CN110628853A

CN110628853A - 一种核桃抗氧化活性肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110628853A
Application number: CN201910810472.6A
Authority: CN
Inventors: 陈永浩; 郝艳宾; 齐建勋; 李俊; 逯晓丹; 董宁光; 王蓓蓓; 张赟齐
Original assignee: Beijing Forestry Fruit Science Research Institute
Current assignee: Beijing Forestry Fruit Science Research Institute
Priority date: 2019-08-29
Filing date: 2019-08-29
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2039-08-29
Also published as: CN110628853B

Abstract

本发明属于植物蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种核桃抗氧化活性肽及其制备方法和应用。所述核桃抗氧化活性肽的制备方法包括：以核桃粕为原料，依次利用蜂蜜曲霉蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme复合蛋白酶进行酶解。本发明还提供了一种双剂型核桃肽泡腾片与无纺布压缩面膜的组合套装，泡腾片A用于崩解后饮用，泡腾片B用于面膜浸渍溶液，通过内服与外敷充分发挥核桃肽的抗氧化活性。

Description

一种核桃抗氧化活性肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种核桃抗氧化活性肽及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，植物蛋白肽被大量应用于食品领域，利用肽的功能活性搭配其它成分，组合形成的产品在市场上逐渐兴起。其中，核桃蛋白属于较为优质的植物蛋白资源，以核桃蛋白为原料，经酶解制备的核桃肽，具有良好的抗氧化活性。

CN107828842A公开了一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽，其制备方法包括：(1)核桃粕粉加水，在高温下处理、去脂得到核桃蛋白液；(2)超声处理核桃蛋白液；(3)加入复合蛋白酶酶解，同步进行超声处理；高温下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；(4)分离液通过二步超滤法处理；(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。上述专利申请采用由三种蛋白酶组成的复合蛋白酶进行酶解，同步超声处理，但酶解效果并不理想。此外，目前市面上有关核桃肽的应用产品大多仅从口服角度发挥其营养功效，形式单一，如CN103932175A提供一种核桃多肽泡腾片，仅适于泡腾后饮用，并且未考虑核桃多肽及泡腾片成品的抗氧化活性等功能活性。有鉴于此，提出本专利。

发明内容

为了进一步提高核桃蛋白的酶解效率，提高所得核桃肽的抗氧化活性，本发明提出一种新的核桃肽的制备方法。所述制备方法效率更高，酶解效果更好，所得核桃肽具有较高的抗氧化活性。

本发明所述核桃抗氧化活性肽的制备方法包括：以核桃粕为原料，从中提取核桃蛋白，并依次利用蜂蜜曲霉蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme复合蛋白酶进行酶解。

本发明通过对现有蛋白酶筛选，发现以上述三种蛋白酶依次对核桃蛋白进行酶解，可使所得核桃肽具有更好的抗氧化性：

蜂蜜曲霉蛋白酶特异性不高但分解活性高，可先把核桃蛋白中大量存在的谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)组成的肽键切断，形成大量核桃蛋白肽片段；然后用底物专一性较高的中性蛋白酶，通过控制酶解时间，优先切开丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)等含有烃基侧链的疏水性氨基酸，或苯丙氨酸(Phe)等芳香族疏水氨基酸组成的肽键；最后利用底物专一性较高的Flavourzyme复合酶，使短肽链中的疏水氨基酸从肽链末端被切断释放，尽量保留谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)在肽链分子中，从而增加核桃肽的抗氧化能力。所得核桃肽的分子量主要分布在1000Da以下，包括6～9个氨基酸，其中含有一个或多个谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)，这些氨基酸的大量存在，从而能够显著提高核桃肽的抗氧化性。与现有的常规酶组合相比，三种酶的组合对目标肽的抗氧化活性针对性强，反应条件易控制，酶解时间短，效率高。

进一步地，本发明还对具体的制备条件进行研究，获得效果更优的方案。

在本发明的一些实施例中，所述蜂蜜曲霉蛋白酶的酶解条件为：体系温度为40～50℃，pH至7.5～8.5；在此条件下，蜂蜜曲霉蛋白酶通过1～3h的酶解可对核桃蛋白中大量存在的谷氨酸(Glu)、精氨酸(Arg)组成的肽键切断，形成大量核桃肽片段，使核桃蛋白的四级结构、三级结构有效破坏，更多的酶切位点暴露出来，为后续两个酶的深度有效酶解，获得高抗氧化活性的肽做好准备，有利于进一步提高核桃肽的抗氧化性。

在本发明的一些实施例中，所述中性蛋白酶的酶解条件为：体系温度为45～55℃，pH为6.8～7.2。在此条件下，更有利于中性蛋白酶发挥底物专一性较高的优势，通过控制酶解时间1～2h，优先切开丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)等含有烃基侧链的疏水性氨基酸，或苯丙氨酸(Phe)等芳香族疏水氨基酸组成的肽键，使抗氧化活性较高的氨基酸残基优先暴露出来，有利于进一步提高核桃肽的抗氧化活性。

在本发明的一些实施例中，所述Flavourzyme复合蛋白酶的酶解条件为：酶解温度45～55℃，pH为5.0-7.0，酶解处理1～3h；在此条件下，更有利于使短肽链中的疏水氨基酸从肽链末端被切断释放，谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)最大限度的保留在肽链分子中，从而核桃肽的抗氧化活性显著提高。

在酶解结束后，调节酶解液的pH至4.0～5.0，达到蛋白的等电点，使未酶解或酶解不充分的蛋白通过离心处理沉淀下来，上清液经脱盐处理后，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

作为本发明的一个具体实施方式，所述核桃抗氧化活性肽的制备具体步骤如下：

S1.取核桃蛋白40～50份，料液比(g/mL)为1:8～12加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；

S2.步骤S1所得液体加热到40～50℃，用NaOH调节pH至7.5～8.5，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1～2份，酶活力3～4U/mg，磁力搅拌酶解1～3h，90～95℃高温灭活5～15min；

S3.冷却到45～55℃，用HCl调节pH至6.8-7.2，加入中性蛋白酶1～2份，酶活力2～4AU/g，磁力搅拌酶解1～2h；

S4.在45～55℃条件下，调节pH至5.0-7.0，加入Flavourzyme复合酶1～2份，酶活力400～600LAPU/g，磁力搅拌酶解1～3h，高温灭活；

S5.用HCl调节pH至4.0～5.0，7000～9000r/min离心10～20min，取上清液，上清液经阴阳离子交换床脱盐后，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

本发明还提供了由上述方法制得的核桃抗氧化活性肽。相比现有核桃肽，本发明所得核桃肽分子量主要集中在在1000Da以下，具有良好的抗氧化性，对DPPH自由基清除率达90％-95％，对羟自由基的清除率将会达到80％-88％，对超氧阴离子自由基的清除率可达90％-95％。

本发明还提供了上述核桃抗氧化活性肽在食品、护肤品等产品中的应用。

本发明还提供了一种食用核桃肽泡腾片(泡腾片A)，含有上述所得核桃抗氧化活性肽。相比现有的含核桃肽成分的泡腾片，本发明所得的核桃肽泡腾片具有更好的抗氧化活性。

在本发明的一些实施例中，所述核桃肽泡腾片由包括如下重量份的原料制得：上述所得核桃抗氧化活性肽0.15-0.35份，碳酸氢钠0.35-0.55份，柠檬酸0.25-0.45份。通过碳酸氢钠及柠檬酸的合理用量加入，所得泡腾片具有肽香浓郁，酸甜适口，气泡丰富的特点，将其适量溶解在水中，口感较佳；且气泡产生速度和丰富程度适中，崩解时间相对较短。

在本发明的一些实施例中，所述核桃肽泡腾片的原料还包括白砂糖、胶原蛋白；优选地，添加白砂糖0.40-0.60份，胶原蛋白0.10-0.30份；进一步优选地，所述核桃肽泡腾片由包括如下重量份的原料制得：核桃抗氧化活性肽0.25份，碳酸氢钠0.45-0.50份，柠檬酸0.30-0.35份，白砂糖0.40-0.50份，胶原蛋白0.20份。

此外，上述核桃肽泡腾片的原料还包括添加润滑剂、果味香精等辅料；其中润滑剂可选择本领域技术人员所熟知的辅料，如聚乙二醇(PEG6000)，添加量以泡腾片片重2％为宜，所述果味香精添加量以泡腾片片重0.1％-1％为宜。

本发明还提供一种用于面膜的核桃肽面膜泡腾片(泡腾片B)，含有上述所得核桃抗氧化活性肽。相比现有的面膜液，采用本发明所得的面膜泡腾片配制的面膜液具有更好的抗氧化活性。

在本发明的一些实施例中，所述用于面膜的核桃肽面膜泡腾片由包括如下重量份的原料制得：核桃抗氧化活性肽0.06-0.14份、碳酸氢钠0.06-0.18份、柠檬酸0.06-0.18份；通过碳酸氢钠及柠檬酸的合理用量加入，不仅使得面膜液的肤感更佳，而且崩解时间较短，气泡丰富。

在本发明的一些实施例中，所述核桃肽泡腾片的原料还包括透明质酸钠；优选地，还可添加透明质酸钠0.1份；所述用于面膜的核桃肽面膜泡腾片由包括如下重量份的原料制得：核桃抗氧化活性肽0.08-0.10份、碳酸氢钠0.09-0.12份、柠檬酸0.12-0.15份，透明质酸钠0.1份。

上述核桃肽泡腾片的制备可采用本领域常规片剂制备方法，如将各组分混合，采用直接压片法制得。

本发明还提供了一种面膜组合物，由无纺布面膜贴、上述用于面膜的核桃肽面膜泡腾片组成。

本发明还提供一种抗氧化组合物，由上述食用核桃肽泡腾片、上述面膜组合物组成；其中，所述食用核桃肽泡腾片与所述面膜组合物中的核桃肽面膜泡腾片的质量比为(1.75-2.05)：(0.41-0.44)。

本发明所述的抗氧化组合物具有携带、使用方便的特点，可将1-10套组合套装塑封于纸板或以其它形式组合，形成组合套装产品。通过这种组合使用方式，使消费者在服用核桃肽泡腾片A的同时，还可利用核桃肽泡腾片B浸渍面膜用于护肤，通过内服与外敷充分发挥核桃肽的抗氧化活性，减少皮肤表面的氧化损伤，并通过体内吸收，改善皮肤组织中促氧化过程和抗氧化防御系统的平衡。

此外，本发明利用核桃抗氧化活性肽作为食源性生物活性肽用于面膜，与化学合成的抗氧化剂相比安全性更高，同时通过在体表清除自由基、促进皮肤组织和胞内氧化还原反应稳态的平衡从而起到对皮肤的保护作用。

本发明通过泡腾片这一产品形态同时提供了核桃肽饮用和面膜外敷的两种使用方式，使核桃肽由内到外充分发挥抗氧化作用，对皮肤起到双重保护的效用，同时为解决泡腾片形态和用途单一的问题提供了新范例。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1核桃肽的制备

一种核桃抗氧化活性肽的制备方法，包括：以核桃粕为原料，从中提取核桃蛋白并以蜂蜜曲霉蛋白酶，中性蛋白酶和Flavourzyme复合蛋白酶进行分步酶解；

其制备步骤和条件为：

S1.取核桃蛋白40份，料液比(g/mL)为1:8加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；

S2.步骤S1所得液体加热到40℃，用NaOH调节pH至7.5，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1份，酶活力3U/mg，磁力搅拌酶解3h，90℃高温灭活15min；

S3.冷却到45℃，调pH至7.2，加入中性蛋白酶1份，酶活力2AU/g，磁力搅拌酶解1h；

S4.在45℃条件下，用HCl调节pH至5.0，加入Flavourzyme复合酶1份，酶活力400LAPU/g，磁力搅拌酶解1h，高温灭活；

S5.用HCl调节pH至4.0，7000r/min离心10min，取上清液，经阴阳离子交换床脱盐，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

实施例2核桃肽的制备

一种核桃抗氧化活性肽的制备方法，包括：

S1.取核桃蛋白50份，料液比(g/mL)为1:12加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；

S2.步骤S1所得液体加热到50℃，用NaOH调节pH至8.5，加入蜂蜜曲霉蛋白酶2份，酶活力4U/mg，磁力搅拌酶解2h，95℃高温灭活5min；

S3.冷却到55℃，用HCl调节pH至7.0，加入中性蛋白酶2份，酶活力4AU/g，磁力搅拌酶解1h；

S4.在55℃，,pH 7.0条件下，加入Flavourzyme复合酶2份，酶活力600LAPU/g，磁力搅拌酶解2h，高温灭活；

S5.用HCl调节pH至5.0，9000r/min离心20min，取上清液，经阴阳离子交换床脱盐，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

实施例3核桃肽的制备

一种核桃抗氧化活性肽的制备方法，包括：

S1.取核桃蛋白45份，料液比(g/mL)为1:10加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；

S2.步骤S1所得液体加热到45℃，用NaOH调节pH至8.0，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1.5份，酶活力3.5U/mg，磁力搅拌酶解1h，92℃高温灭活10min；

S3.冷却到50℃，用HCl调节pH至6.8，加入中性蛋白酶1.5份，酶活力3AU/g，磁力搅拌酶解2h；

S4.在50℃条件下，用HCl调节pH至6.0，加入Flavourzyme复合酶1.5份，酶活力500LAPU/g，磁力搅拌酶解1h，高温灭活；

S5.用HCl调节pH至4.5，8000r/min离心15min，取上清液，经阴阳离子交换床脱盐，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

对比例1核桃肽的制备(省略Flavourzyme复合酶)

S3.冷却到45℃，用HCl调节pH至6.8，加入中性蛋白酶1份，酶活力2AU/g，磁力搅拌酶解2h，高温灭活；

S4.用HCl调节pH至4.0，7000r/min离心10min，取上清液，经阴阳离子交换床脱盐，冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

本对比例与实施例1-3相比，没有用Flavourzyme复合酶进行处理。

对比例2核桃肽的制备(省略中性蛋白酶)

S2.步骤S1所得液体加热到45℃，用NaOH调节pH至7.5，加入蜂蜜曲霉蛋白酶1份，酶活力3U/mg，磁力搅拌酶解3h，90℃高温灭活15min；

S3.冷却到45℃，用HCl调节pH至5.0，加入Flavourzyme复合酶1份，酶活力400LAPU/g，磁力搅拌酶解3h，高温灭活；

本对比例与实施例1-3相比，没有用中性蛋白酶进行处理。

效果考察试验1

1.1 DPPH自由基清除率的测定

采用二苯代苦味酰自由基(DPPH)分析法。将冷冻干燥后的核桃蛋白酶解产物用超纯水配制成一定浓度的溶液，取2.0mL于10mL试管中，然后加入0.2mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.0)1.0mL和0.2mmol/L DPPH乙醇溶液2.0mL，混合均匀，于室温下暗处放置30min然后在518nm测定其吸光度。

·DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]*100％

A₁＝(DPPH溶液+样品溶液)的吸光度；A₂＝(95％乙醇溶液+样品溶液)的吸光度；A₀＝(DPPH溶液+超纯水)的吸光度。

1.2·OH自由基清除率的测定

·OH清除率的测定，吸取1mL样品溶液加入试管中，再加入1.8mmol/L水杨酸－乙醇溶液3mL，1.8mmol/L的FeSO₄溶液4mL，最后加入体积分数0.1％的H₂O₂溶液0.2mL启动反应，振荡混匀，在37℃水浴条件下反应30min后，于510nm波长处测定吸光值(A)。

同时以蒸馏水代替样品溶液按上述方法做空白实验，于510nm波长处测定吸光值(A₀)。每个试样做3个平行实验，取其平均值。·OH清除率按下式计算:

·OH自由基清除率(％)＝(A₀-A)/A₀*100％

1.3 O₂ ^-自由基清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定。取4.5ml，pH8.2，50mmol/L Tris-HCl缓冲液，4.2ml蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的30mmol/L邻苯三酚0.3ml(以10mmol/L HCl配制)，空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液，迅速摇匀后倒入比色杯，325nm处每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加，在加入邻苯三酚前先加入1ml样液。

O₂ ^-·自由基清除率(％)＝(ΔA₀-ΔA)/ΔA₀*100％

与对比例1、2相比，实施例1-3显著提高了三种自由基的清除率，与相关研究(李艳伏.核桃粕肽提取分离及功能特性研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学，2008；易建华，朱振宝，董文宾.核桃蛋白酶解产物抗氧化性的研究[J].食品工业科技，2007，4，84-87；陈永浩,王克建,郝艳宾,等.酶解方式对核桃蛋白肽及其抗氧化活性的影响[J].食品机械，2011，27(5)：63-67)相比，本方案首次选用蜂蜜曲霉蛋白和中性蛋白酶、复合蛋白酶联合酶解，连续分步进行，实现了获得分子量小于1000Da的核桃抗氧化活性肽，使其总体抗氧化活性显著提高，为后续产品的开发应用提供了技术保障。实施例1-3与对比例1-2所得核桃肽的抗氧化效果比较见表1。

表1实施例1-3与对比例1-2所得核桃肽的抗氧化活性比较

	DPPH自由基清除率(％)	·OH自由基清除率(％)	O<sub>2</sub><sup>-</sup>自由基清除率(％)
				实施例1	90.0	80.0	90.2
实施例2	93.4	84.8	93.6
				实施例3	95.0	88.0	95.0
对比例1	65.6	70.3	58.6
				对比例2	58.9	60.2	70.5

1.4氨基酸组成的测定

采用OPA柱前衍生反相高效液相色谱法测定。样品加入6mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24h，冷却后定容、过滤、蒸干，OPA柱前衍生(脯氨酸与氯甲芴甲酯(FMOC)反应)后，上Ag1100氨基酸专用高效液相色谱仪分析，以保留时间定性，峰面积外标法测定。

游离氨基酸计算测定：样品加入10ml 5％的磺基水杨酸沉淀2h。吸取一定的量于10000g离心15min。取一定体积的上清液调pH至2.0左右定溶，0.45μm微膜过滤至样品杯中上机测定。

实施例1-3与对比例1-2所得核桃肽的氨基酸组成见表2，实施例1-3中谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、组氨酸(His)等与体外抗氧化活性直接相关的氨基酸所占比例高于对比例1-2。

表2核桃肽中与抗氧化活性密切相关的氨基酸的组成(％)

1.5分子量分布的测定

采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的分子量分布进行测定，条件为：色谱柱TSKgel2000 SWXL 300mm*7.8mm；流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)；检测波长：220nm；流速：0.5ml/min；柱温30℃；分子量参照物分别为细胞色素C(Mw 12500)、杆菌酶(Mw1450)、乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸(Mw451)、乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸(Mw 189)。实施例1-3与对比例1-2所得核桃肽的分子量分布见表3，实施例1-3中分子量介于235Da1000Da的核桃肽含量显著高于对比例1-2，而实施例1-3中分子量小于227Da的组份含量低于对比例1-2。

表3实施例1-3与对比例1-2所得核桃肽的分子量分布(％)比较

分子量范围	227Da-126Da	235Da-1000Da	1000Da-4100Da	4100Da-12000Da
					实施例1	4.3	81.7	10.5	4.5
实施例2	5.6	74.8	11.8	7.8
					实施例3	3.5	87.1	7.4	2.0
对比例1	10.3	33.6	35.0	21.1
					对比例2	12.6	18.4	46.5	22.5

实施例4食用核桃肽泡腾片(泡腾片A)

配方如下：实施例3制得的核桃抗氧化活性肽0.25份，白砂糖0.45份、碳酸氢钠0.50份，柠檬酸0.35份，胶原蛋白0.2份。

效果考察试验2

以感官评分、气泡产生速度和丰富程度、崩解时间为考察指标，通过单因素试验和正交试验确定适宜配方。

感官评分，是将制得的泡腾片A在50ml水中崩解后摇匀，根据其泡腾饮品的色泽、口感、风味、组织状态等进行综合考察。样品由12人进行观察和品尝，进行综合打分，取平均值为最终感官评分。其中色泽20分，滋味40分，组织状态20分，气味20分，评分标准见表4。

表4核桃肽泡腾片崩解液评分标准

2.1核桃肽添加量对泡腾片A的影响

分别取核桃抗氧化活性肽，0.15份，0.20份，0.25份，0.30份，0.35份，其它辅料用量分别为：碳酸氢钠0.50份，柠檬酸0.35份，糖0.45份，胶原蛋白0.2份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，过筛后直接进行压片。将制好的泡腾片A崩解于50ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后进行感官评分。

表5不同核桃肽添加量对泡腾片A特性的影响

注：‘+’个数表示所产生气泡的丰富程度和速度，下同

由表5可以看出，当核桃抗氧化活性肽的添加量为0.25份时，感官评分最高，当用量为0.15份或0.35份时，感官评分较低。而肽的用量对气泡及崩解时间影响不明显。

2.2碳酸氢钠添加量对泡腾片A的影响

分别取碳酸氢钠0.35份，0.40份，0.45份，0.50份，0.55份。核桃抗氧化活性肽0.25份，其他辅料用量分别为：柠檬酸0.35份，糖0.45份，胶原蛋白0.2份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，进行压片。将制好的泡腾片A崩解于50ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后进行感官评分。

表6不同碳酸氢钠添加量对泡腾片A特性的影响

由表6可以看出，当碳酸氢钠的添加量在0.50份的时候，口感评分最好，且气泡产生速度和丰富程度适中，崩解时间相对较短，而当添加量为0.55份时，虽然气泡变的更为丰富，崩解时间变短，但感官评分降低。

2.3柠檬酸添加量对泡腾片A的影响

分别取柠檬酸0.25份，0.30份，0.35份，0.40份，0.45份，核桃抗氧化活性肽0.25份，其他辅料用量分别为：碳酸氢钠0.50份，糖0.45份，胶原蛋白0.2份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，进行压片。将制好的泡腾片A崩解于50ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后进行感官评分。

表7柠檬酸添加量对泡腾片A特性的影响

由表7可以看出，当柠檬酸的添加量在0.35份的时候感官评分最好，且气泡产生速度和丰富程度适中，崩解时间相对较短，而当添加量为0.45份时，虽然气泡变的更为丰富，崩解时间变短，但感官评分降低。

2.4白砂糖添加量对泡腾片A口味的影响

分别取白砂糖0.40份，0.45份，0.50份，0.55份，0.60份，其它主辅料用量分别为：核桃抗氧化活性肽0.25份，碳酸氢钠0.50份，柠檬酸0.35份，胶原蛋白0.2份，片重0.5％果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，进行压片。将制好的泡腾片A崩解于50ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后进行感官评分。

表8不同白砂糖添加量对泡腾片A特性的影响

由表8可以看出，当白砂糖的添加量在0.45份的时候，感官评分最高，当用量高于0.55份时，感官评分较低，而白砂糖的用量对气泡及崩解时间影响不明显。

泡腾片的其他辅料胶原蛋白为附加物，目的是为了增强产品的护肤性；可食用果味香精是为了增加泡腾片的香浓口感、掩盖肽的特殊性气味(可选择香橙风味、草莓香味、葡萄香味等)；聚乙二醇6000作为润滑剂是为了改善压片效果。

实施例5-12核桃肽泡腾片A

各实施例配方见表9。

表9

实施例14核桃肽泡腾片B

配方如下：核桃抗氧化活性肽0.10份，碳酸氢钠0.15份，柠檬酸0.15份，透明质酸0.1份。

效果考察试验3

以面部舒适感评分、气泡产生速度和丰富程度、崩解时间为考察指标，通过单因素试验和正交试验确定适宜配方。面部舒适感评分，是将制得的泡腾片B在15ml水中崩解后摇匀，将压缩面膜置于其中，若干分钟后待其吸水膨胀后，展开沥水后敷于面部15min。由12人进行舒适感评分，满分100分，取平均值为最终得分。

3.1核桃肽添加量对泡腾片B的影响

分别取核桃抗氧化活性肽0.06份，0.08份，0.10份，0.12份，0.16份，其它辅料用量分别为：碳酸氢钠0.12份，柠檬酸0.12份，透明质酸钠0.10份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，经混匀后过筛压片。将泡腾片崩解于15ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后将面膜置于其中，待其吸水膨胀后，展开沥水，敷于面部15min，对面部舒适感评分。

表10核桃肽添加量对泡腾片B特性的影响

由表10可见，当核桃抗氧化活性肽添加量在0.10份的时候舒，适感评分最高，当用量高于0.14份时，感官评分较低，而核桃抗氧化活性肽的用量对气泡及崩解时间影响不明显。

3.2碳酸氢钠添加量对泡腾片B的影响

分别取碳酸氢钠0.06份，0.09份，0.12份，0.15份，0.18份。其它主辅料添加量为：核桃抗氧化活性肽0.10份，柠檬酸0.12份，透明质酸钠0.1份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PE份6000)，经混匀后过筛压片。将泡腾片崩解于15ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后将面膜置于其中，待其吸水膨胀后，展开沥水，敷于面部15min，对面部舒适感评分。

表11碳酸氢钠添加量对泡腾片B特性的影响

由表11可见，当碳酸氢钠添加量在0.12份的时候，舒适感评分最高，但分数差距不大，但碳酸氢钠添加量增加，崩解时间会略长。

3.3柠檬酸添加量对泡腾片B的影响

分别取柠檬酸0.06份，0.09份，0.12份，0.15份，0.18份。其它主辅料添加量为：核桃抗氧化活性肽0.10份，碳酸氢钠0.12份，透明质酸钠0.1份，片重0.5％的果味香精，片重2％的聚乙二醇(PEG6000)，经混匀后过筛压片。将泡腾片崩解于15ml水中，记录崩解时间，观察气泡产生情况，摇匀后将面膜置于其中，待其吸水膨胀后，展开沥水后敷于面部15min，对面部舒适感评分。

表12柠檬酸添加量对泡腾片B特性的影响

由表12可见，当柠檬酸添加量在0.12份的时候，舒适感评分最高，当用量高于0.18份或低于0.06份时，感官评分较低。柠檬酸添加量多，可集中产生较多气泡，在0.09份-0.15份范围内，气泡产生速度差别不大，在此范围内，崩解时间差异也不明显。

实施例15-23核桃肽泡腾片B

各实施例配方见表13。

表13

	A核桃肽/份	B NaHCO<sub>3</sub>/份	C柠檬酸/份	面部舒适感评分
					实施例15	0.08	0.09	0.09	78
实施例16	0.08	0.12	0.12	80
					实施例17	0.08	0.15	0.15	83
实施例18	0.10	0.09	0.12	86
					实施例19	0.10	0.12	0.15	77
实施例20	0.10	0.15	0.09	79
					实施例21	0.12	0.09	0.15	76
实施例22	0.12	0.12	0.09	77
					实施例23	0.12	0.15	0.12	79

效果考察试验4

对实施例4-23制得的泡腾片的抗氧化活性进行测定，并与市售泡腾片的抗氧化活性进行比较，测定方法见1.1-1.3，测定结果如表14所示：用于崩解后饮用的泡腾片A和用于面膜浸渍液的泡腾片B，其自由基清除率均显著高于市售泡腾片。

表14优选实施例泡腾片与市售泡腾片自由基清除率比较

	DPPH自由基清除率(％)	·OH自由基清除率(％)	O<sub>2</sub><sup>-</sup>自由基清除率(％)
				实施例8	84.0	70.0	80.2
实施例9	83.4	74.8	83.6
				实施例16	88.0	81.0	75.0
实施例17	75.6	60.3	51.6
				实施例18	78.9	52.2	60.5
市售泡腾片1	38.9	28.5	45.3
				市售泡腾片2	22.5	25.6	37.5

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种核桃抗氧化活性肽的制备方法，其特征在于，包括：以核桃粕为原料，从中提取核桃蛋白，并依次利用蜂蜜曲霉蛋白酶、中性蛋白酶、Flavourzyme复合蛋白酶进行酶解。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蜂蜜曲霉蛋白酶的酶解条件为：体系温度为40～50℃，pH至7.5～8.5。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的酶解条件为：体系温度为45～55℃，pH为6.8～7.2；

和/或，所述Flavourzyme复合蛋白酶的酶解条件为：体系温度为45～55℃，pH为5.0-7.0。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：

S1.取核桃蛋白40～50份，料液比(g/mL)为1:8～12，加入去离子水，搅拌分散后，进行预处理；

S3.冷却到45～55℃，用HCl调pH至6.8～7.2，加入中性蛋白酶1～2份，酶活力2～4AU/g，磁力搅拌酶解1～2h；

S5.用HCl调节pH至4.0～5.0，达到蛋白质等电点，7000～9000r/min离心10～20min，未能酶解或酶解不充分的蛋白在等电点沉淀下来并被脱除掉，将上清液通过阴阳离子交换床脱盐，经冷冻干燥得核桃抗氧化活性肽。

5.权利要求1-4任一所述的制备方法得到的核桃抗氧化活性肽。

6.权利要求5所述的核桃抗氧化活性肽在食品、护肤品中的应用。

7.一种食用核桃肽泡腾片，其特征在于，含有权利要求5所述的核桃抗氧化活性肽；

优选地，所述的食用核桃肽泡腾片，由包括如下重量份的原料制得：权利要求5所述核桃抗氧化活性肽0.15-0.35份，碳酸氢钠0.35-0.55份，柠檬酸0.25-0.45份；

更优选地，所述核桃肽泡腾片由包括如下重量份的原料制得：权利要求5所述核桃抗氧化活性肽0.25份，碳酸氢钠0.45-0.50份，柠檬酸0.30-0.35份，白砂糖0.40-0.50份，胶原蛋白0.20份。

8.一种用于面膜的核桃肽面膜泡腾片，其特征在于，含有权利要求5所述的核桃抗氧化活性肽；

优选地，所述的用于面膜的核桃肽面膜泡腾片，由包括如下重量份的原料制得：权利要求5所述核桃抗氧化活性肽0.06-0.14份、碳酸氢钠0.06-0.18份、柠檬酸0.06-0.18份；

更优选地，所述用于面膜的核桃肽面膜泡腾片由包括如下重量份的原料制得：权利要求5所述核桃抗氧化活性肽0.08-0.10份、碳酸氢钠0.09-0.12份、柠檬酸0.12-0.15份，透明质酸钠0.1份。

9.一种面膜组合物，其特征在于，由无纺布面膜贴、权利要求8所述的用于面膜的核桃肽面膜泡腾片组成。

10.一种抗氧化组合物，其特征在于，由权利要求7所述的食用核桃肽泡腾片、权利要求9所述的面膜组合物组成；其中，所述食用核桃肽泡腾片与所述面膜组合物中的核桃肽面膜泡腾片的质量比为(1.75-2.05)：(0.41-0.44)。