CN102603870A - 一种呈味肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种呈味肽及其制备方法和在食品领域的应用，该呈味肽具有SEQ ID No：1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No：1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。

Description

一种呈味肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种呈味肽及其制备方法和在食品领域的应用。

背景技术

食品中存在许多呈味物质(例如甜味物质、鲜味物质、咸味物质、酸味物质等)，这些物质一般为游离氨基酸、肽、呈味核苷酸、无机盐等。在肉及肉制品中呈味物质以游离氨基酸和肽占有较重要的角色，这是由人类的味觉受体——味蕾与呈味物质的结构和性质所决定的。氨基酸和肽中的氨基和羧基两性基团具有缓冲能力，使得其具有复杂的呈味功能，能同时参与并影响食品的滋味的形成，能提高食品的总体风味，改进食品的质构，使食品的总体味感协调、细腻、醇厚浓郁。

这些年来，科研工作者们都尝试着从各式各样的美味食物中分离提取起关键作用的呈味肽(也称风味增强肽、美味肽等)，其具有良好的加工特性、营养功能和生理活性，并且对食品的滋味具有很大的影响，可以用于食品佐料，例如可以用作调味品或香精香料的重要基料。

Yamasaki等人(A peptide with delicious taste.Agricultural and BiologicalChemistry.1978，42，1761-1765.)在1978年的研究表明某些肽可以使食物变得更加美味，并首次从木瓜蛋白酶处理的牛肉中分离出了具有“鲜美的”味道牛肉辛肽。随后，又有研究者们采用凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱、串联质谱等分离纯化技术并结合滋味稀释分析方法和电子舌测定方法，从奶酪，豆浆，酪蛋白、大豆蛋白、鸡蛋白质酶解物，乳蛋白酶解物和火腿酶解物中分离并鉴定出大量的呈味肽(例如Glu-Glu、Glu-Val、Ala-Asp-Glu、Ala-Glu-Asp、Asp-Glu-Glu、Ser-Pro-Glu、Glu-Glu-Asn、Leu-Ser-Glu-Arg-Tyr-Pro等)。然而，从食物中分离纯化后获得的物质大多都为含有多种呈味肽的混合物。

目前与食品滋味较相关的单一组分呈味肽，已弄清结构和性质的仅有少数几种，诸如谷胱甘肽(三肽)，肌肽、鹅肌肽、蛇肉肽(二肽)，这些小肽的pH值在中性附近，具有很强的缓冲能力(通常认为味道变浓与这种缓冲能力有关)。

然而凭借目前的分离提取技术，加之肽在不同条件下性质不稳定和氨基酸序列测定的难度，我们难以从食物中分离获得高纯度的单一组分呈味肽。

众所周知，河豚鱼(也称河鲀)鱼肉质细嫩、鲜美，但是河豚鱼体内含有剧毒的神经毒素，食用极不安全，因此至今未在我国开放。如果能够提取河豚鱼肉中的关键呈味物质或者能够模拟其滋味特征，那么就可以让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

邓婕春等人(红鳍东方鲀食用口感及风味差异研究.食品学院，上海：上海海洋大学，2009：58.)的研究表明，红鳍东方豚肉的呈味物质的人工合成液(其主要成分为游离氨基酸、呈味核苷酸、无机盐)与豚肉的天然抽提液的滋味特征相似程度较小，这三大成分不足以模拟红旗东方鲀水溶性呈味物质的滋味特征，由此判断，红鳍东方豚肉的滋味除了跟游离氨基酸、呈味核苷酸和无机盐有关外，还可能受呈味肽(尤其是低聚肽)影响较大。

到目前为止，对河豚中呈味物质的报道主要集中在游离氨基酸、呈味核苷酸(例如ATP及其关联物)、无机盐离子上，对构成河豚鱼肉鲜美浓郁的重要滋味物质——呈味肽的研究，国内外都还未见相关报道。

发明内容

本发明一方面提供了一种呈味肽，其具有SEQ ID No：1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No：1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的呈味肽具有SEQ ID No：1的氨基酸序列。优选的，该呈味肽有鲜味和甜味的滋味特征。更优选的，该呈味肽具有河豚肉质的或类似河豚肉质的滋味特征。所述的鲜味、甜味为风味物质技术领域的技术人员所熟知的滋味特征技术术语。所述的河豚肉质的滋味特征为风味物质技术领域的技术人员所熟知的常规滋味特征。

众所周知，自然产生的蛋白质或多肽可能发生突变，例如，多肽的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的缺失、插入和/或替换，这通常是由于编码该多肽的DNA的多态性或突变，或者由于体内或合成后多肽的修饰。当然，也可以人为地方式修改多肽的氨基酸序列，引入突变，但是，如果这些突变对多肽的活性或结构的保留影响不大的话，那么这些突变后获得的多肽仍具有无突变多肽实质相同或接近的生物活性。

因此，只要其具有呈味功能，具有通过在SEQ ID No：1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列的多肽仍然包括在本发明之内。

在本发明的另一个具体实施方案中，所述呈味肽具有通过在SEQ ID No：1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。优选的，该呈味肽有鲜味和甜味的滋味特征。更优选的，该呈味肽具有河豚肉质的滋味特征。

在本发明的一个具体实施方案中，所述的呈味肽来源于暗纹东方鲀的肌肉。

本发明另一方面提供了上述呈味肽的制备方法，所述的呈味肽为人工合成或者从暗纹东方鲀体内提取。

在本发明的一个具体实施方案中，上述呈味肽的制备方法包括以下步骤，首先从暗纹东方鲀肌肉中提取水溶性成分，再对该水溶性成分进行超滤，再对超滤组分进行进一步分离纯化。在本发明的一个具体实施方式中，对超滤组分进行层析后，选择鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)，优选的，采用Sephadex G-15凝胶色谱方法进行层析。在本发明的一个具体实施方式中，对层析后选择的鲜味和甜味最强组分进行进一步层析分离，再选择其中鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)进行成分鉴定，优选的，采用RP-HPLC方法进行层析。

在呈味物质技术领域，鉴定呈味物质的呈味/滋味特征通常采用人工感官评定结合电子舌对呈味的呈味特性进行评价，使得结果更准确、更客观。

人工感官评定是采用滋味稀释分析方法(TDA)评定出每个样品的稀释因子即TD值，值越大到则表明样品的滋味特性越强。TD值得测定：将待测组分溶解于1mL水中，按1∶1(体积比)将其稀释，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定，当某个稀释水平的溶液与2个空白(饮用水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，那么这个稀释倍数即为TD值。

在利用电子舌分析系统测定物质的呈味特征时，通常采用一些业内公认的标准品作为对照，例如鉴定甜味的标准品为40mM的蔗糖溶液，鉴定咸味的标准品为12mM的NaCl溶液，鉴定酸味的标准品为10mM的柠檬酸溶液，鉴定鲜味的标准品为4mM的谷氨酸钠溶液。最终以待测样品与标准品之间的距离远近来判断待测样品的滋味特征强度。

本发明还提供了一种呈味肽的制备方法，该方法包括以下步骤，首先从暗纹东方鲀的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；再对所述的超滤组分进行进一步分离纯化后获得具有SEQ ID No：1的氨基酸序列的呈味肽。

在本发明的一个具体实施方式中，对超滤组分进行层析后，选择鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)，优选的，采用Sephadex G-15凝胶色谱方法进行层析。在本发明的一个具体实施方式中，对层析后选择的鲜味和甜味最强组分进行进一步层析分离，再选择其中鲜味和甜味最强的组分(人工感官评定和电子舌分析系统测定)进行成分鉴定，优选的，采用RP-HPLC方法进行层析。

本发明另一方面提供了上述的呈味肽在食品领域的应用。

本发明还提供了一种食品调味品，该食品调味品中包含上述的呈味肽。

呈味肽作为呈味物质的一种，一般应用于食品领域，这是本领域技术人员所熟知的。至于呈味肽应用于食品调味品，例如用作食品调味品的基料或辅料，这些都是呈味物质的常规应用，是本领域技术人员可以预见的。

本发明另一方面提供了一种呈味化合物，该呈味化合物以上述的呈味肽为单体经化学修饰后获得。所述的化学修饰包括中间残基修饰(与Glu-、Asn-、Thr-修饰等)等本领域技术人员所熟知的多肽的化学修饰方法。修饰后获得的化合物具有呈味功能。

本发明还提供了上述的呈味化合物在食品领域的应用。

本发明还提供了一种食品调味品，该食品调味品中包含上述的呈味化合物。

同样的，呈味化合物应用于食品领域，这是本领域技术人员所熟知的。至于呈味化合物应用于食品调味品，例如用作食品调味品的基料或辅料，这些都是呈味物质的常规应用，是本领域技术人员可以预见的。

附图说明

图1为分子量小于3000Da的超滤组分经Sephadex G-15凝胶色谱分离后的层析图谱；

图2为超滤组分Pz和层析组分P1-P5的滋味稀释分析结果；

图3为超滤组分Pz，层析组分P1、P2、P3、P4、P5的电子舌二维主成分分析图；

图4为超滤组分Pz，层析组分P1、P2、P3、P4、P5的电子舌三维主成分分析图；

图5为P2层析组分的RP-HPLC分离图谱；

图6为超滤组分Pz，RP-HPLC分离组分P2a、P2b、P2c电子舌二维主成分分析图；

图7为P2b分离组分的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)一级质谱图；

图8为P2b分离组分的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS/MS)二级质谱图。

具体实施方式

实施例1

提取、分离、纯化并鉴定具有SEQ ID No：1氨基酸序列的呈味肽

步骤(1)：获得河豚的寡肽(水溶性)提取液

原材料：河豚鱼为江苏中洋集团养殖的暗纹东方鲀。其经过江苏中洋集团的河豚鱼厨师剖杀分装后冰鲜运送回实验室。将暗纹东方鲀的肌肉尽可能的从鱼体上分割下来。用绞肉机绞碎，加4倍的水，用匀浆机匀浆，100℃加热3小时。用四层纱布过滤，滤液在11000g下离心20分钟。收集上清液。

步骤(2)：河豚寡肽提取液的分离、纯化

将第一步获得的上清液(河豚多肽提取液)利用分子量截留范围为3000Da的超滤膜对其进行超滤分离，将分子量小于3000Da的超滤组分(本文中用Pz表示)收集，冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中。

将超滤组分(冻干后的样品粉末)配制成浓度为100mg/ml的溶液，用Sephadex G-15凝胶色谱进行进一步的分离(洗脱液为去离子水，流速为0.75mL/min)。层析图谱结果参见图1，横坐标表示洗脱时间(Elution Time)，单位小时(h)，纵坐标表示检测波长为220nm。从图1可以看到5个吸收峰(P1、P2、P3、P4、P5)，收集洗脱过程先后获得的5个洗脱组分(也称层析组分，依次用P1、P2、P3、P4、P5表示)。冷冻干燥后储存于-80℃下。

从图1的结果可以看出，超滤后的组分经过Sephadex G-15凝胶色谱分离成五个主要组分，其中组分P2的物质含量最高。(分子量大小排序是P1＞P2＞P3＞P4＞P5)。

步骤(3)：利用人工感官评定和电子舌系统分析联用的方式来测定超滤组分Pz和层析组分P1-P5的呈味特性

人工感官评定方法

滋味稀释分析(TDA)法如下：分别取Pz、P1-P5的冻干样品各100mg，加水定容于100ml的容量瓶中。再依次取1mL加9mL水进行逐步稀释，各个组分逐步稀释的溶液按照浓度增加的顺序呈给经过训练的评价员(8名：3男，5女，经过培训的感官评定员)，每个稀释水平溶液采用3点测定进行评定。当某个稀释水平的溶液与两个空白(水)之间的滋味差异刚好能被识别出来，记录此时的稀释倍数，即稀释值(TD)。TD最终结果值取各评价员评定结果的平均值，评定结果之间的差异应低于或等于一个稀释水平。感官评分数据利用SPSS 17.0进行单因素方差分析，若有显著性差异，则进行邓肯多重范围检验。每份样品在不同时间内重复三次。均为常温下评定。每位感官员还需评价每次呈上样品的滋味特性。

超滤组分Pz和层析组分P1-P5的滋味稀释分析结果参见图2。图2柱状图中，横坐标表示超滤组分Pz和层析组分(P1-P5)，纵坐标表示：每个组分的稀释值(即滋味强度)。

从图2结果可以看出：超滤组分Pz和层析组分P2的TD值最高，在相同含量范围内，最具有味感。

超滤组分Pz和层析组分P1-P5的人工感官滋味特性评价结果参见下表

表1

从表1的结果可以看出：超滤组分Pz和层析组分P2的滋味描述最为相似，都具有浓厚感和鲜味。层析组分P3和P4也具有鲜味，但由于分子量过小(小于500Da)，肽含量偏低，因而推测其鲜味可能是由于谷氨酸，天冬氨酸等具有鲜味的氨基酸所造成的。

利用电子舌系统测定超滤组分Pz和层析组分P1-P5的滋味轮廓。本实验采用法国AlphaMOS公司的α-Astree电子舌系统，包含7个化学传感器阵列(酸、甜、苦、咸、鲜、2个复合味觉传感器)和1个参比电极以及数据处理软件AlphaSoft Version 12.3和SpSA module。将超滤和层析冻干样品按一定比例用水溶解。每次取80mL检测，平行取3次。每次平行重复检测7次。每次检测2分钟，清洗时间10秒。均为常温下检测。

电子舌则是对样品和标准品同时进行测定，将得到的原始数据用PCA主成分分析方法进行分析。一般为PCA的二维图，PCI表示样品的最主要成分(例如表明了75.151％的样品差异)，PC2表示样品的次主要成分(例如表明了21.045％的样品差异)。PCA的三维图，PCI表示样品的最主要成分(例如表明了75.151％的样品差异)，PC2表示样品的次主要成分(例如表明了21.045％的样品差异)，PC3表示样品的第三主要成分(例如表明了2.037％的样品差异)。本实施例中采用4mM的谷氨酸钠溶液作为鉴定鲜味的标准品，40mM的蔗糖溶液作为鉴定甜味的标准品，通过对比实施例待测样品与标准品之间的距离(软件自动生成)来判断待测样品的滋味(鲜味和甜味)的强度。PCI表示样品的最主要成分，是引起样品差异最主要的因素，因而在判断各组分滋味时主要以PC1方向上的距离远近为辨别标准。

分别取Pz、P1-P5的冻干样品各100mg，加水定容于100ml的容量瓶中。每次取80mL在室温下检测，每个样品检测4次。对照标准品为10mM柠檬酸溶液(citic acid)，12mM氯化钠溶液(NaCl)，4mM谷氨酸钠溶液(MSG)和40mM蔗糖溶液(sucrose)。

图3为超滤组分Pz，层析组分P1、P2、P3、P4、P5的电子舌二维主成分分析图。横坐标表示检测到的最主要成分PC1，纵坐标表示检测到的次主要成分PC2。PC1(75.151％)所代表的变量要大于PC2(21.045％)，六个组分的差异首先主要体现在PCI方向上的各组分距离的差异程度，其次是PC2方向上的差异程度。

图3为基于电子舌的超滤组分、层析组分和对照标准品的二维结果，由图3可以看出，超滤组分、层析组分和标准品各自的4次结果聚在一起，但又不完全重合，说明了电子舌的灵敏度高。从PC1可以看出5个层析组分中P2组分最接近谷氨酸钠和蔗糖，这表明相对于其他4个层析组分，P2组分的鲜味和甜味最强。

图4为超滤组分Pz，层析组分P1、P2、P3、P4、P5的电子舌三维主成分分析图。从PC1可以看出5个层析组分中P2组分最接近谷氨酸钠和蔗糖，这表明相对于其他4个层析组分，P2组分的鲜味和甜味最强。

综合图1-图4以及表1的结果，可以认为：P2组分的肽含量最高，且味道的鲜味和甜味最强，因此选择P2层析组分进行下一步的RP-HPLC分离纯化。

步骤(4)：进一步分离P2层析组分

采用RP-HPLC方法对P2层析组分进行进一步的分离纯化。所用色谱柱为Kromasil C18柱(250*10mm，5μm，EKA chemical，Sweden)。RP-HPLC的分离条件为：等度洗脱，90％乙腈和10％超纯水，流速1ml/min，上样量为50μL，检测波长为215nm。

P2层析组分的RP-HPLC分离图谱参见图5。图5中横坐标表示保留时间(min)，纵坐标表示检测波长为220nm。

从图5中可以看到3个吸收峰(P2a、P2b、P2c)，收集洗脱过程先后获得的3个分离组分(依次用P2a、P2b、P2c表示)。冷冻干燥后储存于-80℃下。

从图5的结果可以看出，层析组分P2经过RP-HPLC分离成3个主要成分，其中P2b含肽量最高。另外从高效液相色谱图中峰面积也可以判断经过凝胶过滤层析后，P2组分的纯度达到了80％。

步骤(5)，利用电子舌来测定超滤组分Pz和RP-HPLC分离组分P2a、P2b、P2c的呈味特性。

电子舌测定方法参见步骤(3)。对照样品为4mM谷氨酸钠溶液(MSG)和40mM蔗糖溶液(sucrose)。

图6为基于电子舌的超滤组分Pz，RP-HPLC分离组分P2a、P2b、P2c，谷氨酸钠和蔗糖的电子舌主成分分析图。其中PCI表明了61.417％样品差异，PC2解释了21.197％样品差异。由图6可以看出，超滤组分Pz和RP-HPLC分离组分P2a、P2b、P2c距离相对较远，这表明他们的滋味特性具有一定的差异。从PC1和PC2可以看出3个RP-HPLC分离组分中P2b组分距离最接近谷氨酸钠和蔗糖，这表明相对于其他2个RP-HPLC分离组分，P2b组分的鲜味和甜味最强。

综合图5、图6的结果，可以认为：P2b组分肽含量最高，味道的鲜味和甜味最强，因此选择P2b分离组分进行多肽序列结构鉴定。

步骤(6)，P2b层析组分的鉴定

制样：取P2b的冻干物8μg，溶解于0.8μL 50％乙腈，0.1％含有4mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸的三氟乙酸(HCCA)溶液中。

先点0.5μL样品于MALDI不锈钢靶板上，自然干燥后，再点上0.5μL0.5g/Lα-氰基-4-羟基肉桂酸溶液(HCCA溶液，其溶剂为0.1％TFA-50％乙腈)，在室温下自然干燥。另点0.5μL 0.5g/L HCCA溶液作空白对照。

利用基质辅助激光解析飞行时间一级质谱(MALDI-TOF/TOF MS)鉴定P2b分离组分的相对分子量。图7的横坐标分子量(m/z)，纵坐标表示丰度。从图7的结果显示P2b离子碎片([M+H]+)为837.4170。经过手工验证，最后分析出P2b的相对分子量为836.4Da。

利用基质辅助激光解析飞行时间二级质谱(MALDI-TOF/TOF MS/MS))鉴定P2b分离组分的氨基酸序列，同时经过手工验证得到P2b组分呈味肽序列为Tyr-Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val，结果，参见图8。图8的横坐标为离子碎片的分子量，纵坐标为丰度。

综合图7、图8的结果，可以得到P2b分离组分中99％为单一组分呈味肽，其氨基酸序列为Tyr-Gly-Gly-Thr-Pro-Pro-Phe-Val(SEQ No：1)。

本实施例的从暗纹东方鲀肌肉中提取的具有SEQ No：1氨基酸序列的多肽具有与暗纹东方鲀肌肉相似的鲜甜的味道，有助于拟合暗纹东方鲀的原本滋味，可以应用于食品领域，例如可以作为基料或辅料来制作调味品，一方面，无需直接食用河豚；另一方面无人工合成调味料可能引起的副作用，让消费者在完全安全的情况下享受河豚鱼鲜美的味道。

Claims (9)

1.一种呈味肽，其特征在于：其具有SEQ ID No：1的氨基酸序列或者具有通过在SEQ ID No：1氨基酸序列中缺失、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的呈味肽，其特征在于：所述的呈味肽来源于暗纹东方鲀的肌肉。

3.如权利要求1所述的呈味肽的制备方法，其特征在于：所述的呈味肽为人工合成或者从暗纹东方鲀体内提取。

4.一种呈味肽的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤，首先从暗纹东方鲀的肌肉中提取水溶性成分，再截留其中分子量小于3000Da的超滤组分；再对所述的超滤组分进行进一步分离纯化后获得具有SEQ ID No：1的氨基酸序列的呈味肽。

5.如权利要求1或2所述的呈味肽在食品领域的应用。

6.一种食品调味品，其特征在于：该食品调味品中包含权利要求1或2所述的呈味肽。

7.一种呈味化合物，其特征在于：该呈味化合物以权利要求1或2所述的呈味肽为单体经化学修饰后获得。

8.如权利要求7所述的呈味化合物在食品领域的应用。

9.一种食品调味品，其特征在于：该食品调味品中包含权利要求7所述的呈味化合物。

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