CN102396688A

CN102396688A - 呈味活性肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102396688A
Application number: CN2011103402135A
Authority: CN
Inventors: 赵谋明; 苏国万; 崔春; 任娇艳
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong Tian Tian Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-11-02
Also published as: CN102396688B

Abstract

本发明提供呈味活性肽及其制备方法与应用，制备方法包括粗酶的制备；通过酶解得到花生粕酶解液；将酶解液过分子量为3000Da的超滤膜，取透过液，冷冻干燥，得粉末A；将粉末A溶于去离子水中，以去离子水为洗脱液，采用SephadexG-25凝胶柱进行洗脱，收集目标峰，浓缩，冷冻干燥，得粉末B；将粉末B溶于去离子水中，以质量浓度0.1-0.2%三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相C18柱进行洗脱，收集两个目标峰，真空浓缩，冷冻干燥，得粉末C和D，C为呈味活性肽Ⅰ，D为呈味活性肽Ⅱ。两条呈味活性肽应用于调味产品中，可明显增强调味品的呈味效果。通过化学合成，可以拓宽呈味肽的应用领域。

Description

呈味活性肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及呈味肽的制备方法和用途，具体涉及具有较强鲜味和增强鲜味的两种呈味活性肽的制备方法与应用。

背景技术

鲜味是继四大基本滋味（酸、甜、苦和咸）之后的第五种基本滋味，是由日本物理化学家Kikunae Ikeda 1908年在谷氨酸钠中发现并鉴定的滋味，并将其命名为Umami（鲜味），随后该科学家建厂大量生产谷氨酸钠（又称味精），将味精推广到全世界。味精作为鲜味剂风靡全球将近一个世纪，但有报道味精会使人口干舌躁，且经过高温烹饪可能产生有毒物质。在随后几十年里，人们把目光转向来自于动植物的天然的、安全的鲜味剂,如从食品中提取鲜味物质5′-肌氨酸和5′-鸟氨酸，但由于鲜味剂浓度较低，且提纯成本高，使得近年来人们更钟情于使用生物技术制备鲜味物质。已有专利报道利用生物技术，包括植物组织培养法、微生物发酵法等，生产风味物质是人们获得天然风味物质的有效途径。

发明申请专利（申请号200810198584.2）公开了利用酶解技术制备富肽型呈味基料的方法，使用该法制备的产品风味绵长、后味厚重、使用方便。发明申请专利（申请号200810025525.5）公开了一种采用微波干燥技术和复合酶解技术制备鸡肉呈味粉的方法，得到的鸡肉呈味粉不仅口感好、环境污染小，且质量稳定，安全性好。发明申请专利（申请号201110030012.5）公开了一种以植物蛋白为原料，多酶复合水解植被富含呈味肽的水解液，该水解液具有浓郁的鲜味，口味延伸感强，添加在方便面、休闲膨化食品和复合调味品及肉制品中，能明显提升其风味，增强口味的厚重感。发明申请专利（申请号200810219500.0）公开了一种结合脉冲电场、发酵技术和酶解技术制备呈味基料的方法。该法制备得到的呈味基料鲜味突出，色泽稳定，蛋白质利用率高达85%以上，氨基酸化率可到55%以上。上述专利报道的方法可制备具有较好呈味效果的产品，但产品中杂质较多，目标产物不明确，纯度低，应用领域狭隘。

花生粕是花生油工业中的副产物，产量大，富含呈味氨基酸。但由于在榨油过程中经历了高温压榨和溶剂浸提的过程，导致花生蛋白严重变性，色泽和气味恶化，目前主要用作饲料或肥料。如何高效利用花生粕，提高其附加值是近年来急需解决的难题。

呈味肽是蛋白质经生物酶水解后得到的一系列小分子活性物质，呈味效果明显，且具有好的稳定性。自70年代发现风味八肽以来，科学家们从未停止过研究呈味肽的脚步。

发明内容

本发明的目的克服现有技术存在的上述不足，提供呈味活性肽及其制备方法与应用，具体技术方案如下。本发明的呈味活性肽是优良的调味品添加剂。

呈味活性肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）粗酶的制备：10～30g麸皮，5～20g花生粕和0.01～0.1g氯化钙与15～50g去离子水混合均匀；在杀菌锅100～121℃中杀菌15～30min，冷却至20-38℃，接种米曲霉,在培养箱28～32℃培养48～72h；加入200mL-400mL水，在30-40℃水浴锅中搅拌0.5-2h；在4-10℃下5000～10,000 × g离心20～30min，取上清液冷冻干燥得粗酶；

（2）酶解：按花生粕与水质量比1：4～1：8加水，加入占花生粕质量0.4～1%的所述粗酶，在45～55℃酶解8～15h；85～95℃加热15～30min灭酶终止酶解反应，离心分离，得到花生粕酶解液；

（3）将酶解液过分子量为3000Da的超滤膜,取透过液，冷冻干燥，得粉末A；

(4) 将粉末A溶于去离子水中使其浓度达到5～30 mg/mL,以去离子水为洗脱液,采用Sephadex G-25凝胶柱进行洗脱，收集目标峰，浓缩，冷冻干燥，得粉末B；

（5）将粉末B溶于去离子水中使其浓度达到5～30 mg/mL，以质量浓度0.1-0.2%三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相C18柱进行洗脱，收集两个目标峰，真空浓缩，冷冻干燥，得粉末C和D，C为呈味活性肽Ⅰ，D为呈味活性肽Ⅱ。

上述的制备方法中，步骤（5）中反相C18柱洗脱液的检测波长为214nm。

上述的制备方法中，呈味活性肽Ⅰ为具有Ser-Ser-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。

上述的制备方法中，呈味活性肽Ⅱ为具有Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。

上述制备方法制得的呈味活性肽Ⅰ或呈味活性肽Ⅱ或它们的钠盐应用于食品中，增加食品的鲜味。其中呈味活性肽Ⅰ本身具有较强的鲜味。呈味活性肽Ⅱ是一种鲜味增强剂。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：结合生物发酵、生物酶解和色谱分离技术，制备出两种新的呈味活性肽，目标活性肽活性效果明显，纯度高。本发明的两种新的呈味肽易于化学合成大生产,且合成的产品纯度高，稳定性好，无色，可拓宽该肽的应用领域，如添加到饮料中等。

附图说明

图1为呈味活性肽Ⅰ的一级结构图（MALDI-TOF/TOF MS）。

图2为呈味活性肽Ⅰ的氨基酸序列结构图（MALDI-TOF/TOF MS）。

图3为呈味活性肽Ⅱ的一级结构图（MALDI-TOF/TOF MS）。

图4为呈味活性肽Ⅱ的氨基酸序列结构图（MALDI-TOF/TOF MS）。

图5为呈味活性肽Ⅰ和呈味活性肽Ⅱ存在花生粕酶解液的凝胶色谱分离样中的反相C18高效液相色谱图。

具体实施方案

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步说明。

实施例1

（1）粗酶的制备：10g麸皮，5g花生粕和0.01g氯化钙与15g去离子水混合均匀；在杀菌锅100℃中杀菌30min，冷却至20℃，接种米曲霉,在培养箱28℃培养72h；加入200mL水，在30℃水浴锅中搅拌0.5h；在4℃下10,000 × g离心20min，取上清液冷冻干燥得粗酶。

（2）酶解：按花生粕水质量比1：4加水，加入花生粕质量0.4%的粗酶，在45℃酶解8h； 95℃加热15min灭酶终止酶解反应，离心分离，得到花生粕酶解液。

(4) 将样品A溶于去离子水中使其浓度达到5 mg/mL,以去离子水为洗脱液,采用Sephadex G-25凝胶柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集目标峰，浓缩，冷冻干燥，得粉末B。

（5）将样品B溶于去离子水中使其浓度达到15 mg/mL，以0.1%三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相C18柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集两个目标峰，80℃真空浓缩，冷冻干燥，得粉末C和D。C为呈味活性肽Ⅰ，D为呈味活性肽Ⅱ。

呈味活性肽C和呈味活性肽D的出峰次序见图5。呈味活性肽Ⅰ的一级结构图和氨基酸序列结构图见图1和图2。呈味活性肽Ⅱ的一级结构图和氨基酸序列结构图见图3和图4。

实施例2

（1）粗酶的制备：30g麸皮，20g花生粕和0.1g氯化钙与36g去离子水混合均匀；在杀菌锅121℃中杀菌15min，冷却至38℃，接种米曲霉,在培养箱32℃培养48h；加入400mL水，在40℃水浴锅中搅拌2h；在10℃下10,000 × g离心20min，取上清液冷冻干燥得粗酶。

（2）酶解：按花生粕水质量比1：6加水，加入花生粕质量0.8%的粗酶，在55℃酶解10h； 95℃加热15min灭酶终止酶解反应，离心分离，得到花生粕酶解液。

(4) 将样品A溶于去离子水中使其浓度达到30 mg/mL,以去离子水为洗脱液,采用Sephadex G-25凝胶柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集目标峰，浓缩，冷冻干燥，得粉末B。

（5）将样品B溶于去离子水中使其浓度达到30 mg/mL，以0.2%三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相C18柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集两个目标峰，80℃真空浓缩，冷冻干燥，得粉末C和D。C为呈味活性肽Ⅰ，D为呈味活性肽Ⅱ。

实施例3

（1）粗酶的制备：28g麸皮，16g花生粕和0.1g氯化钙与44g去离子水混合均匀；在杀菌锅121℃中杀菌15min，冷却至30℃，接种米曲霉,在培养箱30℃培养54h；加入200mL 0.2 M 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)在40℃水浴锅中搅拌1h；在4℃下10,000 × g离心20min，取上清液冷冻干燥得粗酶。

（2）酶解：按花生粕水质量比1：8加水，加入花生粕质量0.6%的粗酶，在55℃酶解8h； 85℃加热30min灭酶终止酶解反应，离心分离，得到花生粕酶解液。

(4) 将样品A溶于去离子水中使其浓度达到20 mg/mL,以去离子水为洗脱液,采用Sephadex G-25凝胶柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集目标峰，浓缩，冷冻干燥，得粉末B。

（5）将样品B溶于去离子水中使其浓度达到20 mg/mL，以0.1%三氟乙酸水溶液为洗脱液，采用反相C18柱进行洗脱，检测波长为214nm，收集两个目标峰，80℃真空浓缩，冷冻干燥，得粉末C和D。C为呈味活性肽Ⅰ，D为呈味活性肽Ⅱ。

实施例4

在香精香料公司挑选经过培训的10名感官评价员（5名男性，5名女性），感官评价实验在23 ± 2 oC的感官评价室进行。

鲜味的阈值评价：稀释法（dilution method），以逐渐降低的浓度制备样品，然后顺序地检验。即对感官测待测样品进行逐步稀释，然后要求评价员对每个稀释度的样品进行评价，评价员只需要说明在哪个稀释度下仍然能品尝到鲜味，而在最大稀释度下品尝到鲜味的浓度就是鲜味的阈值。

鲜味增强评价（以下均为重量百分比）：选用含有0.5%味精和0.5%食盐的牛肉汤的鲜味作为鲜味标准，打分为1；选用含有1%味精和0.5%食盐的牛肉汤的鲜味作为鲜味标准，打分为2；选用含有2%味精和0.5%食盐的牛肉汤的鲜味作为鲜味标准，打分为4；0.5%的待测样品添加到含有0.5%食盐的牛肉汤溶液中，与标准品的鲜味比较进行打分。结果见表1.

	阈值	鲜味
			味精	0.030%	2
呈味活性肽Ⅰ（实例1）	0.025%	2
			呈味活性肽Ⅱ（实例1）	0.100%	4
呈味活性肽Ⅰ（合成）	0.020%	2
			呈味活性肽Ⅱ（合成）	0.100%	4

表1

从表1可见，按本发明方法制备的呈味活性肽Ⅰ的鲜味阈值明显低于味精的阈值，说明制备得到的鲜味肽的较味精具有更强的鲜味，但在牛肉汤中只能表现本身的鲜味，对鲜味不起提升作用。而呈味活性肽Ⅱ鲜味阈值明显大于味精，但能明显提升牛肉汤溶液的鲜味。同时，经过合成呈味活性肽Ⅰ和呈味活性肽Ⅱ，感官评价发现其感官结果与对应分离得到的呈味活性肽的结果相似。证明两种新的呈味肽可通过化学合成进行大生产，拓展呈味肽的应用领域。

Claims

1.呈味活性肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（5）中反相C18柱洗脱液的检测波长为214nm。

3.由权利要求1所述制备方法制得的一种呈味活性肽，其特征在于，呈味活性肽Ⅰ为具有Ser-Ser-Arg-Asn-Glu-Gln-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。

4.由权利要求1所述制备方法制得的一种呈味活性肽，其特征在于，呈味活性肽Ⅱ为具有Glu-Gly-Ser-Glu-Ala-Pro-Asp-Gly-Ser-Ser-Arg所示的氨基酸序列的活性肽。

5.权利要求1制得的呈味活性肽Ⅰ或呈味活性肽Ⅱ或它们的钠盐应用于食品中，增加食品的鲜味。