CN112831535A - 菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法及化妆品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，包括以下步骤：S1.保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净；S2.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5～15℃；S3.往肉糜中加入蛋白酶进行酶解反应，反应得到酶解液；S4.沸水加热酶解液将其中的蛋白酶进行灭活；S5.离心酶解液，收集上清液；S6.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分；S7.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。本发明还公开了一种化妆品，包括上述提取方法提取得到的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。本发明提取方法简单，制得的多肽产物利于机体吸收，提取得到的多肽可应用于化妆品中，天然，无副作用。

Description

菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法及化妆品
技术领域
本发明涉及水产加工利用技术领域，尤其是涉及一种菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，以及在化妆品上的应用。
背景技术
我国海洋面积巨大，生物资源非常丰富。由于海洋内部环境十分复杂，并且海洋中存在着十分丰富的化合物，这些因素造就了海洋生物资源品种多、数量多和稀缺性的特点。因此，海洋生物多肽的开发很有远景。
海洋生物多肽分子结构比蛋白质更为简单，且分子量更小。因此，海洋生物多肽更便于被机体吸收。而且，相对于游离氨基酸，海洋生物多肽有着更为丰富的生物学功能以及更高的营养价值。
菊黄东方鲀，属鲀科，东方鲀属，是河鲀中的常见品种，在中国渤海、东海等地均有生长，菊黄东方鲀常以鱼类和贝类为食。如今，菊黄东方鲀的育苗养殖技术已经非常成熟，在福建省漳州市漳浦县等地均有菊黄东方鲀养殖基地。相对于野生菊黄东方鲀，养殖菊黄东方鲀的毒性大大降低，且其毒性主要存在于内脏等部位，肌肉基本无毒。菊黄东方鲀养殖产量在逐年攀升，人们对于菊黄东方鲀的研究也将逐步深入。
公布号为CN111004309A的专利公开了“一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法”从菊黄东方鲀鱼皮为原料获得ACE抑制肽。公布号为CN109912708A的专利公开了：“一种菊黄东方鲀鱼精蛋白的提取方法”，从菊黄东方鲀鱼精巢中提取鱼精蛋白，目前尚未有从菊黄东方鲀肌肉中提取多肽的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽的提取方法，以获得高活性的具有应用前景的多肽。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，包括以下步骤：
S1.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净。
S2.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5～15℃。低温有利于后续酶解反应的进行。
S3.往肉糜中加入蛋白酶进行酶解反应，反应得到酶解液。
S4.沸水加热酶解液将其中的蛋白酶进行灭活。
S5.离心酶解液，收集上清液。
S6.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分。
S7.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。
其中，步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为2500～3500U/g、反应温度为35～37℃、酶解pH为6.8～7.2、料液比1:10～12g/mL、反应时间7～8h；反应得到胰蛋白酶解液。
优选地，步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为3011U/g、反应温度为36.9℃、酶解pH为7、料液比1:10、反应时间8h。
其中，步骤S3中，酶解反应加入风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4000～5000U/g、反应温度为55～60℃、酶解pH为7～7.5、料液比1:10～12g/mL、反应时间4.2～4.5h；反应得到风味蛋白酶解液。
优选地，步骤S3中，酶解反应加入风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4521.96U/g、反应温度为55℃、酶解pH为7、料液比1:10g/mL、反应时间4.5h。
本发明还公开了一种化妆品，其特征在于：包括上述提取方法提取得到的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。
进一步地，所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽为胰蛋白酶酶解多肽，步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为2500～3500U/g、反应温度为35～37℃、酶解pH为6.8～7.2、料液比1:10～12g/mL、反应时间7～8h。
优选地，所述的胰蛋白酶酶解多肽在化妆品中的剂量为1000～2000μg/mL。
进一步地，还包括风味蛋白酶酶解多肽，胰蛋白酶酶解多肽与风味蛋白酶酶解多肽的质量比为3～5：1，所述的风味蛋白酶酶解多肽的提取方法包括以下步骤：
S21.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净；
S22.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5℃～15℃；
S23.往肉糜中加风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4000～4500U/g、反应温度为55～60℃、酶解pH为7～7.5、料液比1:10～12g/mL、反应时间4.2～4.5h；反应得到风味蛋白酶解液；
S24.沸水加热酶解液将其中的风味蛋白酶进行灭活；
S25.离心酶解液，收集上清液；
S26.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分；
S27.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明以菊黄东方鲀肌肉作为原料进行蛋白酶酶解并纯化，获得多肽，提取方法简单，通过优化后的酶解工艺，使得酶解充分，制得的多肽产物利于机体吸收，可以很好的补充机体所需要的氨基酸。
2、本发明制得的胰蛋白酶酶解多肽对mTYR活性的抑制率高，可抑制黑色素的合成，用于美白化妆品中。
3、本发明美白化妆品中包括菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽与风味蛋白酶酶解多肽，胰蛋白酶酶解多肽可抑制黑色素的合成，风味蛋白酶酶解多肽有良好的抗氧化能力，清除DPPH自由基和·OH自由基的IC50为1200μg/mL、260μg/mL，两种多肽组合能够发挥协同作用。
附图说明
图1为不同蛋白酶对菊黄东方鲀肌肉酶解所得到的酶解液对mTYR活性的抑制率。
图2为pH值对TFMP-T酶解液对mTYR活性的抑制率的影响。
图3为加酶量对TFMP-T酶解液对mTYR活性的抑制率的影响。
图4为酶解时间对TFMP-T酶解液对mTYR活性的抑制率的影响。
图5为温度对TFMP-T酶解液对mTYR活性的抑制率的影响。
图6为不同蛋白酶对菊黄东方鲀肌肉酶解所得到的酶解液的水解度。
图7为pH值对TFMP-F酶水解度的影响。
图8为酶解时间对TFMP-F酶水解度的影响。
图9为料液比对TFMP-F酶水解度的影响。
图10为温度对TFMP-F酶水解度的影响。
图11为加酶量对TFMP-F酶水解度的影响。
图12为TFMP-F和GSH对·OH自由基清除能力。
图13为TFMP-F对·DPPH自由基清除能力。
图14为GSH对·DPPH自由基清除能力。
图15为TFMP-T对B16F10细胞色素沉着的影响，图中：与对照组相比，**(P<0.01)。
图16为TFMP-T对B16F10细胞黑色素含量的影响。
图17为TFMP-T对B16F10细胞TYR活性的影响。
图18为TFMP-T对斑马鱼胚胎黑色素沉着的影响。
图19为TFMP-T对斑马鱼胚胎体内黑色素含量的影响。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例一
本实施例公开了菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽(以下简称：TFMP-T)的提取方法。
本实施的提取方法步骤如下：
S11.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净。
S12.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5℃～15℃。
S13.往肉糜中加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为2500～3500U/g、反应温度为35～37℃、酶解pH为6.8～7.2、料液比1:10～12g/mL、反应时间7～8h，反应得到酶解液。优选为加酶量为3011U/g、反应温度为36.9℃、酶解pH为7、料液比1:10、反应时间8h。
S14.沸水加热酶解液将其中的蛋白酶进行灭活。
S15.离心酶解液，收集上清液。
S16.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分。
S17.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽(TFMP-T)。
本实施例中TFMP-T的提取工艺参数通过以下实验确定，详述如下。
1、蛋白酶的筛选结果
选用不同的蛋白酶进行如上步骤的实验，得到不同的酶解液，设定6种酶的反应条件如下：料液比(1:10)、加酶量(5000U/g)、反应时间(8h)，待该反应完成之后，煮沸酶解液对蛋白酶进行灭活，待其冷却之后，10000rpm/min离心15min，保留上清液检测酶解液对mTYR(酪氨酸酶)活性的抑制率。不同蛋白酶对菊黄东方鲀肌肉酶解所得到的酶解液对mTYR活性的抑制能力具有很大差异，实验结果如图1所示，从图1可以看出只有胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对菊黄东方鲀肌肉酶解所得酶解液对mTYR活性具有一定的抑制能力，但胰蛋白酶所得酶解液的抑制能力远大于木瓜蛋白酶，而碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶所得酶解液对mTYR活性的抑制率为负。因为选用胰蛋白酶。
2、单因素实验
pH对蛋白酶的活力有直接影响，pH过高或者过低均影响蛋白酶的活力。如图2所示，pH在6.5～7范围内，酶解液对mTYR活性的抑制率随着pH上升而上升，pH在7～8.5范围内，酶解液对mTYR活性的抑制率随着pH的上升而下降。酶解反应pH为6.8～7.2时胰蛋白酶的活性相对较高，因此酶解pH选取7。
如图3所示，加酶量为1000～3000U/g时，酶解液对mTYR活性的抑制率随酶添加量的增加呈现上升的趋势，加酶量为3000～6000U/g时，酶解液对mTYR活性抑制率随酶添加量的增加呈现下降的趋势。因此加酶量选取2500～3500U/g。
如图4所示，当酶解时间逐渐延长时，酶解液对mTYR活性的抑制能力不断增强，7h后到达稳定状态。为缩短生产周期，酶解的反应时间选取7～8h。
如图5所示，温度在27～37℃范围内，酶解液对mTYR活性的抑制率随温度的提高而增强，当温度从37℃上升到47℃，酶解液对mTYR活性抑制率开始下降。所以酶解温度选取35～37℃。
3、响应面优化结果
进行响应面设计，表1为试验方案和结果，表2为数据的方差分析。按照Box-Behnken的组合设计，设计3因素3水平共17个试验，其中中心点重复5次试验；响应值是mTYR活性抑制率。
表1 Box-Behnken试验方案和结果
Figure BDA0002934686190000051
Figure BDA0002934686190000061
将表1结果多元二次回归拟合，建立提取工艺参数回归模型。回归方程为：IR(％)＝91.10-0.88A+0.06B-0.69C-0.49AB+0.055AC-1.17BC-7.85A2-6.97B2-6.37C2
模型P<0.01，表明模型极显著；失拟项P>0.05，失拟项差异不显著；决定系数R2＝96.17％，回归模型可描述响应值的变化。校正系数RAdj 2＝91.24，即抑制率的变化有91.24％来源于所选因素的影响。因此该模型能够对体外菊黄东方鲀肌肉酶解液对mTYR活性抑制率进行分析和预测。对mTYR活性抑制率的影响次序为温度>pH>加酶量。由方差分析和回归方程可知，模型中二次项A2、B2、C2极显著影响mTYR活性抑制率。
表2回归模型方差分析
Figure BDA0002934686190000062
Figure BDA0002934686190000071
注：**(P<0.01)；*(P<0.05)。
由以上响应面优化所得的TFMP-T的最优提取工艺：加酶(胰蛋白酶)量3011U/g、反应温度36.9℃、酶解pH 7.0、料液比1∶10(g/mL)、反应时间8h，预测mTYR活性抑制率为91.14％，而其实际值为90.42％，相对误差为0.80％，二者无显著性差异。
4、分子量分布
测定TFMP-T中分子量范围，得到TFMP-T中分子量范围在0-1KD、1-5KD、＞5KD组分占比分别为97.31％，2.68％和0.01％。TFMP-T分子量基本在0-1KD范围内，分子量比较小，利于机体吸收。
5、氨基酸组成
测定TFMP-T的组成，TFMP-T蛋白质含量为78.00％，说明该TFMP-T的主要成分是蛋白质。灰分和水分含量为3.79％±0.20％，5.96％±0.01％。TFMP-T总氨基酸含量为71.56％，含有18种氨基酸，如表3所示，种类十分齐全。总氨基酸中必需氨基酸占42.29％，所以TFMP-T可以很好地补充机体所需要的氨基酸。
表3 TFMP-T的氨基酸组成
氨基酸种类 氨基酸含量/％ 氨基酸种类 氨基酸含量/％
天冬氨酸 6.65 亮氨酸 6.26
苏氨酸 3.36 酪氨酸 2.52
丝氨酸 2.77 苯基丙氨酸 2.80
谷氨酸 10.59 赖氨酸 6.91
甘氨酸 4.01 组氨酸 1.68
丙氨酸 4.94 精氨酸 4.47
缬氨酸 4.10 脯氨酸 2.67
蛋氨酸 2.22 胱氨酸 1.00
异亮氨酸 3.94 色氨酸 0.67
实施例二
本实施例公开了菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽(以下简称：TFMP-F)的提取方法。
本实施的提取方法步骤如下：
S21.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净。
S22.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5℃～15℃。
S23.往肉糜中加风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4000～5000U/g、反应温度为55～60℃、酶解pH为7～7.5、料液比1:10～12g/mL、反应时间4.2～4.5h；反应得到风味蛋白酶解液。优选为：加酶量为4521.96U/g、反应温度为55℃、酶解pH为7、料液比1:10g/mL、反应时间4.5h。
S24.沸水加热酶解液将其中的风味蛋白酶进行灭活。
S25.离心酶解液，收集上清液。
S26.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分。
S27.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽。
本实施例中TFMP-F的提取工艺参数通过以下实验确定，详述如下。
1、蛋白酶的筛选结果
选用不同的蛋白酶进行如上步骤的实验，得到不同的酶解液，设定6种酶的反应条件如下：料液比(1:10)、加酶量(5000U/g)、反应时间(8h)。酶解反应完成之后，沸水加热酶解液10min对蛋白酶进行灭活，冷却后10000rpm/min离心15min，保留上清液对水解度进行检测。实验重复3次。实验结果如图6所示。从图6中可以看出，利用风味蛋白酶所得酶解液的水解度明显高于其他蛋白酶的酶解液，表明该蛋白酶的酶解效果较好。所以选择风味蛋白酶进行提取。
2、单因素实验
pH对蛋白酶的活性有直接影响，pH过高或者过低均影响蛋白酶的活性。如图7所示，pH在6～7.5时，水解度随pH提高而增大，而后则随着pH提高而减小。菊黄东方鲀肌肉在pH6和8的条件下酶解，水解度较低，而在pH为7～7.5的条件下，该酶的活性则相对较高。
酶解时间对于酶解实验至关重要，如果酶解时间较短，则底物酶解不充分，造成水解度降低。如图8所示，当反应时间从3h逐渐延长到5h时，水解度呈上升的趋势，4.5h后水解度波动较小，处于稳定状态，为缩短生产周期，则反应时间选取4.2～4.5h。
在酶解反应的过程之中，料液比起着重要的作用。提高料液比有利于提高传质推动力，从而促进酶解实验的进行；但从节省实验试剂及减少后期浓缩工作的角度考虑，料液比也不宜过大。从图9可知，料液比从1:5(g/mL)增大至1:25(g/mL)的过程中，水解度呈现出先上升后下降的趋势，料液比在1:5-1:10(g/mL)范围时，水解度是上升的，之后水解度趋于稳定。由于料液比过大会增加后期浓缩的压力，而且会造成实验试剂的大量消耗。出于减少浓缩压力以及节省实验试剂的考虑，因此，酶解料液比选取1:10～12(g/mL)。
如图10所示，温度在30～60℃时，水解度随温度的提高而提高，温度在60～70℃时，水解度逐渐下降。温度增高，提高了分子撞击的几率，从而对酶催化效率有促进作用，所以有利于风味蛋白酶酶解菊黄东方鲀肌肉。当温度持续增高，酶的活性逐渐降低，菊黄东方鲀肌肉酶解液水解度也随之降低。因此，酶解温度选择55～60℃。
如图11所示，酶浓度为1000-4000U/g时，水解度逐渐提高，酶浓度为4000-5000U/g时，水解度趋于平稳，因此，酶浓度选取4000～5000U/g。
3、响应面优化结果
进行响应面试验，数据的方差分析结果如表5所示。按照Box-Behnken的组合设计，软件Design-Expert8.0.6设计3因素3水平共17个试验，其中中心点重复5次试验；响应值是水解度，设计的试验方案和结果如表4所示。
表4 Box-Behnken试验方案及结果
Figure BDA0002934686190000091
Figure BDA0002934686190000101
利用软件Design-Expert8.0.6，将表4结果进行多元二次回归拟合，获得酶解条件和酶解液水解度回归模型，其回归方程为：
DH(％)＝21.24+0.8A+2.19B-3.49C-0.66AB+0.81AC+0.61BC+1.17A2-2.14B2+0.16C2
对模型进行方差分析，结果如表5所示，在二次回归模型中，P<0.01，模型极显著；失拟项P>0.05，失拟项差异不显著；决定系数R2＝97.58％，校正系数R2 Adj＝94.47％，模型拟合程度高，此模型能够对菊黄东方鲀肌肉水解度结果进行分析和预测。在所选的3个因素中，对水解度的影响次序为温度>加酶量>pH。在方差分析中，模型中一次项B、C极显著影响水解度，A显著影响水解度；模型中二次项B2极显著影响水解度，A2显著影响水解度。
表5回归模型方差分析
Figure BDA0002934686190000102
注：**(P<0.01)；*(P<0.05)。
由以上响应面优化所得的TFMP-T的最优提取工艺：加酶(风味蛋白酶)量4521.96U/g、反应温度55℃、酶解pH 7、料液比1:10(g/mL)、反应时间4.5h，预测其水解度为26.66％。为检验模型结果与真实情况的一致性和可靠性，进行3次重复验证试验，计算其水解度实际值为26.26％，误差值为1.52％，与预测值无显著性差异。
4、分子量分布
测定TFMP-T中分子量范围，得到TFMP-F中分子量范围在0-1KD、1-5KD、＞5KD组分占比分别为98.58％，0.51％和0.91％。TFMP-T分子量基本在0-1KD范围内，分子量比较小，利于机体吸收。
5、氨基酸组成
测定TFMP-F的组成，TFMP-F蛋白质含量为77.10％，而灰分和水分的含量为8.24％±0.35％和7.42％±0.19％。TFMP-F总氨基酸含量为70.18％，含有18种氨基酸，如表6所示，种类十分齐全。总氨基酸中必需氨基酸占41.61％，所以TFMP-F可以很好地补充机体所需要的氨基酸。
表6 TFMP-F的氨基酸组成
氨基酸种类 氨基酸含量/％ 氨基酸种类 氨基酸含量/％
天冬氨酸 6.59 亮氨酸 6.01
苏氨酸 3.27 酪氨酸 2.39
丝氨酸 2.77 苯基丙氨酸 2.71
谷氨酸 10.45 赖氨酸 6.67
甘氨酸 4.13 组氨酸 1.62
丙氨酸 4.87 精氨酸 4.44
缬氨酸 3.95 脯氨酸 2.74
蛋氨酸 2.15 胱氨酸 0.98
异亮氨酸 3.79 色氨酸 0.65
实施例三
本实施公开了一种化妆品，采用实施例一或实施例二的提取方法，提取得到的菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽(TFMP-T)或者菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽(TFMP-F)作为原料进行制备，或者同时采用上述两种多肽混合作为化妆品的原料。若将上述两种多肽进行混合，则质量比为TFMP-T：TFMP-F＝(3～5)：1。胰蛋白酶酶解多肽(TFMP-T)在化妆品中的剂量为1000～2000μg/mL。
1、抗氧化性
由于人体肌肤长期暴露在阳光、污浊空气、电脑辐射和绚丽彩妆下bai的肌肤会发生氧化反应，产生一种有害化合物——自由基，它的强氧化性会损害机体的组织和细胞，进而引起衰老。因为自由基对肌肤的损害时刻在发生，肌肤氧化也在随时威胁着美丽，因此化妆品原料中需要有抗氧化剂。而本申请制得的菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽(TFMP-F)具有良好的抗氧化能力。通过以下实验进行抗氧化能力的测定。
(1)对DPPH自由基的清除能力
将不同浓度的TFMP-F加入0.2MDPPH溶液之中，并混匀，室温反应1h。待反应完全后，检测反应液吸光值(波长475nm)。实验重复3次。采用GSH作为阳性对照。实验结果如图12所示。TFMP-F能够清除·OH自由基，IC50为260μg/mL。
(2)对·OH自由基清除能力
采用南京建成生物工程有限公司试剂盒进行测定。实验重复3次。采用GSH作为阳性对照。实验结果如图13、图14所示。TFMP-F能够清除DPPH自由基，IC50为1200μg/mL。
2、对细胞黑色素合成的抑制
通常肌肤黑色素的异常增将会导致色素沉着。一部分黑色素会随着角质层脱落，另一部分沉淀于底层，而且如果皮肤上黑色素沉积过多，可能会导致机体疾病的发生，比如黑斑、晒斑等症状。因此化妆品原料中需要有能适当抑制黑色素合成的抑制剂。而本申请制得的菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽(TFMP-T)具有黑色素合成的抑制作用。通过以下实验进行测定。
(1)对B16F10细胞黑色素合成的抑制作用
由于B16F10细胞黑色素表达能力很强，适合黑色素相关实验的研究，所以本实验采用该细胞进行实验。
从细胞毒性试验可知，0-2000μg/mL TFMP-T不影响B16F10细胞的增殖。选取0、60、125、250、500、1000μg/mL这6个浓度TFMP-T处理B16F10细胞60h研究其对黑色素沉着的影响。图15为不同浓度处理的B16F10细胞离心所收集到的细胞沉淀照片。从照片中可以很直观地看出，细胞沉淀黑色素沉着随着TFMP-T的浓度的提高而逐渐降低，说明TFMP-T对B16F10细胞黑色素的沉着有抑制作用，并且具有浓度依赖性。
图16为TFMP-T对B16F10细胞黑色素含量的影响。由图16可以看出，TFMP-T可抑制B16F10细胞黑色素的合成，其相对黑色素含量随着TFMP-T浓度提高而逐渐降低，呈现浓度依赖性。相对于空白组，最高浓度处理组(1000μg/mL)细胞黑色素含量下降了60％。由统计学分析结果可知，对照组和处理组呈极显著差异(P<0.01)。
用TFMP-T处理B16F10细胞60h，采用多巴氧化速率法检测TYR活性。由图17可以看出，TFMP-T可抑制B16F10细胞TYR活性，且呈现出浓度依赖性。浓度处理组(1000μg/mL)对细胞酪氨酸酶活性抑制率为63％。由统计学分析结果可知，处理组和对照组呈极显著差异(P<0.01)。
综上，TFMP-T对B16F10细胞黑色素的沉着，黑色素的形成以及TYR活性有抑制功效。其中，浓度处理组(1000μg/mL)相对黑色素含量下降60％，TYR的活性下降63％。
(2)对斑马鱼体内黑色素合成的抑制作用
由于斑马鱼胚胎易于观察，便于进行黑色素相关研究。选取斑马鱼进行动物模型实验来探究TFMP-T对斑马鱼黑色素合成的抑制作用。
取受精24h后的胚胎，用TFMP-T斑马鱼胚胎培养液培养，阳性对照采用浓度为0.2mM的PTU进行处理。培养48h后观察并拍照记录。结果如图18所示，空白组斑马鱼的眼部、背脊部、卵黄囊色素沉着比较明显。PTU处理后斑马鱼眼部、背脊部和卵黄囊部位黑色素沉着明显下降。而用不同浓度TFMP-T处理，斑马鱼的眼部、背脊部和卵黄囊部位黑色素的沉着随着TFMP-T浓度的增加而逐渐下降，呈浓度依赖性。说明TFMP-T在一定程度上能够抑制斑马鱼眼部、背脊部、卵黄囊等部位黑色素的沉积。
由图19可以看出，相对于空白组，TFMP-T浓度分别为50、100、200μg/mL时均极其显著(P<0.01)抑制斑马鱼体内黑色素含量，说明TFMP-T可抑制斑马鱼体内黑色素的合成，且呈浓度依赖性。其中，最高浓度处理组(200μg/mL)斑马鱼体内黑色素含量下降了52％。
综上结果表明：TFMP-T可抑制斑马鱼体内黑色素含量和TYR活力。200μg/mL TFMP-T对斑马鱼体内黑色素含量和TYR活力的抑制率均大于50％。
综上，本发明制备得到的菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽(TFMP-F)或者菊黄东方鲀肌肉胰蛋白酶酶解多肽(TFMP-T)为纯天然水产多肽，作为纯天然抗氧化剂或者纯天然黑色素抑制剂，无毒副作用，安全性高，可用于开发化妆品。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净；
S2.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5～15℃；
S3.往肉糜中加入蛋白酶进行酶解反应，反应得到酶解液；
S4.沸水加热酶解液将其中的蛋白酶进行灭活；
S5.离心酶解液，收集上清液；
S6.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分；
S7.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。
2.如权利要求1所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，其特征在于：步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为2500～3500U/g、反应温度为35～37℃、酶解pH为6.8～7.2、料液比1:10～12g/mL、反应时间7～8h；反应得到胰蛋白酶解液。
3.如权利要求2所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，其特征在于：步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为3011U/g、反应温度为36.9℃、酶解pH为7、料液比1:10、反应时间8h。
4.如权利要求1所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，其特征在于：步骤S3中，酶解反应加入风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4000～5000U/g、反应温度为55～60℃、酶解pH为7～7.5、料液比1:10～12g/mL、反应时间4.2～4.5h；反应得到风味蛋白酶解液。
5.如权利要求4所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽的提取方法，其特征在于：步骤S3中，酶解反应加入风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4521.96U/g、反应温度为55℃、酶解pH为7、料液比1:10g/mL、反应时间4.5h。
6.一种化妆品，其特征在于：包括权利要求1～5任一项提取方法提取得到的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽。
7.如权利要求6所述的化妆品，其特征在于：所述的菊黄东方鲀肌肉酶解多肽为胰蛋白酶酶解多肽，步骤S3中，酶解反应加入胰蛋白酶进行酶解反应，加酶量为2500～3500U/g、反应温度为35～37℃、酶解pH为6.8～7.2、料液比1:10～12g/mL、反应时间7～8h。
8.如权利要求6所述的化妆品，其特征在于：所述的胰蛋白酶酶解多肽在化妆品中的剂量为1000～2000μg/mL。
9.如权利要求7或8所述的化妆品，其特征在于：还包括风味蛋白酶酶解多肽，胰蛋白酶酶解多肽与风味蛋白酶酶解多肽的质量比为3～5：1，所述的风味蛋白酶酶解多肽的提取方法包括以下步骤：
S21.去除菊黄东方鲀的头部、鱼皮、血液、鱼骨，单独保留菊黄东方鲀的肌肉部分，并清洗干净；
S22.用绞肉机把菊黄东方鲀肌肉绞为肉糜，并且在肌肉搅碎过程中冰敷降温至5℃～15℃；
S23.往肉糜中加风味蛋白酶进行酶解反应，加酶量为4000～4500U/g、反应温度为55～60℃、酶解pH为7～7.5、料液比1:10～12g/mL、反应时间4.2～4.5h；反应得到风味蛋白酶解液；
S24.沸水加热酶解液将其中的风味蛋白酶进行灭活；
S25.离心酶解液，收集上清液；
S26.对酶解液的上清液进行超滤处理，并且收集0～1KD组分；
S27.将收集的组分进行冻干，得到菊黄东方鲀肌肉风味蛋白酶酶解多肽。
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