TWI817084B - 膠原蛋白的製備方法 - Google Patents
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Abstract
一種膠原蛋白的製備方法，包含：(a)將雞軟骨切分為最大截面積不大於1.5 cm×1.5 cm的雞軟骨片；(b)使雞軟骨片在酸性環境下進行蛋白酶水解處理，獲得含有經水解的雞軟骨片及以第一型膠原蛋白為主之第一水解液的第一混合物；(c)將該等經水解的雞軟骨片取出並浸泡至乙醇溶液，以獲得數個經乙醇處理的雞軟骨片；(d)將該等經乙醇處理的雞軟骨片取出並浸泡至酸液中，得到第三混合物；(e)使該第三混合物進行粉碎；及(f)使該經粉碎的第三混合物進行蛋白酶水解處理，獲得以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。本發明方法同時可獲得高純度的第一型與第二型膠原蛋白。
Description
本發明是有關於一種膠原蛋白的製備方法，特別是指一種同時可獲得高純度的第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白的膠原蛋白製備方法。
膠原蛋白為人體內非常重要的一種蛋白質，主要存在於結締組織的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)內。其功能除了是細胞外基質的主要組成外，還具備使皮膚擁有彈性光澤、讓骨骼堅硬、保護內臟、強固毛髮等功能，因此，膠原蛋白也成為熱門研究對象。膠原蛋白可取自從動物皮膚、筋腱、骨骼、軟骨、血管等組織，目前已發現有二十多種不同的膠原蛋白，這些膠原蛋白分別由不同多胜肽組成。不同組織的膠原蛋白種類也各不相同，例如皮膚、肌腱、韌帶主要是第一型和第三型的混合，而椎間盤和多數軟骨主要為第二型，腎及血管管壁則為第四型膠原蛋白。
中國專利公開案CN 102702346A提出一種從魚皮中提取酸溶性膠原蛋白的方法，主要是利用醋酸水溶液處理除脂肪魚皮65~80小時，再經離心後得到膠原蛋白提取液；之後再利用氯化鈉晶體對該提取液進行鹽析而獲得酸溶性膠原蛋白。此專利公開案所製得的膠原蛋白可能存有魚腥味而影響口感或後續應用，且並未就所獲得的膠原蛋白類型進行深入研究。
美國專利公告US 5,840,848提供一種由脊椎動物來源之無肉無骨膠原組織獲得實質上無第一型膠原蛋白及其他不純物的第二型膠原蛋白的方法，包含：在攪拌下使該組織接觸含有一酸性蛋白酶的酸溶液一段時間，以取得實質上不含第一型膠原蛋白的組織；之後於攪拌下使該組織接觸一包含中性蛋白酶的中性pH值溶液一段時間，以獲得第二型膠原蛋白。此專利公告雖然是使用不會有腥味的雞胸骨，仍需要花費至少65小時的時間，且未就第一型膠原蛋白進行回收作業。
由前述說明可知，針對有效縮短時間，並同時獲取高純度的第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白的製備方法，仍有待持續研發。
因此，本發明的目的，即在提供一種可於較短時間內同時獲得高純度的第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白的製備方法。
於是，本發明膠原蛋白的製備方法，包含以下步驟：
(a) 將數個雞軟骨切分為數個最大截面積不大於1.5 cm×1.5 cm的雞軟骨片；
(b) 使該等雞軟骨片在一酸性環境下進行一使用一蛋白酶的水解處理，以獲得一第一混合物，該第一混合物含有數個經水解的雞軟骨片以及一以第一型膠原蛋白為主的第一水解液；
(c) 將該等經水解的雞軟骨片自該第一混合物中取出並浸泡至一乙醇溶液中而使得殘餘的第一型膠原蛋白被沉澱，以獲得一第二混合物，該第二混合物含有數個經乙醇處理的雞軟骨片以及一以殘餘的第一型膠原蛋白為主的沉澱液；
(d) 將該等經乙醇處理的雞軟骨片取出並浸泡至一酸液中，得到一第三混合物；
(e) 使該第三混合物進行粉碎，以使每個經乙醇處理的雞軟骨片具有不大於1 mm×1 mm的最大截面積，並得到一經粉碎的第三混合物；及
(f) 使該經粉碎的第三混合物進行一使用一蛋白酶的水解處理，以獲得一以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。
本發明的功效在於：本發明製備方法使用雞軟骨、同時透過二階段調控雞軟骨的最大截面積範圍，以利於縮短時間，並在分離出第一型膠原蛋白後，將經水解的雞軟骨浸泡在乙醇溶液中，使剩餘的第一型膠原蛋白及其餘雜質沉澱，進而取得高純度的第二型膠原蛋白。
以下就本發明內容進行詳細說明：
本文中所使用的「最大截面積」泛指橫截面的最大面積。
步驟(a)
步驟(a)的雞軟骨主要是取自與雞胸肉連接的雞軟骨，在使用前必須先清洗雞軟骨，再清除雞軟骨上殘留的肉，以獲得表面不存在雞肉的雞軟骨。接著，取數個經過上述清潔後的雞軟骨進行切分並得到數個雞軟骨片，且每個雞軟骨片的最大截面積不大於1.5 cm×1.5 cm。前述的切分方式可選用任何可以將雞軟骨切分為雞軟骨片的器械，例如果汁機、食物調理機、刀具等。
較佳地，該製備方法還包含一個於該步驟(a)之前的步驟(a0)，該步驟(a0)是使該等雞軟骨進行殺菌。於本發明的具體例中，該步驟(a0)是將經清洗及清除表面上殘留肉的雞軟骨進行殺菌。該殺菌方式可以參照任何適用於雞肉處理所採用的殺菌方式，例如將雞軟骨放置於過氧化氫溶液中進行除菌，該過氧化氫溶液的濃度範圍為2~10 vol%。
步驟(b)
較佳地，該步驟(b)是使該等雞軟骨片放置於一酸液中，再於酸液中加入蛋白酶進行水解處理，而獲得該第一混合物。上述的酸液例如但不限於鹽酸、檸檬酸、醋酸、乳酸等，可以單獨使用或組合使用，亦可混合以任何用來稀釋酸的試劑，例如但不限於水、乙醇等。該酸液的濃度可以依據實際使用進行調整變化，較佳地，該酸液的濃度範圍為0.01 N~0.1 N。較佳地，該步驟(b)的水解時間為不小於16小時。於本發明的具體例中，該步驟(b)的水解時間為24小時。
或者可選擇地，該步驟(b)是將蛋白酶與酸液進行混合並形成一酵素液，之後再將該酵素液與該等雞軟骨片進行混合及水解處理。該酵素液的蛋白酶濃度可以依據實際使用進行調整變化，較佳地，該酵素液的蛋白酶濃度範圍為2 mg/mL~6 mg/mL。上述的蛋白酶可使用任何適用於膠原蛋白水解處理的蛋白酶；較佳地，該蛋白酶是選自於複合蛋白酶(Protamex)、鹼性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶(Trypsin)、鳳梨蛋白酶(Bromelain)、木瓜蛋白酶(Papain)、風味蛋白酶(Flavourzyme)、胃蛋白酶(Pepsin)或前述的組合。於本發明的一具體例中，該蛋白酶為胃蛋白酶。
較佳地，該製備方法還包含一個於該步驟(b)之後的步驟(b1)，該步驟(b1)是自該第一混合物分離出該以第一型膠原蛋白為主的第一水解液並進行冷凍乾燥，以取得第一型膠原蛋白。
步驟(c)
該步驟(c)是將該第一混合物中的該等經水解的雞軟骨片取出，之後再浸泡至一乙醇溶液中，得到第二混合物。此步驟所使用的乙醇溶液的濃度範圍為75~95 vol%。較佳地，該乙醇溶液的濃度範圍為90~95 vol%。於本發明的具體例中，該乙醇溶液的濃度為95 vol%。較佳地，該步驟(c)的浸泡時間為不小於16小時。於本發明的具體例中，該步驟(c)的浸泡時間為24小時。
步驟(d)
該步驟(d)是將該第二混合物中的該等經乙醇處理的雞軟骨片取出，之後再浸泡至一酸液中，得到第三混合物。此步驟所使用的酸液與前述步驟(b)中所提及酸液的範圍一致，但步驟(b)的酸液與步驟(d)的酸液可為相同或不同。
步驟(e)
步驟(e)是將第三混合物進行粉碎，使每個經乙醇處理的雞軟骨片具有不大於1 mm×1 mm的最大截面積，並得到一經粉碎第三混合物。其中，步驟(e)的粉碎方式是使用均質機，不過步驟(e)同樣可運用果汁機、食物調理機、刀具等方式進行，也能達到相似的效果。
步驟(f)
步驟(f)是使該經粉碎的第三混合物與蛋白酶混合並進行水解處理，以自該經粉碎的第三混合物中取得第二型膠原蛋白，並獲得一以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。步驟(f)所使用的蛋白酶如前述步驟(b)所提及蛋白酶範圍一致，但步驟(b)的蛋白酶與步驟(f)的蛋白酶可為相同或不相同。
較佳地，該製備方法還包含一個於該步驟(f)之後的步驟(f1)，該步驟(f1)是將該第二水解液加入氫氧化鈉溶液進行酸鹼中和，以取得一以第二型膠原蛋白為主的中性水解液。此步驟所使用的氫氧化鈉溶液的濃度範圍為0.01 N~0.05 N。
較佳地，該製備方法還包含一個於該步驟(f1)之後的步驟(f2)，該步驟(f2)是將該中性水解液進行冷凍乾燥，以取得第二型膠原蛋白。
本發明將就以下實施例作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
[ 實施例 1]原料來源及前置處理：取1 kg的雞軟骨原料，清除雞軟骨表面的殘留肉，獲得表面無肉的雞軟骨。接著進行以下的製備步驟：
(a0) 將上述經過清洗且清除表面上殘留肉的雞軟骨放置於1 L的過氧化氫水溶液(濃度為5 vol%)中進行除菌20分鐘；然後再用水清洗經除菌的雞軟骨，以去除過氧化氫。
(a) 將300 g的上述步驟(a0)經除菌的雞軟骨放入果汁機中進行切分並得到數個雞軟骨片。每個雞軟骨片的最大截面積皆不大於1.5 cm×1.5 cm。
(b) 將0.065 N的檸檬酸溶液與胃蛋白酶(pepsin)(購自Sigma-Aldrich公司)進行混合並形成濃度為5 mg/mL的酵素液。將900 mL的酵素液與上述步驟(a)的該等雞軟骨片進行攪拌混合及水解處理歷時24小時，藉此得到第一混合物。該第一混合物含有數個經水解的雞軟骨片以及以第一型膠原蛋白為主的第一水解液。
(b1) 將該第一混合物中的該等經水解的雞軟骨片以及該以第一型膠原蛋白為主的第一水解液分離，並於-80℃下對該以第一型膠原蛋白為主的第一水解液進行冷凍乾燥，以取得90 g (產率為9%)的第一型膠原蛋白。
[註：該第一型膠原蛋白的產率(%)是藉由在步驟(b1)將所得到的第一型膠原蛋白的重量除以雞軟骨原料的重量(1 kg)而得到]。
(c) 將自該第一混合物中分離得到的該等經水解的雞軟骨片浸泡於一乙醇溶液(濃度為95 vol%)中而使得殘餘的第一型膠原蛋白被沉澱，以獲得一第二混合物，該第二混合物含有數個經乙醇處理的雞軟骨片以及一以殘餘的第一型膠原蛋白為主的沉澱液。
(d) 將該等經乙醇處理的雞軟骨片取出並浸泡至600 mL的檸檬酸水溶液(濃度為0.065 N)中，得到第三混合物。
(e) 將該第三混合物放置於均質機(IKA公司製造，型號為T 50 basic ULTRA-TURRAX
®)中進行粉碎，以使每個經乙醇處理的雞軟骨片具有不大於1 mm×1 mm的最大截面積，藉此得到經粉碎的第三混合物。
(f) 使200g的該經粉碎的第三混合物與600 mL的胃蛋白酶水溶液(濃度為5 mg/mL)進行攪拌混合及水解處理歷時24小時，藉此得到以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。
(f1) 將該以第二型膠原蛋白為主的第二水解液加入0.025 N氫氧化鈉進行酸鹼中和，以取得以第二型膠原蛋白為主的中性水解液。
(f2) 將該以第二型膠原蛋白為主的中性水解液於-80℃下進行冷凍乾燥，以取得60 g (產率為6%)的第二型膠原蛋白。
[註：該第二型膠原蛋白的產率(%)是藉由將在步驟(f2)所得到的第二型膠原蛋白的重量除以雞軟骨原料的重量(1 kg)而得到]。
[
比較例
1]
為供比較，在本比較例1中，申請人進一步參考上面實施例1當中所述的方法來進行第一型膠原蛋白以及第二型膠原蛋白的製備，不同之處在於：比較例1的製備方法中並未對(b1)所得到的經水解的雞軟骨片進行乙醇處理，而是直接浸泡於檸檬酸水溶液中。其詳細步驟如下：
原料來源及前置處理：以水清洗數個雞軟骨，之後清除雞軟骨表面的殘留肉，獲得表面無肉的雞軟骨。接著進行以下的製備步驟：
(a0) 將上述經過清洗且清除表面上殘留肉的雞軟骨放置於1 L的過氧化氫水溶液(濃度為5 vol%)中進行除菌20分鐘；然後再用水清洗經除菌的雞軟骨，以去除過氧化氫。
(a) 將300 g的上述步驟(a0)經除菌的雞軟骨放入果汁機中進行切分並得到數個雞軟骨片。每個雞軟骨片的最大截面積皆不大於1.5 cm×1.5 cm。
(b) 將0.065 N的檸檬酸溶液與胃蛋白酶進行混合並形成濃度為5 mg/mL的酵素液。將900 mL的酵素液與上述步驟(a)的該等雞軟骨片進行攪拌混合及水解處理歷時24小時，藉此得到第一混合物。該第一混合物含有數個經水解的雞軟骨片以及以第一型膠原蛋白為主的第一水解液。
(b1) 將該第一混合物中的該等經水解的雞軟骨片以及該以第一型膠原蛋白為主的第一水解液分離，並於-80℃下對該以第一型膠原蛋白為主的第一水解液進行冷凍乾燥，以取得90 g (產率為9%)(計算方法同上述)的第一型膠原蛋白。
(c) 將自該第一混合物中分離得到的該等經水解的雞軟骨片浸泡於600 mL的檸檬酸水溶液(濃度為0.065 N)中，得到第二混合物。
(d) 將該第二混合物放置於均質機中進行粉碎，以使每個經水解的雞軟骨片具有不大於1 mm×1 mm的最大截面積，藉此得到經粉碎的第二混合物。
(e) 使200 g的該經粉碎的第二混合物與600 mL的胃蛋白酶水溶液(濃度為5 mg/mL)進行攪拌混合及水解處理歷時24小時，藉此得到以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。
(e1) 將該以第二型膠原蛋白為主的第二水解液加入0.025 N氫氧化鈉溶液進行酸鹼中和，以取得以第二型膠原蛋白為主的中性水解液。
(e2) 將該以第二型膠原蛋白為主的中性水解液於-80℃下進行冷凍乾燥，以取得60 g (產率為6%)(計算方法同上述)的第二型膠原蛋白。
[
蛋白質電泳分析
1]
分別取0.1 g的前述實施例1的步驟(b1)所獲得的第一型膠原蛋白及步驟(f2)所獲得的第二型膠原蛋白溶解於1 mL的水中，接著使用Bio-Rad電泳系統來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析，以及使用一濃度為3 mg/mL的考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)溶液來對所得到的電泳膠片進行染色，結果如圖1。
取0.1 g的前述比較例1的步驟(e2)所獲得的第二型膠原蛋白溶解於1 mL的水中，接著進行如上所述的SDS-PAGE分析以及使用考馬斯亮藍溶液(同上述)來對所得到的電泳膠片進行染色，結果如圖2。
於圖1中，中間為蛋白質分子量標記(marker)，左側的膠徑為第一型膠原蛋白分析結果，右側的膠徑為第二型膠原蛋白分析結果。其中，左側的膠徑顯示有第一型膠原蛋白中所含有的膠原蛋白α1鏈(130 kDa)及膠原蛋白α2鏈(110 kDa)；相較之下，右側的膠徑僅顯示有第二型膠原蛋白中所含有的膠原蛋白α鏈(130 kDa)。由此可見，藉由本發明的方法確實能夠製備得到高純度的第一型膠原蛋白以及第二型膠原蛋白。
於圖2中，左側為蛋白質分子量標記，右側為第二型膠原蛋白分析結果。其中，右側的膠徑顯示除了含有第二型膠原蛋白的膠原蛋白α鏈以外，還含有第一型膠原蛋白的膠原蛋白α2鏈與其他雜蛋白。
比較上述圖1與圖2的第二型膠原蛋白結果可知，本發明製備方法的實驗例1中，步驟(c)將該等經水解的雞軟骨片浸泡至該乙醇溶液中，可使該等經水解的雞軟骨片上殘餘的第一型膠原蛋白及其餘雜蛋白發生沉澱，進而提高步驟(f)所獲得的第二型膠原蛋白的純度，因此本發明確實能同時獲得高純度的第一型膠原蛋白與第二型膠原蛋白。
[
測試例
1]
由於在醇類當中，能被人體安全吸收的種類不多，為了測試該等可食用的醇類在沉澱殘餘的第一型膠原蛋白上的能力，在本測試例1中，申請人進一步參考前述實施例1的步驟(a0)至步驟(c)來進行殘餘的第一型膠原蛋白的沉澱，並將步驟(c)中所使用的該乙醇溶液置換為己六醇溶液(濃度為95 vol%)，以獲得一己六醇第二混合物，該己六醇第二混合物含有數個經己六醇處理的雞軟骨片以及一以殘餘的第一型膠原蛋白為主的第一測試沉澱液。
[
測試例
2]
在本測試例2中，申請人進一步參考前述實施例1的步驟(a0)至步驟(c)來進行殘餘的第一型膠原蛋白的沉澱，並將步驟(c)中所使用的該乙醇溶液置換為丙三醇溶液(濃度為95 vol%)，以獲得一丙三醇第二混合物，該丙三醇第二混合物含有數個經丙三醇處理的雞軟骨片以及一以殘餘的第一型膠原蛋白為主的第二測試沉澱液。
[
蛋白質濃度分析
]
對該實驗例1、測試例1及測試例2中所得到的該沉澱液、該第一測試沉澱液及該第二測試沉澱液分別取1 mL來進行離心。接著將該沉澱液的沉澱物利用90 vol%的乙醇稀釋300倍，將該第一測試沉澱液的沉澱物利用90 vol%的己六醇稀釋300倍，以及將該第二測試沉澱液的沉澱物利用90 vol%的丙三醇稀釋300倍。
對稀釋後的沉澱物各取1 mL，使用一BCA蛋白質分析套組(Thermo Fisher Scientific)並依據製造商的操作指南來進行蛋白質濃度的分析，並利用分光光譜儀(BioTek公司製造-ELx808)測試各沉澱物稀釋液在562 nm的波長下的吸光值(OD
562)，藉此計算得到各沉澱物稀釋液中所含有的殘餘的第一型膠原蛋白的濃度。上述實驗被重複3次，結果如表1。
從表1中比較的結果可知，將該等經水解的雞軟骨片被乙醇所沉澱下來的殘餘第一型膠原蛋白之濃度最高，因此推知，在可食用的各種醇類中，乙醇具有最佳能沉澱殘餘第一型膠原蛋白的能力。
表1、不同醇類所沉澱得到的殘餘的第一型膠原蛋白濃度
| 分析樣品 (離心後沉澱物) | 第一測試沉澱液(己六醇) | 第二測試沉澱液(丙三醇) | 沉澱液 (乙醇) |
| 第一型膠原蛋白濃度(mg/mL) | 14.11±2.49 | 16.13±0.928 | 53.11±1.54 |
[
測試例
3
至
7
]
為了測試步驟(c)中的乙醇濃度對於所得到的第二型膠原蛋白純度的影響，在本測試例3至7中，申請人進一步參考前述實施例1當中所述的方法來進行第二型膠原蛋白的製備，不同之處在於：在測試例3至7中，將步驟(c)中所使用的該乙醇溶液(濃度95 vol%)分別置換為濃度90、85、80、75以及70 vol%的乙醇溶液，繼而在步驟(f2)分別獲得測試例3至7的5個測試蛋白(主要為第二型膠原蛋白)。
[
蛋白質電泳分析
2]
取0.1 g的前述測試例3至7的測試蛋白以及0.1 g的前述實施例1的第二型膠原蛋白，分別溶解於1 mL的水中，接著參考上面[蛋白質電泳分析1]當中所述的方法來進行SDS-PAGE分析以及考馬斯亮藍溶液染色，結果如圖3。
於圖3中，膠徑由左至右分別為：蛋白質分子量標記、實施例1的第二型膠原蛋白，以及測試例3至7的測試蛋白。
根據圖3可知，當本發明製備方法的步驟(c)中使用的乙醇溶液濃度越高，所得到的第二型膠原蛋白越多，而殘餘的第一型膠原蛋白則越少，並且在乙醇溶液濃度為90%~95 vol%時可以獲得最佳純度的第二型膠原蛋白。
綜上所述，本發明製備方法使用雞軟骨、同時透過二階段調控雞軟骨的最大截面積範圍，以利於縮短時間，並在分離出第一型膠原蛋白後，將經水解的雞軟骨浸泡在乙醇溶液中，使剩餘的第一型膠原蛋白及其餘雜質沉澱，進而取得高純度的第二型膠原蛋白，故確實能達成本發明的目的。
惟以上所述者，僅為本發明的實施例而已，當不能以此限定本發明實施的範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作的簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋的範圍內。
本發明的其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：
圖1是藉由本發明膠原蛋白的製備方法的實施例1所製備得到的第一型膠原蛋白以及第二型膠原蛋白的電泳分析結果，其中膠徑由左至右分別為第一型膠原蛋白、蛋白質分子量標記(245至100 kDa)以及第二型膠原蛋白；
圖2是藉由比較例1的方法所製備得到的第二型膠原蛋白的電泳分析結果，其中膠徑由左至右分別為蛋白質分子量標記(245至75 kDa)以及第二型膠原蛋白；及
圖3是分別藉由實施例1以及測試例3至7的方法所製備得到的第二型膠原蛋白以及測試蛋白的電泳分析結果，其中膠徑由左至右分別為實施例1所得到的第二型膠原蛋白、測試例3所得到的第一測試蛋白、測試例4所得到的第二測試蛋白及測試例5所得到的第三測試蛋白。
Claims (10)
- 一種膠原蛋白的製備方法，包含以下步驟： (a) 將數個雞軟骨切分為數個最大截面積不大於1.5 cm×1.5 cm的雞軟骨片； (b) 使該等雞軟骨片在一酸性環境下進行一使用一蛋白酶的水解處理，以獲得一第一混合物，該第一混合物含有數個經水解的雞軟骨片以及一以第一型膠原蛋白為主的第一水解液； (c) 將該等經水解的雞軟骨片自該第一混合物中取出並浸泡至一乙醇溶液中而使得殘餘的第一型膠原蛋白被沉澱，以獲得一第二混合物，該第二混合物含有數個經乙醇處理的雞軟骨片以及一以殘餘的第一型膠原蛋白為主的沉澱液； (d) 將該等經乙醇處理的雞軟骨片取出並浸泡至一酸液中，得到一第三混合物； (e) 使該第三混合物進行粉碎，以使每個經乙醇處理的雞軟骨片具有不大於1 mm×1 mm的最大截面積，並得到一經粉碎的第三混合物；及 (f) 使該經粉碎的第三混合物進行一使用一蛋白酶的水解處理，以獲得一以第二型膠原蛋白為主的第二水解液。
- 如請求項1所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(c)的該乙醇溶液濃度範圍為75 vol%~95 vol%。
- 如請求項2所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(c)的該乙醇溶液濃度範圍為90 vol%~95 vol%。
- 如請求項1所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(b)與該步驟(f)的蛋白酶為相同或不同且各自選自於複合蛋白酶、鹼性蛋白酶、胰蛋白酶、鳳梨蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶或前述的組合。
- 如請求項1所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(b)是將該蛋白酶與一酸液混合並形成一酵素液，之後再將該酵素液與該等雞軟骨片進行混合及水解處理。
- 如請求項5所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該酵素液中蛋白酶的濃度範圍為2 mg/mL~6 mg/mL。
- 如請求項1或5所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該酸液是選自於檸檬酸、鹽酸、醋酸、乳酸或前述的組合。
- 如請求項7所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該酸液的濃度範圍為0.05 N~0.1 N。
- 如請求項1所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(b)及該步驟(f)的水解處理時間為不小於16小時。
- 如請求項1所述的膠原蛋白的製備方法，其中，該步驟(c)將該等經水解的雞軟骨片浸泡於該乙醇溶液的時間為不小於16小時。
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