CN114994160B - 一种检测甲醛处理蛋白质/多肽/氨基酸食品/产品的分析方法 - Google Patents

一种检测甲醛处理蛋白质/多肽/氨基酸食品/产品的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测食品/产品(尤其是含蛋白质或肽类或氨基酸的食品/产品)是否被甲醛处理过的分析方法。所述方法基于甲醛在处理食品过程，甲醛与蛋白质或多肽的氨基酸残基发生共价键反应，引发氨基酸残基出现特定的化学修饰，并引起氨基酸残基分子量的改变，将这种被修饰的氨基酸残基作为甲醛对蛋白质或多肽特定修饰的标志，作为判断食品是否被甲醛处理过的标准。本发明的方法检测的是甲醛在蛋白质或多肽上的稳定结合态，即使食品被多次清洗、处理、无残留游离甲醛，仍然会保留并被检测到这种稳定结合态的“甲醛”，因此本发明的方法是一种灵敏度高、准确性好、抗干扰性强、可靠、可溯源，能用于仲裁性分析的，甄别食品/产品(尤其是含蛋白质或肽类的食品)是否被甲醛处理过的方法。

Description

一种检测甲醛处理蛋白质/多肽/氨基酸食品/产品的分析 方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种检测甲醛处理含蛋白质/多肽/氨基酸的食品/产品的分析方法。
背景技术
近年来，随着甲醛浸泡食物、食品事件的不断发生，食品中的甲醛问题已经成为公共卫生关注的焦点。相关食品安全规范也对甲醛浸泡和吊白块等加工工艺做出了规定，特别是水产食品中的甲醛问题已被列入国家食品安全战略研究的重点内容。
甲醛(CH2O)，又称蚁醛，易溶于水和乙醇。福尔马林(35％～40％甲醛水溶液)是常用的组织防腐剂和消毒剂。甲醛是一种有毒化学物质，对皮肤和黏膜有强烈的刺激作用，长期接触低浓度甲醛，可引起免疫系统、神经系统、呼吸系统和肝脏的损害。甲醛可凝固蛋白质，当它与蛋白质、氨基酸结合后，可使蛋白质变性，严重干扰人体细胞的正常代谢，对细胞具有极大的伤害作用。甲醛已被世界卫生组织确定为致癌、致畸物和公认的变态反应源，是公认的过敏源，也是可能的强致突变物。但是，因为甲醛(常采用福尔马林溶液)有保鲜、防腐及杀菌作用，一些不法商贩将其用于食品的保鲜、防腐，如在极难保鲜的水产品等食品中违法添加甲醛，用以改善水产品的感官、延长保质期。因此，准确辨别甲醛处理食品对消费者的食用安全非常重要。
目前，我国现行食品标准中，食品中甲醛残留量的检测方法大致有五类：色谱法、分光光度法、荧光法、催化动力学法、电化学法。其中色谱法最为常用。这些方法均检测的是食品/产品(主要是水产品)中残留的甲醛，所述甲醛是游离的甲醛，检测的准确性与甲醛的提取回收方式等因素直接相关。常用的提取回收方式为蒸馏法和萃取法。其中，蒸馏法是目前大部分食品安全检测中的主要手段，其优点是简单易行、成本低，不需要复杂的仪器设备；缺点是操作比较烦琐，并且需要的蒸馏装置比较复杂。特别是，如果不法商家将食品浸泡甲醛后再进行清洗，就会直接影响对游离甲醛鉴定结果的准确性，逃避甲醛的检出。综上，当前采用的主要检测方法，都是检测食品/产品中残留的游离的甲醛，不能检测甲醛处理在食品/产品中留下的不可逆痕迹和永久性证据。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种检测食品/产品(尤其是含蛋白质或肽类或氨基酸的食品/产品)是否被甲醛处理过的分析方法。所述方法基于甲醛处理食品，会在食品中的蛋白质或多肽或氨基酸上留痕，即，甲醛与蛋白质或多肽上氨基酸残基或游离氨基酸的侧链，或者，蛋白质或肽类或游离氨基酸的N端发生共价键反应，引发相应位置上出现特定的化学修饰，并引起游离氨基酸或氨基酸残基的侧链，或者蛋白质/多肽/游离氨基酸N端的分子量改变，将这种被修饰的游离氨基酸或氨基酸残基，或蛋白质/多肽/游离氨基酸的N端作为甲醛对蛋白质或多肽或游离氨基酸特定修饰的标志，并作为判断食品是否被甲醛浸泡处理过的标准。
本发明检测方法检测的是甲醛在蛋白质或多肽或游离氨基酸上的稳定结合态(多为共价键)，即使食品被多次清洗、处理，仍然会保留这种稳定结合态的“甲醛”，从而能从被甲醛处理过的食品中检测到。因此，本发明是一种灵敏度高、准确性好、抗干扰性强、可靠、可溯源，能用于仲裁性分析的，甄别食品/产品(尤其是含蛋白质或肽类或氨基酸的食品)是否被甲醛处理过的方法。
本发明人经过对比研究发现，甲醛处理含蛋白质或多肽或氨基酸的食品的过程中，甲醛可以和蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端，蛋白质或多肽上的多种氨基酸残基(如赖氨酸)的侧链或游离氨基酸的侧链发生多种化学反应，生成半缩醛胺、亚胺等新的结构，从而在原有氨基酸残基或游离氨基酸上发生+12Da、+14Da、+28Da、+30Da等分子量偏移。与未经甲醛处理的样品相比，这些氨基酸残基或游离氨基酸上这些分子量偏移的质谱峰(可能体现为某种或某些化学修饰)的丰度明显增加。因此，可以通过基于质谱的蛋白质组学技术对甲醛处理食品中蛋白质或多肽的氨基酸残基或游离氨基酸上发生的分子量变化进行检测，尤其是二级质谱检测，能够定位到蛋白质或多肽的具体氨基酸残基位置，从而确定是哪个氨基酸残基发生了分子量偏移，以辨别被检测的食品是否经过甲醛处理。此方法适用于所有含蛋白质或多肽或氨基酸的食品，包括但不限于水产品，例如鱼类(例如三文鱼等)、甲壳类(例如虾夷扇贝等)，禽畜肉类(例如鸡肉、鸭肉、牛肉、猪肉等)等，具有广泛适用性。
本发明提供一种分析含蛋白质或多肽或氨基酸的食品/产品是否被甲醛处理的质谱检测方法。
根据本发明，所述质谱检测方法包括以下步骤，使用质谱检测被检测样品，将其质谱数据与未被甲醛处理的对照品的质谱数据进行比较，通过特征性质谱峰来判断被检测样品是否被甲醛处理过，包括被检测样品的质谱中是否出现了特征性质谱峰，或者，特征性质谱峰的丰度是否增加。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da分子量偏移的检测峰；和/或，两个近端氨基酸或氨基酸残基之间的+12Da分子量偏移的检测峰。
所述游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da的分子量偏移峰包括：游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上的+12Da的分子量偏移，优选，所述的氨基酸为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)；更优选的氨基酸是赖氨酸(K)；还包括：蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上的+12Da的分子量偏移。
在本发明中，“游离氨基酸”和“氨基酸的游离态”，“游离态氨基酸”含义相同，是指独立的完整的氨基酸分子，其具有α-碳原子上的羧基和氨基。所述的游离氨基酸包括原始存在于食品或产品中的氨基酸分子，也包括，本发明中为了检测需要，对含蛋白质或多肽的食品或产品进行酶解处理，酶解后获得的独立的完整的氨基酸分子，其具有α-碳原子上的羧基和氨基。
在本发明中，“氨基酸残基”和“氨基酸的残基态”、“残基态氨基酸”含义相同，是指存在于蛋白质或多肽中的氨基酸。
在本发明中，游离氨基酸的侧链和氨基酸残基的侧链均指氨基酸分子中α-碳原子上的羧基和氨基之外的基团。
在本发明中，两个近端氨基酸或氨基酸残基包括：在同一条蛋白质或多肽中，氨基酸序列位置上邻近的两个氨基酸残基，例如序列位置上中间间隔0～8个氨基酸残基的两个氨基酸残基；在同一条蛋白质或多肽中，其二级结构或三级结构上从空间位置角度而言，邻近的两个氨基酸残基；在不同蛋白质或多肽之间，从空间位置角度而言邻近的两个氨基酸残基；或者，从空间位置角度而言邻近的两个游离氨基酸。
引起所述+12Da分子量偏移检测峰最常见的是在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上生成的噻唑烷-2-甲酸结构(thiazolidine-2-carboxylicacid)、席夫碱(或称亚胺)结构(Schiff base)、咪唑烷酮结构(imidazolidinone)；在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端形成的噻唑烷-2-甲酸结构(thiazolidine-2-carboxylicacid)、席夫碱(或称亚胺)结构(Schiff base)、咪唑烷酮结构(imidazolidinone)或环形N端结构(cyclic N-terminus)；在两个近端氨基酸或氨基酸残基之间发生增加一个亚甲基桥的交联反应。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+14Da分子量偏移的检测峰。
所述+14Da的分子量偏移峰包括：游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上的+14Da的分子量偏移，优选，所述的氨基酸为赖氨酸(K)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；还包括：蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上的+14Da的分子量偏移。
引起所述+14Da分子量偏移检测峰最常见的是在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质中氨基酸残基的侧链上形成的甲基化或甲酯结构(methyl ester)；在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的甲基化或甲酯结构(methyl ester)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+28Da分子量偏移的检测峰。
所述+28Da的分子量偏移峰包括：游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上的+28Da的分子量偏移，优选，所述的氨基酸为赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)；还包括：蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上的+28Da的分子量偏移。
引起所述+28Da分子量偏移检测峰最常见的是在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的醛基结构(-CO，Formylation)或二甲基结构(-(CH3)2-，di-Methylation)；在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的醛基结构(-CO，Formylation)或二甲基结构(-(CH3)2-，di-Methylation)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+30Da分子量偏移的检测峰。
所述+30Da的分子量偏移峰包括：游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上的+30Da的分子量偏移，优选，所述的氨基酸为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)；还包括：蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上的+30Da的分子量偏移。
引起所述+30Da分子量偏移检测峰最常见的是在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的羟甲基结构(-CH2OH)；在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的羟甲基结构(-CH2OH)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+24Da分子量偏移的检测峰，和/或，近端两个氨基酸或氨基酸残基之间的+24Da分子量偏移的检测峰。
引起所述近端两个氨基酸或氨基酸残基之间的+24Da分子量偏移检测峰最常见的包括在近端两个氨基酸或氨基酸残基之间发生增加两个亚甲基桥或一个乙烯基的交联反应。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+87Da分子量偏移的检测峰，优选为多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端上+87Da分子量偏移。
引起所述+87Da分子量偏移检测峰最常见的包括在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的环氧丙酰胺结构(glycidamide)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+129Da分子量偏移的检测峰；优选为游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上+129Da分子量偏移，优选所述的氨基酸是赖氨酸(K)。
引起所述+129Da分子量偏移检测峰最常见的包括在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的乙酰化8-羟基2,7,10-三氨基癸酸结构(Acetylhypusine)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+70Da分子量偏移的检测峰；优选为游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上+70Da分子量偏移，优选所述的氨基酸是半胱氨酸(C)。
引起所述+70Da分子量偏移检测峰最常见的包括在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的巴豆醛结构(Crotonaldehyde)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+119Da分子量偏移的检测峰；优选为游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上+119Da分子量偏移，优选所述的氨基酸是半胱氨酸(C)。
引起所述+119Da分子量偏移检测峰最常见的包括在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的半胱氨酰结构(Cysteinyl)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+1Da分子量偏移的检测峰；优选为游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上+1Da分子量偏移，优选所述的氨基酸是天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)。
引起所述+1Da分子量偏移检测峰最常见的包括游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上的脱酰胺结构(Deamidated)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+26Da分子量偏移的检测峰，优选为多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端上+26Da分子量偏移。
引起所述+26Da分子量偏移检测峰最常见的包括在多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端上形成的delta-H2C2结构。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+29Da分子量偏移的检测峰，优选为游离态氨基酸或残基态氨基酸的侧链上+29Da分子量偏移，优选所述的氨基酸是天冬酰胺(N)或谷氨酰胺(Q)。
引起所述+29Da分子量偏移检测峰最常见的包括在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的脱酰胺以及乙基化结构(Ethyl+Deamidated)。
根据本发明，所述特征性质谱峰包括游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+71Da分子量偏移的检测峰，优选为多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端上+71Da分子量偏移。
引起所述+71Da分子量偏移检测峰最常见的包括在游离氨基酸或多肽或蛋白质的N端上形成的丙酰胺结构(Propionamide)。
根据本发明，被检测样品出现上述特征性质谱峰，或者上述特征性质谱峰的丰度相对于对照品提高1倍及以上，可判断被检测样品被甲醛处理过。优选，所述特征性质谱峰的丰度增加了2倍及以上，例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
根据本发明，特征性质谱峰的丰度优选以所述特征性质谱峰在同一质谱数据中的相对值表示。所述相对值的计算以质谱峰的肽段数、谱图数、峰强度或峰面积等为指标。在本发明的一些实施方式中，以同一质谱数据中的来自内标的质谱数据为特征性质谱峰相对值的计算基础，所述内标选自同一质谱数据中通过质谱鉴定到的所有蛋白质或多肽或游离氨基酸的总数(所述总数例如是质谱鉴定的谱峰数目的总和或所有谱峰面积的累加之和或所有谱峰峰高(峰强度)累加之和)，或者，同一质谱数据中指定的某个蛋白质的总质谱数据(例如该蛋白酶解多肽的质谱鉴定的谱峰数目的总和或所有谱峰面积的累加之和或所有谱峰峰高(峰强度)累加之和)。在本发明的一些实施方式中，以同一质谱数据中的来自外标的质谱数据为特征性质谱峰相对值的计算基础，所述外标是在为质谱检测，加入的被检验样品和对照品之外的化学物质，例如结构已知的重稳定同位素标记的多肽。
根据本发明，出现所述特征性质谱峰可以是出现前述特征性质谱峰中的任一个特征性质谱峰，或者任意两个以上特征性质谱峰。
根据本发明，所述特征性质谱峰的丰度增加可以是前述特征性质谱峰中的任一个，或者任意两个以上的特征性质谱峰的丰度增加。
根据本发明，对于鱼类，例如三文鱼，可以检测前述所述的特征性质谱峰；优选检测游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或+30Da分子量偏移的质谱峰；更优选的是，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和/或精氨酸(R)侧链的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)侧链的+30Da分子量偏移的质谱峰。
根据本发明，对于虾类，可以检测前述所述的特征性质谱峰；优选检测游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或+30Da分子量偏移的质谱峰，和/或+87Da分子量偏移的质谱峰；更优选的是，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)和/或色氨酸(W)侧链的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)和/或色氨酸(W)侧链的+30Da分子量偏移的质谱峰，和/或，多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端的+87Da分子量偏移的质谱峰。
根据本发明，对于牛肉，可以检测前述所述的特征性质谱峰；优选检测游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或+30Da分子量偏移的质谱峰；更优选是，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、和/或色氨酸(W)侧链的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)、色氨酸(W)侧链+30Da分子量偏移的质谱峰。
根据本发明，对于猪肉，可以检测前述所述的特征性质谱峰；优选检测游离氨基酸的，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或+30Da分子量偏移的质谱峰；更优选的是，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、和/或色氨酸(W)侧链的+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，多肽或蛋白质或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+14Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)侧链+28Da分子量偏移的质谱峰，和/或，游离态或残基态的赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)侧链+30Da分子量偏移的质谱峰。
根据本发明，可采用本领域已知的色谱检测系统和检测条件，与质谱检测联用。所用分析条件参数可根据具体使用的色谱仪进行相应的设置和调整。
在本发明的一些实施方式中，所述色谱分析，采用0.01-5％(优选范围为0.03-1％，更优选为0.05-0.15％)甲酸水溶液为A相，含有0.01-5％(优选范围为0.03-1％，更优选为0.05-0.15％)甲酸的乙腈水溶液为B相，所述乙腈水溶液中乙腈和水的体积比为：100:0～50:50，色谱流动相的百分比均为体积百分比，进行从水相到乙腈相的反相液相梯度洗脱。本领域技术人员可以理解从水相到乙腈相的反相液相梯度洗脱的流动相以及洗脱条件可以根据色谱系统和分离目的调整其时间及梯度过程。在本发明的一些实施例中，反相液相梯度洗脱的程序为：0→(15～17)min，(96～94)％A→(88～86)％A，(4～6)％B→(12～14)％B；(15～17)min→(50～52)min，(88～86)％A→(73～71)％A，(12～14)％B→(27～29)％B；(50～52)→(65.5～66.5)min，(73～71)％A→(56～54)％A，(27～29)％B→(44～46)％B；(65.5～66.5)→(66.7～67.5)min，(56～54)％A→(2～0)％A，(44～46)％B→(98～100)％B；(66.7～67.5)→(74～76)min，(2～0)％A，(98～100)％B；例如，梯度洗脱的程序为：0→16min，5％B→13％B；16→51min，13％B→28％B；51→66min，28％B→45％B；66→67min，45％B→100％B；67→75min，100％B；
根据本发明，所述质谱检测可采用本领域已知的质谱检测系统和检测方法，以获得被检测样品和对照品的质谱数据。所用分析条件参数可根据具体使用的质谱仪器进行相应的设置和调整。
在本发明的一些实施方式中，质谱检测的条件为，0.1-20KV(优选范围为1-10KV，更优选为1.5-3KV)电压，一级谱图扫描时，电子增益(AGC)设置为0.1-50e6(优选范围为0.3-10e6，更优选为0.5-2e6)，扫描范围为200-5000m/z(优选范围为300-2000m/z)，分辨率为10000-300000(优选范围为50000-100000，更优选为60000-80000)，采用高能碰撞解离(HCD)方法，碰撞能量设为1-100％(优选范围为10-50％，更优选为22-32％)，二级谱图通过5000-50000(优选范围为10000-30000，更优选为15000-20000)分辨率获取，电子增益(AGC)设置为0.1-50e4(优选范围为0.5-20e4，更优选为4-6e4)，隔离窗口(m/z)为0.1-5(优选范围为1-3，更优选为2-2.5)，动态排除时间设为0-300s(优选范围为1-100s，更优选为5-25s)。
在本发明的一个实施方式中，使用Orbitrap Q-Exactive质谱系统。
根据本发明，所述质谱检测时，进一步包括分析所述特征性质谱峰的丰度是否增加的步骤，包括：采用能对质谱检测数据进行目标检索的数据分析软件(包括但不限于Proteome Discoverer、Mascot、maxquant等数据分析软件)，对被检测样品和/或对照品的质谱原始数据进行检索，检索对象为所述特征性质谱峰，并根据具有所述质谱峰的肽段数、谱图数、峰强度或峰面积等指标，对所述特征性质谱峰进行定量分析和对比。在利用分析软件对质谱原始数据进行检索时，可根据样品前处理中酶解使用的蛋白酶、质谱检测用的质谱仪器，进行相应数据的检索条件设置和调整。在本发明的一些实施方式中，对于采用胰蛋白酶酶解，使用Orbitrap Q-Exactive质谱系统获得的质谱检测数据，所用检索条件为最大漏切数目设为0-10个(优选范围为1-5，例如1个、2个、3个、4个、5个)，FDR≤0.01，MS质量容差为0.1-500ppm(优选范围为1-100ppm，更优选为5-20ppm，例如5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm、10ppm、11ppm、12ppm、13ppm、14ppm、15ppm、16ppm等)，二级碎片离子的质量容差为0.005-4Da(优选范围为0.01-0.5Da，更优选为0.01-0.05Da，例如0.01Da、0.02Da、0.03Da、0.04Da、0.05Da、0.06Da、0.07Da、0.08Da、0.09Da、0.1Da等)。
根据本发明，所述检测方法还包括在质谱检测被检测样品和/或对照品前，对被检测样品和/或对照品进行前处理的步骤，所述步骤包括提取和分离被检测样品和/或对照品中的蛋白质或多肽或氨基酸，对提取和分离的蛋白质或多肽进行酶解，将酶解后的产物用于质谱检测。可以采用本领域已知的蛋白质提取、分离和酶解的方法。
在本发明的一些实施方式中，所述前处理步骤包括破碎被检测样品和/或对照品，将初步破碎后的被检测样品和/或对照品进行生物化学裂解，从裂解后的混合物中沉淀出蛋白质或多肽或氨基酸，再将沉淀后的蛋白质或多肽或氨基酸采用蛋白酶进行酶解。
在本发明的一些实施方式中，所述破碎被检测样品和/或对照品包括：取适量重量的(例如50-200mg)的样品，加入没过样品量的缓冲溶液(例如PBS溶液)，将被检测样品和/或对照品初步破碎化，离心(例如300-10000g，1-20min)后弃上清。在初步破碎化过程中，为了防止蛋白被组织中释放的蛋白酶水解，影响后续检测，可以在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，将初步破碎后的被检测样品和/或对照品进行生物化学裂解包括：在初步破碎化离心得到沉淀物中，加入组织细胞裂解液(例如RIPA裂解液)，任选同时使用机械破碎方式(例如在体系中加入珠子，或使用研磨，或者使用刀片切割等)，将被检测样品和/或对照品破碎至无块状组织。在此过程中，为了防止蛋白被组织中释放的蛋白酶水解，影响后续检测，可以在体系中加入蛋白酶抑制剂和/或去修饰酶抑制剂。优选，在将被检测样品和/或对照品破碎至无块状组织后，继续在低温下裂解5min～120min。将裂解后的被检测样品和/或对照品溶液离心，取上清，用于随后的蛋白质或多肽或氨基酸的分离。
在本发明的一些实施方式中，从裂解后的混合物中沉淀出蛋白质或多肽或氨基酸，包括：取适量蛋白裂解液，加入蛋白质沉淀试剂，沉淀并分离得到蛋白质，用于随后的蛋白酶解。可以采用本领域已知的蛋白沉淀方法，包括但不限于使用三氯乙酸、丙酮、盐析等方法。在本发明的一个实施方式中，取适量蛋白裂解液，加入终浓度为5％～50％的TCA溶液，冰上静置1～20小时(例如1～3小时)，沉淀蛋白；将沉淀后的裂解液离心，弃去上清；加入适量0.01％-2％盐酸丙酮(例如0.1％)，清洗沉淀，离心，弃去上清；加入适量冰丙酮，清洗沉淀，离心，弃去上清；挥净残留的丙酮。
在本发明的一些实施方式中，采用蛋白酶或水解酶(包括但不限于胰蛋白酶、Chymotrypsin、Glu-C、Lys-C、Arg-C、Asp-N、Cyanogen bromide(CNBr)、BNPS-skatole、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)酶解分离得到的蛋白质或多肽，获得酶解后更小的酶解多肽片段或氨基酸，用于随后的质谱检测。在本发明的一个实施方式中，采用蛋白酶进行一到两次酶解处理。在本发明的一个实施方式中，在进行蛋白酶酶解过程中，加入二硫苏糖醇以断裂二硫键，使酶解更充分。在本发明的一个实施方式中，使用胰蛋白酶，在pH值为7～10下，对沉淀的蛋白质或多肽进行第一次酶解，酶解后依次加入DTT溶液、IAA溶液和半胱氨酸溶液，进行二硫键断裂反应，之后，使用胰蛋白酶，在pH值为7～10下，进行第二次酶解。酶解反应结束后调节溶液pH值为酸性，终止酶解。离心后取上清，去除溶剂后待用。
在本发明的一个具体实施方式中，向沉淀的蛋白质或多肽中加入5～500mM(优选范围为40～200mM，更优选为90-110mM)NH4HCO3溶液，使蛋白终浓度为0.1～100μg/μl(优选范围为0.2～50μg/μl，更优选为1～10μg/μl)；按蛋白质与胰蛋白酶质量比为(10～500):1(优选范围为(30～100):1，更优选为(40～60):1)的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为7～10(优选范围为7.8～8.5)，于37℃水浴酶解0.5-40h(优选范围为1～24h，更优选为10～12h)；第二天，将酶解得到的溶液离心，加入终浓度为1～10mM(优选范围为2～8mM，更优选为4～6mM)的DTT溶液，30～80℃(优选范围为50～60℃)振荡反应0.1～5(优选范围为0.5～2)小时；反应完毕后，向溶液中加入终浓度为5～50mM(优选范围为10～30mM，更优选为14～20mM)的IAA溶液，避光反应10～120分钟(优选范围为30～60分钟)；向反应完后的溶液中加入终浓度为5～100mM(优选范围为10～50mM，更优选为25～35mM)的半胱氨酸溶液，室温振荡反应5～100分钟(优选范围为15-45分钟)；按蛋白质与胰蛋白酶质量比为(10～500):1(优选范围为(50～200):1，更优选为(90～110):1)的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为7～10(优选范围为7.8-8.5)，于37℃反应0.5～24h(优选范围为1～10h，更优选为3～5h)，进行二次酶解。向酶解反应结束后的溶液中加入适量酸性液体(例如TFA溶液)，调节溶液pH值为酸性，终止酶解。离心后取上清，去除溶剂后待用。
根据本发明，所述前处理步骤中还可以包含对蛋白裂解液进行蛋白含量测定的步骤，以定量其中的蛋白质含量，用于后期甲醛修饰的相对含量定量。可以采用本领域已知的蛋白质定量检测方法，包括但不限于BCA蛋白定量检测试剂盒，考马斯亮蓝定量检测法等。
在本发明的一个实施方式中，所述对照品的质谱数据是事前检测获得并固定的，可被不同场合下，同类被检测样品的质谱检测重复使用，优选，被检测样品的前处理和质谱检测根据对照品质谱数据获得时使用的相同方法和条件进行。
在本发明的一个实施方式中，所述被检测样品和对照品进行平行的前处理和质谱检测，将获得的被检测样品和对照品的质谱数据进行对比分析。
本发明还提供一种检测含蛋白质或多肽或氨基酸的食品/产品是否被甲醛处理过的方法。
根据本发明，所述方法包括以下步骤：检测被检测样品，将其检测结果与未被甲醛处理的对照品的检测结果相比，分析其是否存在游离氨基酸或氨基酸残基的化学结构被甲醛共价修饰形成的特定结构，或者进一步分析其所述特定结构的含量是否增加。
根据本发明，如果与对照品相比，被检测样品存在所述特定结构，或者特定结构的含量增加了1倍及以上，可判断被检测样品被甲醛处理过。优选，所述特定结构的含量增加了2倍及以上，例如3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。
根据本发明，所述特定结构包括但不限于：在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的噻唑烷-2-甲酸结构、席夫碱(或称亚胺)结构或咪唑烷酮结构，优选，所述的氨基酸是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)；或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的噻唑烷-2-甲酸结构、席夫碱(或称亚胺)结构、咪唑烷酮结构或环形N端结构。
根据本发明，所述特定结构包括但不限于：在两个近端氨基酸或氨基酸残基之间形成一个亚甲基桥的结构。
根据本发明，所述特定结构包括：在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的甲基化结构或甲酯结构(-(CH3))，优选，所述的氨基酸是赖氨酸(K)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的甲基化结构或甲酯结构(-(CH3))。
根据本发明，所述特定结构包括：在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的醛基结构(-CO)或二甲基结构(-(CH3)2)，优选，所述的氨基酸是赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)；或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的醛基结构(-CO)或二甲基结构(-(CH3)2)。
根据本发明，所述特定结构包括：在游离氨基酸的侧链，或者多肽或蛋白质上氨基酸残基的侧链上形成的羟甲基结构(-CH2OH)，优选，所述的氨基酸是赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)；或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的羟甲基结构(-CH2OH)。
根据本发明，所述特定结构还包括：在两个近端氨基酸或氨基酸残基之间形成两个亚甲基桥或一个乙烯基的结构。
根据本发明，所述特定结构还包括：在游离赖氨酸的侧链或赖氨酸残基侧链上形成的：乙酰化8-羟基2,7,10-三氨基癸酸(Acetylhypusine)结构。
根据本发明，所述特定结构还包括：在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端形成的delta-H2C2结构。
根据本发明，所述特定结构还包括：在游离半胱氨酸的侧链或者半胱氨酸残基侧链上形成的：巴豆醛结构(Crotonaldehyde)或半胱氨酰结构(Cysteinyl)。
根据本发明，所述特定结构还包括：在游离天冬酰胺或谷氨酰胺的侧链，或者天冬酰胺残基或谷氨酰胺残基的侧链上形成：脱酰胺后的结构(Deamidated)，或脱酰胺以及乙基化结构(Ethyl+Deamidated)。
根据本发明，所述特定结构还包括：在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端形成的环氧丙酰胺结构(glycidamide)。
根据本发明，所述特定结构还包括：在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端形成的丙酰胺结构(Propionamide)。
根据本发明，优选所述特定结构为：在赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)的游离态或残基态的侧链上形成的噻唑烷-2-甲酸结构、席夫碱(或称亚胺)结构、咪唑烷酮结构，或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的噻唑烷-2-甲酸结构、席夫碱(或称亚胺)结构、咪唑烷酮结构或环形N端结构；在赖氨酸(K)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)的游离态或残基态的侧链上，或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上，形成的甲基化结构或甲酯结构；在赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)的游离态或残基态的侧链上，或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上形成的醛基结构(-CO)或二甲基结构(-(CH3)2)；在赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、半胱氨酸(C)的游离态或残基态的侧链上，或者，在蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端上，形成的羟甲基结构(-CH2OH)。
根据本发明，检测样品和/或对照品中所述特定结构的方法包括但不限于，采用质谱检测，检测反映所述特定结构的质谱峰；或者，使用能够特异性结合具有上述任一特定结构的氨基酸残基或结构片段的抗体，采用免疫学的方法检测；或者，使用以上述任一特定结构的氨基酸残基或结构片段为目标的检测方法，包括但不限于核磁共振波谱法、光谱法(紫外及可见分光光度法、原子吸收分光光度法、分子荧光法、红外分光光度法)、电化学法(电位法、电导法、库仑法、极谱法、伏安法)、色谱法(液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、超临界色谱法)、分子印迹法、X-射线单晶法、放射化分析法、芯片分析法。
所述质谱检测方法如前文所述。
根据本发明，所述抗体免疫学检测，可以是酶联免疫吸附或荧光免疫检测方法，通过在抗体上进一步结合酶或荧光物质，进行显色或荧光检测。
根据本发明，所述抗体可以通过本领域已知的抗体制备方法制备获得，包括但不限于用具有所述特定结构的氨基酸免疫动物制备多克隆抗体，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，或利用基因工程技术制备重组抗体等。
根据本发明，所述含蛋白质或多肽或氨基酸的食品/产品包括但不限于新鲜的，生的，冰冻的或经过加热、腌制等处理的等含蛋白质的食品/产品，优选为未被加热和腌制处理的。种类包括但不限于，各种水产品(例如各种鱼类、虾、蟹、贝类等)，各种畜禽的肉类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、羊、猪、牛、驴等)，各种由生肉类加工而成的产品(例如鱼丸、牛肉丸、香肠、腌肉等)，优选为未被加热和腌制处理的水产品、畜禽肉类，以及由这些水产品或畜禽肉类加工而成的产品。
本发明中，氨基酸是本领域已知的。下表列出了天然氨基酸的中文名称、英文名称，三个字母缩写，一个字母缩写和结构式。在本发明的行文中，可以使用氨基酸的中文名称、英文名称，三个字母缩写，一个字母缩写和结构式来表示对应的氨基酸。
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附图说明
图1三文鱼、牛、猪、虾开源检索的结果
图2甲醛处理组与未处理组在15种氨基酸修饰上的定量分析比较
图3甲醛处理组与未处理组在蛋白质的多肽N端、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)等氨基酸残基上发生的+12Da和+30Da分子量偏移峰的定量分析比较
图4对BSA甲醛处理组与未处理组交联修饰的比较
图5不同时间、不同浓度甲醛浸泡三文鱼样品的赖氨酸(K)残基+12Da/+14Da/+28Da以及任一N端+12Da的变化结果
图6甲醛溶液浸泡前后不同蛋白质样品的赖氨酸(K)残基+12Da修饰变化结果
图7甲醛溶液浸泡后清洗和不清洗对样品中赖氨酸(K)残基+12Da修饰的检测结果的影响
图8甲醛处理前后样品中赖氨酸(K)含有+12Da修饰的蛋白质的GO功能富集分析结果
图9甲醛处理前后样品中赖氨酸(K)含有+12Da修饰的蛋白质的相互作用网络分析结果
图10以三文鱼为测试样品，采用甲醛处理和分析共计进行6次重复性实验，测定赖氨酸(K)残基+12Da/+14Da/+28Da以及任一N端+12Da分子量偏移峰的检测结果
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的常规原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备；所进行的操作都是本领域已知的，或者按照市售商品的用户手册进行。
缩写：TCA：三氯乙酸；DTT：二硫苏糖醇；IAA：碘乙酰胺；TFA：三氟乙酸。
在以下描述中，“任一N端”和“任意N端”的含义相同，指的是蛋白质或者多肽或者游离氨基酸的N端。
本发明以下实施例中所用的通用实验方法：
对样品用不同浓度(例如1％，5％，36％，37％)的甲醛进行浸泡处理。
1、样品破碎与蛋白质提取
取100mg左右的样品，加入没过样品量的PBS溶液，剪碎样品，离心(5000g，5min)后弃上清。加入600μl RIPA裂解液和珠子，使用组织破碎仪将样品破碎至无块状组织。低温再裂解10min～30min，离心，将上清转移至新的离心管中。
2、蛋白质浓度检测
采用BCA蛋白质定量检测试剂盒，具体方法如下：
配制梯度稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品，浓度分别为0/0.125/0.25/0.5/1/2μg/μl。将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B混合(试剂A与试剂B的体积比为50:1)，制备工作液。取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各25μl，加入到微孔板中(检测范围＝20-2000μg/mL)。在每一个孔中加入200μl工作液，并在震荡器上震荡30秒，使其充分混合。将微孔板密封，在37℃孵育30分钟。将微孔板冷却到室温。使用微孔板分光光度计，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。将BSA标准品在562nm处经过空白校正的平均吸光值对其浓度(μg/mL)作图，绘制标准曲线，计算待测蛋白质样品的浓度。
3、蛋白质分离与酶解
取出含约100μg蛋白的蛋白裂解液，加入TCA溶液(终浓度约20％～30％)，冰上静置2小时，沉淀蛋白。将沉淀后的裂解液高速(16000g)离心10分钟，弃去上清。加入1ml0.1％盐酸丙酮，清洗沉淀，高速(16000g)离心5分钟，弃去上清。加入1ml冰丙酮，清洗沉淀，高速(16000g)离心5min，弃去上清。室温放置约15分钟，使残留的丙酮挥发干净。向离心管中加入100mM NH4HCO3溶液，使蛋白终浓度为1～2μg/μl。按蛋白质与胰蛋白酶质量比为50:1的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为8，于37℃水浴酶解过夜。第二天，将酶解得到的溶液离心，加入DTT溶液(终浓度为5mM)，56℃振荡反应1小时。反应完毕后，向溶液中加入IAA溶液(终浓度为15mM)，避光反应45分钟。向反应完后的溶液中加入半胱氨酸溶液(终浓度为30mM)，室温振荡反应30分钟。按蛋白质与胰蛋白酶质量比为100:1的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为8，于37℃反应4h，进行二次酶解。向酶解反应结束后的溶液中加入适量TFA溶液，调节溶液pH值为酸性，终止酶解。高速(16000g)离心10分钟，吸取上清到一新的离心管中。将酶解得到的多肽溶液于真空浓缩仪中旋干待用。
4、质谱分析
将多肽样品经Zip-Tip Micro-C18除盐后，加入7μl A相溶液(0.1％甲酸水溶液)溶解样品，取5μl上样到Nano-LC系统(EASY-nLC 1000)经C18柱进行分离(50μm内径×15cm，2μm C18)，分离后的样品直接进入到Orbitrap Q-Exactive质谱系统中。利用数据依赖采集(data-dependent acquisition,DDA)模式进行分析，使用75min的液相梯度，洗脱梯度为0→16min，5％→13％B；16→51min，13％→28％B；51→66min，28％→45％B；66→67min，45％→100％B；67→75min，100％B，所述B相为含0.1％甲酸的乙腈。电压设置2.4KV，一级谱图扫描时，电子增益(AGC)设置为1e6，扫描范围为350-1800m/z，分辨率为70000，采用高能碰撞解离(HCD)方法对丰度排序前15的2-4价多肽进行碰撞破碎，碰撞能量设为27％，二级谱图通过17500分辨率获取，电子增益(AGC)设置为5e4，隔离窗口(m/z)为2.2，动态排除时间设为15s。
5、数据分析
采用Proteome Discoverer、Mascot、Maxquant数据分析软件，对质谱原始数据进行检索。检索对象和参数如下：以Uniprot上下载的相应物种的蛋白质组学FASTA文件建立数据库，以赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)等氨基酸+12Da(Schiff)、+30Da(Methylol)的分子量偏移以及pFind检索得出的15种修饰等作为可变修饰，蛋白水解酶为胰蛋白酶，最大漏切数目为5个，FDR≤0.01。MS质量容差为10ppm，二级碎片离子的质量容差为0.02Da。根据具有相应分子量偏移的质谱峰的肽段数、谱图数、峰强度或峰面积为指标，对所述特征性质谱峰进行定量分析，以同一质谱数据中通过质谱鉴定到的所有蛋白质酶解多肽的相应指标的总数作为所述特征性质谱峰的丰度的计算基础。
以下实施例研究和分析了甲醛对含蛋白质的食品中的氨基酸修饰的类型，以及所述修饰对检测食品是否经过甲醛处理的灵敏性、准确性和稳定性。
实施例1生物信息学开源检索
以三文鱼、虾、牛肉、猪肉分别作为鱼类、虾夷扇贝甲壳类等水产品、禽畜类副产品的代表，对样品进行甲醛(福尔马林溶液36％)处理，采用前述通用方法中的1、2、3和4分别对处理后的样品和未处理的样品进行蛋白质提取、分离、酶解与质谱分析，通过pFind 3软件对检测的质谱数据进行开源检索(或称为开放性检索(open search)，即，不设定检索条件)(图1)，用于确定甲醛修饰发生的位置和修饰类型。进行开源检索使用的理论对比质谱图，是从Uniprot数据库中获得对应物种的蛋白质组学FASTA文件。
申请人在甲醛处理后的三文鱼、虾、牛肉、猪肉中分别检索和鉴定到200种、144种、267种、216种修饰类型(如下表A-D所示，其中每个单元格中代表一种修饰，“[]”之前表示修饰类型，“[]”中表示发生修饰的位置)，其中属于四种物种共有的修饰有35种(详见表1)。随着研究的深入，还会发现其他的修饰类型，并且可能会发现不同物种间存在差异修饰。
表A
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表B
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表C
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表D
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表1目前发现的甲醛处理后的三文鱼、虾、牛肉、猪肉中共有的35种修饰种类
上述35种修饰中，与未经甲醛处理的样品进行对比，得到甲醛处理样品组特有的修饰种类15种(详见表2)。
表2目前发现的与未经甲醛处理的样品相比，甲醛处理样品中特有的15种修饰种类
修饰类型 修饰发生的位置 修饰的结构/组成 单一同位素分子量 平均分子量
Acetylhypusine K H(11)C(6)N O(2) 129.078979 129.157
C+12 任一N端 C 12 12.0107
Crotonaldehyde C H(6)C(4)O 70.041865 70.0898
Cysteinyl C H(5)C(3)N O(2)S 119.004099 119.1423
Deamidated N,Q H(-1)N(-1)O 0.984016 0.9848
Delta_H(2)C(2) 任一N端 H(2)C(2) 26.01565 26.0373
Dimethyl(Ethyl) K，任一N端 H(4)C(2) 28.0313 28.0532
Ethyl+Deamidated N,Q H(3)C(2)N(-1)O 29.015316 29.0379
Formyl K CO 27.994915 28.0101
glycidamide 任一N端 H(5)C(3)N O(2) 87.032028 87.0773
Hydroxymethyl N H(2)C O 30.010565 30.026
Methyl H,K H(2)C 14.01565 14.0266
methylol Y,N H(2)C O 30.010565 30.026
Propionamide 任一N端 H(5)C(3)N O 71.037114 71.0779
Thiazolidine K,Y C 12 12.0107
通过前述通用方法中的5数据分析方法进行生物信息学分析，对上述15种修饰种类对应的分子量偏移的质谱峰进行检索，并进行定量分析(结果见图2)。同未经甲醛处理的样品进行比较，甲醛处理后分子量偏移的质谱峰(意味着氨基酸可能发生了修饰反应)发生了不同程度的变化。选取四种物种中变化均相对较大的四种分子量变化的为代表，分别为赖氨酸残基+14.0266Da、任一N端+12.0107Da、赖氨酸残基+28.0101Da、赖氨酸残基+12.0107Da，分别命名为K+14Da、C+12[Any N-term](或N-term+12Da)、K+28Da、K+12Da，它们均可作为是否甲醛浸泡处理的重要判断依据。除此之外，每个物种还有其特定的变化明显的分子量偏移峰，例如虾的任一N端+87Da分子量偏移峰。
发明人结合检测结果、生物信息学检索和分析结果，以及文献研究报道，确定出如下4个分子量偏移质谱检测峰所包含的明确的由甲醛处理导致的修饰结构，列表如下。表中“Pep”代表肽链，“Protein”代表蛋白质，两者含义相同，均是至少由两个以上氨基酸残基形成的肽或蛋白质：
表3
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实施例2+12Da、+30Da分子量偏移峰的研究
以三文鱼、虾、牛肉、猪肉，采用甲醛(福尔马林溶液36％)处理样品，按照上述通用实验方法里的1、2、3、4进行蛋白质提取、分离、酶解与质谱分析，通过通用实验方法里的5利用生物信息学对质谱数据进行检索，以赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)等氨基酸残基+12Da、+30Da的分子量偏移为可变修饰，将甲醛处理组与未处理组的氨基酸修饰进行定量分析，结果见图3。
从图3可见，同未经甲醛处理的样品进行比较，甲醛处理后分子量偏移的质谱峰(意味着氨基酸发生了修饰反应)发生了不同程度的变化。在四种物种中，赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)的+12Da和+30Da都有较明显的变化，可以作为是否甲醛浸泡处理的判断依据；特别是以赖氨酸+12Da变化尤为明显，可作为是否甲醛浸泡处理的重要判断依据。
在三文鱼中，苯丙氨酸(F)和精氨酸(R)的+12Da的变化也很明显，也可以作为三文鱼是否甲醛浸泡处理的判断依据。
在虾中，精氨酸(R)+12Da，色氨酸(W)+12Da和+30Da的变化也很明显，也可以作为虾类是否甲醛浸泡处理的判断依据。
在牛肉中，精氨酸(R)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)的+12Da的变化也很明显，也可以作为牛肉是否甲醛浸泡处理的判断依据。
在猪肉中，精氨酸(R)、组氨酸(H)、色氨酸(W)的+12Da的变化也很明显，也可以作为猪肉是否甲醛浸泡处理的判断依据。
实施例3交联修饰的研究
甲醛具有高反应活性，同时对细胞和组织具有高渗透性，已广泛应用于生物学、生物技术和医学研究。蛋白质的甲醛交联被认为是在两个近端氨基酸之间形成一个或两个亚甲基桥结构，或者一个乙烯基结构(-HN-(CH2)-NH-，-HN-CH＝CH-NH-)。
在本实施例中，我们以BSA蛋白为模型，采用生物信息学对甲醛处理的BSA蛋白进行检索，结果见图4。从图4可以看出，甲醛处理后，BSA发生明显的+12Da、+24Da的质量偏移，并以+24Da的质量偏移为主。对所述的+12Da、+24Da的质量偏移按照发生位置进行分类统计后发现，甲醛处理后，在两个近端氨基酸之间存在相当比例的+12Da、+24Da的质量偏移，即，在两个近端氨基酸之间形成了亚甲基桥或乙烯基结构，因此，交联反应的分子量变化亦可作为是否甲醛浸泡处理的重要判断依据。
实施例4甲醛处理反应条件的影响研究
本实施例以三文鱼样品为例，分别采用不同甲醛浓度(0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1％、2％、4％、8％、16％、20％、36％)和不同甲醛浸泡时间(0.5h、1h、2h、4h、8h、24h)对样品进行处理，不同浓度的甲醛实验处理相同的时间为10小时，不同处理时间的实验使用同一浓度的甲醛(36％的福尔马林溶液)，再按照上述通用实验方法的1、2、3和4对样品进行蛋白质提取、分离、酶解和检测，并与未经浸泡的样品(对照组)做对比，以赖氨酸残基的+12Da/+14Da/+28Da以及任一N端+12Da的变化为例，进行定量分析，并进行拟合，结果见图5。如图5所示，甲醛处理后，四种修饰均发生明显升高，说明使用低至0.1％浓度的甲醛处理，或者用36％的甲醛处理短至半个小时，甲醛在蛋白质层面都会留下痕迹，对甲醛和蛋白质的共价结合产物进行质谱分析，是灵敏和可靠的检测方法。其中，任一N端的+12Da的分子量偏移和赖氨酸+12Da是更为敏感的指标。
进一步分别以三文鱼、虾、猪肉、牛肉为样品，对用甲醛溶液处理前后的样品进行蛋白质提取与质谱检测，结果如图6所示，以赖氨酸的+12Da修饰为例，甲醛溶液处理后此修饰变化在各个甲醛处理样品中均明显升高，约8-20倍。这说明以赖氨酸的+12Da修饰为指标，可以对食品是否做过甲醛浸泡的判断标准，而本发明的方法对甲醛处理含蛋白质的食品的检测具有普适性。
实施例5甲醛处理后样品的清洗对检测结果的影响研究
本实施例以虾和三文鱼为例，均取了三等份样品(各100mg)，以不做处理的正常样品作对照组，另外两份采用甲醛溶液(福尔马林溶液，浓度为35-40％)浸泡24小时，再对其中被甲醛溶液处理后的一份进行清洗(20L自来水冲洗并浸泡三分钟)重复三次。
采用前述方法，对三份样品中的赖氨酸残基+12Da修饰进行分析，结果见图7。从图7实验结果来看，甲醛处理后，赖氨酸+12Da修饰明显升高，而清洗与不清洗的分析结果几乎没有区别。这表明本发明的检测结果不受甲醛处理后是否再清洗的影响，所检测信号为甲醛在食品/产品上留下的永久性信号。
实施例6对内源性甲醛和外源性甲醛的区分研究
本实施例以三文鱼为代表，对甲醛处理前后样品中赖氨酸残基含有+12Da修饰的蛋白质进行GO功能富集分析，结果见图8。从图8可见，甲醛处理后含有赖氨酸+12Da修饰的蛋白质明显增多，且具有不同的细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecularfunction,MF)、生物过程(biological process,BP)。同时具有不同的蛋白质相互作用网络关系(结果见图9)。因此，本发明的方法还可以用于对甲醛未处理的样品进行检测，进而区分内源性和外源性甲醛造成的修饰。
实施例7实验重复性的研究
本实施例以三文鱼为例，采用前述通用方法中的1、2、3和4对未处理的样品和甲醛处理0.5h和10h的样品分别进行蛋白质提取、分离、酶解与质谱分析，测定赖氨酸残基+12Da/+14Da/+28Da以及任一N端+12Da分子量偏移峰的含量，各进行6次重复性实验，将6次重复实验定量检测的结果进行统计，如图10所示，标准差很小，表明实验结果重复性良好，说明此检测方法稳定可靠。
此外，从图10可见，甲醛处理0.5h后任一N端+12Da的分子量偏移峰的丰度增加的程度与甲醛处理10h的相当，均非常显著的高于未经甲醛处理的对照品，表明任一N端+12Da的分子量偏移峰是非常灵敏的甲醛检测指标。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种分析含蛋白质或多肽或氨基酸的食品是否被甲醛处理的质谱检测方法，其特征在于包括以下步骤，使用质谱检测被检测样品，将其质谱数据与未被甲醛处理的对照品的质谱数据进行比较，通过特征性质谱峰来判断被检测样品是否被甲醛处理过，包括被检测样品的质谱中是否出现了特征性质谱峰，或者，特征性质谱峰的丰度是否增加，所述特征性质谱峰包括以下检测峰：
游离态或残基态的赖氨酸的+12Da分子量偏移的检测峰；蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+12Da分子量偏移的检测峰；游离态或残基态的赖氨酸的+14Da分子量偏移的检测峰；和，游离态或残基态的赖氨酸的+28Da分子量偏移的检测峰；
或，再进一步包含以下检测峰中的一种以上：
游离态或残基态的精氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸的+12Da分子量偏移的检测峰；
蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+14Da分子量偏移的检测峰；
游离态或残基态的赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸或天冬酰胺的+30Da分子量偏移的检测峰；
蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+30Da分子量偏移的检测峰；
蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+87Da分子量偏移的检测峰；
游离态或残基态的半胱氨酸的+70Da分子量偏移的检测峰；
游离态或残基态的半胱氨酸的+119Da分子量偏移的检测峰；
蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+26Da分子量偏移的检测峰；
游离态或残基态的谷氨酰胺的+29Da分子量偏移的检测峰；
同一蛋白质或多肽中的或者不同蛋白质或多肽间的两个近端氨基酸或氨基酸残基之间的+12Da分子量偏移的检测峰；
同一蛋白质或多肽中的或者不同蛋白质或多肽间的两个近端氨基酸或氨基酸残基之间的+24Da分子量偏移的检测峰；
质谱检测的条件为，0.1-20KV电压，一级谱图扫描时，电子增益设置为0.1-50e6，扫描范围为200-5000m/z，分辨率为10000-300000，采用高能碰撞解离方法，碰撞能量设为1-100％，二级谱图通过5000-50000分辨率获取，电子增益设置为0.1-50e4，隔离窗口为0.1-5m/z，动态排除时间设为0-300s。
2.如权利要求1所述的质谱检测方法，其特征在于，所述被检测样品和未被甲醛处理的对照品是鱼类、虾类、牛肉和猪肉。
3.如权利要求2所述的质谱检测方法，其特征在于，对于鱼类，检测游离态或残基态的赖氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+14Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+28Da分子量偏移的质谱峰，和，蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰；
或，再进一步包含以下检测峰中的一种以上：游离态或残基态的赖氨酸或酪氨酸+30Da分子量偏移的质谱峰，酪氨酸、苯丙氨酸或精氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰。
4.如权利要求2所述的质谱检测方法，其特征在于，对于虾类，检测游离态或残基态的赖氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+14Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+28Da分子量偏移的质谱峰，和，蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰；
或，再进一步包含以下检测峰中的一种以上：游离态或残基态的赖氨酸、酪氨酸或色氨酸的+30Da分子量偏移的质谱峰，蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端的+87Da分子量偏移的质谱峰，酪氨酸、精氨酸或色氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰。
5.如权利要求2所述的质谱检测方法，其特征在于，对于牛肉，检测游离态或残基态的赖氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+14Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+28Da分子量偏移的质谱峰，和，蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰；
或，再进一步包含以下检测峰中的一种以上：游离态或残基态的赖氨酸或色氨酸的+30Da分子量偏移的质谱峰，酪氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰。
6.如权利要求2所述的质谱检测方法，其特征在于，对于猪肉，检测游离态或残基态的赖氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+14Da分子量偏移的质谱峰，游离态或残基态的赖氨酸+28Da分子量偏移的质谱峰，和，蛋白质或多肽或游离氨基酸的N端+12Da分子量偏移的质谱峰；
或，再进一步包含以下检测峰中的一种以上：游离态或残基态的赖氨酸或酪氨酸+30Da分子量偏移的质谱峰，酪氨酸、精氨酸、组氨酸或色氨酸的+12Da分子量偏移的质谱峰。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，色谱分析时，采用0.01-5％甲酸水溶液为A相，含有0.01-5％甲酸的乙腈水溶液为B相，进行从水相到乙腈相的反相液相梯度洗脱。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为：0→(15～17)min，(96～94)％A→(88～86)％A，(4～6)％B→(12～14)％B；(15～17)min→(50～52)min，(88～86)％A→(73～71)％A，(12～14)％B→(27～29)％B；(50～52)→(65.5～66.5)min，(73～71)％A→(56～54)％A，(27～29)％B→(44～46)％B；(65.5～66.5)→(66.7～67.5)min，(56～54)％A→(2～0)％A，(44～46)％B→(98～100)％B；(66.7～67.5)→(74～76)min，(2～0)％A，(98～100)％B。
9.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，采用质谱检测时，进一步包括分析所述特征性质谱峰的丰度是否增加的步骤，包括：采用能对质谱检测数据进行目标检索的数据分析软件，对被检测样品和/或对照品的质谱原始数据进行检索，检索对象为所述特征性质谱峰，并根据具有所述质谱峰的肽段数、谱图数、峰强度或峰面积，对所述特征性质谱峰进行定量分析和对比。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，特征性质谱峰的丰度以所述特征性质谱峰在同一质谱数据中的相对值表示。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，以同一质谱数据中的来自内标的质谱数据为特征性质谱峰相对值的计算基础。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述内标选自同一质谱数据中通过质谱鉴定到的所有蛋白质或多肽或游离氨基酸的总数，或者，同一质谱数据中指定的某个蛋白质的总质谱数据。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，以同一质谱数据中的来自外标的质谱数据为特征性质谱峰相对值的计算基础。
14.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，对于采用胰蛋白酶酶解获得的检测物，使用Orbitrap Q-Exactive质谱系统获得的质谱检测数据，所用检索条件为最大漏切数目设为0-10个，FDR≤0.01，MS质量容差为0.1-500ppm，二级碎片离子的质量容差为0.005-4Da。
15.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，在检测被检测样品和/或对照品前，对被检测样品和/或对照品进行前处理的步骤，所述步骤包括提取和分离样品和/或对照品中的蛋白质或多肽或氨基酸，对提取和分离的蛋白质或多肽进行酶解，将酶解后的产物用于检测。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述前处理步骤包括破碎样品和/或对照品，将初步破碎后的样品和/或对照品进行生物化学裂解，从裂解后的混合物中沉淀出蛋白质或多肽或氨基酸，再将沉淀后的蛋白质或多肽或氨基酸采用蛋白酶进行酶解。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，取适量蛋白裂解液，加入终浓度为5％～50％的TCA溶液，冰上静置1～20小时，沉淀蛋白；将沉淀后的裂解液离心，弃去上清；加入适量0.01％-2％盐酸丙酮，清洗沉淀，离心，弃去上清；加入适量冰丙酮，清洗沉淀，离心，弃去上清；挥净残留的丙酮。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，采用蛋白酶进行一到两次酶解处理。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，在进行蛋白酶酶解过程中，加入二硫苏糖醇以断裂二硫键，使酶解更充分。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，使用胰蛋白酶，在pH值为7～10下，对沉淀的蛋白质或多肽进行第一次酶解，酶解后依次加入DTT溶液、IAA溶液和半胱氨酸溶液，进行二硫键断裂反应，之后，使用胰蛋白酶，在pH值为7～10下，进行第二次酶解。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，向沉淀的蛋白质或多肽中加入5～500mMNH4HCO3溶液，使蛋白终浓度为0.1～100μg/μl；按蛋白质与胰蛋白酶质量比为10～500:1的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为7～10，于37℃水浴酶解0.5-40h；第二天，将酶解得到的溶液离心，加入终浓度为1～10mM的DTT溶液，30～80℃振荡反应0.1～5小时；反应完毕后，向溶液中加入终浓度为5～50mM的IAA溶液，避光反应10～120分钟；向反应完后的溶液中加入终浓度为5～100mM的半胱氨酸溶液，室温振荡反应5～100分钟；按蛋白质与胰蛋白酶质量比为10～500:1的比例向蛋白质溶液中加入胰蛋白酶，调节pH值为7～10，于37℃反应0.5～24h，进行二次酶解。
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