CN114230636A - 一类多肽及其应用以及含该类多肽的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类多肽及其应用以及含该类多肽的药物，涉及多肽研究技术领域，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1‑4所示。本发明提供的多肽为人工合成多肽，本身具有较强的自由基清除能力，并能降低UVB照后人成纤维细胞的活性氧(ROS)水平，增加UVB照后人成纤维细胞的细胞活力，减少其细胞死亡和细胞凋亡，缓解UVB照后人成纤维细胞衰老，因此可应用于紫外辐射防护技术以及涉及到的药物上。该类多肽人工合成方便，具有防治皮肤紫外损伤的潜力，可广泛推广。

Description

一类多肽及其应用以及含该类多肽的药物
技术领域
本发明属于生物多肽研究技术领域，具体涉及一类多肽及其应用以及含该类多肽的药物。
背景技术
近年来，臭氧层变薄使人们接触日光中紫外辐射的机会增加，而过度暴露于紫外线照射对人类的健康具有重大危害。紫外线是阳光中波长为100-400纳米(nm)的光线，可分为长波UVA(320-400nm)，中波UVB(280-320nm)，短波UVC(100-280nm)。UVC穿透能力低，在到达地球大气平流层时被平流层中的臭氧给吸收。因此，到达体表与人体相互作用的紫外线主要是UVA和UVB。
皮肤作为机体的第一道防线，覆盖全身表面，最先接触紫外照射。长波紫外线UVA穿透能力强，可穿透真皮全层；中波紫外线UVB大部分被皮肤表皮吸收，其余可到达真皮组织。其中UVB能量高，其生物活性远大于UVA，被认为是皮肤光损伤的主要原因。长时间暴露在UVB下可引起强烈的皮肤光损伤，包括晒伤、免疫力下降、皮肤光老化。此外，UVB是导致皮肤癌的一个关键环境因素。
研究表明，紫外线光子被皮肤中的生色团以及光敏剂吸收发生的光化学反应可引发皮肤组成成分的激发态的形成，生成大量的高活性物质，包括过氧化氢、超氧化物、羟基自由基和单线态氧等。由于内源性抗氧化系统有限，大量的活性物质的累积最终爆发皮肤细胞氧化应激。这些氧化产物与多不饱和脂肪酸反应引起脂质过氧化反应的级联反应，形成脂质过氧化氢，随后转变为活性醛，作用于蛋白质组和基因组靶标。DNA作为紫外光子攻击的直接靶标，还可间接被大量生成的ROS进一步损伤，由此形成的DNA光产物包括环丁烷嘧啶二聚体(CPD)，嘧啶(6-4)光化学产物(6-4PP)，以及杜瓦价键异构体等。
这些活性物质及DNA损伤进一步激活与细胞增殖、分化、衰老、炎症、免疫抑制和细胞外重塑相关的多条信号通。如，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径，其中膜受体被UVB诱导的ROS激活。MAPK的磷酸化激活c-Jun转录因子和核因子κB(NF-κB)，随后激活转录因子活化蛋白1(AP-1)复合物。AP-1和NF-κB通路均可能影响基质金属蛋白酶(MMPs)和血红素加氧酶-1(HO-1)在皮肤光老化过程中的稳态。MMPs是锌依赖的内蛋白酶，可以降解胶原蛋白和弹性纤维，这导致皮肤光损伤及光老化的形成(Lu et al.,Int J Mol Sci,2019)。此外，这些事件将刺激细胞继续产生具有促炎作用的细胞因子，从而加剧炎症并参与炎症-活性氧反馈循环。
由于紫外线较高的能量及紫外线与人体皮肤之间光化学反应的存在，皮肤在紫外强烈照射下产生光损伤，出现真皮血管扩张、红肿和水泡等炎症反应，长期接触紫外线可导致日光性皮炎和皮肤老化，甚至发生皮肤癌变。常规的化学和物理防晒霜不能阻止ROS的生成和随后炎症介质的激活，无法治疗皮肤紫外损伤。预防和治疗皮肤光老化的光保护策略除阻断紫外线的发生外，还包括DNA修复、去除ROS(抗氧化剂)、抗炎和免疫调节；药物主要是多酚、类黄酮和非类黄酮、非酚类衍生物和全植物提取物。目前看来，这些药物对于人体皮肤紫外损伤和光老化的疗效并不显著，其具体作用机制也不明确，尚无大量干预皮肤光损伤的流行病学调查和临床实验。
多肽是在体内担负着重要调节功能活性物质，目前大约有140种多肽类药物正在进行临床试验。研究证明，多肽类药物因其自身生物特性具有明显的靶向作用，可特异性作用于一系列分子靶点。如，CBLB502通过结合Toll样受体(TLR5)活化核因子NF-κB信号通路发挥对小鼠肠型和骨髓型急性放射综合征的保护作用(Lyudmila G et al.,Science,2008)。据此，多肽类药物的高特异活性使其作用于皮肤紫外损伤时疗效更显著。总的来说，多肽药物在活性、特异性、安全性、改造和修饰以及生产成本方面具有较强的优势。此外，多肽类药物的制药技术成熟使其在临床应用方面更具优越性。因此，多肽药物具有开发成为有效紫外辐射损伤防护剂的潜在价值。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供一类多肽，并应用于紫外辐射防护技术以及涉及到的药物上，用以明确解决皮肤紫外辐射防护问题。
本发明采用的技术方案如下：
一类多肽，包括四条多肽，所述四条多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。
本发明所述多肽，具有防护皮肤紫外损伤以及其它多种细胞改善功能，将其命名为UIFSP肽(Ultraviolet B-induced frog skin peptide)，四条多肽的分子量分别为1405.6546，1420.8038，1358.6678，1464.7321Da，其氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO：1SGSGGGRISSGNFGSRSLQ，
SEQ ID NO：2KVLKQVHPDTGIS，
SEQ ID NO：3SPEGAEAKDAGKVT，
SEQ ID NO：4GGYDVDKNNSRLK，
所述多肽在制备紫外辐射防护剂中或在治疗皮肤疾病的药物方面的应用。
所述多肽在制备自由基清除的防护剂或药物方面的应用。
所述多肽在制备降低人皮肤细胞ROS水平的防护剂或药物方面的应用。
所述多肽在制备增加人皮肤细胞活力的防护剂或药物方面的应用。
所述多肽在制备延长人皮肤细胞生命周期的防护剂或药物方面的应用。
所述多肽在制备减少人皮肤细胞凋亡的防护剂或药物方面的应用。
所述多肽在制备缓解人皮肤细胞衰老的防护剂或药物方面的应用。
含所述多肽的药物，包括所述多肽以及药学上可接受的辅料。
作为优选地，所述辅料为制备水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂中的一种所需的辅料。
综上所述，相比于现有技术，本发明具有如下优点及益效果：
1.本发明提供了一类新的多肽，经试验证明，本发明提供的多肽具有较强的自由基清除能力，尤其是UIFSP-4肽，同一浓度下，其自由基清除能力与抗氧化剂Gly和NAC相当；
2.本发明提供的多肽，相较于未加入UIFSP-1～4肽的照射对照组，明显降低了UVB照后人成纤维细胞的活性氧(ROS)水平；
3.本发明提供的多肽，相较于未加入UIFSP-1～4肽的照射对照组，明显增加了UVB照后人成纤维细胞的细胞活力；
4.本发明提供的多肽，相较于未加入UIFSP-1～4肽的照射对照组，明显降低了受照后WS1细胞的细胞死亡率；
5.本发明提供的多肽，相较于未加入UIFSP-1～4肽的照射对照组，明显降低了受照后WS1细胞的细胞凋亡率；
6.本发明提供的多肽，相较于未加入UIFSP-1～4肽的照射对照组，UIFSP-2～4明显缓解了UVB照后人成纤维细胞衰老。
7.本发明提供的多肽人工合成方便，便于大量生产；且其在防治皮肤紫外损伤上的潜力巨大，在紫外辐射防护剂中或在治疗皮肤疾病的药物中，均能广泛使用，具备实际应用推广价值。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1示氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的多肽溶液以及对照组(抗氧化剂Gly和NAC)清除ABTS+自由基能力水平情况的检测结果。
图2示氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的多肽以及对照组在30mJ/cm2光照后WS1细胞的ROS水平情况的检测结果。
图3示氨基酸序列如SEQ ID NO:1-4所示的多肽以及对照组在30mJ/cm2光照后WS1细胞的线粒体酶活力水平情况的检测结果。
图4示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽以及对照组在30mJ/cm2光照后WS1细胞的乳酸脱氢酶(LDH)释放水平情况的检测结果。
图5示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽以及对照组在30mJ/cm2光照后WS1细胞的凋亡水平情况的检测结果，其中，FITC+/PI-是细胞凋亡早期，FITC+/PI+是细胞凋亡晚期。
图6示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽以及对照组在30mJ/cm2光照后WS1细胞的衰老水平情况的检测结果。
具体实施方式
本发明实施例提供的多肽，由生工生物工程(上海)股份有限公司化学人工合成，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示；
具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，水浸剂、粉剂、油剂、乳剂、软膏剂、硬膏剂、气雾剂的制备工艺成熟，参照现有技术常规方法即可制成，例如：
制备含有本发明提供的多肽的水浸剂：向多肽中加去离子水混匀，过滤灭菌制得水浸剂。
制备含有本发明提供的多肽的粉剂：向多肽中加矫味剂混匀，按物料的干湿程度使用干法粉碎或湿法粉碎，粉末过筛制得粉剂。
制备含有本发明提供的多肽的油剂：向多肽中添加凡士林(油性基质)均匀混合制得油剂。
制备含有本发明提供的多肽的乳剂：向多肽中加阿拉伯胶(乳化剂)和液状石蜡研磨制成初乳后，加入羟苯乙酯溶液混合研磨或加入高压匀质机研磨制得乳剂。
制备含有本发明提供的多肽的软膏：向多肽中加羊毛脂、凡士林均匀混合制得软膏。
制备含有本发明提供的多肽的硬膏：向多肽中加铅肥皂炸料、炼油、下丹、去火毒、滩涂后制得硬膏。
制备含有本发明提供的多肽的气雾剂：向多肽中加聚乙二醇，储于带阀门的耐压容器中制得气雾剂。
实施例1
验证多肽的ABTS+自由基清除能力：将ABTS溶液和氧化剂溶液以1：1浓度混合配置ABTS工作液，室温避光孵育过夜。96孔板中分别加入200μL的ABTS工作液和10μL的10mM的甘氨酸(Gly)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、UIFSP 1-4肽溶液，室温避光孵育2-9min，酶标仪测定吸光度：734或405nm波长。
结果显示如图1，结果论证UIFSP-4肽溶液具有强自由基清除能力，作用与抗氧化剂Gly和NAC相当。对照组与多肽治疗组比较有统计学意义，t＝123.4，121.6，72.20，****代表P＜0.0001。
实施例2
验证多肽是否降低UVB照后人成纤维细胞WS1的ROS水平：根据实验设计，将细胞分为：Ⅰ：非照射组(Control)；Ⅱ：照射对照组(Vehicle)；Ⅲ：照射+多肽保护组(UIFSP-1～4)，照射组剂量为30mJ/cm2。WS1细胞以4×104/mL，100μl/孔接种于6孔板，Ⅲ组UIFSP 1-4肽处理72h，之后进行30mJ/cm2的UVB照射。照后24h，每孔加入1mL预先用无血清培养基配置的DCFH-DA荧光探针，室温避光孵育30min。用无血清培养基洗涤WS1细胞3次，胰酶消化，收集细胞。细胞PBS溶液重悬后，流式细胞仪上机检测ROS水平的变化。
结果显示，UIFSP肽可降低受照后WS1细胞的活性氧水平(如图2所示)。对照组与UIFSP肽治疗组比较有统计学意义，t＝11.02，10.54，4.646，12.26，**代表P＜0.01，****代表P＜0.0001。
实施例3
验证多肽是否增加UVB照后人成纤维细胞WS1的细胞活力：根据实验设计，将细胞分为：Ⅰ：非照射组(Control)；Ⅱ：照射对照组(Vehicle)；Ⅲ：照射+多肽保护组(UIFSP-1～4)，照射组剂量为30mJ/cm2。取对数期生长WS 1细胞，调整其细胞浓度为3×104/ml，以100μl/孔接种于96孔板。Ⅲ组照前使用30μM的UIFSP-1～4肽处理细胞72h，细胞融合至80％以上密度时进行UVB辐照，照射剂量：30mJ/cm2。照后36h，每孔加入10μL的CCK-8溶液，继续孵育2h，酶标仪测定吸光度：450nm波长。
结果显示，UVB照前UIFSP肽处理可增加受照后WS1细胞的细胞活力(如图3所示)。对照组与UIFSP肽治疗组比较有统计学意义，t＝3.553，4.961，3.339，4.235，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001，****代表P＜0.0001。
实施例4
验证多肽是否降低UVB照后人成纤维细胞WS1的细胞死亡率：根据实验设计，将细胞分为：Ⅰ：非照射组(Control)；Ⅱ：照射对照组(Vehicle)；Ⅲ：照射+多肽保护组(UIFSP-1～4)，照射组剂量为30mJ/cm2。WS1细胞以3000个/孔的密度接种于96孔板，Ⅲ组UIFSP 1-4肽处理72h，之后进行30mJ/cm2的UVB照射，照后立即更换为2％FBS的DMEM培养基。照后35h，向每组最大酶活性孔加入LDH释放试剂，继续孵育1h。照后36h，孔板离心后吸取上清进行LDH释放检测，酶标仪测定吸光度：490nm波长。
结果显示，UVB照前UIFSP肽处理可降低受照后WS1细胞的细胞死亡率(如图4所示)。对照组与UIFSP肽治疗组比较有统计学意义，t＝10.00，10.89，12.04，14.65，****代表P＜0.0001。
实施例5
验证多肽是否减少UVB照后人成纤维细胞WS1的细胞凋亡：根据实验设计，将细胞分为：Ⅰ：非照射组(Control)；Ⅱ：照射对照组(Vehicle)；Ⅲ：照射+多肽保护组(UIFSP-1～4)，照射组剂量为30mJ/cm2。WS1细胞以4×104个/孔的密度接种于6孔板，Ⅲ组UIFSP 1-4肽处理72h，之后进行30mJ/cm2的UVB照射。照后24h，收集细胞于离心管中，加入Annexin V-FITC、PI染料，室温避光孵育15min，流式细胞仪上机检测凋亡水平。
凋亡水平检测中涉及的指标：
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)，正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素FITC标记，以FITC-Annexin-V作为荧光探针检测PS，FITC+表示FITC检测阳性，即膜外翻-细胞凋亡发生。
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。PI+表示PI检测阳性，即膜完整性破坏-细胞死亡。
因此，FITC+/PI-是细胞凋亡早期，FITC+/PI+是细胞凋亡晚期。
结果显示，UVB照前UIFSP肽处理可降低受照后WS1细胞的细胞凋亡(如图5所示)，不仅减少照后细胞早凋(t＝6.991，5.028，9.097，5.516，**代表P＜0.01，****代表P＜0.0001)，也能降低细胞晚凋率(t＝7.339，6.846，8.795，5.697，**代表P＜0.01，****代表P＜0.0001)。
实施例6
验证多肽是否缓解UVB照后人成纤维细胞WS1的细胞衰老：根据实验设计，将细胞分为：Ⅰ：非照射组(Control)；Ⅱ：照射对照组(Vehicle)；Ⅲ：照射+多肽保护组(UIFSP-1～4)，照射组剂量为10mJ/cm2。WS1细胞以5×103个/孔的密度接种于24孔板，Ⅲ组UIFSP 1-4肽处理72h，之后进行10mJ/cm2的UVB照射。照后72h，4％多聚甲醛固定细胞，细胞衰老SA-β-Gal染料密封孵育过夜。显微镜下拍摄WS1细胞衰老图像，并统计衰老阳性细胞率。
结果显示，UVB照前UIFSP-3、UIFSP-4肽处理可缓解受照后WS1细胞的细胞衰老(如图6所示)。对照组与UIFSP-3、4肽治疗组比较有统计学意义，t＝4.597，3.491，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。
综上，本发明UIFSP多肽本身具有较强的自由基清除能力，并能降低UVB照后人成纤维细胞的活性氧(ROS)水平，增加UVB照后人成纤维细胞的细胞活力，减少其细胞死亡和细胞凋亡，缓解UVB照后人成纤维细胞衰老。该类多肽人工合成方便，防治皮肤紫外损伤的潜力巨大，具备实际应用推广价值。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Figure RE-IDA0003391024350000011
Figure RE-IDA0003391024350000021

Claims (10)

1.一类多肽，其特征在于：包括四条多肽，所述四条多肽的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1～4所示。
2.如权利要求1所述的多肽在制备紫外辐射防护剂或在治疗皮肤疾病的药物方面的应用。
3.如权利要求1所述的多肽在制备自由基清除的防护剂或药物方面的应用。
4.如权利要求1所述的多肽在制备降低人皮肤细胞ROS水平的防护剂或药物方面的应用。
5.如权利要求1所述的多肽在制备增加人皮肤细胞活力的防护剂或药物方面的应用。
6.如权利要求1所述的多肽在制备延长人皮肤细胞生命周期的防护剂或药物方面的应用。
7.如权利要求1所述的多肽在制备减少人皮肤细胞凋亡的防护剂或药物方面的应用。
8.如权利要求1所述的多肽在制备缓解人皮肤细胞衰老的防护剂或药物方面的应用。
9.一种含如权利要求1所述的多肽的药物，其特征在于：包括所述多肽以及药学上可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于：所述辅料为制备水浸剂、粉剂、洗剂、酊剂、油剂、乳剂、软膏、硬膏或气雾剂中的一种所需的辅料。
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