CN105063149A - 一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一、棉籽粉原料的制备；步骤二、将棉籽粉原料和水混匀，加入多糖复合酶酶解，并进行超声波振荡处理，得到振荡酶解液；步骤三、一次碱提得到一次蛋白液和一次沉淀；步骤四、二次酶提得到二次蛋白液；步骤五、将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，酸沉离心得到一次沉淀粉；步骤六、将一次沉淀粉和水混匀，并加入糖化酶酶解，灭酶离心得到二次沉淀粉；步骤七、将二次沉淀粉冷冻干燥，即得棉籽蛋白。本发明提供的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，工艺更简单安全，棉籽蛋白提取率可达70％左右、提取的棉籽蛋白纯度高达90％以上。

Description

一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法

技术领域

本发明涉及农产品精深加工及其副产物综合利用技术领域，具体涉及一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法。

背景技术

我国是产棉大国，每年棉籽产量达900万吨以上，棉籽中含大量的蛋白质，棉籽提油后的饼粕蛋白质含量高达40％～50％，不仅是重要的植物油料，而且是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白质来源。棉籽粕中的蛋白质由良好的氨基酸组成，是氨基酸组成较齐全的优质高蛋白质饲料，棉籽蛋白氨基酸组成平衡合理，除蛋氨酸含量稍低外，其余必需氨基酸含量均达到联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)推荐的标准，而且棉籽蛋白口味清淡，含抗营养因子较少，是一种优质膳食蛋白资源。但榨油后约有80％棉籽粕被当作肥料直接下地，造成巨大的蛋白质资源浪费，对棉籽蛋白质开发利用将是一项重要战略措施，通过对棉籽粕中蛋白质的研究，为大规模的工业生产提供了理论基础，棉籽蛋白作为高蛋白食品、高质量广谱饲料及医药工业原料等方面有很大的潜力与应用前景，因此，有必要研究一种从棉籽粕中制备高纯度棉籽蛋白的方法。

发明内容

针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供了一种工艺简单安全、棉籽蛋白提取率高、提取的棉籽蛋白纯度高达90％以上的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一、棉籽粉原料的制备；步骤二、一次酶解：将棉籽粉原料和水混匀制得一次浆液，调节一次浆液pH，并加入多糖复合酶酶解，待酶解反应结束进行灭酶处理，得到一次酶解液，对一次酶解液进行超声波振荡处理，得到振荡酶解液；步骤三、一次提取：将振荡酶解液进行一次碱提，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；步骤四、二次提取：将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；步骤五、酸沉：将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，调节pH后进行酸沉离心，得到一次沉淀粉；步骤六、二次酶解：将一次沉淀粉和水混匀制得二次浆液，调节二次浆液pH，并加入糖化酶酶解，待酶解反应结束进行灭酶离心处理，得到二次沉淀粉；步骤七、将二次沉淀粉进行冷冻干燥，即得棉籽蛋白。

优选的，所述步骤一中的棉籽粉原料制备过程为：将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.035～0.045％，残油含量为1.45～1.55％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为60～80目的棉籽粉原料。

优选的，所述步骤二中的一次酶解过程如下：将棉籽粉原料和水按料液比1g:10～25mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至3.5～5.5，加入多糖复合酶酶解，酶解反应温度为40～60℃，酶解反应时间为1～5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为160～200W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理25～35分钟，得到振荡酶解液。

优选的，所述步骤二中的多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：5～10，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的1000～3000u/g。

优选的，所述步骤三中一次提取的条件为：碱提料液比1g:10～25ml，碱提pH9～12，碱提温度35～50℃，碱提时间1～2.5小时。

优选的，所述步骤四中二次提取的条件为：酶提料液比1g:25～40ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的180～300u/g，酶提pH10～11，酶提温度50～60℃，酶提时间0.5～1.5小时。

优选的，所述步骤五中的酸沉过程如下：将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为18～25℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉。

优选的，所述步骤六中的二次酶解过程如下：将一次沉淀粉和水按料液比1g:7～10mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至4～5.5，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的400～1000u/g，酶解反应温度为50～65℃，酶解反应时间为1～2.5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉。

优选的，所述步骤七中冷冻干燥的条件为：冷冻温度-60℃，冷冻时间48h，真空度为1.33pa。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明提供的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，

(1)本发明通过采用多糖复合酶酶解来破坏棉籽细胞的细胞壁，使得细胞里面的蛋白质更易于提取，相较于单一使用纤维素酶或果胶酶酶解的蛋白得率更高。

(2)本发明通过将经多糖复合酶酶解得到的一次酶解液进行超声波振荡处理，以提供合适的微环境来溶解蛋白质，破坏细胞壁的结构，提高蛋白质的溶出率，缩短提取时间，增加蛋白得率和纯度。

(3)本发明通过先后采用碱提进行一次提取和酶提进行二次提取，并改变前后两次提取的条件，可有效提高蛋白质的提取率。

(4)本发明通过将酸沉得到的一次沉淀粉辅以糖化酶进行二次酶解纯化处理，可有效提高棉籽蛋白的纯度。

(5)本发明提供的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，相比于水酶法提取蛋白，省去了破乳步骤，使得工艺更简单安全，棉籽蛋白提取率可达70％左右、提取的棉籽蛋白纯度高达90％以上。

附图说明

图1是本发明所述酶法辅助制备棉籽蛋白的方法的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

如图1所示，本发明提供了一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤一、棉籽粉原料的制备，其制备过程为：将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.035～0.045％，残油含量为1.45～1.55％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为60～80目的棉籽粉原料；

步骤二、一次酶解：将棉籽粉原料和水按料液比1g:10～25mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至3.5～5.5，并加入多糖复合酶酶解，所述多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：5～10，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的1000～3000u/g，酶解反应温度为40～60℃，酶解反应时间为1～5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为160～200W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理25～35分钟，得到振荡酶解液；

步骤三、一次提取：将振荡酶解液进行一次碱提，碱提料液比1g:10～25ml，碱提pH9～12，碱提温度35～50℃，碱提时间1～2.5小时，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；

步骤四、二次提取：将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，酶提料液比1g:25～40ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的180～300u/g，酶提pH10～11，酶提温度50～60℃，酶提时间0.5～1.5小时，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；

步骤五、酸沉：将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为18～25℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉；

步骤六、二次酶解：将一次沉淀粉和水按料液比1g:7～10mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至4～5.5，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的400～1000u/g，酶解反应温度为50～65℃，酶解反应时间为1～2.5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉；

步骤七、将二次沉淀粉进行冷冻干燥，冷冻干燥的条件为：冷冻温度-60℃，冷冻时间48h，真空度为1.33pa，即得棉籽蛋白。

本发明提供的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，通过采用多糖复合酶酶解来破坏棉籽细胞的细胞壁，使得细胞里面的蛋白质更易于提取，相较于单一使用纤维素酶或果胶酶酶解的蛋白得率更高；通过将经多糖复合酶酶解得到的一次酶解液进行超声波振荡处理，以提供合适的微环境来溶解蛋白质，破坏细胞壁的结构，提高蛋白质的溶出率，缩短提取时间，增加蛋白得率和纯度；通过先后采用碱提进行一次提取和酶提进行二次提取，并改变前后两次提取的条件，可有效提高蛋白质的提取率；通过将酸沉得到的一次沉淀粉辅以糖化酶进行二次酶解纯化处理，可有效提高棉籽蛋白的纯度；本发明提供的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，相比于水酶法提取蛋白，省去了破乳步骤，使得工艺更简单安全，棉籽蛋白提取率可达70％左右、提取的棉籽蛋白纯度高达90％以上。

实施例1：

将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.035％，残油含量为1.55％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为70目的棉籽粉原料；将棉籽粉原料和水按料液比1g:10mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至4.5，并加入多糖复合酶酶解，所述多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：5，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的1000u/g，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为1小时，待酶解反应结束，升温至90℃灭酶15分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为180W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理25分钟，得到振荡酶解液；将振荡酶解液进行一次碱提，碱提料液比1g:10ml，碱提pH9，碱提温度50℃，碱提时间1小时，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，酶提料液比1g:25ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的240u/g，酶提pH10，酶提温度55℃，酶提时间0.5小时，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为22℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉；将一次沉淀粉和水按料液比1g:7mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至4，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的700u/g，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为1.5小时，待酶解反应结束，升温至90℃灭酶15分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉；将二次沉淀粉进行冷冻干燥，冷冻干燥的条件为：冷冻温度-60℃，冷冻时间48h，真空度为1.33pa，即得棉籽蛋白，其中，棉籽蛋白得率为68.9％，蛋白纯度为91.8％。

实施例2：

将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.04％，残油含量为1.45％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为80目的棉籽粉原料；将棉籽粉原料和水按料液比1g:18mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至5.5，并加入多糖复合酶酶解，所述多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：7.5，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的3000u/g，酶解反应温度为40℃，酶解反应时间为5小时，待酶解反应结束，升温至80℃灭酶20分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为160W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理35分钟，得到振荡酶解液；将振荡酶解液进行一次碱提，碱提料液比1g:18ml，碱提pH10.5，碱提温度35℃，碱提时间2.5小时，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，酶提料液比1g:40ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的300u/g，酶提pH11，酶提温度60℃，酶提时间1.5小时，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为18℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉；将一次沉淀粉和水按料液比1g:10mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至5，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的1000u/g，酶解反应温度为65℃，酶解反应时间为2.5小时，待酶解反应结束，升温至80℃灭酶20分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉；将二次沉淀粉进行冷冻干燥，即得棉籽蛋白，其中，棉籽蛋白得率为69.5％，蛋白纯度为93.2％。

实施例3：

将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.045％，残油含量为1.50％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为60目的棉籽粉原料；将棉籽粉原料和水按料液比1g:25mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至3.5，并加入多糖复合酶酶解，所述多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：10，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的2000u/g，酶解反应温度为60℃，酶解反应时间为3小时，待酶解反应结束，升温至85℃灭酶10分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为200W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理30分钟，得到振荡酶解液；将振荡酶解液进行一次碱提，碱提料液比1g:17.5ml，碱提pH12，碱提温度50℃，碱提时间2小时，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，酶提料液比1g:30ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的180u/g，酶提pH11，酶提温度60℃，酶提时间1小时，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为25℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉；将一次沉淀粉和水按料液比1g:8.5mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至5.5，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的400u/g，酶解反应温度为50℃，酶解反应时间为1小时，待酶解反应结束，升温至85℃灭酶10分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉；将二次沉淀粉进行冷冻干燥，即得棉籽蛋白，其中，棉籽蛋白得率为72.3％，蛋白纯度为90.4％。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、棉籽粉原料的制备；

步骤二、一次酶解：将棉籽粉原料和水混匀制得一次浆液，调节一次浆液pH，并加入多糖复合酶酶解，待酶解反应结束进行灭酶处理，得到一次酶解液，对一次酶解液进行超声波振荡处理，得到振荡酶解液；

步骤三、一次提取：将振荡酶解液进行一次碱提，得到一次碱提液，并将其离心分离得到一次蛋白液和一次沉淀；

步骤四、二次提取：将一次沉淀加水溶解，并加入碱性蛋白酶进行二次酶提，得到二次酶提液，并将其离心分离得到二次蛋白液；

步骤五、酸沉：将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，调节pH后进行酸沉离心，得到一次沉淀粉；

步骤六、二次酶解：将一次沉淀粉和水混匀制得二次浆液，调节二次浆液pH，并加入糖化酶酶解，待酶解反应结束进行灭酶离心处理，得到二次沉淀粉；

步骤七、将二次沉淀粉进行冷冻干燥，即得棉籽蛋白。

2.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤一中的棉籽粉原料制备过程为：将棉籽脱壳后依次采用甲醇和正己烷浸泡，脱溶后得到脱酚脱脂的棉籽粕，其游离棉酚含量为0.035～0.045％，残油含量为1.45～1.55％，并将脱酚脱脂的棉籽粕粉碎过筛得到颗粒大小为60～80目的棉籽粉原料。

3.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤二中的一次酶解过程如下：将棉籽粉原料和水按料液比1g:10～25mL混匀制得一次浆液，在一次浆液中加入盐酸或柠檬酸将一次浆液pH调至3.5～5.5，加入多糖复合酶酶解，酶解反应温度为40～60℃，酶解反应时间为1～5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，得到一次酶解液，采用超声功率为160～200W的超声波对一次酶解液进行超声波振荡处理25～35分钟，得到振荡酶解液。

4.如权利要求3所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤二中的多糖复合酶采用纤维素酶+果胶酶，所述纤维素酶和果胶酶的用量为1：5～10，且多糖复合酶的加酶量为棉籽粉原料用量的1000～3000u/g。

5.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤三中一次提取的条件为：碱提料液比1g:10～25ml，碱提pH9～12，碱提温度35～50℃，碱提时间1～2.5小时。

6.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤四中二次提取的条件为：酶提料液比1g:25～40ml，碱性蛋白酶的加酶量为一次沉淀用量的180～300u/g，酶提pH10～11，酶提温度50～60℃，酶提时间0.5～1.5小时。

7.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤五中的酸沉过程如下：将一次蛋白液和二次蛋白液混匀，加入盐酸或柠檬酸调节pH至4.6进行酸沉，酸沉温度为18～25℃，待出现絮状物后离心，得到一次沉淀粉。

8.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤六中的二次酶解过程如下：将一次沉淀粉和水按料液比1g:7～10mL混匀制得二次浆液，在二次浆液中加入盐酸或柠檬酸将二次浆液pH调至4～5.5，并加入糖化酶酶解，且糖化酶的加酶量为一次沉淀粉用量的400～1000u/g，酶解反应温度为50～65℃，酶解反应时间为1～2.5小时，待酶解反应结束，升温至80～90℃灭酶10～20分钟，并进行离心处理，得到二次沉淀粉。

9.如权利要求1所述的酶法辅助制备棉籽蛋白的方法，其特征在于，所述步骤七中冷冻干燥的条件为：冷冻温度-60℃，冷冻时间48h，真空度为1.33pa。