dihydrate(SNP)를 사용하였다

그 결과 280 nm 및 214 nm에서의 흡광도 피크가 유사하며, 분획 78 ~ 91가 흡광도 피크가 매우 높게 나타나서 산화질소 생성 활성이 높은 것을 확인하였다( 도 1).

이때, 상기 분획 78~91이 분리된 조건으로 0.383 (540 nm 파장에서 UV 흡광도 평균수치) , 14개 분획, 총 50 ml, 2시간 반에 걸쳐 산화질소생성 높은 분획들이 분리되었으며 540 nm에서 평균흡광도는 0.383이었다.

그런 다음, 상기 분획 DEAE Sephadex A-25 컬럼(Sigma Chemicals, St.Louis, MO)에 적재한 후 50 mM 인산 완충용액(pH7.4)으로 평형화한 다음, 20 mL/h의 흐름율로 상기 완충용액으로 용출하여 분획(No. 1 ~ 96)을 분리하였다. 이때, NaCl염 경사를 0 M, 0.1M, 0.5M, 1M, 2.5 M로 높이면서 분리정제를 하였다.

그런 다음, 상기 각각의 분획들(No. 1 ~ 96)을 NO assay(540nm에서 발색)를 수행하면서 자체 자외선(UV) 흡광도(280 nm, 214 nm)를 측정하여 NO 생성 활성을 분석하였다. 그 결과, 280 nm 및 214 nm에서의 흡광도 피크와 산화질소활성 피크가 유사하며, 분획 8 ~ 15 및 24가 흡광도 피크가 매우 높게 나타나서 산화질소 생성 활성이 높은 것을 확인하였다(도 2).

이때, 상기 분획 8 ~ 15 및 24의 분리된 조건으로는 분획0~20번까지 0M, 21-60번까지 0.5M NaCl염경사이므로 해당 8 ~ 15 ~ 24 분획은 0M 염경사에서 0.5M NaCL염경사로 바뀌는 단계, 총 60 mlTris-HCl (pH7.4) 완충용액용출단계 이었다.

< 실시예 3> 서양뒤영벌 유충 유래 활성분획물로부터 산화질소 생성 활성을 갖는 다당폴리머 의 분리 및 정제

상기 <실시예 1>에서 분리한 분획 8 ~ 15를 투석막을 이용 증류수에 2일 투석하였다. 이때 사용된 투석막은 분자량 3500 달톤 컷오프(cut off)로 염을 제거한 다음, 동결건조한 후, TSK G300SW(7.5 mm x 30 cm) Spectraphysics HPLC UV 3000 system을 이용하여 다시 한번 정제하였다.

그런 다음, 상기 정제물의 구조를 Liquid chromatography-Mass spectrometer(Shimadzu LCMS-2020, Japan)를 이용하여 구조를 동정하였다. 이때, 상기 LC/MS는 이온트랩(ion trap), 2개 용매펌프(binary pump) 및 UV 탐지기(detector)를 가지며, 컬럼은 5 mm agilent Zorbox SB-C18 (0.5x250mm)(Agilent Technologies)이며, 용매는 100 mM 아세트산 암모늄(ammonium acetate) ph4.0이고, 용리액 B는 0.5% 1-부탄올을 포함하는 100 mM 아세트산 암모늄 pH4.0이며, 구배(gradient) 조건은 0 ~ 60분 5 ~ 100%; 60 ~ 70분 100% B; 70 ~ 90분 5%B이고, 흐름율(flow rate)은 10 ml/min이었다.

SDS-PAGE 결과, 상기 정제물은 31kDa와 45kDa에서 밴드가 나타났으며 IEF 수행을 통해 pI 6.4로 추정할 수 있었다. 또한, LC/MS 결과, 표준(자일리톨)의 LC/MS 결과의 스펙트럼(spectrum)이 상기 정제물의 스펙트럼과 유사한 것을 확인하였다. 상기 정제물은 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol)의 반복단위로 구성된 폴리머이고, 이때 폴리머는 벌집구조의 육각환 구조로 구성되어 있음을 확인하였다.

< 제조예 1> 정제의 제조(직접 가압)

본 발명의 다당폴리머 5.0 ㎎

락토오스 14.1 ㎎

크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎

통상적인 정제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합하고 가압하여 정제를 제조하였다.

< 제조예 2> 정제의 제조(습식 조립)

본 발명의 다당폴리머 5.0 ㎎

락토오스 16.0 ㎎

녹말 4.0 mg

프리솔베이트 80 0.3 mg

실리콘 다이옥사이드 2.7 ㎎

마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎

본 발명의 다당폴리머를 체로 친 후, 락토오스와 녹말을 혼합하였다. 이후, 폴리솔베이트를 순수한 물에 녹인 후, 적당량을 활성성분, 락토오스 및 녹말 혼합물에 첨가한 다음 미립화하였다. 건조 후에 미립을 제질한 후, 콜로이달 실리콘 다이옥사이드 및 마그네슘 스타아레이트와 혼합하였다. 미립을 가압하여 정제를 제조하였다.

< 제조예 3> 캅셀제의 제조

본 발명의 다당폴리머 5.0 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

폴리비닐피롤리돈 10.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

통상적인 캅셀제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 첨가하여 균일하게 혼합한 후 적절한 크기의 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

< 제조예 4> 주사제의 제조

본 발명의 다당폴리머 100 ㎎

만니톨 180 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

증류수 2974 mg

통상적인 주사제의 제조 방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

< 제조예 5> 건강식품의 제조

본 발명의 다당폴리머 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

< 제조예 6> 건강 음료의 제조

본 발명의 다당폴리머 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

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서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 하여 일산화 질소(NO)의 생성 유도활성을 통해 혈관 확장 및 이완 조절능을 갖는, 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 부정맥, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 다당폴리머는
1) 서양뒤영벌 유충을 분쇄한 후, 황산암모늄(ammonium sulfate)을 처리하여 단백질을 침전시킨 다음, 상등액을 제거하여 침전물을 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 침전물을 겔 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 정제물을 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하여 일산화 질소(NO)의 생성 유도활성을 통해 혈관 확장 및 이완 조절능을 갖는, 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 부정맥, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심혈관계질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 다당폴리머는 1,5-안하이드로-자일리톨이 반복단위구조를 가지며 벌집구조상배열을 형성하는 것을 특징으로 하여 일산화 질소(NO)의 생성 유도활성을 통해 혈관 확장 및 이완 조절능을 갖는, 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 부정맥, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심혈관계질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
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서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정제.
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서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 하여 일산화 질소(NO)의 생성 유도활성을 갖는,
혈관 확장 및 이완 조절 예방 일산화 질소(NO)의 생성 유도활성을 통해 혈관 확장 및 이완 조절능을 갖는, 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 부정맥, 뇌혈관 질환 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심혈관계질환 예방용 건강식품.
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서양뒤영벌 유충으로부터 분리된, 1,5-안하이드로-자일리톨(1,5-anhydro-xylitol) 다당폴리머를 유효성분으로 함유하는 혈관확장 및 이완을 위한 강정용 건강식품.
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