CN105519761A - 一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法。其是以鱿鱼羽状壳为原料，鱿鱼羽状壳经粉碎后，得用超声波辅助酶法二次对鱿鱼羽状壳进行提取，得酶解多肽液，再将其通过低温离心分离和膜分离、蒸馏水透析方法去除杂质，提高功能性多肽液纯度；最后经真空冷冻干燥得到固体的功能性多肽。本发明的方法工艺合理，超声波辅助反应速度快，反应条件温和，得到的功能性多肽纯度高，活性好，实现了对鱿鱼羽状壳的增殖利用，减少资源浪费和环境污染。
Description
技术领域
本发明涉及肽的制备，尤其是一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法。
背景技术
鱿鱼，即枪乌贼科和柔鱼科软体动物的俗称，是我国重要的海洋资源，我国鱿鱼渔获量已达到20万吨。鱿鱼营养丰富，高蛋白、低脂肪，是良好的水产品加工原料。目前，我国的鱿鱼加工业技术含量还很低，加工过程中，约有30％左右的鱿鱼头、足、内脏及表皮等下脚料产生。目前，这些下脚料大多废弃物或作为饲料原料，造成了环境污染和资源的严重浪费。
鱿鱼羽状壳俗称“针骨”，生物学上称为“内壳”。其是加工下脚料中的一种。目前，利用鱿鱼羽状壳生产甲壳素的技术方案已有报道，例如，2012年3月14日公开的CN102372795A中国发明申请说明书中就公开了“一种利用鱿鱼鞘制备β-甲壳素的方法”，该文件中公开了采用超声波辅助法制备β-甲壳素的技术方案。而鱿鱼羽状壳中也富含蛋白质，这种蛋白质可用于制备各种功能性多肽，经验证，该类多肽对风湿性关节炎具有一定的疗效。目前，还未发现利用鱿鱼羽状壳生产功能性多肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺合理、反应条件温和、制备速度快、得物纯度高及活性好的利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂后，低温粉碎，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量3～5倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01～0.05%的中性复合蛋白酶，调节pH值为6.5～7.5，控制温度45～55℃，超声辅助酶解3～5h，得一次酶解液；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01～0.05%的端肽酶，调节pH值为6.5～7.5，控制温度45～55℃，超声辅助酶解3～5h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液进行低温离心，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用滤膜进行分离，采用蒸馏水透析，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
所述的低温粉碎是采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎。
所述的中性复合蛋白酶是由30～60％中性蛋白酶、20～40％木瓜蛋白酶和20～30％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞10000ul/g。
所述的步骤(2)、步骤(3)中的超声辅助酶解的超声频率控制为24～71KHZ。
所述的低温离心是控制温度0～5℃，离心机转速10000～15000g，离心5～15min。
所述的滤膜为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜中的一种。
所述的采用蒸馏水透析是控制透析温度为2～10℃，每隔3～5h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止。
本发明是以鱿鱼羽状壳为原料，鱿鱼羽状壳经粉碎后，得用超声波辅助酶法二次对鱿鱼羽状壳进行提取，得酶解多肽液，再将其通过低温离心分离和膜分离、蒸馏水透析方法去除杂质，提高功能性多肽液纯度；最后经真空冷冻干燥得到固体的功能性多肽。其中，粉碎后鱿鱼羽状壳利用超声辅助中性复合蛋白酶和端粒酶将鱿鱼羽状壳中的蛋白酶解成小分子多肽溶解在溶液中，其在超声波的辅助作用下，反应速度快，所需时间短，反应条件温和，避免使用酸碱，反应完全，脱离率大于95%；酶解多肽液采用低温离心去杂、膜分离和真空冷冻干燥，进一步提高多肽的纯度，同时又不会破坏其结构而活性好。本发明的制备工艺合理，操作可行，较好利用水产品加工废弃物，减少环境污染，增加综合效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂，采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎，过150目筛，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量4倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.03%的中性复合蛋白酶，调节pH值为7.0，控制温度50℃，超声频率控制为50KHZ，超声辅助酶解4h，得一次酶解液；其中，中性复合蛋白酶是由50％中性蛋白酶、30％木瓜蛋白酶和20％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞15000ul/g；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.03%的端肽酶，调节pH值为7.0，控制温度50℃，超声频率控制为50KHZ，超声辅助酶解4h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液控制温度4℃，离心机转速12000g，离心10min，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用超滤膜进行分离，采用蒸馏水透析，其中，控制透析温度为4℃，每隔4h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
本实施例所提供的利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，工艺合理，操作简单可行，超声波辅助反应速度快，反应条件温和，得到的功能性多肽纯度高，活性好，综合利用水产品加工废弃物，减少环境污染。
实施例2
一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂，采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎，过100目筛，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量5倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.05%的中性复合蛋白酶，调节pH值为7.5，控制温度45℃，超声频率控制为24KHZ，超声辅助酶解3h，得一次酶解液；其中，中性复合蛋白酶是由60％中性蛋白酶、20％木瓜蛋白酶和20％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞12000ul/g；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.05%的端肽酶，调节pH值为7.5，控制温度55℃，超声频率控制为24KHZ，超声辅助酶解3h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液控制温度5℃，离心机转速10000g，离心15min，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用微滤膜进行分离，采用蒸馏水透析，其中，控制透析温度为10℃，每隔3h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
本实施例所提供的利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法工艺合理，操作可行，其反应条件温和，速度快，得到的功能性多肽纯度高，活性好。
实施例3
一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂，采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎，过120目筛，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量3倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01%的中性复合蛋白酶，调节pH值为6.5，控制温度45℃，超声频率控制为71KHZ，超声辅助酶解5h，得一次酶解液；其中，中性复合蛋白酶是由30％中性蛋白酶、40％木瓜蛋白酶和30％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞20000ul/g；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01%的端肽酶，调节pH值为6.5，控制温度45℃，超声频率控制为71KHZ，超声辅助酶解5h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液控制温度0℃，离心机转速15000g，离心5min，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用纳滤膜进行分离，采用蒸馏水透析，其中，控制透析温度为2℃，每隔5h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
本实施例所提供的利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法工艺合理，操作可行，其反应条件温和，速度快，得到的功能性多肽纯度高，活性好。
实施例4
一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂，采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎，过150目筛，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量3～5倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.04%的中性复合蛋白酶，调节pH值为7.2，控制温度48℃，超声频率控制为55KHZ，超声辅助酶解4h，得一次酶解液；其中，中性复合蛋白酶是由45％中性蛋白酶、30％木瓜蛋白酶和25％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞10000ul/g；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.04%的端肽酶，调节pH值为7.2，控制温度48℃，超声频率控制为55KHZ，超声辅助酶解4h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液控制温度3℃，离心机转速15000g，离心10in，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用反渗透膜进行分离，采用蒸馏水透析，其中，控制透析温度为5℃，每隔4h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
本实施例所提供的利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，工艺合理，操作简单可行，超声波辅助反应速度快，反应条件温和，得到的功能性多肽纯度高，活性好，综合利用水产品加工废弃物，减少环境污染。
Claims (7)
1.一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取鱿鱼羽状壳为原料，用生理盐水洗涤，去除杂质和油脂后，低温粉碎，得鱿鱼羽状壳粉，备用；
(2)一次超声辅助酶解：将步骤(1)中得到的鱿鱼羽状壳粉加入其质量3～5倍的去离子水，搅拌均匀，加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01～0.05%的中性复合蛋白酶，调节pH值为6.5～7.5，控制温度45～55℃，超声辅助酶解3～5h，得一次酶解液；
(3)二次超声辅助酶解：将步骤(2)得到的一次酶解液中加入鱿鱼羽状壳粉重量0.01～0.05%的端肽酶，调节pH值为6.5～7.5，控制温度45～55℃，超声辅助酶解3～5h，得二次酶解液；
(4)离心：将步骤(3)中得到的二次酶解液进行低温离心，去除沉淀，收集上清液，得功能性多肽粗提液；
(5)透析：将步骤(4)中得到的功能性多肽粗提液利用滤膜进行分离，采用蒸馏水透析，得功能性多肽透析液；
(6)真空干燥：将步骤(5)中得到的功能性多肽透析液真空冷冻干燥，得固体功能性多肽。
2.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的低温粉碎是采用冷却式粉碎机对洗涤后的鱿鱼羽状壳进行粉碎。
3.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的中性复合蛋白酶是由30～60％中性蛋白酶、20～40％木瓜蛋白酶和20～30％风味蛋白酶混合而成，酶活力＞10000ul/g。
4.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的步骤(2)、步骤(3)中的超声辅助酶解的超声频率控制为24～71KHZ。
5.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的低温离心是控制温度0～5℃，离心机转速10000～15000g，离心5～15min。
6.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的滤膜为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种利用鱿鱼羽状壳制备功能性多肽的方法，其特征在于：所述的采用蒸馏水透析是控制透析温度为2～10℃，每隔3～5h换蒸馏水一次，直至蒸馏水中无杂质检出为止。
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