KR100477896B1 - 상백피로부터 얻은 헤파리나제 효소 활성 및 암전이활성을 저해하는 활성분획물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상백피로부터 얻은 헤파리나제 효소 활성 및 암전이 활성을 저해하는 활성분획물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 뽕나무(Morus alba L.)의 뿌리 껍질인 상백피(Mori Cortex Radicis)로부터 암전이 시에 일어나는 암세포의 내피세포 침윤(invasion)이나 소혈관 형성 시에 필요한 헤파리나제의 활성을 저해하며 동시에 암전이 활성을 저해하는 활성분획물과 이를 효율적으로 분리, 정제하는 방법 및 상기 활성분획물을 유효성분으로 함유하는 헤파리나제 효소 활성 및 암전이 활성 저해용 약제에 관한 것이다.

Description

상백피로부터 얻은 헤파리나제 효소 활성 및 암전이 활성을 저해하는 활성분획물{Active fractions showing inhibitory effects on heparinase activity and cancer metastasis from the root bark of Morus alba L.}

본 발명은 상백피로부터 얻은 헤파리나제(heparinase) 효소 활성 및 암전이 활성을 저해하는 활성분획물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 뽕나무(Morus alba L.)의 뿌리 껍질인 상백피(Mori Cortex Radicis)로부터 암전이 시에 일어나는 암세포의 내피세포 침윤(invasion)이나 소혈관 형성 시에 필요한 헤파리나제의 활성을 저해하며 동시에 암전이 활성을 저해하는 활성분획물과 이를 효율적으로 분리, 정제하는 방법 및 상기 활성분획물을 유효성분으로 함유하는 헤파리나제 효소 활성 및 암전이 활성 저해용 약제에 관한 것이다.

포유동물 세포에서 일어나는 암세포의 침윤이나 암세포의 전이(tumor metastasis)는 세포 외부에 존재하는 효소에 의해 기저막(basement membranes)의 효소적 분해과정을 수반한다. 헤파란 설페이트(heparan sulfate)나 헤파린(heparin)은 콜라젠(collagen), 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등과 함께 대부분의 포유동물 세포에 존재하는 기저막의 주요 구성성분 중의 하나이다. 헤파린, 헤파란 썰페이트 및 다당결합단백질(heparin/heparan sulfate proteoglycan, HSPG)은 세포표면이나 세포외부 격자(extracellular matrix, ECM)에 존재하여 성장인자나 사이토카인(cytokine), 효소, 효소 저해제, 바이러스 단백질을 포함하는 다양한 분자들과 결합 혹은 반응을 통해서 세포의 성장, 암세포의 이동, 세포의 분화, 혈관생성(angiogenesis), 바이러스 침투, 항혈액응고에 관여하고 있다. 즉, 암세포의 성장뿐 만 아니라 혈관생성 및 세균, 원생동물(protozoa), 바이러스 등에 의한 부착, 감염에서도 헤파린, 헤파란 설페이트 및 다당결합단백질(HPSG) 등이 관여하여 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)나 염기성 섬유 모세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF), 안지오제닌(angiogenin), 니드카인(nidkine)과 같은 헤파린 결합 단백질 등을 매개로 작용하는 것으로 알려져 있다.

헤파린은 비만세포(mast cell), 호염기성 과립형 백혈구(basophilic granulocytes)에 주로 존재하고 헤파란 설페이트는 세포표면이나 세포외부 격자에 존재하며 헤파린과 헤파란 설페이트는 엔-아세틸화(N-acetylation) 또는 엔-황화(N-sulfation)된 글루코사민(α-D glucosamine)과 유론산(uronic acid)의 이당류 단위가 연속적으로 결합된 복합 선상의 다당류로서 서로 구조적으로 매우 유사하다. 즉, 헤파린과 헤파란 설페이트는 유론산 (L-iduronic acid) 혹은 글루쿠론산(D-glucuronic acid)과 헥소사민(hexosamine)이 1,4 위치로 결합한 이당류가 반복적으로 연속한 단위로서 황화합물의 위치와 수에 따라 다양한 형태의 다당류를 나타낸다. 헤파린과 헤파란 설페이트는 세린(serine)계 단백질 분해효소(protease) 저해제인 안티스롬빈(antithrombin) III을 활성화해서 스롬빈(thrombin)과 팩터(factor) Xa와 같은 세린계 단백질 분해효소의 불활성화를 통하여 혈액의 응고를 방지하여 지난 50 년간 항혈액응고제로 사용되어 왔다.

헤파린과 헤파란 설페이트는 각각 헤파리나제와 헤파라나제(heparanase) 효소에 의해 분해되며, 헤파리나제는 헤파린 뿐만 아니라 헤파란 설페이트도 가수분해하는 효소로서 효소적 작용에 의해 세포외부 격자로부터 헤파린 결합 성장인자를 유리하여 상처 치유로부터 암전이에 이르는 생리학적, 병리학적 작용에 관여하며 헤파린 다당류의 α-D 글루코사민과 유론산의 결합을 절단을 통해 이루어진다. 헤파리나제 활성은 순환계 세포(circulating cell)나 세포외부 격자와 기저막을 통과하는 호중성 백혈구(neutrophil), 비만세포, 대식세포, 활성화된 T 림포세포 등에서 확인되고 있다.

이들 헤파리나제와 헤파라나제 효소는 혈관생성이나 암전이 과정에 밀접하게 관련되어 있는 것으로 알려져 있다[J. Clinic. Invest. 108, 341∼347, 2001; FASEB J. 15, 1661∼1663, 2001; Science 220, 313∼325, 1983]. 암세포가 다른 조직으로 전이를 하기 위해서는 새로운 혈관이 생겨 이를 통한 영양물질의 공급이 이루어져야 한다. 이러한 혈관생성에는 혈관내피세포성장인자나 염기성 섬유모세포성장인자가 요구된다. 이들 성장인자들은 헤파린 혹은 헤파란 설페이트에 결합되어 있다가 해파리나제나 헤파라나제 효소가 이들을 분해하면 유리되어 혈관생성세포의 성장을 유도시켜 혈관생성이 이루어진다. 따라서, 이들 효소의 활성을 저해하면 신혈관생성을 저해할 수 있어 암세포의 성장저해, 특히 전이된 암세포의 성장을 억제할 수 있다. 또한, 이들 효소의 저해제들이 암전이를 억제한다는 것이 보고되면서[Leukemia 16, 376∼381, 2002; J. Med. Chem. 43, 2591∼2600, 2000; Int. J. Cancer 83, 424∼431, 1999] 항암제로서의 개발 가능성이 제시되어 몇몇 연구자들에 의해 이들 효소에 대한 새로운 저해제를 찾으려는 탐색연구가 진행되고 있다. 현재까지 황화 키틴(sulfated chitin), 라미나린 황화합물(laminarin sulfate), 칼슘 스피룰린(calcium spirulin), 포스포로티오에이트 디엔에이 올리고누클레오타이드(phosphorothioate DNA oligonucleotide) 등의 다양이온성 화합물(polyanionic compounds)[Biochem. Biophysic. Acta 1471, M99∼M108, 2001]과 A-72363C[J. Antibiotics 49, 61∼64, 1996] 및 수라민(suramin)[J. Biol. Chem. 266, 9661∼9666, 1991], PI-88(phosphomannopentaose sulfate)[Cancer Res. 59, 3433∼3441, 1999] 등이 헤파리나제와 헤파라나제 효소 저해제로 보고되어 있으며, 헤파라나제 활성을 저해하고 종양세포의 전이 및 혈관생성을 저해하는 수라민과 PI-88은 항암제로 개발되어 전임상과 임상실험을 진행하고 있다.

따라서, 미량으로서 헤파라나제 또는 헤파리나제 효소 활성 저해뿐만 아니라 생체내에서도 이들을 저해하여 암전이를 억제할 수 있는 신규 화합물의 개발이 요구되고 있다. 일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위한 여러 가지 방법 중, 기존 약제의 실험적 변형에 의한 노력보다는 전통 의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 발견할 수 있는 가능성이 매우 높으며 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 개발된 약물들에 의한 독성 염려가 적은 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 그 동안 새로운 형태의 항암제 개발의 일환으로 헤파리나제에 대하여 강한 저해활성을 나타내는 물질을 개발하기 위하여 오랫동안 연구를 수행하였다. 이에, 동의보감을 비롯한 우리나라의 전통 의학에서 사용되어온 약제들을 대상으로 암전이 저해물질을 탐색하기 위하여 헤파리나제 효소 및 B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 마우스에서 암전이 저해활성 등을 관찰한 결과, 특이적인 저해활성을 보이는 활성분획물을 상백피로부터 획득함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 헤파리나제 효소 활성 및 동물모델에서의 암전이 저해 활성에 뚜렷한 효과가 있는 상백피 활성분획물을 활성이 가장 우수한 조성으로 분리하는 방법과 그 추출물을 유효성분으로 함유한 약제를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 (1) 상백피(Mori Cortex Radicis)를 분쇄한 후 알콜 수용액을 넣어 용매 추출하고, (2) 상기 추출여액을 증발 농축한 후, 농축액을 증류수에 현탁하고 에틸 아세테이트로 활성물질을 추출, 농축하여 엑기스를 얻고, (3) 상기 엑기스를 실리카겔(silica gel)에 흡착한 뒤, 클로로포름 또는 클로로포름과 메탄올을 10 : 1 로 혼합한 용액으로 용출하여 얻은 헤파리나제 저해 활성 또는 암전이 저해 활성을 갖는 활성분획물을 그 특징으로 한다.

또한, 상기 상백피 활성분획물을 유효성분으로 하는 헤파리나제 효소 활성 및 암전이 활성 저해제 등으로 사용하는 것을 포함한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 헤파리나제 효소 활성 및 B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 마우스에서 암 전이 억제 활성을 저해하는 상백피로부터 분리된 활성분획물에 관한 것이다.

즉, 상백피로부터 분획하여 얻은 활성분획물이 헤파리나제 효소 활성을 저해하고, B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스에서 암 전이 억제효과를 갖고 있는 것을 처음으로 관찰하여, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 헤파리나제 효소 활성과 암전이 활성 등에 억제 효과를 지닌 활성분획물을 개발하였다.

또한, 상백피(Mori Cortex Radicis)를 분쇄한 후 알콜 수용액을 상백피 함량대비 5 배를 넣어 3회 용매 추출하고, 여기에서 얻어진 여액을 증발 농축한 후, 농축액을 총량의 10 배의 증류수로 현탁시킨 후 에틸 아세테이트(ethyl acetate)의 유기용매로 활성물질을 추출, 농축하여 엑기스를 얻는다. 상기 엑기스를 실리카겔(silica gel)에 흡착한 뒤, 클로로포름 또는 메탄올로 용출하여 활성분획을 분리, 정제한다.

바람직하게는, 상기 활성분획을 분리하는 과정에서 클로로포름(chloroform) 또는 클로로포름과 메탄올을 10 : 1로 혼합한 용매로 용출하여 얻은 활성분획들을 헤파리나제 저해 활성 및 동물모델에서 암 전이 저해 활성을 측정한다.

상기 활성분획에서 제거되지 않은 미량의 용매를 제거하기 위하여 활성분획물 총량의 2 배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤 동결건조시켜 분말상태의 활성분획을 조제한다.

이렇게 제조된 활성분획물 이외에도 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 정제, 산제, 과립, 캅셀제, 현탁액, 유화액 또는 비경구 투여용의 단위투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.

상기 활성분획물로 표시되는 유효성분의 유효투여량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎／㎏(몸무게)／1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투여한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 상백피로부터 활성분획물의 제조

분쇄한 상백피를 함량대비 5 배량의 알코올성 용매를 사용하여 활성물질이 용출될 수 있도록 5시간 동안 환류 추출하고 이 과정을 3 차례 반복한 후, 상기 알코올성 용매 추출액을 감압 농축하였다. 그런 다음, 농축된 활성분획을 10 배량의 증류수에 현탁하고 동량의 에틸아세테이트의 유기용매로 3 회에 걸쳐 용매 분획하여 활성물질을 포함하는 조 추출물을 얻었다. 상기에서 얻어진 조추출물을 실리카겔에 흡착한 뒤, 클로로포름으로 용출하여 활성분획 SBC100을, 클로로포름과 메타놀을 10 : 1로 혼합한 용매로 용출하여 활성분획 SBCM101 등을 분리하였다. 공정시 사용한 용매 중 제거되지 않은 미량의 용매를 제거하기 위하여 활성분획물 총량의 2 배의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤 동결건조시켜 분말상태의 활성분획을 조제하였다.

실시예 2 : 헤파리나제 저해활성 측정

헤파린 10 ng을 포함하는 반응용액 17 ㎕에 검정할 시료용액 3 ㎕를 넣고 헤파리나제 효소액 10 ㎕(0.1 unit)를 첨가한 다음, 상온에서 15 분간 반응하였다. 다시 안티스롬빈 Ⅲ 용액 20 ㎕을 첨가하고 상온에서 2 분간 반응시킨 후 팩터 Ⅹa 용액 20 ㎕을 첨가하였다. 첨가 1 분 후, 팩터 Ⅹa의 기질 20 ㎕을 첨가하여 15 분간 반응시키고 빙초산 20 ㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 헤파리나제 효소에 대한 저해율은 다음 수학식 1과 같이 계산하였으며, IC₅₀ 값은 효소활성의 저해율이 50％에 달하는 저해제의 농도로 결정하였다.

A : 저해제를 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

B : 효소액을 넣지 않은 것의 반응 후 흡광도

C : 저해제를 넣은 것의 반응 후 흡광도

분리된 활성분획 SBC100과 활성분획 SBCM101의 헤파리나제 효소 활성을 50％ 저해하는 농도(IC₅₀)를 측정한 결과, 각각 4 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖로 나타났으며, 저해제로 이미 알려진 수라민의 경우, 본 실험에서 50％ 저해하는 농도(IC₅₀)가 5 μM로 나타났다. 이때 헤파리나제는 플라보박테리움 헤파리눔(Flavobacterium heparinum)에서, 헤파린은 돼지의 내장 점막에서 분리된 것을 시그마사(Sigma Co.)로부터 구입하여 사용하였다.

실시예 3 : 동물모델 마우스에서 암전이 저해활성 측정

SBC100 활성분획과 SBCM101 활성분획의 2가지 시료들의 투여용량은 입수된 시료량을 근거로 각각을 10 mg/kg, 10 mg/kg으로 설정하였다. 각 시료들에 메탄올을 첨가하여 녹인 후, 드라이기를 이용하여 메탄올을 증발시켰으며, 0.5% Tween 80을 매체로 하여 설정된 용량으로 제조한 뒤 사용하였다. 용매 대조군으로는 0.5% Tween 80을 사용하였다.

B16F10 멜라노마 세포를 배양한 후, 세포를 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 이용하여 분리하였으며, 0.85% 생리식염수로 희석하여 2.5 ×10⁶ cells/㎖로 맞추었다. 준비된 세포 현탁액을 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스(대한바이오링크, 14 ∼ 20 g)에 마리 당 0.2 ㎖씩 꼬리정맥 내로 주사하였다. 마우스는 각 군당 7 마리씩 배치하였다.

암세포를 이식한 4시간 뒤, 약물 투여를 시작하여 13일 째까지 마우스 몸무게 20 g당 시료 용액을 0.2 ㎖씩 매일 복강 투여하였다. 몸무게 측정은 0, 3, 6, 9, 12, 14 일째에 실시하였다. 암세포 이식 14일 후 마우스를 부검하여 암세포가 전이된 폐를 적출하였으며, 카메라를 이용하여 각 군별로 폐를 촬영하였다. 적출한 폐는 중성 포르말린(neutral formalin)에 담가 보관하였고, 폐에서의 암세포 군락수(pulmonary metastatic tumor colony)를 육안으로 계수하였다. 통계학적 유의성은 스튜던츠 티-테스트(Student's t-test)로 검정하였다.

SBM100 활성분획과 SBCM101 활성분획의 시료 투여군은 14일간 매일 1회 복강 투여시, 용매 대조군과 같이 정상적인 체중의 증가가 관찰되어 시험기간동안 약물투여에 기인한 몸무게의 변화는 없었다.

실험 최종일(14일째)에 마우스에 대한 부검을 실시하여 SBC100 활성분획 처리시, 용매 대조군이 평균 129개의 암세포 군락을 형성했을 때 SBC100 활성분획 10 mg/kg 처리한 실험군에서는 평균 89개(p < 0.05)의 암세포 군락을 형성하여 31%의 유의성 있는 생체내 전이 억제 활성을 보였다[도 2]. SBCM101 활성분획 처리시의 경우, 용매 대조군은 약 135개의 암세포 군락을 형성하였으나 SBCM101 활성분획 10 mg/kg 처리한 실험군은 약 87개(p < 0.01)의 암세포 군락을 형성하여 36%의 유의성 있는 생체내 전이 억제 활성을 보였다[도 3].

실시예 4: 정제의 제조

유효성분 10 g

락토스 70 g

결정성 셀룰로오스 15 g

마그네슘 스테아레이트 5 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합한 후 직타법(direct tableting method)에 의해 정제를 제조하였다. 각 정제의 총량은 100 ㎎이고, 그 중 유효성분의 함량은 10 ㎎이다.

실시예 5: 분말제의 제조

유효성분 10 g

옥수수 전분 50 g

카르복시 셀룰로오스 40 g

총 량 100 g

상기에서 나열된 성분들을 잘게 부숴 혼합하여 분말을 제조하였다. 경질 캡슐에 분말 100 ㎎을 넣어 캡슐제를 제조하였다.

실시예 6: 독성실험

1. 급성독성

상백피로부터 분리된 활성분획물을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다.

일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 50 마리를 대조군은 10 마리, 실험군은 20 마리씩 배정하였다. 대조군에는 DMSO만을 투여하고, 실험군은 상백피로부터 분리된 활성분획물을 투여농도 10 ㎎/㎏의 2,000배(20 g/㎏) 및 10,000배(100 g/㎏)의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 20 g/㎏ 농도의 상백피 활성분획물을 투여한 실험군에서는 모두 생존하였으나, 100 g/㎏ 농도의 상백피 활성분획물을 투여한 실험군에서는 12 마리의 치사율을 보였다.

이와 같은 실험 결과로부터 상백피 분획물은 1회 동물 치사량이 100 g/㎏(100,000 ㎎/㎏) 정도로서 일반적인 효능을 보이는 농도(10 ㎎/㎏)의 약 10,000배 정도로서 독성이 거의 없는 매우 안전한 물질임을 알 수 있었다.

2. 장기 및 조직독성

상백피로부터 분리된 활성분획물을 10 ㎎/㎏의 농도로 14일 동안 투여하여 암전이 동물모델에 이용된 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스를 대상으로 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상백피 활성분획물을 투여한 실험군과 DMSO만을 투여한 대조군의 각 동물로부터 14일 후 심장, 폐, 췌장, 부신, 간, 신장 및 근육 등을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였다. 그 결과, 대조군과 실험군 동물의 모든 장기에 대한 조직학적 관찰에서는 특이한 이상은 관찰되지 않아 상백피 활성분획물의 동물장기에 대한 독성은 발견되지 않았다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 상백피로부터 얻은 활성분획물은 헤파리나제 효소활성과 암전이 활성을 억제하는 효과가 우수하므로 이를 유효성분으로 함유하는 약제로 사용할 수 있다.

도 1은 B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스에 상백피로부터 분리된 활성분획물을 10일간 투여한 실험군과 0.5% Tween 80 만을 처리한 대조군의 마우스 폐로 전이되는 정도의 차이를 비교한 사진이다.

도 2는 B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스에 상백피로부터 분리된 활성분획 SBC100을 10일간 투여한 후 마우스 폐로 전이되는 암세포의 수를 비교한 막대그래프이다.

도 3은 B16F10 멜라노마 세포를 꼬리정맥 주사한 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스에 상백피로부터 분리된 활성분획 SBCM101을 10일간 투여한 후 마우스 폐로 전이되는 암세포의 수를 비교한 막대그래프이다.

Claims (5)

1. (1) 상백피(Mori Cortex Radicis)를 분쇄한 후 알콜 수용액을 넣어 용매 추출하고, (2) 상기 추출여액을 증발 농축한 후, 농축액을 증류수에 현탁하고 에틸 아세테이트로 활성물질을 추출, 농축하여 엑기스를 얻고, (3) 상기 엑기스를 실리카겔(silica gel)에 흡착한 뒤, 클로로포름 또는 클로로포름과 메탄올을 10 : 1 로 혼합한 용액으로 용출하여 얻은 것을 특징으로 하는 헤파리나제 저해 활성 또는 암전이 저해 활성을 갖는 활성분획물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1의 활성분획물이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 암전이 저해제.