CN108796016A - 核桃肽及其酶解提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是核桃肽及其酶解提取方法。核桃肽的酶解提取方法包括以下几个步骤：(1)将核桃仁粉碎得到核桃渣，将核桃渣加入水中，打浆，用有机碱调节pH值，搅拌，离心，除去油层，取上清液，用无机酸调节pH值，离心，用乙醇洗涤，得到核桃蛋白；(2)加热或用紫外光照射使核桃蛋白变性；(3)单酶酶解/双酶酶解；(4)将酶解液加热灭活，自然冷却后调节pH值，离心，取上清液，冷冻干燥，即得核桃肽。通过上述办法得到的核桃肽具有优异的抗氧化活性和降血压活性。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工领域，尤其是一种核桃肽及其酶解提取方法。
背景技术
核桃(Juglans regia L)又名胡桃、羌桃，属胡桃科胡桃属植物，与扁桃、腰果、榛子并列为世界四大干果。核桃的药用价值和营养价值都很高。《神农本草经》将核桃列为久服轻身益气、延年益寿的上品。明代李时珍著《本草纲目》记述，核桃仁有补气养血，润燥化痰，处三焦，温肺润肠，治虚寒喘咳，腰脚重疼，心腹疝痛等功效。核桃蛋白是一种良好的植物蛋白，核桃蛋白在持油性、溶解度、乳化性方面有着较好的功能性质。总体超过了其它一些植物蛋白的品质。在我国蛋白质资源缺乏的情况下，对核桃粕蛋白的开发利用能带来巨大的经济和社会效益并对食品工业有巨大的推动作用。
核桃一直被作为一种益智类食品深受消费者的青睐，开发核桃蛋白肽也容易被人们接受。另外，我国是核桃生产最大的国家，核桃制油后废弃了大量的核桃渣，采用核桃渣为原料开发核桃蛋白肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产，同时减少了资源的浪费，提高了核桃制品的附加值，有效地弥补了核桃深加工的欠缺。所以，研究开发核桃生物活性肽具有广阔的前景。
传统获得肽的方法有很多。传统法主要有：酸法、碱法、电法、人工嫁接法、基因表达法等。但在工艺技术方面，这些合成工艺方法的局限性，是导致其这些合成方法没有产品的原因。
而酶法在传统法的基础上有所突破和创新，适应了低碳经济和绿色环保的要求。酶法就是用生物酶催化蛋白质获得多肽，就是蛋白质降解，人工合成的多肽。酶法较酸法、碱法、电法温和、环保。生产工艺简易，投资少、见效快，适宜工业化生产。目前，大豆肽和乳蛋白肽是在研究中应用最多的食源性活性肽。然而至今关于酶解法制备核桃肽的报道中均没有使用相同的蛋白酶，故酶法生产核桃肽具有一定的盲目性。
酶法获得多肽，分子量易控制、产品自身富有绿色属性、生产出来的肽无苦味、肽分子量小、这些小分子肽不需消化直接吸收，具有动力、载体、运输、递质和营养功能，特别是它具有极强的活性和多样性。
发明内容
本发明是核桃肽及其酶解提取方法，主要改进核桃肽的生产工艺，包括使用了有机胍来调节pH值，改进了核桃变性办法等技术方案，改进了现有技术，通过本发明提供的技术方案有效提升了得到的核桃肽的性能。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁粉碎过5-20目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中，打浆，用有机碱将pH值调至8.0-9.0，在50-65℃下搅拌0.8-3小时，离心5-20分钟，除去油层，取上清液，用(1.0-2.0)mol/L无机酸水溶液调节pH值至4.2-5.1，离心15-30分钟，用乙醇洗涤1-3次，得到核桃蛋白；
所述的核桃渣与水的质量比为(3-8):100；
所述的无机酸为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种；
(2)将核桃蛋白配制成蛋白水溶液，使核桃蛋白变性；
(3)将蛋白水溶液调节到蛋白酶最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶最适宜pH值，加入蛋白酶，酶解1-10小时，得到酶解液，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶最适合的pH值；
所述蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种；
(4)将酶解液加热至100℃并保持5-20分钟，自然冷却用无机酸水溶液后调节pH值至4.0-5.5，离心5-10分钟，取上清液，冷冻干燥，即得核桃肽；所述的无机酸为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种。
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁粉碎过5-20目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中，打浆，用有机碱将pH值调至8.0-9.0，在50-65℃下搅拌0.8-3小时，离心5-20分钟，除去油层，取上清液，用(1.0-2.0)mol/L无机酸水溶液调节pH值至4.2-5.1，离心15-30分钟，用乙醇洗涤1-3次，得到核桃蛋白；
所述的核桃渣与水的质量比为(3-8):100；
所述的无机酸为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种；
(2)将核桃蛋白配制成蛋白水溶液，使核桃蛋白变性；
(3)将蛋白水溶液调节到蛋白酶A最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶A最适宜pH值，加入蛋白酶A，酶解1-10小时，得到酶解液A，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶A最适合的pH值；
所述蛋白酶A的质量为核桃渣质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶A为为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持5-20分钟，调节到蛋白酶B最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶B最适宜pH值，加入蛋白酶B，，酶解1-10小时，得到酶解液B，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶B最适合的pH值；
所述蛋白酶B的质量为核桃渣质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶B为为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种且与蛋白酶A不同；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持5-20分钟，自然冷却后调节pH值至4.0-5.5，离心5-10分钟，取上清液，用水调节pH值至7.0，冷冻干燥，即得核桃肽；
优选地，步骤(2)为将核桃蛋白配置成3-10wt％的蛋白水溶液，搅拌，在85-100℃下加热10-20分钟。
优选地，步骤(2)为用紫外光照射核桃蛋白30-60分钟后将核桃蛋白配置成3-10wt％的蛋白水溶液。
优选地，所述的紫外光为紫外圆偏振光。
优选地，所述有机碱为有机胍和丙酸钙中的任意一种或两者任意比例的混合物。
优选地，所述有机碱为一种有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物。
优选地，所述的有机胍如通式(I)或通式(II)所示：
其中R1选自Me,Et,Pr,i-Pr,t-Bu,Cy,Ph,Bn；R2和R3选自Cy,Ph,Bn，且R2和R3相同。
所述的Me为甲基，Et为乙基，Pr为正丙基，i-Pr为异丙基，t-Bu为叔丁基，Cy为环己基，Ph为苯基，Bn为苄基。
本发明还提供了按照上述核桃肽酶解提取方法提取得到的核桃肽。
使用本发明提供的酶解提取方法提取的核桃肽具有良好的抗氧化活性和降血压活性。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，以下实施例仅仅是用来解释本发明，并不用于限定本发明。
具体地，本发明所用碱性蛋白酶，酶活力2.0×105U/g，购自北京科百奥生物技术有限公司；
中性蛋白酶，酶活力6.0×104U/g，购自北京奥博兴生物技术有限公司；
木瓜蛋白酶，酶活力5.0×105U/g，购自北京奥博兴生物技术有限公司；
胰蛋白酶，酶活力2.5×103U/g，购自国药集团化学试剂有限公司；
胃蛋白酶，酶活力1.2×103U/g，购自国药集团化学试剂有限公司。
有机胍中通式(I)的化合物均按照Modified guanidines as chiralsuperbases:the first example of asymmetric silylation of secondary alcohols(Chemical Communications,2001,7(3):243-244.)一文中的方法制备；
有机胍中通式(II)的化合物均按照Enantioselective Synthesis ofα‐AminoNitriles from N‐Benzhydryl Imines and HCN with a Chiral Bicyclic Guanidine asCatalyst.(Organic Letters,1999,1(1):157.)一文中的方法制备；
本发明中使用的普通紫外光波长为266nm，普通紫外灯购自江阴申星万合环境科技有限公司，型号为ZW10D15W/Y。
本发明使用的圆偏振紫外光波长为266nm，圆偏振紫外光通过飞秒激光系统生成，该激光系统包括绿光激光器、泵浦源、振荡器、光学再生放大器等几部分组成。先由绿光激光器产生1064nm波长的连续激光，经过倍频晶体后倍频为532nm波长的可见光，在进入振荡器经自锁模过程形成800nm的飞秒脉冲激光，由泵浦源产的的泵浦光在光学再生放大器中放大，最后通过三倍频器倍频后产生线偏振光，线偏振光通过起偏器，改变起偏器的透振方向，有消光的为线偏振光，确定偏振方向，然后将该偏振光与四分之一波片的快慢轴各成45°角，通过四分之一波片产生圆偏振光，之后再通过四分之一玻片和检偏器，改变检偏器的透振方向，消光则确定为圆偏振光，将确认的圆偏振光将四分之一玻片的快轴平行于检偏器的透光轴，改变检偏器的透振方向，逆时针小于90°有消光的为左旋圆偏振光，顺时针转角小于90°有消光的为右旋圆偏振光。
本发明中使用的化学试剂，CAS号如下：
盐酸，CAS号：7647-01-0。
磷酸，CAS号：7664-38-2。
硫酸，CAS号：7664-93-9。
无水乙醇，CAS号：64-17-5。
95％乙醇是指体积分数为95％的乙醇。
丙酸钙，CAS号：4075-81-4。
实施例1
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用丙酸钙将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液，搅拌，在90℃下加热20分钟；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用丙酸钙调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用丙酸钙不断调节pH值在7.5，得到酶解液；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
实施例2
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用丙酸钙将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm普通紫外光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述普通紫外光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用丙酸钙调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用丙酸钙不断调节pH值在7.5，得到酶解液；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
实施例3
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用丙酸钙将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用丙酸钙调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用丙酸钙不断调节pH值在7.5，得到酶解液；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
实施例4
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用丙酸钙将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用丙酸钙调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用丙酸钙不断调节pH值在7.5，得到酶解液A；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持15分钟，自然冷却到37℃，用丙酸钙调节pH值至8.0，加入胰蛋白酶，酶解3小时，得到酶解液B，酶解过程中用丙酸钙不断调节pH值，使反应液pH值保持在8.0；
胰蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
实施例5
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用有机胍将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用有机胍调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用有机胍不断调节pH值在7.5，得到酶解液A；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持15分钟，自然冷却到37℃，用有机胍调节pH值至8.0，加入胰蛋白酶，酶解3小时，得到酶解液B，酶解过程中用有机胍不断调节pH值，使反应液pH值保持在8.0；
胰蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
在本实施例中所述的有机胍的结构为：
实施例6
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用有机胍将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，将蛋白水溶液用有机胍调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用有机胍不断调节pH值在7.5，得到酶解液A；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持15分钟，自然冷却到37℃，用有机胍调节pH值至8.0，加入胰蛋白酶，酶解3小时，得到酶解液B，酶解过程中用有机胍不断调节pH值，使反应液pH值保持在8.0；
胰蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
在本实施例中所述的有机胍的结构为：
实施例7
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用混合有机碱将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，用混合有机碱调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用混合有机碱不断调节pH值在7.5，得到酶解液A；
混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持15分钟，自然冷却到37℃，用混合有机碱调节pH值至8.0，加入胰蛋白酶，酶解3小时，得到酶解液B，酶解过程中用混合有机碱不断调节pH值，使反应液pH值保持在8.0；
混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
胰蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后用1mol/L盐酸调节pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
在本实施例中所述的有机胍的结构为：
实施例8
一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁(品种为山核桃)粉碎过10目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中打浆20分钟，用混合有机碱固体将pH值调至8.5，在55℃下搅拌80分钟，5000r/min离心10分钟，除去油层，取上清液，用1.0mol/L盐酸调节pH值至4.2，6000r/min离心20分钟，取沉淀用等体积的95％乙醇洗涤2次，得到核桃蛋白；
所述混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
所述核桃渣与水的质量比为5:100；
(2)用波长为266nm紫外左旋圆偏振光照射核桃蛋白40分钟后将核桃蛋白配置成6％的蛋白水溶液；所述紫外左旋圆偏振光光强度为1000W/m2；
(3)冷却到40℃，用混合有机碱调节pH至7.5，加入中性蛋白酶，酶解5小时，酶解过程中用混合有机碱不断调节pH值在7.5，得到酶解液A；
混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
中性蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持15分钟，自然冷却到37℃，用混合有机碱调节pH值至8.0，加入胰蛋白酶，酶解3小时，得到酶解液B，酶解过程中用混合有机碱不断调节pH值，使反应液pH值保持在8.0；
混合有机碱为预先混合均匀的有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物；
胰蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.5％；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持15分钟，自然冷却后调节用1mol/L盐酸pH值至4.5，6000r/min离心5分钟，取上清液，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的条件为设定预冻温度为-25℃，当样品温度降到设定温度后保持2h，设定升华温度为10℃，解析温度为36℃，干燥时间为24h，即得核桃肽。
在本实施例中所述的有机胍的结构为：
测试例1
抗氧化活性测定
采用二苯代苦味酰自由基(DPPH)分析法。将实施例1-8制得的核桃肽用超纯水配制成2mg/mL的溶液，取2.0mL于10mL试管中，然后加入0.2mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)1.0mL和0.2mmol/L DPPH乙醇溶液2.0mL，混合均匀，于室温下暗处放置30min然后在518nm测定其吸光度A1，同时测定2mL 95％乙醇和2mL样品溶液混合后的吸光度A2，以及2mLDPPH溶液和2mL超纯水混合后的吸光度A0。清除率越大，抗氧化能力越强。
自由基清除率计算公式如下：
测试结果如表1所示：
表1 DPPH自由基清除率测定结果
根据上表所示，在制备核桃肽工艺中，用普通紫外光照射变性(实施例2)比加热变性(实施例1)有更好的自由基清除率，当使用紫外偏振光(实施例3)时自由基清除率较普通紫外光(实施例2)的自由基清除率更进一步。使用双酶水解(实施例4)也会较单酶水解(实施例3)有更好的效果。当工艺中用来中和的有机碱用有机胍(实施例5-6)时较使用丙酸钙(实施例4)时有更好的效果，其中无论是单独使用双环胍(实施例6)还是单环胍(实施例5)效果区别不大，但是当使用有机胍和丙酸钙复配时(实施例7-8)较单独使用有机胍有更好的效果，其中双环胍和丙酸钙复配(实施例8)效果稍好于单环胍和丙酸钙复配(实施例7)的效果。
测试例2
降血压活性的测定
采用Cushman的降血压体外检测方法，用血管紧张素转化酶(ACE)水解血管紧张素I的体外模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸(Hip)，该物质在228nm处有吸收峰，通过测定马尿酸的量来检测ACE抑制剂的活性。
将实施例1-8方法制备的核桃肽用超纯水配制成1.4mg/mL的溶液，旋涡振荡混匀后进行ACE抑制率的测定。将HHL溶解在0.1mol/L含0.3mol/L氯化钠的硼酸盐缓冲液中(pH＝8.3)，浓度为5mmol/L。在2mL刻度离心管中依次加入80μL的HHL，100μL去离子水，10μL核桃肽水溶液，将此混合液放入37℃恒温水浴中保温3min，然后加入10μL(0.1U/mL)ACE酶液，开始反应。恒温保持30min，加入0.2mL的HCl(1.0mol/L)，中止反应，再加入1.2mL温度为-20℃的乙酸乙酯，均匀混合大约15s，萃取被ACE所释放的马尿酸，3500r/min离心5min，将乙酸乙酯转入另一刻度试管中，在120℃的烘箱中烘干，重新溶于去离子水中，在228nm处测定吸光值。空白对照管除在反应前先加入0.2mL的HCl(1.0mol/L)中止反应外，其余操作相同。
抑制率计算公式如下：
式中ODA为不存在核桃肽水溶液时的吸光值(用超纯水代替核桃肽水溶液)；ODB为存在核桃肽水溶液和血管紧张素转化酶时的吸光值；ODC为核桃肽水溶液与血管紧张素转化酶都不存在时的吸光值(用超纯水代替核桃肽水溶液，并在反应前中止反应)。抑制率越高降血压活性越好。
测试结果如表2所示。
表2抑制率测定结果
| 抑制率(％) | |
| 测试例1 | 65.42 |
| 测试例2 | 66.08 |
| 测试例3 | 70.11 |
| 测试例4 | 65.20 |
| 测试例5 | 69.76 |
| 测试例6 | 70.02 |
| 测试例7 | 68.84 |
| 测试例8 | 75.51 |
由上表可知，普通紫外光照射变性(实施例2)和加热变性(实施例1)，对核桃肽的降血压活性影响不大，但是用紫外圆偏振光照射变性(实施例3)会使其降血压活性有一个很大的提升，然而当使用双酶水解(实施例4)后与单酶水解(实施例3)相比抑制率大幅下降，用有机胍(实施例5-6)代替丙酸钙(实施例4)后，抑制率有了一个明显的上升，但是单环胍(实施例5)和双环胍(实施例6)区别不大，有机碱使用单环胍和丙酸钙(实施例7)复配后，效果甚至还稍稍低于单独使用单环胍(实施例5-6)，然而使用双环胍和丙酸钙复配(实施例8)取得了一个非常好的抑制率。
综上所述，本发明提供了核桃肽及其酶解提取方法。根据本发明提供的酶解提取方法提取的核桃肽，有非常好的抗氧化活性和抗血压活性。
Claims (9)
1.一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁粉碎过5-20目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中，打浆，用有机碱将pH值调至8.0-9.0，在50-65℃下搅拌0.8-3小时，离心5-20分钟，除去油层，取上清液，用(1.0-2.0)mol/L无机酸水溶液调节pH值至4.2-5.1，离心15-30分钟，用乙醇洗涤1-3次，得到核桃蛋白；
所述的核桃渣与水的质量比为(3-8):100；
(2)将核桃蛋白配制成蛋白水溶液，使核桃蛋白变性；
(3)将蛋白水溶液调节到蛋白酶最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶最适宜pH值，加入蛋白酶，酶解1-10小时，得到酶解液，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶最适合的pH值；
所述蛋白酶的质量为蛋白水溶液质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种；
(4)将酶解液加热至100℃并保持5-20分钟，自然冷却后用无机酸水溶液调节pH值至4.0-5.5，离心5-10分钟，取上清液，冷冻干燥，即得核桃肽；所述的无机酸为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种。
2.一种核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将核桃仁粉碎过5-20目筛得到核桃渣，将核桃渣加入水中，打浆，用有机碱将pH值调至8.0-9.0，在50-65℃下搅拌0.8-3小时，离心5-20分钟，除去油层，取上清液，用(1.0-2.0)mol/L无机酸水溶液调节pH值至4.2-5.1，离心15-30分钟，用乙醇洗涤1-3次，得到核桃蛋白；
所述的核桃渣与水的质量比为(3-8):100；
(2)将核桃蛋白配制成蛋白水溶液，使核桃蛋白变性；
(3)将蛋白水溶液调节到蛋白酶A最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶A最适宜pH值，加入蛋白酶A，酶解1-10小时，得到酶解液A，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶A最适合的pH值；
所述蛋白酶A的质量为蛋白水溶液质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶A为为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种；
(4)将酶解液A加热至100℃并保持5-20分钟，冷却到蛋白酶B的最适宜温度，用有机碱或无机酸调节pH值至蛋白酶B最适宜pH值，加入蛋白酶B，酶解1-10小时，得到酶解液B，酶解过程中用有机碱不断调节pH值，使反应液保持在蛋白酶B最适合的pH值；
所述蛋白酶B的质量为蛋白水溶液质量的0.1-2％；
所述的蛋白酶B为为碱性蛋白酶，中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶中的任意一种且与蛋白酶A不同；
(5)将酶解液B加热至100℃并保持5-20分钟，自然冷却后用无机酸水溶液调节pH值至4.0-5.5，离心5-10分钟，取上清液，冷冻干燥，即得核桃肽；所述的无机酸为盐酸、磷酸、硫酸中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤(2)为将核桃蛋白配置成3-10wt％的蛋白水溶液，搅拌，在85-100℃下加热10-20分钟。
4.根据权利要求1或2所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，步骤(2)为用紫外光照射核桃蛋白30-60分钟后将核桃蛋白配置成3-10wt％的蛋白水溶液。
5.根据权利要求4所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，所述的紫外光为紫外圆偏振光。
6.根据权利要求1或2所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，所述有机碱为有机胍和丙酸钙中的任意一种或两者任意比例的混合物。
7.根据权利要求1或2所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，所述有机碱为有机胍和丙酸钙质量比为3:1的混合物。
8.根据权利要求6或7所述的核桃肽酶解提取方法，其特征在于，所述的有机胍如通式(I)或通式(II)所示：
其中R1选自Me,Et,Pr,i-Pr,t-Bu,Cy,Ph,Bn；R2和R3选自Cy,Ph,Bn，且R2和R3相同。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的核桃肽酶解提取方法提取得到的核桃肽。
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