CN112326825A - 一种测定非变性胶原蛋白含量的方法 - Google Patents

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Abstract

一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，包括采用羟脯氨酸作为对照品，通过高效液相色谱法对含非变性胶原蛋白的供试品进行含量测定；具体为：供试品通过纯化、水解、衍生等步骤制备成供试品溶液；采用对照品溶液获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；再根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。本发明可以有效测定产品中非变性胶原蛋白含量，检测结果准确。

Description

一种测定非变性胶原蛋白含量的方法
技术领域
本发明涉及含量测定领域，具体涉及一种测定非变性胶原蛋白含量的方法。
背景技术
骨关节炎症和软骨磨损是由于人体自身免疫反应抵抗内源性II型胶原蛋白造成的，II型胶原蛋白必须是非变性的才具有功效。市场上改善关节的产品通常是由变性/水解II型胶原蛋白以及非变性II型胶原蛋白混合而成。非变性II型胶原蛋白通过一种称为口服免疫耐受的作用机制，在较小的剂量下就能发挥功效。
非变性II型胶原蛋白以原骨胶原同型三聚体的超螺旋结构存在于哺乳动物软骨中，是由三条相同的a1链组成，在哺乳动物透明软骨中含量非常丰富，约占软骨组织蛋白质总量的80％。三股螺旋结构是非变性II型胶原蛋白生物活性的一个重要标志，是其发挥功能特性的前提。然而，三股螺旋结构容易受加工环境的影响，加工过程中引入的物理热、辐照、剪切、酸及其他化学试剂，都会部分或完全破坏胶原蛋白的三螺旋结构，导致其失去天然的生物活性功能。
因此在保留非变性II型胶原蛋白三螺旋结构不被破坏的前提下，去除产品中变性/水解II型胶原蛋白干扰是准确定量测定非变性II型胶原蛋白含量的关键技术。
中国文献CN109627326A公开了一种非变性胶原蛋白提取方法和胶原蛋白的鉴定方法，该文献中虽然可以从产品中提取出非变性胶原蛋白，但获取的非变性胶原蛋白并不是纯品，其中还包括有非变性胶原蛋白以外的其他物质，不能准确获取非变性胶原蛋白的含量，且现有技术中并没有纯的非变性胶原蛋白作为参照，无法直接采用高效液相色谱法直接进行准确测定；因此，根据现有技术的记载只能实现非变性胶原蛋白的定性检测，无法有效实现非变性胶原蛋白含量的准确测量。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术中的检测方法无法准确获得产品中非变性胶原蛋白的含量的缺陷，从而提供一种能有效且准确测定非变性胶原蛋白含量的方法。
一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，采用高效液相色谱法进行测量，采用羟脯氨酸作为对照品，含非变性胶原蛋白的产品作为供试品；
所述供试品制备成供试品溶液的过程包括：
纯化：去除供试品中的变性蛋白获得纯化产物，
水解：将纯化产物与酸溶液混合进行水解，水解后采用碱溶液进行中和，获得水解产物，
衍生：将水解产物与衍生液混合进行衍生，衍生后采用终止液终止反应，过滤后获得供试品溶液；
采用对照品配置成不同浓度的溶液，衍生后获得对照品溶液；通过对照品溶液的检测结果获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；
根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。
所述供试品中非变性胶原蛋白的含量的换算公式为：
Figure BDA0002750689020000031
其中，X为供试品中非变性II胶原蛋白的含量，mg/g，
C为供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL，
V为供试品溶液的最终定容体积，mL，
m为供试品的质量，g，
a为非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数。
不同来源的非变性胶原蛋白中羟脯氨酸的含量不同，可以根据“董宪兵、李侠等,分光光度法测定畜禽骨素中胶原蛋白含量[J]，现代食品科技.2013年10期第2538-2541+2419页”记载的方法获得混合胶原蛋白与羟脯氨酸的换算系数，当本发明中采用猪软骨以及鸡软骨的混合胶原蛋白时，该混合胶原蛋白与羟脯氨酸的换算系数为10.9，因此，本发明中优选将非变性II型胶原蛋白与羟脯氨酸的换算系数a设置为10.9。
所述对照品溶液的配置过程为：采用羟脯胺酸配置成不同浓度的羟脯胺酸溶液，将不同浓度的羟脯胺酸溶液分别采用与供试品相同的衍生步骤处理获得对照品溶液。
所述水解步骤中采用的酸溶液为浓度为4-8mol/L的盐酸溶液，水解温度为100-120℃，水解时间大于20h；所述中和所用碱溶液为浓度为4-8mol/L的NaOH溶液；
所述衍生步骤中采用的衍生液包括浓度为0.3-0.7mol/L NaHCO3溶液和浓度为0.5-1.5％的DNFB乙腈溶液，衍生温度为50-70℃，衍生总时间为0.5-1.5h；所述衍生步骤中采用的终止液为浓度为0.05-0.15mol/L的KH2PO4。
所述衍生步骤中过滤采用0.45μm的滤膜。
所述高效液相色谱法所采用的色谱条件包括：
色谱柱为C18色谱柱，检测波长为360nm，0.05M乙酸钠为流动相A,50％乙腈为流动相B，采用的梯度洗脱程序为：
Figure BDA0002750689020000041
所述供试品中去除变性蛋白获得纯化产物的过程为：
称取供试品，采用盐酸胍溶液进行溶解，在2-8℃放置16-24h，离心，去除上清液，加入包含蛋白酶抑制剂、碘乙酰胺、EDTANa2的稀释液，2-8℃放置0.5-2h，离心，去除上清液，重复至少一次上述盐酸胍溶液和稀释液的洗涤步骤获得沉淀；向沉淀中加入蛋白酶溶液，于35-40℃搅拌反应至少24h，离心，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，重复洗涤至少1次；干燥即可。
所述稀释液中蛋白酶抑制剂、碘乙酰胺、EDTANa2的质量比为(17-20):(28-31):1；所述蛋白酶抑制剂在稀释液中的浓度为8-12mg/L；盐酸胍在盐酸胍溶液中的浓度为2-6mol/L；蛋白酶在蛋白酶溶液中的浓度为0.5-2mg/mL；
所述干燥的方式为：85℃以下进行烘干或冻干；所述离心的条件为：12000-18000r/min离心15-25min。
所述盐酸胍溶液、稀释液、蛋白酶溶液均采用Tris-HCl缓冲液作为溶剂进行配置，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.2-7.6，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05-0.2mol/L。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明公开了一种采用非变性胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸实现间接测定含非变性胶原蛋白的产品中非变性胶原蛋白的含量的方法，尤其适用于间接测量改善骨关节产品中非变性胶原蛋白的含量，实现的具体原理为：采用含非变性胶原蛋白的供试品，先去除氨糖类物质、水解/变性II型胶原蛋白、其他杂质蛋白，获得较为纯净的纯化物质，然后将纯化物质进行水解处理，使非变性胶原蛋白可以解离出羟脯氨酸，通过衍生处理后的供试品和对照品共同进行高效液相色谱检测，可以更加准确的获取羟脯氨酸的含量，通过结合非变性胶原蛋白中羟脯氨酸与非变性胶原蛋白的换算系数a，最后可以有效换算出非变性胶原蛋白的含量，进而实现非变性胶原蛋白含量的准确检测。采用本发明的方法可以有效实现产品中非变性胶原蛋白的含量测定，测量结果相对现有技术而言更加准确；且通过检测得知，本发明方法具有专属性好、重现性好、准确度高等优点。
2.本发明供试品中去除变性蛋白的过程中，尤其是盐酸胍溶液对供试品进行处理的过程中，采用在低温2-8℃的条件下进行，有利于非变性II型胶原蛋白的保护，避免其变性，同时结合离心的方式，有效去除变性蛋白，使后期定量更准确；同时，蛋白酶溶液加入后采用恒温搅拌反应的方式，可以更有效的去除杂蛋白，避免杂蛋白对检测的干扰，进一步提高定量检测的准确性。
3.本发明中水解后的水解产物进入柱子之前进行衍生处理，可以使水解产生的羟脯氨酸更加稳定且便于检测，进而可以准确测量出羟脯氨酸的含量，结合换算系数a，有效实现供试品中非变性II型胶原蛋白含量的准确测定；且本发明还提供了高效液相色谱法的色谱条件，同时对该色谱法的专属性、系统适用性、精密度和准确度进行评估验证，证明本发明中的色谱法效果优异。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种测定非变性II型胶原蛋白含量的方法，包括：
1、溶液配制
1.1、1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris溶液)：准确称取12.114g的三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL水中，配制成Tris溶液；用浓盐酸调节pH至7.4作为储备液，使用时稀释10倍即得到0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
1.2、稀释液：准确称取10mg胃蛋白酶抑制剂、0.185g碘乙酰胺、0.292g EDTANa2，于1L容量瓶中，加入900mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至1L，摇匀即可。
1.3、4mol/L盐酸胍溶液：称取38.212g的盐酸胍固体，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.4、1mg/mLα-糜蛋白酶溶液：称取0.1g的α-糜蛋白酶，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.5、1％2,4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液：准确称取0.1g的DNFB置于容量瓶中，加入适量乙腈溶解后，再采用乙腈定容至10mL，摇匀即可。
1.6、0.05mol/L乙酸钠溶液：准确称取4.1g无水乙酸钠置于1L容量瓶中，加入800mL纯水溶解，定容至1L，摇匀，溶液过0.45μm水相滤膜，取续滤液备用。
1.7、50％乙腈：准确量取500mL色谱纯乙腈于1000mL容量瓶中，用水定容，摇匀即可。
2、样品溶液的制备
2.1、供试品溶液的制备
2.1.1、去除可溶性杂质
准确称取适量供试品于50mL离心管中，本发明中可根据供试品中非变性II型胶原蛋白的大致含量调整称样量，本实施例中的供试品为改善骨关节的产品，其为完美牌臻固力固体饮料(主要成分有：赤藓糖醇、柠檬粉、沙棘粉、雪莲培养物，非变性II型胶原蛋白，水解II型胶原蛋白；其中非变性II型胶原蛋白来源为猪软骨以及鸡胸软骨的混合胶原蛋白)，包括改善骨关节产品1：厂家生产的批号为165029的完美牌臻固力固体饮料，改善骨关节产品2：厂家生产的批号为190820的完美牌臻固力固体饮料，改善骨关节产品3：厂家生产的批号为191123的完美牌臻固力固体饮料。其取样量约3.0g，在供试品中加入25mL 4mol/L盐酸胍溶液，4℃放置20h，15000r/min离心20min，去除上清液，加入25mL稀释液，4℃放置1h，15000r/min离心20min，去除上清液；采用盐酸胍溶液和稀释液的洗涤重复洗涤1次，即可获得沉淀。
2.1.2、酶解去除变性蛋白
向上述2.1.1获得的沉淀中加入20mL 1mg/mL的α-糜蛋白酶溶液，于37℃搅拌反应48h，15000r/min离心20min，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，采用水重复洗涤1次，带离心管于80℃烘干过夜，冷却即可获得纯化产物。
2.1.3、水解
将上述纯化产物置于水解管中，用4mL 6mol/L盐酸110℃水解24h，用4mL 6mol/LNaOH溶液中和，最后用蒸馏水定容至10mL获得水解产物。
2.1.4、衍生
分取100μL水解产物，依次加入200μL 0.5mol/L NaHCO3溶液和100μL 1％的DNFB乙腈溶液，60℃衍生1h，用0.1mol/L KH2PO4溶液终止反应并补助至1mL，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.2、对照品溶液的制备
2.2.1、精密称取约98.3mg羟脯氨酸对照品于100mL容量瓶中，加水溶解并定容，得标准储备溶液。分别精密量取羟脯氨酸储备溶液0.8mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.0786mg/mL、0.0983mg/mL、0.1966mg/mL、0.2949mg/mL、0.3932mg/mL系列羟脯胺酸溶液。
2.2.2、对照品溶液的配置：分别取100μL 2.2.1中不同浓度的羟脯胺酸溶液，采用与供试品相同的衍生步骤进行处理，取续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.3、阴性对照品溶液的制备
取厂家生产的批号为165029的完美牌臻固力固体饮料3.0g在90℃的条件下加热24h获得阴性对照样品，按上述供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液。
3、色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，本实施例中采用Phenomenex菲罗门C18液相色谱柱，其规格为：4.6mm×250mm，5μm。
流动相：0.05M乙酸钠为流动相A，50％乙腈为流动相B，按表1所示的梯度洗脱程序进行洗脱。
表1
Figure BDA0002750689020000101
进样量为：10μL。
检测波长为：360nm。
4、样品测定及结果计算
取供试品溶液与系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。其中，改善骨关节产品1作为供试品获得的供试品溶液、浓度为0.2949mg/mL的对照品溶液以及阴性对照品溶液的色谱图如图1所示。采用系列对照品溶液根据采用外标法获得以标准品浓度x为横坐标、峰面积y为纵坐标的标准曲线，该标准曲线的线性方程为y＝2101.38998x-9.05029，R2＝0.99952。通过上述检测结果可知，在标准曲线的线性方程中，羟脯氨酸在0.07864～0.3932mg/mL浓度范围内线性关系良好。
根据标准曲线的线性方程可以查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，将羟脯胺酸的浓度代入下式(1)所示的公式中，即可计算供试品中非变性II型胶原蛋白的含量。
Figure BDA0002750689020000111
式中：
X─供试品中非变性II胶原蛋白的含量，g/100g,即％；
C─由标准曲线查得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL；
V─供试品溶液的最终定容体积，mL；本实施例中V为供试品溶液上机体积1mL/上机供试品溶液占总供试品溶液的份数,即V＝1mL/(1/100)＝100mL；
m─供试品的质量，g，即下表2中的称样量；
10.9─非变性II型胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数；
1000─g与mg之间的换算倍数。
采用上述检测方法检测得到的结果如下表2所示。
表2
Figure BDA0002750689020000121
通过上表1和图1可知，羟脯氨酸的保留时间约为13.4min，理论塔板数均大于5000，供试品溶液中羟脯氨酸峰与相邻未知峰的分离度大于1.5，阴性对照品溶液的色谱图中未见与对照品溶液色谱图中羟脯氨酸保留时间一致的色谱峰，证明阴性无干扰。采用本发明的方法可以有效检测出改善骨关节产品中非变性II型胶原蛋白含量，检测结果准确可靠。
实施例2
一种测定非变性II型胶原蛋白含量的方法，包括：
1、溶液配制
1.1、1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris溶液)：准确称取12.114g的三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL水中，配制成Tris溶液；用浓盐酸调节pH至7.24作为储备液，使用时稀释20倍即得到0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液。
1.2、稀释液：准确称取10mg胃蛋白酶抑制剂、0.185g碘乙酰胺、0.292g EDTANa2，于1L容量瓶中，加入900mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至1L，摇匀即可。
1.3、2mol/L盐酸胍溶液：称取19.106g的盐酸胍固体，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.4、1mg/mLα-糜蛋白酶溶液：称取0.1g的α-糜蛋白酶，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.5、0.5％2,4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液：准确称取0.05g的DNFB置于容量瓶中，加入适量乙腈溶解后，再采用乙腈定容至10mL，摇匀即可。
1.6、0.05mol/L乙酸钠溶液：准确称取4.1g无水乙酸钠置于1L容量瓶中，加入800mL纯水溶解，定容至1L，摇匀，溶液过0.45μm水相滤膜，取续滤液备用。
1.7、50％乙腈：准确量取500mL色谱纯乙腈于1000mL容量瓶中，用水定容，摇匀即可。
2、样品溶液的制备
2.1、供试品溶液的制备
2.1.1、去除可溶性杂质
准确称取适量供试品于50mL离心管中，本发明中可根据供试品中非变性II型胶原蛋白的大致含量调整称样量，本实施例中供试品为改善骨关节产品，其为完美牌臻固力固体饮料，厂家生产的批号为165029的改善骨关节产品1，其取样量约3.0g，在供试品中加入50mL 2mol/L盐酸胍溶液，2℃放置16h，12000r/min离心20min，去除上清液，加入25mL稀释液，4℃放置1h，12000r/min离心20min，去除上清液；采用盐酸胍溶液和稀释液的洗涤重复洗涤1次，即可获得沉淀。
2.1.2、酶解去除变性蛋白
向上述2.1.1获得的沉淀中加入20mL 1mg/mL的α-糜蛋白酶溶液，于35℃搅拌反应24h，12000r/min离心20min，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，采用水重复洗涤1次，带离心管于85℃烘干过夜，冷却即可获得纯化产物。
2.1.3、水解
将上述纯化产物置于水解管中，用4mL 4mol/L盐酸105℃水解20h，用4mL 4mol/LNaOH溶液中和，最后用蒸馏水定容至10mL获得水解产物。
2.1.4、衍生
分取100μL水解产物，依次加入200μL 0.5mol/L NaHCO3溶液和200μL 0.5％的DNFB乙腈溶液，60℃衍生1h，用0.05mol/L KH2PO4溶液终止反应并补助至1mL，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.2、对照品溶液的制备
2.2.1、精密称取约98.3mg羟脯氨酸对照品于100mL容量瓶中，加水溶解并定容，得标准储备溶液。分别精密量取羟脯氨酸储备溶液0.8mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.0786mg/mL、0.0983mg/mL、0.1966mg/mL、0.2949mg/mL、0.3932mg/mL系列羟脯胺酸溶液。
2.2.2、对照品溶液的配置：分别取100μL 2.2.1中不同浓度的羟脯胺酸溶液，采用与供试品相同的衍生步骤进行处理，取续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.3、阴性对照品溶液的制备
本实施例中采用的阴性对照样品溶液与实施例1相同。
3、色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，本实施例中采用Phenomenex菲罗门C18液相色谱柱，其规格为：4.6mm×250mm，5μm。
流动相：0.05M乙酸钠为流动相A，50％乙腈为流动相B，按表3所示的梯度洗脱程序进行洗脱。
表3
Figure BDA0002750689020000151
进样量为：10μL。
检测波长为：360nm。
4、样品测定及结果计算
取供试品溶液与系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。采用系列对照品溶液根据采用外标法获得以标准品浓度x为横坐标、峰面积y为纵坐标的标准曲线，该标准曲线的线性方程为y＝2126.65059x-19.38552，R2＝0.99869。通过上述检测结果可知，在标准曲线的线性方程中，羟脯氨酸在0.07864～0.3932mg/mL浓度范围内线性关系良好。
根据标准曲线的线性方程可以查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，将羟脯胺酸的浓度代入下式(1)所示的公式中，即可计算供试品中非变性II型胶原蛋白的含量。
Figure BDA0002750689020000161
式中：
X─供试品中非变性II胶原蛋白的含量，g/100g,即％；
C─由标准曲线查得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL；
V─供试品溶液的最终定容体积，mL；本实施例中V为供试品溶液上机体积1mL/上机供试品溶液占总供试品溶液的份数,即V＝1mL/(1/100)＝100mL；
m─供试品的质量，g，即下表2中的称样量；
10.9─非变性II型胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数；
1000─g与mg之间的换算倍数。
采用上述检测方法检测得到的结果如下表4所示。
表4
Figure BDA0002750689020000162
实施例3
一种测定非变性II型胶原蛋白含量的方法，包括：
1、溶液配制
1.1、1mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液(Tris溶液)：准确称取12.114g的三羟甲基氨基甲烷，溶于100mL水中，配制成Tris溶液；用浓盐酸调节pH至7.56作为储备液，使用时稀释5倍即得到0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液。
1.2、稀释液：准确称取10mg胃蛋白酶抑制剂、0.185g碘乙酰胺、0.292g EDTANa2，于1L容量瓶中，加入900mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至1L，摇匀即可。
1.3、6mol/L盐酸胍溶液：称取57.318g的盐酸胍固体，用0.2mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.4、2mg/mLα-糜蛋白酶溶液：称取0.2g的α-糜蛋白酶，用0.2mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，定容至100mL，摇匀即可。
1.5、0.2％2,4-二硝基氟苯(DNFB)乙腈溶液：准确称取0.2g的DNFB置于容量瓶中，加入适量乙腈溶解后，再采用乙腈定容至10mL，摇匀即可。
1.6、0.05mol/L乙酸钠溶液：准确称取4.1g无水乙酸钠置于1L容量瓶中，加入800mL纯水溶解，定容至1L，摇匀，溶液过0.45μm水相滤膜，取续滤液备用。
1.7、50％乙腈：准确量取500mL色谱纯乙腈于1000mL容量瓶中，用水定容，摇匀即可。
2、样品溶液的制备
2.1、供试品溶液的制备
2.1.1、去除可溶性杂质
准确称取适量供试品于50mL离心管中，本发明中可根据供试品中非变性II型胶原蛋白的大致含量调整称样量，本实施例中供试品为改善骨关节产品，其为完美牌臻固力固体饮料，厂家生产的批号为165029的改善骨关节产品1，其取样量约3.0g，在供试品中加入25mL 6mol/L盐酸胍溶液，8℃放置24h，12000r/min离心20min，去除上清液，加入25mL稀释液，4℃放置1h，18000r/min离心20min，去除上清液；采用盐酸胍溶液和稀释液的洗涤重复洗涤1次，即可获得沉淀。
2.1.2、酶解去除变性蛋白
向上述2.1.1获得的沉淀中加入20mL 2mg/mL的α-糜蛋白酶溶液，于40℃搅拌反应24h，18000r/min离心20min，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，采用水重复洗涤1次，带离心管于80℃烘干过夜，冷却即可获得纯化产物。
2.1.3、水解
将上述纯化产物置于水解管中，用2mL 8mol/L盐酸120℃水解20h，用2mL 8mol/LNaOH溶液中和，最后用蒸馏水定容至5mL获得水解产物。
2.1.4、衍生
分取100μL水解产物，依次加入200μL 0.5mol/L NaHCO3溶液和100μL 1.0％的DNFB乙腈溶液，60℃衍生1h，用0.05mol/L KH2PO4溶液终止反应并补助至1mL，涡旋混匀后过0.45μm滤膜，续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.2、对照品溶液的制备
2.2.1、精密称取约98.3mg羟脯氨酸对照品于100mL容量瓶中，加水溶解并定容，得标准储备溶液。分别精密量取羟脯氨酸储备溶液0.8mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得浓度分别为0.0786mg/mL、0.0983mg/mL、0.1966mg/mL、0.2949mg/mL、0.3932mg/mL系列羟脯胺酸溶液。
2.2.2、对照品溶液的配置：分别取100μL 2.2.1中不同浓度的羟脯胺酸溶液，采用与供试品相同的衍生步骤进行处理，取续滤液转移至自动进样瓶中上机。
2.3、阴性对照品溶液的制备
本实施例中采用的阴性对照样品溶液与实施例1相同。
3、色谱条件
色谱柱：C18色谱柱，本实施例中采用Phenomenex菲罗门C18液相色谱柱，其规格为：4.6mm×250mm，5μm。
流动相：0.05M乙酸钠为流动相A，50％乙腈为流动相B，按表5所示的梯度洗脱程序进行洗脱。
表5
Figure BDA0002750689020000191
进样量为：10μL。
检测波长为：360nm。
4、样品测定及结果计算
取供试品溶液与系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。采用系列对照品溶液根据采用外标法获得以标准品浓度x为横坐标、峰面积y为纵坐标的标准曲线，该标准曲线的线性方程为y＝2130.00288x+0.173770，R2＝0.99999。通过上述检测结果可知，在标准曲线的线性方程中，羟脯氨酸在0.07864～0.3932mg/mL浓度范围内线性关系良好。
根据标准曲线的线性方程可以查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，将羟脯胺酸的浓度代入下式(1)所示的公式中，即可计算供试品中非变性II型胶原蛋白的含量。
Figure BDA0002750689020000201
式中：
X─供试品中非变性II胶原蛋白的含量，g/100g,即％；
C─由标准曲线查得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL；
V─供试品溶液的最终定容体积，mL；本实施例中V为供试品溶液上机体积1mL/上机供试品溶液占总供试品溶液的份数,即V＝1mL/(1/100)＝100mL；
m─供试品的质量，g，即下表2中的称样量；
10.9─非变性II型胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数；
1000─g与mg之间的换算倍数。
采用上述检测方法检测得到的结果如下表6所示。
表6
Figure BDA0002750689020000211
实验例
本试验例还对实施例1所用的方法进行重复性、准确度以及定量限和检出限的考察。具体考察方法和考察结果如下：
1、重复性考察
精密称定同一批号的改善骨关节产品6份,每份3.0g(精确到0.001g)，按实施例1中供试品溶液制备方法制备后，注入高效液相色谱仪，按实施例1中的色谱条件进行测定。改善骨关节产品中羟脯氨酸的含量计算结果如表7所示。
表7
Figure BDA0002750689020000212
由表7可知，平行测定6个样品，测试结果的RSD为6.42％，低于判定标准(RSD<10％)，表明本法具有很好的重复性。
2、准确度考察
精密称取已知非变性II型胶原蛋白含量的完美牌臻固力固体饮料9份(批号:165029，换算后羟脯氨酸的含量0.466g/100g)作为供试品，每份精密称取1.5g(精确到0.001g)，根据低、中、高浓度羟脯氨酸加入量与供试品中待测羟脯氨酸的含量之比在0.8:1、1:1、1.2:1的情况下进行加标，即按表4所示的加标量B在对应的供试品中加入羟脯氨酸对照品溶液，然后采用实施例1中的方法制备供试品溶液,依照实施例1的色谱条件测定，获得羟脯氨酸的测得量C，根据羟脯氨酸的测得量C通过公式(1)即可计算得到下表8中记载的非变性II型胶原蛋白含量(％)。下述表8中羟脯氨酸理论含量A为样品中非变性II型胶原蛋白的理论含量(0.466*称样量)，结果见表8。
表8
Figure BDA0002750689020000221
通过上述表8可知：本发明方法的回收率均在80％-120％之间，RSD(％)＜10％，表明本法具有较好的准确度。
3、定量限和检出限考察
取浓度为0.07864mg/mL的羟脯氨酸溶液，按照实施例1中的方法制备出对照品溶液，逐级稀释，依照实施例1的色谱条件测定。计算出羟脯胺酸的浓度为0.01mg/mL时其信噪比为3.6，浓度为0.035mg/mL时其信噪比为11.5。通过上述检测结果可以得知：本发明方法检测羟脯氨酸的检出限为0.01mg/mL，换算后，非变性II型胶原蛋白的检测限为0.109mg/mL；本发明方法的定量限为0.035mg/mL，换算后，非变性II型胶原蛋白的定量限为0.382mg/mL。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行测量，采用羟脯氨酸作为对照品，含非变性胶原蛋白的产品作为供试品；
所述供试品制备成供试品溶液的过程包括：
纯化：去除供试品中的变性蛋白获得纯化产物；水解：将纯化产物与酸溶液混合进行水解，水解后采用碱溶液进行中和，获得水解产物；衍生：将水解产物与衍生液混合进行衍生，衍生后采用终止液终止反应，过滤后获得供试品溶液；
采用对照品配置成不同浓度的溶液，衍生后获得对照品溶液；通过对照品溶液的检测结果获得羟脯氨酸的标准曲线，根据标准曲线查询获得供试品溶液中羟脯胺酸的浓度；
根据非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数a换算得出供试品中非变性胶原蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述供试品中非变性胶原蛋白的含量的换算公式为：
Figure FDA0002750689010000011
其中，X为供试品中非变性II胶原蛋白的含量，mg/g，
C为供试品溶液中羟脯胺酸的浓度，mg/mL，
V为供试品溶液的最终定容体积，mL，
m为供试品的质量，g，
a为非变性胶原蛋白与羟脯胺酸的换算系数。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述非变性胶原蛋白为非变性II型胶原蛋白，换算系数a为10.9。
4.根据权利要求1-3任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述对照品溶液的配置过程为：采用羟脯胺酸配置成不同浓度的羟脯胺酸溶液，将不同浓度的羟脯胺酸溶液分别采用与供试品相同的衍生步骤处理获得对照品溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述水解步骤中采用的酸溶液为浓度为4-8mol/L的盐酸溶液，水解温度为100-120℃，水解时间大于20h；所述中和所用碱溶液为浓度为4-8mol/L的NaOH溶液；
所述衍生步骤中采用的衍生液包括浓度为0.3-0.7mol/L NaHCO3溶液和浓度为0.5-1.5％的DNFB乙腈溶液，衍生温度为50-70℃，衍生总时间为0.5-1.5h；所述衍生步骤中采用的终止液为浓度为0.05-0.15mol/L的KH2PO4。
6.根据权利要求5所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，
所述衍生步骤中过滤采用0.45μm的滤膜。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法所采用的色谱条件包括：
色谱柱为C18色谱柱，检测波长为340-380nm，0.03-0.07M乙酸钠为流动相A,30-50％乙腈为流动相B，采用的梯度洗脱程序为：
Figure FDA0002750689010000031
8.根据权利要求1-6任一所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述供试品中去除变性蛋白获得纯化产物的过程为：
称取供试品，采用盐酸胍溶液进行溶解，在2-8℃放置16-24h，离心，去除上清液，加入包含蛋白酶抑制剂、碘乙酰胺、EDTANa2的稀释液，2-8℃放置0.5-2h，离心，去除上清液，重复至少一次上述盐酸胍溶液和稀释液的洗涤步骤获得沉淀；向沉淀中加入蛋白酶溶液，于35-40℃搅拌反应至少24h，离心，去除上清液，水洗，离心，去除上清液，重复洗涤至少1次；干燥即可。
9.根据权利要求8所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述稀释液中蛋白酶抑制剂、碘乙酰胺、EDTANa2的质量比为(17-20):(28-31):1；所述蛋白酶抑制剂在稀释液中的浓度为8-12mg/L；盐酸胍在盐酸胍溶液中的浓度为2-6mol/L；蛋白酶在蛋白酶溶液中的浓度为0.5-2mg/mL；
所述干燥的方式为：85℃以下进行烘干或冻干；所述离心的条件为：12000-18000r/min离心15-25min。
10.根据权利要求8或9所述的一种测定非变性胶原蛋白含量的方法，其特征在于，所述盐酸胍溶液、稀释液、蛋白酶溶液均采用Tris-HCl缓冲液作为溶剂进行配置，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.2-7.6，Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05-0.2mol/L。
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