CN114606283A - 一种具有良好乳化性能的核桃多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有良好乳化性能的核桃多肽及其制备方法,所述核桃多肽是氨基酸序列为Glu‑Lys‑Val‑Ser‑Tyr‑Asp‑His‑Cys‑Ile‑Met‑Ser‑Leu‑Asp、Gly‑Gln‑Phe‑His‑Ala‑Trp‑Lys‑Asn‑Pro‑Asn‑Thr‑Met‑Ser和Asp‑Glu‑His‑Val‑Leu‑Lys‑Phe‑Gly‑Met‑Thr‑Cys的多肽混合物。本发明以核桃粕为原料,经脱脂后碱提酸沉,再使用胰蛋白酶限制性酶解,最后采用超滤分离和葡聚糖凝胶G‑25凝胶层析分离纯化获得核桃多肽。本发明核桃多肽的分子量在3~5kDa,其乳化性能和乳化稳定性良好,为多肽乳化剂的开发提供了理论依据,拓宽了核桃蛋白的应用领域,同时可以变废为宝,提高核桃蛋白的利用率,丰富核桃蛋白的产业应用,增加核桃产业的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于多肽产品技术领域,具体涉及一种具有良好乳化性能的核桃多肽及其制备方法。
背景技术
我国是世界上核桃栽培面积最大、种植株树最多、产量最高的国家。2018年,我国的核桃产量高达158.63万吨,占世界核桃总产量的45%。核桃粕是核桃榨油后的副产物,脱脂核桃粕中含有50%~60%的蛋白质。核桃蛋白中不仅含有8种人体必需氨基酸,半必需氨基酸含量也较为丰富。目前的核桃粕主要用作饲料和肥料,或被直接丢弃,造成大量核桃优质蛋白资源浪费,利用率和经济效益均比较低。
生物活性肽是指具有功效的生物活性蛋白质的特定部分,当被摄入时会赋予食用者积极的健康效果。多肽在生理功能上优于氨基酸和蛋白质,是一种能部分替代氨基酸和蛋白质等营养物质的食品。目前,有关生物活性肽的制备方法主要有以下几种:(1)化学水解法:利用酸或碱溶液促使蛋白质分子中的肽键断裂,从而形成小分子多肽,包括酸水解法和碱水解法。(2)蛋白酶水解法:利用催化蛋白水解的酶来将蛋白酶解为小分子多肽。化学水解法过程不易控制,生产的多肽产品质量不稳定。蛋白酶水解法操作简单,活性多肽产量较多,可以进行大规模生产,在实际应用中较为普遍。
目前对核桃多肽的研究多集中在ACE抑制肽、抗氧化肽、抗疲劳肽等方面,例如:CN109810177A公开了一种具有ACE抑制活性的核桃粕多肽的制备方法,所述多肽可作为ACE抑制剂和制备降血压药物;CN106520872A公开了一种具有抗疲劳功效的核桃低聚多肽,其中85%以上核桃低聚肽的分子量小于1500Da。
发明内容
本发明的目的在于通过对核桃蛋白的限制性酶解,提供一种乳化性能和稳定性良好的核桃多肽,同时为其提供一种制备方法,以解决现有核桃多肽制备工艺复杂、乳化性低等问题。
本发明所提供的具有良好乳化性能的核桃多肽是氨基酸序列为Glu-Lys-Val-Ser-Tyr-Asp-His-Cys-Ile-Met-Ser-Leu-Asp、Gly-Gln-Phe-His-Ala-Trp-Lys-Asn-Pro-Asn-Thr-Met-Ser和Asp-Glu-His-Val-Leu-Lys-Phe-Gly-Met-Thr-Cys的多肽混合物,各多肽占核桃多肽的质量百分比依次为30%~40%、20%~30%、35%~45%。
上述具有良好乳化性的核桃多肽的制备方法由下述步骤组成:
1、核桃蛋白的提取
(1)脱脂:将核桃粕过100目筛后,按料液比为1g:4~8mL加入石油醚中,于室温下脱脂后自然晾干,得到脱脂核桃粕。
(2)碱提酸沉:按料液比为1g:12~20mL,将脱脂核桃粕加入去离子水中,用1mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH值至10~12,50~55℃搅拌使蛋白充分溶解后,冷却至室温,离心分离,用1mol/L的HCl水溶液将上清液pH值调至4~5,静置沉淀后离心,用去离子水洗涤沉淀至中性,经真空冷冻干燥后得到核桃蛋白。
2、核桃蛋白的酶解
按料液比为0.8~1.2g:100mL,将核桃蛋白溶于去离子水,用0.5mol/L NaOH水溶液调节溶液pH至7.5~8.5,加入胰蛋白酶进行限制性酶解;酶解过程中实时监控反应液pH值,不断使用0.5mol/L NaOH水溶液调节反应液pH值,使反应液pH值与初始pH值保持一致;酶解完后置于沸水浴中8~10min灭活酶,然后迅速冷却至室温,调节溶液pH值至7.0,离心取上清液得到核桃蛋白酶解液。
3、核桃蛋白酶解产物的分离纯化
(1)超滤分离:使用孔径0.45μm的微孔滤膜对核桃蛋白酶解液过滤,然后采用1kDa、3kDa、5kDa的超滤膜依次进行分离,收集3~5kDa的组分,冷冻干燥。
(2)葡聚糖凝胶G-25凝胶层析:将冷冻干燥后的组分用去离子水配制成核桃多肽液,经0.45μm的微孔滤膜进行过滤,去除杂质后,采用葡聚糖凝胶G-25凝胶进行上样,洗脱液为蒸馏水,洗脱流速为1mL/min,收集保留时间在12~15min的组分,将该组分真空冷冻干燥即得到乳化性能良好的核桃多肽。
上述步骤2中,优选所述胰蛋白酶的加入量为核桃蛋白质量的4%~6%。
上述步骤2中,优选所述限制性酶解的温度为35~40℃,时间为2~4小时。
上述步骤3中,所述超滤膜材质为再生纤维素,滤膜直径为44.5mm。
本发明的有益效果如下:
1、本发明以核桃粕为原料,可以变废为宝,提高核桃蛋白的利用率,丰富核桃蛋白的产业应用,增加核桃产业的经济效益。
2、本发明得到的核桃多肽的分子量在3~5kDa,此多肽的乳化性能和稳定性良好,为新型多肽乳化剂的开发提供理论依据,拓宽核桃蛋白的应用领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明,但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、核桃蛋白的提取
(1)脱脂:将核桃粕过100目筛后,按料液比为1g:5mL加入石油醚中,于室温下脱脂2h,重复脱脂3次,过夜自然晾干,得到脱脂核桃粕。
(2)碱提酸沉:按料液比为1g:15mL,将脱脂核桃粕加入去离子水中,用1mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH值至11,53℃磁力搅拌1.5h使蛋白充分溶解,冷却至室温后5000r/min离心5min,用1mol/L的HCl水溶液将上清液pH值调至4.5,静置沉淀1h后离心,用去离子水洗涤沉淀至中性,经真空冷冻干燥后得到核桃蛋白。
2、核桃蛋白的酶解
按料液比为1g:100mL,将核桃蛋白溶于去离子水,磁力搅拌1h,用0.5mol/LNaOH水溶液调节溶液pH至8.0,加入核桃蛋白质量5%的胰蛋白酶,在37℃下进行限制性酶解。用pH计实时监控反应液pH值,酶解过程中不断使用0.5mol/L NaOH水溶液调节反应液pH值,使反应液pH值与初始pH值保持一致。分别酶解2h、3h、4h、后,置于90℃沸水浴中10min灭活酶。然后迅速冷却至室温,调节溶液pH值至7.0,离心取上清液得到核桃蛋白酶解液,置于4℃保存。
3、核桃蛋白酶解产物的分离
(1)超滤分离:使用孔径0.45μm的微孔滤膜对核桃蛋白酶解液过滤,然后采用1kDa、3kDa、5kDa的超滤膜(材质为再生纤维素,滤膜直径为44.5mm)依次进行分离,将核桃蛋白酶解液分为:<1kDa、1~3kDa、3~5kDa和>5kDa四种级分,分别测定各级分的乳化性及乳化稳定性,测定结果见表1。
乳化及乳化稳定性的测定方法参考金凤等人的方法,具体如下:
准确称取100mg样品分散于去离子水中,配制为10mg/mL的样品溶液。取6mL样品溶液加入2mL核桃油或漆籽油,使用高剪切分散乳化机均质3min,立即从溶液底部移取50μL样品,加入5mL SDS(0.1%,w/v)溶液后,涡旋震荡5s,在500nm处测定样品吸光值。将乳液置于室温条件下静置10min后再次取样。测定样品的乳化稳定性。乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)的计算公式如下:
表1不同酶解时间超滤得到的四种级分的乳化及乳化稳定性测定结果
由表1可以看出,胰蛋白酶酶解3h得到的3~5kDa的级分乳化及乳化稳定性最高,将乳化及乳化稳定性最高的超滤级分冷冻干燥,进一步采用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析纯化。
(2)葡聚糖凝胶G-25凝胶层析:将冷冻干燥后的样品用去离子水配制成浓度为150mg/mL的样品溶液液,经0.45μm的微孔滤膜进行过滤,去除杂质后,准确量取5mL样品溶液进行上样,洗脱液为蒸馏水,洗脱流速设定为1mL/min,在280nm波长处测定其吸光度。根据洗脱图谱,将在同一洗脱峰下的多肽液合并收集,得到5个多肽组分,测定其乳化性及乳化稳定性。测定结果见表2。
表2葡聚糖凝胶G-25凝胶层析得到的多肽组分的乳化及乳化稳定性测定结果
由表2可以看出,酶解3h超滤分离得到的3~5kDa级分经葡聚糖凝胶G-25凝胶层析得到的组分2的乳化及乳化稳定性最高,该组分的乳化性EAI(m2/g)=148.39,乳化稳定性ESI(%)=91.24。所述的组分2即为本发明具有良好乳化性能的核桃多肽。
参考段娜娜等人的方法对组分2进行序列鉴定,具体方法为:利用含0.1%(v/v)三氟乙酸的水溶液将组分2复溶(组分2浓度为10mg/mL),并用液相色谱仪与质谱仪直接相连,用构成的液质联用系统对样品进行梯度洗脱分离。上样量5μL,以150mm×75μm的熔融石英毛细管柱与C18树脂组合形成分析柱,流动相A为含0.1%(v/v)甲酸的水溶液,流动相B是含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液,洗脱梯度:0~60min,流动相A:90%~40%,流动相B:10%~60%,洗脱流速为0.25μL/min。MS使用单一全扫描质谱Orbitrap,并通过软件Xcalibur 2.2采集数据。用LC-MS/MS图谱检索UniProt数据库,得到核桃多肽序列。结果表明,此多肽为Glu-Lys-Val-Ser-Tyr-Asp-His-Cys-Ile-Met-Ser-Leu-Asp和Gly-Gln-Phe-His-Ala-Trp-Lys-Asn-Pro-Asn-Thr-Met-Ser、Asp-Glu-His-Val-Leu-Lys-Phe-Gly-Met-Thr-Cys的混合物,其各自占混合物质量的百分比为35%、25%、40%。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种具有良好乳化性能的核桃多肽及其制备方法
<140> 2021115486614
<141> 2021-12-17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Lys Val Ser Tyr Asp His Cys Ile Met Ser Leu Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Gln Phe His Ala Trp Lys Asn Pro Asn Thr Met Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Glu His Val Leu Lys Phe Gly Met Thr Cys
1 5 10
Claims (5)
1.一种具有良好乳化性能的核桃多肽,其特征在于:所述核桃多肽是氨基酸序列为Glu-Lys-Val-Ser-Tyr-Asp-His-Cys-Ile-Met-Ser-Leu-Asp、Gly-Gln-Phe-His-Ala-Trp-Lys-Asn-Pro-Asn-Thr-Met-Ser和Asp-Glu-His-Val-Leu-Lys-Phe-Gly-Met-Thr-Cys的多肽混合物,各多肽占核桃多肽的质量百分比依次为30%~40%、20%~30%、35%~45%。
2.一种权利要求1所述的具有良好乳化性能的核桃多肽的制备方法,其特征在于所述方法由下述步骤组成:
(1)核桃蛋白的提取
①脱脂:将核桃粕过100目筛后,按料液比为1g:4~8mL加入石油醚中,于室温下脱脂后自然晾干,得到脱脂核桃粕;
②碱提酸沉:按料液比为1g:12~20mL,将脱脂核桃粕加入去离子水中,用1mol/L的NaOH水溶液调节溶液的pH值至10~12,50~55℃搅拌使蛋白充分溶解后,冷却至室温,离心分离,用1mol/L的HCl水溶液将上清液pH值调至4~5,静置沉淀后离心,用去离子水洗涤沉淀至中性,经真空冷冻干燥后得到核桃蛋白;
(2)核桃蛋白的酶解
按料液比为0.8~1.2g:100mL,将核桃蛋白溶于去离子水,用0.5mol/L NaOH水溶液调节溶液pH至7.5~8.5,加入胰蛋白酶进行限制性酶解;酶解过程中实时监控反应液pH值,不断使用0.5mol/L NaOH水溶液调节反应液pH值,使反应液pH值与初始pH值保持一致;酶解完后置于沸水浴中8~10min灭活酶,然后迅速冷却至室温,调节溶液pH值至7.0,离心取上清液得到核桃蛋白酶解液;
(3)核桃蛋白酶解产物的分离纯化
①超滤分离:使用孔径0.45μm的微孔滤膜对核桃蛋白酶解液过滤,然后采用1kDa、3kDa、5kDa的超滤膜依次进行分离,收集3~5kDa的组分,冷冻干燥;
②葡聚糖凝胶G-25凝胶层析:将冷冻干燥后的组分用去离子水配制成核桃多肽液,经0.45μm的微孔滤膜进行过滤,去除杂质后,采用葡聚糖凝胶G-25凝胶进行上样,洗脱液为蒸馏水,洗脱流速为1mL/min,收集保留时间在12~15min的组分,将该组分真空冷冻干燥即得到乳化性能良好的核桃多肽。
3.根据权利要求2所述的具有良好乳化性能的核桃多肽的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述胰蛋白酶的加入量为核桃蛋白质量的4%~6%。
4.根据权利要求2所述的具有良好乳化性能的核桃多肽的制备方法,其特征在于:步骤(2)中,所述限制性酶解的温度为35~40℃,时间为2~4小时。
5.根据权利要求2所述的具有良好乳化性能的核桃多肽的制备方法,其特征在于:步骤(3)中,所述超滤膜材质为再生纤维素,滤膜直径为44.5mm。
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