CN105131083B - 具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了两种具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法，其中一种扁杏仁肽的氨基酸序列为Met‑His‑Thr‑Asp‑Asp，另一种扁杏仁肽的氨基酸序列为Gln‑His‑Thr‑Asp‑Asp。这两种扁杏仁肽是以扁杏仁为原料，先提取扁杏仁蛋白，将扁杏仁蛋白酶解得到扁杏仁总肽，再经葡聚糖凝胶层析、反相制备色谱分离得到。实验结果表明，这两种扁杏仁肽具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性，前者对血管紧张素转化酶抑制活性的IC₅₀值为67.52±0.05μg/mL，后者对血管紧张素转化酶抑制活性的IC₅₀值为43.18±0.07μg/mL，且细胞毒性较低，因而可以作为降压药物。该发明为扁杏仁的深加工和降压肽的开发提供了新途径。

Description

具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法

技术领域

本发明属于医用蛋白或肽/蛋白技术领域，具体涉及两种具有显著的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的扁杏仁肽及其制备方法。

背景技术

目前，天然生物活性肽研究的蛋白来源主要有：(1)植物性来源：大豆/豆粕、米糟、花生、杏仁等；(2)动物性来源：蚕丝、猪肉、鸡肉、动物皮/骨、动物毒液等。

生物活性肽的作用研究方向主要有：(1)抗高血压活性；(2)抗氧化活性；(3)抗血栓活性；(4)抗菌作用；(5)免疫作用；(6)拮抗与抗拮抗活性；(7)抗炎症作用等。

以上成果大多停留在色谱分析水平，没有制取到足够的纯净样品。有的仅进行了体外或细胞活性研究两者中的一项，不能充分证明产物的安全和有效性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供两种具有显著的血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽，以及这两种扁杏仁肽的制备方法。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：该扁杏仁肽的氨基酸序列为α-His-Thr-Asp-Asp，其中α代表Met或Gln。

本发明具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法由下述步骤组成：

1、提取扁杏仁蛋白

将扁杏仁依次经热水脱皮、粉碎、脱脂、溶剂提取、乙醇和等电点沉降法复合沉淀、冷冻干燥，得到扁杏仁蛋白。

2、蛋白酶解

将步骤1得到的扁杏仁蛋白先用Protamex复合蛋白酶水解，然后用Alcalase碱性蛋白酶水解，离心分离，上清液冷冻干燥，得到扁杏仁总肽。

3、葡聚糖凝胶层析

将步骤2得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为30～50g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入Sephadex G-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪进行分离，进样量2mL，流速3mL/分钟；收集19～40分钟所有流出成分，冷冻干燥。

4、反相制备色谱分离

将步骤3冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为40～60g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气后，注射入制备色谱系统，进样量1mL，采用SinochromODS-BP色谱柱分离，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为含0.05％三氟乙酸的超纯水，梯度洗脱程序：0～10分钟，20％乙腈；10～30分钟，20％～40％乙腈；30～40分钟，40％～70％乙腈；流速12mL/分钟；收集8.52～9.14分钟和14.87～15.26分钟流出的两种成分，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。

本发明的扁杏仁蛋白可根据现有文献公开的任意一种提取方法提取。

本发明以扁杏仁为原料，先提取扁杏仁蛋白，再将扁杏仁蛋白酶解后得到的扁杏仁总肽经葡聚糖凝胶层析、反相制备色谱分离得到两种扁杏仁肽。实验结果表明，所制备的两种扁杏仁肽具有较高的ACE抑制活性，其中氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽对ACE抑制活性的IC₅₀值为67.52±0.05μg/mL，氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽对ACE抑制活性的IC₅₀值为43.18±0.07μg/mL，且细胞毒性较低，因而可以作为降压药物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、提取扁杏仁蛋白

根据公布号为CN 102845585A、发明名称为“聚乙二醇-微波辅助提取杏仁蛋白的方法”中实施例1公开的方法提取扁杏仁蛋白。

2、蛋白酶解

将扁杏仁蛋白与蒸馏水按质量体积比为40g:1L混合，在温度为42℃水浴中先用Protamex复合蛋白酶在pH值为6.5下水解100分钟，加酶量为53140U/g蛋白，水解完后在沸水浴中灭酶20分钟，然后在温度为53℃的环境中用Alcalase碱性蛋白酶在pH值为7.6下酶解90分钟，加酶量为1130U/g蛋白，酶解完后在沸水浴中灭酶20分钟，酶解过程用0.5mol/LNaOH水溶液调节pH值；10000转/分钟离心分离20分钟，所得上清液在-40℃冷冻干燥24小时，得到扁杏仁总肽。

3、葡聚糖凝胶层析

将2.06g扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为40g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入Sephadex G-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪(上海沪西分析仪器厂提供)在检测波长为280nm、进样量为2mL、流速为3mL/分钟下进行分离，收集19～40分钟所有流出成分，如此反复试验，合并流出组分，在-40℃冷冻干燥24小时，得到产品共0.76g。

4、反相制备色谱分离

将步骤3葡聚糖凝胶层析中得到的0.76g产品与超纯水按质量体积比为50g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气20分钟后，注射入岛津LC-10A制备色谱系统，色谱柱为大连伊利特Sinochrom ODS-BP，检测波长220nm，进样量1mL，流速12mL/min，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为超纯水(含0.05wt.％三氟乙酸)，梯度洗脱程序：0～10分钟，20％(体积浓度)乙腈；10～30分钟，20％～40％(体积浓度)乙腈；30～40分钟，40％～70％(体积浓度)乙腈；收集8.52～9.14分钟和14.87～15.26分钟流出的两种成分，在-40℃冷冻干燥24小时，得到114mg肽A和12mg肽B，经HPLC检测证明两种肽均为纯品，经PPSQ-31A蛋白质自动检测仪检测，肽A的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp，肽B的氨基酸序列为Gln-His-Thr-Asp-Asp。

发明人对实施例1得到的肽A和肽B分别进行体外和细胞实验，具体实验情况如下：

1、体外ACE抑制活性

在37℃下，ACE可以与马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)相互作用，将其降解为马尿酸(HA)，即同等条件下，一个物质如果使得ACE-HHL体系中转化出的HA越少，其ACE抑制性越强，即HA峰面积越小，物质的ACE抑制性越强。

将肽A和肽B分别用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制成5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL 5个浓度，作为样品溶液。向2mL离心管中加入120μL5mmol/L HHL和40μL样品溶液，于37℃水浴恒温6min，加入100μL0.1U/mL的ACE溶液(用pH值为8.3的硼酸缓冲液配制)，于恒温磁力搅拌器中37℃恒温4000r/min搅拌反应60min，加入160μL 1.0mol/L HCl水溶液反应10min，终止反应后用超滤膜过滤，滤液用Waters1525高效液相色谱仪测定HA，色谱条件：Waters PDA 2996二极管阵列检测器；美国安捷伦Agilent 300Stable-bond C18大孔色谱柱；进样量20μL；流速1mL/min；检测波长228nm；流动相A为乙腈，流动相B为超纯水，两者均含0.05％TFA；梯度洗脱程序：0～40min，10％～45％乙腈。同时pH值为8.3的硼酸缓冲液做空白对照试验。每个实验平行测定3次取平均值。用SPSS Statistics进行统计，分别拟合肽A和肽B抑制曲线，计算IC₅₀值，试验结果见表1。

表1肽A和肽B的ACE抑制活性结果

由表1可见，肽A的IC₅₀＝67.52±0.05μg/mL，肽B的IC₅₀＝43.18±0.07μg/mL，说明肽A和肽B具有较好的ACE抑制活性。

2、人脐静脉内皮细胞活性试验

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，用PBS缓冲液冲洗，弃去PBS缓冲液，用胰酶溶液消化细胞，制成1×10⁴/mL或1×10⁵/mL的细胞悬液。平行分为11组，具体分组如下：

(1)空白对照组；

(2)肽A低剂量组：加入肽A浓度为150μg/mL；

(3)肽A中剂量组：加入肽A终浓度为300μg/mL；

(4)肽A高剂量组：加入肽A肽终浓度为600μg/mL；

(5)肽B低剂量组：加入肽B终浓度为150μg/mL；

(6)肽B中剂量组：加入肽B终浓度为300μg/mL；

(7)肽B高剂量组：加入肽B终浓度为600μg/mL；

(8)卡托普利(Cap)组：Cap浓度为10^-5mol/L；

(9)去甲肾上腺素(NE)组：加入NE终浓度为100μg/L；

(10)肽A+NE：加入肽A与NE，肽A浓度为300μg/mL、NE浓度为100μg/mL；

(11)肽B+NE：加入肽B与NE，肽A浓度为300μg/mL、NE浓度为100μg/mL。

①MTT实验

将1×10⁴/mL细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养。待细胞贴壁后，空白对照组加入100μL高糖DMEM培养液；试验组(2)-(11)按分组要求分别加入同体积的不同干预因素。每组设6个复孔，放入37℃、5％CO₂条件下分别培养24、48和72h。培养结束后，每孔加入10μL的MTT溶液，继续孵育4h，终止培养，吸弃培养液。每孔加入100μL的DMSO，震荡10min，使结晶物质充分溶解。用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光度(A)值，并计算细胞增值率，结果见表2。

表2MTT比色法试验结果

注：表中数据为细胞增殖率，根据公式细胞增殖率＝试验组ODA₄₉₀值/对照组ODA₄₉₀×100％计算得到；*表示与空白对照组比较P<0.05，**表示与空白对照组比较p<0.01。

由表2可见，较之空白对照组，NE对HUVEC增殖有明显的促进作用，而Cap及不同剂量的肽A、肽B对HUVEC均有抑制生长作用，其中Cap和高剂量肽A和肽B对HUVEC增殖有极显著的抑制作用(p<0.01)，同时肽A和肽B对NE均具有一定拮抗作用。

(2)HUVEC培养液中一氧化氮(NO)和内皮素(ET)含量测定

将1×10⁵/mL细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，于37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，待细胞贴壁后，按分组要求分别加入不同干预因素，分别继续培养10、24和48h，收集培养上清液，按试剂盒说明书测定NO、ET含量，结果见表3和表4。

表3细胞培养液中NO含量(μM)测定结果(n＝6)

注：*表示与空白对照组比较P<0.05，**表示与空白对照组比较p<0.01。

表4细胞培养液中ET含量(pg/mL)测定结果(n＝6)

注：*表示与空白对照组比较P<0.05，**表示与空白对照组比较p<0.01。

由表3、表4可见，与空白对照组比较，卡托普利及不同剂量的肽A、肽B均可升高HUVEC培养液中NO含量，而且随着培养时间的延长，NO量显著增加。而卡托普利及不同剂量的肽A、肽B对HUVEC培养液中ET的含量，均有显著的降低作用。

实验结果还显示，去甲肾上腺素(NE组)可显著地降低HUVEC培养液中NO含量，促进ET分泌；中剂量肽A、肽B和去甲肾上腺素合用，可使培养液中NO含量和ET值接近空白对照组，说明肽A、肽B对去甲肾上腺素具有显著的拮抗作用。

综合上述实验结果可见，本发明所提供的氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的两种扁杏仁肽均具有较高的ACE抑制活性和对人脐静脉内皮细胞功能的保护作用，因而具有降压作用，可以作为降压药物开发使用。

Claims (2)

1.具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽，其特征在于该扁杏仁肽的氨基酸序列为：α-His-Thr-Asp-Asp，其中α代表Met或Gln。

2.一种权利要求1所述的具有血管紧张素转化酶抑制活性的扁杏仁肽的制备方法，其特征在于它由下述步骤组成：

(1)提取扁杏仁蛋白

将扁杏仁依次经热水脱皮、粉碎、脱脂、溶剂提取、乙醇和等电点沉降法复合沉淀、冷冻干燥，得到扁杏仁蛋白；

(2)蛋白酶解

将步骤(1)得到的扁杏仁蛋白与蒸馏水按质量体积比为40g:1L混合，在温度为42℃水浴中先用Protamex复合蛋白酶在pH值为6.5下水解100分钟，加酶量为53140U/g蛋白，水解完后在沸水浴中灭酶20分钟，然后在温度为53℃的环境中用Alcalase碱性蛋白酶在pH值为7.6下酶解90分钟，加酶量为1130U/g蛋白，酶解完后在沸水浴中灭酶20分钟，酶解过程用0.5mol/L NaOH水溶液调节pH值；10000转/分钟离心分离20分钟，所得上清液在-40℃冷冻干燥24小时，得到扁杏仁总肽；

(3)葡聚糖凝胶层析

将步骤(2)得到的扁杏仁总肽与超纯水按质量体积比为30～50g:1L混合，脱气、超滤膜过滤后加入Sephadex G-15填充柱中，以超纯水为流动相，采用自动液相色谱分离层析仪进行分离，进样量2mL，流速3mL/分钟；收集19～40分钟所有流出成分，冷冻干燥；

(4)反相制备色谱分离

将步骤(3)冷冻干燥后得到的产品与超纯水按质量体积比为40～60g:1L混合，用超滤膜过滤，超声脱气后，注射入制备色谱系统，进样量1mL，采用Sinochrom ODS-BP色谱柱分离，洗脱相A为乙腈，洗脱相B为含0.05％三氟乙酸的超纯水，梯度洗脱程序：0～10分钟，20％乙腈；10～30分钟，20％～40％乙腈；30～40分钟，40％～70％乙腈；流速12mL/分钟；收集8.52～9.14分钟和14.87～15.26分钟流出的两种成分，冷冻干燥，得到氨基酸序列为Met-His-Thr-Asp-Asp和Gln-His-Thr-Asp-Asp的扁杏仁肽。