CN117547022A - 一种用蜗牛壳制备生物活性物质的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用蜗牛壳制备生物活性物质的方法及其应用，采用所述方法能够从蜗牛壳中提取出包括可溶性钙在内的生物活性物质复合物。将本发明通过蜗牛壳制备的生物活性物质作为营养添加剂，能够增强动物免疫力，具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种由蜗牛壳制备生物活性物质及其制备方法和应用。
背景技术
蜗牛属腹足纲陆生软体动物，具有很高的食用和药用价值。中国普遍养殖的品种有白玉蜗牛，其黏液中主要含有胶原蛋白、尿囊素、硫酸软骨素、维生素、天然抗菌肽等活性成分。其中尿囊素可以使皮肤再生；蛋白质和维生素可以增加皮肤的营养，使肌肤更加细腻和光滑。
目前对蜗牛产品的应用开发多数集中在食品和化妆品领域，对于蜗牛活性物质的提取主要是集中在对蜗牛活性肽的提取上，例如，《热带病与寄生虫学》2005年第3卷第3期公开发表的“江西巴蜗牛活性成分提取方法的比较研究”报道了天螺多糖提取方法。《中国生化药物杂志》1993年第2期公开发表的“蜗牛酶的研制及应用”报道了从蜗牛消化腺提取蜗牛酶的方法。专利CN201210292779.X公开了一种蜗牛粘液的提取方法提取蜗牛分泌物。专利CN202211184756.7中公开了一种蜗牛活性肽的提取方法，通过将蜗牛壳去除，将所得到的蜗牛肉进行酶解、脱脂，最终浓缩干燥得到活性肽产品。
专利CN202211165416.X中公开了一种采用蜗牛壳制作可溶性生物活性钙的方法，其通过将蜗牛壳杂质去除，经粉碎后获得蜗牛壳粉，之后与水混合得到乳液，并将乳液与乳酸混合，经加热、浓缩、过滤得到乳酸钙晶体，再除臭灭菌获得乳酸钙晶体成品
以上方法有效利用了蜗牛肉、粘液以及蜗牛壳，但在实际生产过程中，由于蜗牛壳的回收过程难以避免的存在壳肉未分离的情况，如果仅按照壳回收的方式处理，会造成蜗牛壳残留肉的浪费；如果将蜗牛连壳带肉一起混合作为食材，则在实际食用过程中还是会遗留部分可以食用的肉质。因此，如何充分、高效利用蜗牛壳及其残余肉质，并加工出更有价值的产品成为需要解决的问题。
发明内容
本发明提出一种由蜗牛壳制备活性物质的方法和应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案。
在一个方面，本发明提供了一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将包括蜗牛壳在内的剩余物破碎，破碎物过50-100目筛，收集过筛后的剩余物，并测定过筛后剩余物的含水量，控制含水量在10-30％之间；
(2)配制好10-12％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:3-5范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，温度为22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物1；
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物2；
(5)将次级混合物2进行灭菌处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
在一个实施方案中，所述的步骤(1)将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过60目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至90％以上的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在10-30％之间。
在一个实施方案中，所述的步骤(1)如下：将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过60目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在20％。
在一个实施方案中，所述步骤(1)中，蜗牛壳内物去除为简单去肉处理，无需进行多次彻底去除。
在一个实施方案中，所述步骤(1)中，蜗牛壳内物去除后，在剩余物中加入5％(w/w)的蜗牛肉。
在一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述蜗牛壳内物去除采用机械去除。
在一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述蜗牛壳内物去除采用高温蒸煮后离心去壳。
在一个实施方案中，所述步骤(2)配制好10-12％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:3-5范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，配制好10％的柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例为2:5，之后持续混合10-30min得到初级混合物。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，配制好12％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:5范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，初级混合物的混合时间为10min。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，初级混合物的混合时间为15min。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，初级混合物的混合时间为20min。
在一个实施方案中，所述步骤(2)中，初级混合物的混合时间为30min。
在一个实施方案中，所述步骤(3)中的将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，温度为25℃条件下，150转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24h，得到次级混合物1。
在一个实施方案中，所述复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)。
在一个实施方案中，所述步骤(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物2。
在一个实施方案中，所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
在一个实施方案中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过50-100目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。
在一个实施方案中，所述微量元素包括：铁30-50mg/kg、铜20-60mg/kg、锌50-80mg/kg、锰0.4-1.2mg/kg；所述红参提取物100-500mg/kg；所述山楂提取物为50-120mg/kg。
在一个实施方案中，所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用90-100℃蒸煮20-50min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
所述步骤(5)中灭菌温度为120-130℃，灭菌时间为40min以上。
在一个方面，本发明提供了如前方法所制备的蜗牛活性物质。
在一个方面，本发明提供了一种保健组合物，其包含如前所述的蜗牛活性物质。
在一个方面，本发明提供了一种添加剂，其包含如前所述的蜗牛活性物质。
技术效果
本发明具有如下有益效果：
(1)发明人意外地发现，在处理蜗牛壳时，并不需要将蜗牛壳彻底清理干净，而是保留一部分蜗牛肉的情况下，能够获得效果更优的提取物，这样的操作不仅高效，而且可以节省时间和人工，通过实验发现，在保留蜗牛肉，甚至是添加部分蜗牛肉的情况下，得钙率反而显著提高。
(2)本发明通过添加柠檬酸，并摸索出合适的复合菌组合，在选用特定的菌株时，其带来的短肽和氨基酸明显高于其他实验组，如果选用其他复合菌，则虽然得钙率可能有所增加，但作为中药应用成分、免疫成分的多肽和氨基酸远低于正常组。尤其是发酵方式，采用间断性的发酵，能够带来更好的技术效果，这说明复合菌的选择和发酵方式之间有明显的协同作用。
(4)本发明选用了红参和山楂提取物作为重要成分加入到次级混合物1，能够带来更好的防腹泻效果，但在更换两者任意组分时，发现其作用都会明显下降，说明这两者之间存在明显的关联性，这说明本发明所获得的活性物质能够用于改善肠胃功能，具有极好的生理活性，有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明各个实施例和对比例所得终产物的得钙率测试结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
蜗牛，为白玉蜗牛，购自北京市海淀区四道口水产批发市场；红参(Talinumpaniculatum(Jacq.)Gaertn.)、西洋参(Panax quinquefolius L.)、人参(Panaxginseng C.A.Mey.)购自吉林农业大学参茸市场；山楂购自江苏无锡市场。
实施例1
本实施例提供了一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物进行一次机械去除，蜗牛壳上全将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过60目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至90％以上的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在10％；
(2)配制好10％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:5范围内，之后持续混合10min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1，温度为22℃条件下，150转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为10％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为1×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1，25℃条件下，150转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过50目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁30mg/kg、铜20mg/kg、锌50mg/kg、锰0.4mg/kg；所述红参提取物100mg/kg；所述山楂提取物为50mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用90℃蒸煮20min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物；
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌40min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
实施例2
本实施例提供了一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在20％。
(2)配制好10％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:3范围内，之后持续混合10min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，温度为25℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为10％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为4×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁50mg/kg、铜60mg/kg、锌80mg/kg、锰1.2mg/kg；所述红参提取物400mg/kg；所述山楂提取物为120mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用100℃蒸煮50min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行130℃、灭菌45min，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
实施例3
本实施例提供了一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例1
与实施例3相比，步骤(1)中蜗牛去壳后，将蜗牛壳多次重复冲洗，彻底去肉。其他步骤与实施例3相同，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，将蜗牛壳多次重复冲洗，彻底去肉，之后进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例2
该对比例与实施例3的区别在于步骤(2)中采用了10％乳酸溶液，其他步骤与实施例3相同，具体步骤如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好10％乳酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例3
该对比例与实施例3的区别在于步骤(2)中采用了12％乳酸溶液，其他步骤与实施例3相同，具体步骤如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好12％乳酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例4
该对比例与实施例3方法的区别在于步骤(3)所采用的复合菌株为高加索酸奶乳杆菌(CGMCC，1.15610)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)，其他条件不变。具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括高加索酸奶乳杆菌(CGMCC，1.15610)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例5
该对比例与实施例3的区别在于，步骤(3)所采用的复合菌液为德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.104)，其他条件不变，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.104)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例6
该对比例与实施例(3)的区别在于步骤(4)发酵方式不同，其采用的发酵方式为持续发酵48h，得到次级混合物2，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例7
该对比例与实施例3的区别在于，步骤(4)中在次级混合物1中加入的是人参提取物，其他步骤与实施例3相同，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和人参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述人参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的人参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例8
该对比例与实施例3的区别在于，将步骤(4)中所采用的复合菌液为德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.104)，其他条件不变，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述山楂提取物的制备方式如下：山楂清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到山楂提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
对比例9
该对比例与实施例3的区别在于，将山楂提取物替换为红枣提取物，其他条件相同，具体如下：
一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过90目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至95％的剩余物均已过筛，经称重后，在剩余物中加入5％(w/w)蜗牛肉，之后测定含水量，控制含水量在30％。
(2)配制好11％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:4范围内，之后持续混合20min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.5，温度为27℃条件下，200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物1；
其中，复合菌液包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(CGMCC，1.2161)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC，1.483)；在初级混合物中的发酵菌液添加量为15％(w/w)，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌数为2×1010CFU/g，鼠李糖乳杆菌的活菌数为5×109CFU/g。
(4)在次级混合物1中加入微量元素、红枣提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，26℃条件下，180转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续48h，得到次级混合物2；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
其中，所述红枣提取物的制备方式如下：红枣清洗后干燥处理，之后进行粉碎，过80目，再过滤，将滤液进行浓缩干燥，得到红枣提取物。所述微量元素包括：铁40mg/kg、铜50mg/kg、锌60mg/kg、锰0.9mg/kg；所述红参提取物450mg/kg；所述山楂提取物为100mg/kg。所述红参提取物制备方式如下：
取清洗干净的红参，去除芦头，之后先用95℃蒸煮40min，取滤液，将滤液干燥，得红参提取物。
(5)将次级混合物2进行120℃、灭菌50min处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
测试例1
将实施例1-3及对比例1-9所得的终产物进行可溶性钙测试，将去肉的蜗牛壳干燥磨成粉，测鱼鳞粉的总钙含量，总钙含量采用GB/T5009.92-2016中所述的EDTA滴定法测定。可溶性钙含量测定方法为：采用GB/T5009.92-2016中所述的EDTA滴定法测定脱钙液中的钙含量脱钙率按下列公式计算：脱钙率(％)＝脱钙液/总钙×100％。经测试发现，实施例1-3和对比例1-9的脱钙率如图1所示。
从图1可知，实施例3、对比例4-5、7-9的脱钙率最高，对比例2-3脱钙率最低。这说明柠檬酸能够促进可溶性钙的产生，相对而言，乳酸所带来的脱钙效果较差。
测试例2
将本发明实施例1-3和对比例1-9中制得的终产物进行多肽以及氨基酸含量测定，结果见表1。小于10kDa多肽含量采用OPA法测定；氨基酸参照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》测定，算出其总含量。具体测试方法参考文献：吴寒，芮昕，李春阳，等.多菌种固态发酵法提高燕麦全谷物的蛋白质营养品质[J].食品科学，2018，39(16)：168-175.
表1
由表1可知，本发明实施例1-3制得的终产物中小于10kDa的多肽以及氨基酸含量高，这说明在处理蜗牛壳时，并无必要彻底清除干净剩余的残肉，反而时留有部分残肉或者添加部分蜗牛肉所得的效果更优。
测试例3
该测试是针对各个终产物对番泻叶致泻小鼠的止泻作用进行研究，实验设计如下：
本实验采用番泻叶致小鼠腹泻模型，每只小鼠每天采用4g/(kg.d)番泻叶的剂量连续灌胃7天，然后再给药观察各组药物对番泻叶致小鼠腹泻的抑制作用，通过一定时间内观察小鼠湿粪的总粒数来作为研究评价指标。
对照组及各组实验动物均按1g/20g体重灌胃给药相应的药物水溶液，各组各3只小鼠，每只小鼠按4g/(kg.d)的剂量灌服番泻叶溶液，然后单独观察每只小鼠湿粪计数，以湿粪排出粒数的多少表示腹泻程度，记录各小鼠灌服番泻叶后4小时内的湿粪总数，并计算各组药物对番泻叶所致的小鼠腹泻抑制率。腹泻抑制率计数公式如下：抑制率＝[(模型组的湿粪数-给药各组的湿粪数)/模型组的湿粪数]*100％。
实验结果，见表2。
| 测试组 | 湿粪个数 | 抑制率(％) |
| 模型组 | 15 | / |
| 实施例1 | 6.3 | 58 |
| 实施例2 | 6.7 | 55.3 |
| 实施例3 | 4.7 | 68.7 |
| 对比例1 | 7.7 | 48.7 |
| 对比例2 | 9 | 40 |
| 对比例3 | 8 | 46.7 |
| 对比例4 | 11 | 26.7 |
| 对比例5 | 11.3 | 24.7 |
| 对比例6 | 10.7 | 28.7 |
| 对比例7 | 12.6 | 16 |
| 对比例8 | 10.3 | 31.3 |
| 对比例9 | 9.5 | 36.7 |
由上表可知，实施例1-3中，终产物对小鼠腹泻的治疗效果最佳，而从对比例的数据看，单纯改变单一因素并不能显著改善对腹泻的改善效果，对比例7和对比例9的数据显示，红参和山楂之间存在明显的协同作用，而从其他对比例看，其他步骤的因素对于治疗效果也存在明显作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用蜗牛壳制备活性物质的方法，包括以下步骤：
(1)将蜗牛壳内物去除，将包括蜗牛壳在内的剩余物破碎，破碎物过50-100目筛，收集过筛后的剩余物，并测定过筛后剩余物的含水量，控制含水量在10-30％之间；
(2)配制好10-12％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:3-5范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物；
(3)将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，温度为22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物1；
(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物2；
(5)将次级混合物2进行灭菌处理，之后冷冻干燥处理，得到蜗牛活性物质终产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)如下：将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过60目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至90％以上的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在10-30％之间。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(1)如下：将蜗牛壳内物处理得到包括蜗牛壳的剩余物后，即进行破碎，破碎物过60目筛，之后收集滤过后的剩余物，未能够过筛的剩余物再次进行破碎，直至90％以上的剩余物均已过筛，之后测定含水量，控制含水量在20％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)配制好10-12％柠檬酸溶液，缓慢加入至步骤(1)得到的蜗牛壳剩余物中，最终控制柠檬酸溶液与蜗牛壳剩余物的重量比例在2:3-5范围内，之后持续混合10-30min得到初级混合物。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的将初级混合物用复合菌液发酵，所述复合菌液包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.4，温度为25℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物1。
6.如权利要求1所述的方法，所述步骤(4)在次级混合物1中加入微量元素、山楂提取物和红参提取物，混匀后之后再次进行发酵，发酵菌液为复合菌液，包括乳杆菌和鼠李糖乳杆菌，两者菌数比为2:0.1-0.5，22-27℃条件下，150-200转/min摇床培养发酵，每隔20min，静置10min，持续24-48h，得到次级混合物2，所述步骤(5)中灭菌温度为120-130℃，灭菌时间为40min以上；所述复合菌液与步骤(3)复合菌液相同。
7.如权利要求6所述的方法，步骤(4)中所述微量元素包括：铁30-50mg/kg、铜20-60mg/kg、锌50-80mg/kg、锰0.4-1.2mg/kg；所述红参提取物100-500mg/kg；所述山楂提取物为50-120mg/kg。
8.如权利要求1-7所述的方法所制备的蜗牛活性物质。
9.一种保健组合物，其包含如权利要求8所述的蜗牛活性物质。
10.一种添加剂，其包含如权利要求8所述的蜗牛活性物质。
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