CN107164439A - 一种适用于化妆品的鱼鳞ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法 - Google Patents
一种适用于化妆品的鱼鳞ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法。以海洋鱼类鱼鳞或部分淡水鱼类鱼鳞为原料，预处理采用碱溶液快速脱脂，酸溶液快速脱钙，而后，经过生物酶解技术，将预处理得到的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白固体直接制备成为Ⅰ型胶原蛋白肽浓缩液，提取率≥97％；再利用连续流离心协同膜分离技术在常温下对酶解液分离、纯化和除盐，得到含量≥95％的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽液体，最后利用喷雾干燥技术快速干燥形成特殊中空结构的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球，并利用光辐射技术快速灭菌密封保存。本发明方法将鱼鳞中Ⅰ型胶原蛋白近乎100％的变为Ⅰ型胶原蛋白肽浓缩液；制备的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽呈现微球状，颗粒尺寸均匀，集中在1～10μm之间的微米级别。
Description
技术领域
本发明涉及到一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，属于生物提取技术与化妆品领域。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌腱韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护肌体的功能，具有很强的生物活性和生物功能。胶原蛋白肽(collagen peptide)是胶原蛋白(collagen)的水解物，是多肽或小肽混合物。无论在食品保健、生物医学还是在化妆品等行业中，胶原蛋白肽具有广泛的应用和巨大的市场价值。在食品应用方面，胶原蛋白肽不仅可作为功能性食品，而且可以作为肉制品改良剂，还可以作为食品包装材料——人工肠衣和可食性蛋白膜。
特别是在化妆品方面，由于胶原蛋白肽与人皮肤胶原蛋白的结构相似，相容性好，可以进入到人的皮肤深层，对皮肤有很好的营养作用，并且胶原蛋白肽中存在具有大量羧基和羟基的羟脯氨酸和羟赖氨酸等氨基酸，以及大量的甘氨酸等天然保湿因子，能提高组织细胞的贮水能力，对皮肤有很好的保湿效果，很多种胶原蛋白肽与皮肤细胞的生长、分裂、增殖、迁移以及分化有关，能够给皮肤提供养分，延缓皮肤的衰老，促进皮肤的创面修复，胶原蛋白肽溶液还有较强的抗辐射作用，因而广泛应用于化妆品行业。虽然目前市场中销售的许多高档化妆品中很多都含有胶原蛋白肽，但存在着胶原蛋白肽分子量分布不集中，产品稳定性较差，保湿能力有限等问题，这些问题都与胶原蛋白肽的制备工艺有关，急需解决。
目前，通过酶法提取已经是相当热门的一类蛋白肽制备方法。相对于酸法和碱法，酶法提取不仅可以避免酸、碱水解法所产生的产品分子量分布广泛和均匀度差的问题，还可以解决因提取过程中消耗大量的酸或碱，导致提取产品成分非常复杂、后续纯化处理困难的麻烦。
近年来的文献表明：蛋白或肽的分子量分布与功能活性(保湿能力、乳化能力、感觉味道和抗氧化活性等)，理化性质(吸收率、抗原性和金属结合能力)等性质之间存在着一定的关系，所以，特定分子量片段的蛋白肽具有其他分子量片段的蛋白肽难于比拟的功能活性与理化性质；而蛋白、肽的分子量分布的稳定性也在一定程度上决定其功能活性、理化性质的稳定性。
胶原蛋白肽可以作为化妆品核心原料，需要先溶于水，所以胶原蛋白肽溶液的稳定性对于其化妆品最终产品的稳定性尤为重要。
还有由于皮肤不像胃肠道，它缺乏相应的蛋白酶和微生物菌群。胶原蛋白肽接触或进入皮肤中，基本上无法降解，所以，胶原蛋白肽的分子量大小直接决定了胶原蛋白肽的皮肤渗透性强弱和对皮肤的保湿作用大小。而特定分子量片段的胶原蛋白肽所形成的特殊微球结构也对其保湿能力产生影响。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的技术解决方案是：
一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理
将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2—10倍的碱溶液，搅拌0分钟—1小时(优选 10-30min)，除掉鱼鳞的脂肪和其他杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2—10倍的酸溶液，搅拌15分钟—1小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1—4％，酸溶液的质量体积浓度为3—8％；
(2)酶解提取
利用合适的蛋白酶定向酶解鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽；将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加入鱼鳞重量的0.5～3倍的去离子水，加入浓碱液调节pH值6～8之间，加入鱼鳞投料重量0.5％～10％的蛋白酶，反应温度为45～65℃，反应15分钟～1小时；酶解反应结束后升温至70～80℃，保温0～30分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液，提取率≥97％；
(3)分离纯化
连连续流离心结合相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜去除鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液中的固体残渣和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为1kDa～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％，分子量主要分布在500～1100Da之间的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液；
(4)快速干燥和灭菌封装
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的微米级鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球。再通过光辐射进行快速灭菌，最后进行无菌分装。
所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞可以是海洋鱼类鱼鳞或已经被证明胶原蛋白类型为Ⅰ型的淡水鱼类鱼鳞。
所述步骤(1)预处理和所述步骤(2)加入浓碱液调节pH值所使用的碱为碳酸氢钠(钾)或氢氧化钠(钾)；酸为盐酸或硝酸。
所述步骤(2)中所使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或两种组合。
所述步骤(2)中酶解反应结束后升温至70～80℃进行升温灭酶，如果直接进行连续流离心协同膜分离技术分离纯化鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽，则升温灭酶可以不做。
所述步骤(3)中所使用的相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜流速为 5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为1kDa～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。
所述步骤(3)中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。
所述步骤(4)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～95℃。
所述步骤(4)中所得到的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球的颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间，属于微米级别，且微球内部为中空结构。
所述预处理步骤前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
所述步骤(4)中所使用的光辐射可使用紫外光辐射、γ-射线或电子束辐射，辐射剂量为0.01～40kGy，辐射时间为1～60分钟。
本发明与现有技术不同之处在于：鱼鳞主要是由Ⅰ型胶原蛋白和钙盐——羟基磷灰石组成的，所以定向酶解鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白所得到的胶原蛋白肽，即鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽。而相关实验表明，酸是钙盐的优良去除剂；而酶是包括Ⅰ型胶原蛋白在内的所有蛋白的专属消解剂。所以，在酶法提取鱼鳞胶原蛋白肽的过程中，只要抓住以上要点，在预处理过程中去除足够的鱼鳞钙盐，保证鱼鳞中的Ⅰ型胶原蛋白完全暴露在蛋白酶之下，就能实现提取、酶解、溶解三位一体，一步将预处理后的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白固体直接溶解成为鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽液体，提取率接近于100％。同时，由于酶解反应开始时，加入少量的水仅起到鱼鳞间的润滑和导热作用；酶解反应发生后，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白固体直接和蛋白酶接触反应，保证整个酶解反应可以在1小时内完成，并起到浓缩的作用，形成高浓度的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽液体，减少后端分离纯化步骤的时间消耗。由此更能满足产业化放大和大规模生产的要求。
本发明立足海洋生物资源高值化，根据人体皮肤的实际需要，以我国来源丰富的水产加工产业下脚料——鱼鳞作为胶原蛋白肽的原料，完全采用生物酶解技术，开发一步到位快速制备特定分子量片段(分子量主要分布在500～1100Da之间)，特殊微球结构的化妆品用鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的工艺，制备的化妆品用鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽构型明确、分子量分布集中稳定，所形成的微球尺寸均匀、结构中空利于储水，并与人体皮肤具备高度亲和力。根据行业标准QB/T4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》，经人体试验表明：添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水，能够有效提升人体皮肤角质层的水分，并有效改善化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水自身的保湿能力；不仅如此，添加了本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的精华液，与国际知名品牌的明星产品：兰蔻小黑瓶精华肌底液和雅诗兰黛特润修护肌透精华露(第六代小棕瓶)对比，在保湿功效方面均显示出相当的优势。经过成年女性受试者在正常情况下连续8周的人体试用试验，结果表明：添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆品具有保湿和改善皮肤水分流失，以及改善面部皮肤和眼部皮肤粗糙度的功效。本发明能够实现高效率、高产量、高环保的“绿色”生产。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明选择主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为原料，保证了酶提得到的胶原蛋白肽是源自单一构型蛋白的Ⅰ型胶原蛋白肽。
2.本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽制备方法完全使用生物酶定向酶解技术，符合蛋白酶解机制，在酶解提取开始时，仅加入少量的水起到鱼鳞间的润滑和导热作用；酶解提取发生后，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白固体直接和蛋白酶接触反应，保证酶解提取过程可以在1小时内完成，并起到浓缩的作用，形成高浓度的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽液体，实现提取、酶解、溶解三位一体，一步到位将预处理后鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白固体直接溶解成为鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽浓缩液，提取率≥97％，接近于100％；一方面，可以有效杜绝化学法中强酸、强碱和高热，带来的环境污染和巨大的能源消耗，显著降低了生产成本，同时不产生任何有毒有害物质。另一方面，可以减少后端分离纯化步骤的时间消耗。由此，更能满足产业化放大和大规模生产的要求。
3.本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽规模化生产周期基本上可以控制在24 小时内完成，更为简短务实；流程整体更为简单可行，高效节能，使用同样的设备，单位时间的效率可以提高5～15倍，更为适合大规模生产。
4.本发明方法生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽含量高(≥95％)，结构为特殊的微球结构，颗粒均匀，尺寸位于1～10μm之间的微米级别，微球内部为中空结构，更有利于吸收存储大量的水分，并避免水分流失。。
5.本发明方法生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽具有特定的分子量片段，分子量主要分布在500～1100Da之间，更为集中。既可以保证产品的稳定性，胶原蛋白肽溶液稳定性试验证明：对比国内外14种胶原蛋白肽，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的稳定性良好，在室温条件下放置3周，分子量基本保持不变；又可以更有效地透过皮肤，更好地补充皮肤水分。
6.本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽与人体皮肤具备高度亲和力，根据行业标准QB/T4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》，经8小时人体试验表明：添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水，不仅能够有效提升人体皮肤角质层的水分，还能有效改善化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水自身的保湿能力。与国内外有代表性的5种胶原蛋白肽产品(分别为：法国罗塞洛、德国雅名、日本Nippi(两种)和中国海南华研)相比，本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽对皮肤的保湿性具有较大的优势。
7.根据行业标准QB/T4256-2011《化妆品保湿功效评价指南》，经8小时人体试验表明：添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的精华液，与国际知名品牌的明星产品：兰蔻小黑瓶精华肌底液和雅诗兰黛特润修护肌透精华露(第六代小棕瓶)对比，在保湿功效方面均显示出相当的优势。这不仅体现添加本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆品具有良好的皮肤亲和力，能够较好地提升和保持人体皮肤水分；而且由于保湿性是一切化妆品的基础，本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽拥有的优异的保湿性能和与生具备的良好的皮肤亲和力，预示着添加本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆品在抗衰老功效方面也会有不逊于甚至超越国际知名品牌的类似产品的表现。
8.以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，在正常情况下连续8周的人体试用试验，评价待检样品的人体安全性及功效。试验结果表明：受试物对于人体皮肤的安全性良好；试用8周后，面部皮肤角质层含水量增加，水分流失速率降低，皮肤粗糙度Rz降低，且具有显著差异性，提示该受试物具有保湿、改善皮肤水分流失和改善皮肤粗糙度的功效；试用8周后，眼周皮肤粗糙度Rz、Ra 均显著降低，提示该受试物具有改善眼部皮肤粗糙度的功效。本试验得到的有关功效的所有数据结果均是有统计学差异的。需要提别说明的是，连续8周的人体功效评价试验，在试用前及试用4周后及8周后测试面部的角质层含水量、经皮水分流失(TEWL)，面部皮肤与眼周皮肤的纹理(Ra，Rz)，并进行VISIA拍照。测定时，是要洗净脸上的所有化妆品，并在温度：20±2℃；相对湿度：50±10％的测试环境下，等待2个小时以上，才能进行测定，这样得到的结果才是真正代表化妆品长期使用对皮肤的真实效果。
9.以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，在正常情况下连续8周的人体试用试验，评价待检样品的性能和功效。大部分的受试者认为：产品耐受性好；产品性状好；产品气味好；产品质地好；使用后眼周皱纹有改善；使用后面部细纹有改善；使用后皮肤变得滋润；使用后皮肤变得有弹性；使用后皮肤变得光滑；使用后皮肤变得柔软；该产品适合本人皮肤类型；整体来说，产品令人满意；愿意继续使用此产品；会购买该试用产品(假设价钱在可接受范围内)。本试验得到的有关功效的所有数据结果均是有统计学差异的。
10.本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽特别适合作为化妆品的功能原料，但也可以作为临床营养品、保健食品、运动食品以及蛋白营养补充剂直接食用。
附图说明
图1是本发明方法：鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法的工艺流程图。
图2是本发明鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的傅立叶变换离子回旋共振质谱 (FT-MS)谱图。
图3是本发明制备的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽颗粒的SEM电镜图(a——×2000 倍；b——×10000倍；c——×4000倍；d——×3000倍；e——×1500倍；f——×2000 倍)。
图4是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液与本发明鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的凝胶色谱对比图(a——本发明步骤2后鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液的凝胶色谱图；b——本发明鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的凝胶色谱图)。
图5是国内外15种胶原蛋白肽溶液放置3周前后的凝胶色谱对比图(a ——海康生物胶原蛋白肽；a’——放置3周后的海康生物胶原蛋白肽；b——湖北德炎生物胶原蛋白肽；b’——放置3周后的湖北德炎生物胶原蛋白肽；c——天久生物胶原蛋白肽；c’——放置3周后的天久生物胶原蛋白肽；d——天骄生物胶原蛋白肽；d’——放置3周后的天骄生物胶原蛋白肽；e——阿敏生物胶原蛋白肽；e’——放置3周后的阿敏生物胶原蛋白肽；f——海南华研胶原蛋白肽；f’——放置3周后的海南华研胶原蛋白肽； g——可生鱼鳞胶原蛋白；g’——放置3周后的可生鱼鳞胶原蛋白；h——可生鱼皮胶原蛋白肽；h’——放置3周后的可生鱼皮胶原蛋白肽；i——玉脂研胶原蛋白肽；i’——放置3周后的玉脂研胶原蛋白肽；j——法姬玛胶原蛋白肽；j’——放置3周后的法姬玛胶原蛋白肽；k——吉利鼎胶原蛋白肽；k’——放置3周后的吉利鼎胶原蛋白肽；l——瑞邦胶原蛋白肽；l’——放置3周后的瑞邦胶原蛋白肽；m——法国罗塞洛胶原蛋白肽； m’——放置3周后的法国罗塞洛胶原蛋白肽；n——德国雅名胶原蛋白肽；n’——放置 3周后的德国雅名胶原蛋白肽；o——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽；o’——放置3周后的本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)。
表1是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液放置3周后的降解物所占比例。
图6是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽与国内外18种胶原蛋白肽溶液的GE凝胶色谱对比图(1——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽；2——日本胜肽；3——海康生物胶原蛋白肽；4——湖北德炎生物胶原蛋白肽；5——天久生物胶原蛋白肽；6——天骄生物胶原蛋白肽；7——阿敏生物(牛)胶原蛋白肽；8——海南华研胶原蛋白肽；9——可生鱼鳞胶原蛋白肽；10——可生鱼皮胶原蛋白肽；11——玉脂研胶原蛋白肽；12——法姬玛胶原蛋白肽；13——吉利鼎胶原蛋白肽；14——瑞邦保健级别胶原蛋白肽；15——瑞邦食品级别胶原蛋白肽；16——法国罗塞洛胶原蛋白肽；17——德国雅名胶原蛋白肽；18——日本Nippi collagen-100胶原蛋白肽；19——日本Nippi海洋胶原蛋白肽)。
表2是GE凝胶色谱测定本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽与国内外18种胶原蛋白肽溶液的最高出峰位置与半峰宽对比。
图7是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽系列化妆品的8小时保湿能力对比(1 ——透明化妆水(含2％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；2——半透明化妆水(含2％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；3——化妆膏(含2％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；4——化妆乳液(含1％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；5——空白对照(不涂抹任何化妆品))。
图8是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽透明化妆水相对于透明化妆水对照，皮肤角质层含水量比例的变化(1——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽透明化妆水(含量 2％)；2——透明化妆水对照(未添加胶原蛋白肽))。
图9是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽半透明化妆水相对于半透明化妆水对照，皮肤角质层含水量比例的变化(1——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽半透明化妆水(含量2％)；2——半透明化妆水对照(未添加胶原蛋白肽))。
图10是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽化妆膏相对于化妆膏对照，皮肤角质层含水量比例的变化(1——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽化妆膏(含量2％)；2——化妆膏对照(未添加胶原蛋白肽))。
图11是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽化妆乳液相对于化妆乳液对照，皮肤角质层含水量比例的变化(1——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽化妆乳液(含量1％)；2 ——化妆乳液对照(未添加胶原蛋白肽))。
图12是国内外6种胶原蛋白肽透明化妆水的8小时保湿能力对比(1——透明化妆水(含2％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；2——透明化妆水(含2％德国雅名胶原蛋白肽)；3——透明化妆水(含2％法国罗塞洛胶原蛋白肽)；4——透明化妆水(含2％日本Nippi海洋胶原蛋白肽)；5——透明化妆水(含2％中国海南华研胶原蛋白肽)；6——透明化妆水(含2％Nippi collagen-100胶原蛋白肽)；7——透明化妆水对照(不添加任何胶原蛋白肽))。
图13是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽与国内外5种胶原蛋白肽的凝胶色谱图对比(1——Nippi海洋胶原蛋白肽(号称日本最大的胶原蛋白企业)；2——中国海南华研(号称中国最大的胶原蛋白对外出口企业)；3——德国雅名Aymin胶原蛋白肽；4 ——NippiCollagen-100胶原蛋白肽；5——法国罗塞洛胶原蛋白肽；6——本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)。
图14是本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的精华液与国际知名品牌的明星产品：兰蔻小黑瓶精华肌底液和雅诗兰黛特润修护肌透精华露(第六代小棕瓶)，8小时保湿能力对比(1——海洋源I型胶原蛋白肽精华液(含2％本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽)；2——兰蔻小黑瓶精华肌底液；3——雅诗兰黛特润修护肌透精华露(第六代小棕瓶)；4——空白对照(不涂抹任何化妆品))。
图15是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用8周后，受试者面部皮肤角质层含水量的变化趋势。
图16是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用8周后，受试者面部皮肤水分流失速率的变化趋势。
图17是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用8周后，受试者面部皮肤粗糙度Rz的变化趋势。
图18是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用8周后，受试者眼部皮肤粗糙度Ra的变化趋势。
图19是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用8周后，受试者眼部皮肤粗糙度Rz的变化趋势。
图20是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用期为8周，受试者使用前后眼部皮肤的图片对比(a——使用前；b——使用4周后；c——使用8周后)。
图21是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用期为8周，受试者使用前后面部皮肤的图片对比(a——使用前；b——使用4周后；c——使用8周后)。
表3是以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，选择皮肤干燥、有明显皱纹等皮肤问题的中国成年女性作为受试者，试用期为8周，受试者的评价内容与评价结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1：
一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)预处理
将美国红鱼(Sciaenops ocellatus)鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌30分钟，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌30分钟，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为3％，酸溶液的质量体积浓度为5％；
(2)酶解提取
将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加入鱼鳞重量的1倍的去离子水，加入浓碱液调节pH为6.5，加入鱼鳞投料重量2％的木瓜蛋白酶，反应温度为55℃，反应45分钟；酶解结束后升温至70℃，保温20分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液，提取率＝99.8％。
(3)分离纯化
鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为10kDa的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为 0.931Mpa，温度为30℃；再用相对分子质量为200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为30℃，浓缩得到含量＝96％，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。
(4)快速干燥与灭菌封装
喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为160℃，出风温度为90℃。得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球；再通过γ-射线辐射进行快速灭菌与适度交联，辐射剂量为10kGy，辐射时间为30分钟，最后进行无菌分装。
实施例2：
一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)预处理
将鳙鱼鱼鳞先粉碎，投入反应釜中，加入鱼鳞重量2倍的碱溶液，搅拌15分钟，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌30分钟，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为4％，酸溶液的质量体积浓度为4％；
(2)酶解提取
将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为7.0，加入鱼鳞投料重量1.5％的木瓜蛋白酶和1.5％的中性蛋白酶，反应温度为60℃，反应35 分钟，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液，提取率＝99.5％。
(3)分离纯化
鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kDa的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5 立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为30℃，浓缩得到含量＝97％的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。
(4)快速干燥与灭菌封装
喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为150℃，出风温度为85℃。得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球；再通过紫外光辐射进行快速灭菌与适度交联，辐射剂量为5kGy，辐射时间为60分钟，最后进行无菌分装。
实施例3：
一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)预处理
将罗非鱼(Oreochromis spp)鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量10倍的碱溶液，搅拌15分钟，用水洗净，加入鱼鳞重量10倍的酸溶液，搅拌25分钟，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为4％，酸溶液的质量体积浓度为6％；
(2)酶解提取
将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为6.5，加入鱼鳞投料重量2.5％的风味蛋白酶和1.5％的木瓜蛋白酶，反应温度为53℃，反应30 分钟；酶解结束后升温至75℃，保温20分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液，提取率＝98.8％。
(3)分离纯化
鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为5kDa的纳滤膜去除大分子杂质，流速为6立方米/小时，膜压力为0.931Mpa，温度为35℃；再用相对分子质量为500Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为8 立方米/小时，膜压力为2.5Mpa，温度为35℃，浓缩得到含量＝96％的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。
(4)快速干燥与灭菌封装
喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为88℃。得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的微米级鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球；再通过γ-射线辐射进行快速灭菌与适度交联，辐射剂量为15kGy，辐射时间为15分钟，最后进行无菌分装。
实施例4：
一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，步骤如下：
(1)预处理
将沙丁鱼(Sardine)鱼鳞先粉碎，再投入反应釜中，加入鱼鳞重量5倍的碱溶液，搅拌18分钟，用水洗净，加入鱼鳞重量5倍的酸溶液，搅拌25分钟，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为3％，酸溶液的质量体积浓度为5％；
(2)酶解提取
将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加去离子水，加入浓碱液调节pH为8，加入鱼鳞投料重量3.5％的胰蛋白酶或糜蛋白酶，反应温度为50℃，反应1小时；酶解结束后升温至80℃，保温30分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液，提取率＝97.5％。
(3)分离纯化
鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液用连续流离心机在14000rpm下高速离心，所得清液用相对分子质量为10kDa的纳滤膜去除大分子杂质，流速为8立方米/小时，膜压力为 0.931Mpa，温度为25℃；再用相对分子质量为500Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，流速为5立方米/小时，膜压力为2.758Mpa，温度为40℃，浓缩得到含量＝95％的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液。
(4)快速干燥与灭菌封装
喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，设定进风温度为165℃，出风温度为92℃。得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球；再通过电子束辐射进行快速灭菌与适度交联，辐射剂量为10kGy，辐射时间为15分钟，最后进行无菌分装。
如图2所示，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽通过傅立叶变换离子回旋共振质谱 (FT-MS)分析谱图特征，证明其均为单电荷物质，核质比(m/z)代表其分子量；所以，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的分子量主要分布在500～1100Da之间。
如图3(a)和图3(b)所示，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球通过2000倍和 10000倍的扫描电镜放大后，观察可见：其颗粒尺寸集中在1～10μm的范围之间，属于微米级别，而且可以推测出微球内部应该为中空结构，这样才有可能在真空负压的状态下，呈现干瘪状态。如图3(c)所示，经过4000倍的扫描电镜放大观察并验证得到：鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球内部的确是的中空结构，且具有较大的存储空间。如图3(d)、图3 (e)和图3(f)所示，鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球通过3000倍、1500倍和2000倍的扫描电镜放大后，观察可见：鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球因逐渐吸收水分，而逐渐饱满，显示水分就是存储在微球内部的中空结构的。
图4、图5、图6和图13采用的是凝胶色谱法测定；而表1和表2分别是基于图5和图6的凝胶色谱实验总结的结论。
凝胶色谱法是利用凝胶把分子量大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质，对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，然后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。因此，在凝胶色谱中，物质出峰时的体积(Volume)与物质分子量(Mr)的对数(log)成正比，即出峰体积越大，物质的分子量越大；出峰体积越小，物质的分子量越小。
根据孙大文教授的研究，对于分子量小于3000Da的蛋白质水解物，GE公司的Superdex peptide系列的凝胶色谱柱比TSK gel G2000SWXL色谱柱具有更好的选择性。所以本发明也选择GE公司的凝胶色谱柱作为色谱固定相。测定方法也参见以下文章：
1)Su,G.W.,Ren,J.Y.,Zhao,M.M.&Sun,D.W.(2013).Comparison of SuperdexPeptide HR 10/30Column and TSK Gel G2000SWXL Column for Molecular WeightDistribution Analysis of Protein Hydrolysates.Food and Bioprocess Technolog,6: 3620–3626.
如图4所示，本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液与本发明鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的凝胶色谱对比图上的出峰位置基本一致，这一方面说明：本发明步骤2制备的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解液已经与鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽最终产品在分子量分布方面高度类似，本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的特定分子量片段是主要由于步骤2酶解提取工艺产生的，膜分离纯化仅起到后期的辅助性的去除小分子杂质和无机盐的作用。
如图5所示，除本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽以外，其他国内外14种胶原蛋白肽溶液在放置3周后，它们的分子量分布均出现较大的变化，显示这些胶原蛋白肽在液体状态下的稳定性较差，并不适合在化妆品领域使用，这说明：这些胶原蛋白肽本身的分子量片段的稳定性较差，这些产品的制备工艺有待改进。
如图5(o)和表1所示，在放置3周后，本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液与刚配置时候相比，主要出峰位置完全一样。所不同的地方(图5(o)中用红色圆圈标出)可能是在放置阶段的由于少部分肽降解产生的氨基酸脱落的缘故。但经过表1 的峰面积归一化法计算所占的峰面积比例为3.3％，小于5％，基本可忽略不计。这说明：本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽由于特定的500～1100Da之间的分子量片段，在液体状态下的稳定性更佳，放置3周，分子量分布基本无波动，特别适合在各种化妆品中使用。
如图6和表2所示，对比国内外18种胶原蛋白肽，本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽分子量的集中度较好，且分子量分布均小于国内外18种胶原蛋白肽。
如图7所示，无论是透明化妆水、半透明化妆水，还是化妆膏，亦或是化妆乳液，添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽后，受试者皮肤的含水量均有所提升。特别是鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽化妆水系列(透明化妆水和半透明化妆水)，受试者皮肤的含水量提升更是显著。
如图7、图8、图9、图10和图11所示，无论是透明化妆水、半透明化妆水，还是化妆膏，亦或是化妆乳液，添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽后，均能提高相应化妆品基质的保湿能力，这显示本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽是维持化妆品保湿能力的主要物质。
如图12所示，添加了本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的透明化妆水的8小时保湿能力明显优于添加国内外5种胶原蛋白肽的透明化妆水。结合图13所示，本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的分子量片段与国内外5种胶原蛋白肽相比有明显不同，分子量分布明显更为集中且偏小。这一方面说明：胶原蛋白肽的保湿功效与其分子量分布之间息息相关。本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽特定的500～1100Da之间的分子量片段，能够更有效地透过皮肤，更好地补充皮肤水分，具有更高的保湿功效。
如图14所示，添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的精华液，与国际知名品牌的明星产品：兰蔻小黑瓶精华肌底液和雅诗兰黛特润修护肌透精华露(第六代小棕瓶) 对比，在保湿功效方面均显示出相当的优势。这不仅体现添加本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆品具有良好的皮肤亲和力，能够较好地提升和保持人体皮肤水分；而且由于保湿性是一切化妆品的基础，本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽拥有的优异的保湿性能和与生具备的良好的皮肤亲和力，预示着添加本发明生产出来的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆品在抗衰老功效方面也会有不逊于甚至超越国际知名品牌的类似产品的表现。
如图15和图16所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者面部皮肤角质层含水量增加，水分流失速率降低，且具有显著差异性，提示该受试物具有保湿和改善皮肤水分流失的功效。
如图17所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者面部皮肤粗糙度Rz降低，且具有显著差异性，提示该受试物具有改善皮肤粗糙度的功效。
如图18和图19所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者眼周皮肤粗糙度 Rz、Ra均显著降低，提示该受试物具有改善眼部皮肤粗糙度的功效。
如图20所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者眼部皱纹变少变浅，更加细腻平滑。
如图21所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者面部干燥与细纹现象均有改善，皮肤更加滋润平滑。
如表3所示，以添加本发明的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的化妆膏、化妆乳液、透明化妆水和半透明化妆水作为受试物，试用8周后，受试者在以下14个方面评价良好：产品耐受性好；产品性状好；产品气味好；产品质地好；使用后眼周皱纹有改善；使用后面部细纹有改善；使用后皮肤变得滋润；使用后皮肤变得有弹性；使用后皮肤变得光滑；使用后皮肤变得柔软；该产品适合本人皮肤类型；整体来说，产品令人满意；愿意继续使用此产品；会购买该试用产品(假设价钱在可接受范围内)。
表1
表2
表3
Claims (10)
1.一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理
将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2—10倍的碱溶液，搅拌0分钟—1小时，除掉鱼鳞的脂肪和其他杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2—10倍的酸溶液，搅拌15分钟—1小时，再用去离子水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1—4％，酸溶液的质量体积浓度为3—8％；
(2)酶解提取
利用合适的蛋白酶定向酶解鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽：将经过预处理并洗净的鱼鳞置于反应釜中，加入鱼鳞重量的0.5～3倍的去离子水，加入浓碱液调节pH值6～8之间，加入鱼鳞投料重量0.5％～10％的蛋白酶，反应温度为45～65℃，反应15分钟～1小时；酶解反应结束后升温至70～80℃，保温0～30分钟灭酶，得到鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液，提取率≥97％；
(3)分离纯化
连续流离心结合相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜去除鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽酶解浓缩液中的固体残渣和大分子杂质，所得清液再用相对分子质量为1kDa～200Da的纳滤膜去除小分子杂质和无机盐，并进一步浓缩得到含量≥95％，分子量主要分布在500～1100Da之间的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽溶液；
(4)快速干燥与灭菌封装
利用喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的微米级鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽微球，再通过光辐射进行快速灭菌，最后进行无菌分装。
2.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或已经被证明胶原蛋白类型为Ⅰ型的淡水鱼类鱼鳞。
3.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤(1)预处理和所述步骤(2)酶解提取加入浓碱液调节pH值所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；酸为盐酸或硝酸。
4.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，，其特征在于：所述步骤(2)中所使用的蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或两种组合；酶解反应结束后升温至70～80℃进行升温灭酶，如果直接进行连续流离心协同膜分离技术分离纯化鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽，则升温灭酶可以不做。
5.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所使用的相对分子质量为10kDa～5kDa的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.552-0.931Mpa，温度为20～50℃；所使用的相对分子质量为1kDa～200Da的纳滤膜流速为5～14立方米/小时，膜压力为0.483～2.758Mpa，温度为20～50℃。
6.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中所使用的离心机为10000～15000rpm的连续流离心机。
7.根据权利要求1所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所使用的喷雾干燥的进风温度为120～180℃、出风温度为70～95℃；得到的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽为颗粒尺寸范围集中在1～10μm之间的微米级别的微球，且微球内部为中空结构；所使用的光辐射包括紫外光辐射、γ-射线或电子束辐射，辐射剂量为0.01～40kGy，辐射时间为1～60分钟。
8.根据权利要求1～7之一所述一种适用于化妆品的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽的规模化制备方法，其特征在于：所述预处理步骤前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。
9.一种化妆品，它包括权利要求1-7任一项方法得到的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽，。
10.如权利要求9所述的化妆品，其特征在于，包括精华液、化妆水、化妆膏或化妆乳液，所述的化妆品中含有重量比0.01％～99％的所述的鱼鳞Ⅰ型胶原蛋白肽。
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