SU1108102A1

SU1108102A1 - Способ получени пероксидазы

Info

Publication number: SU1108102A1
Application number: SU823488294A
Authority: SU
Inventors: Бектас Гафурович Мухамеджанов; Гульжахан Гожахметовна Садвакасова; Рауза Минлиахмедовна Кунаева; Гульбагиля Рамазановна Балтабаева; Маулкен Акишевна Аскарова
Original assignee: Институт Ботаники Ан Казсср
Priority date: 1982-08-27
Filing date: 1982-08-27
Publication date: 1984-08-15

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ , включающий гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента , фракционирование экстракта сульфатом аммони и его гель-фильтрацию, .отличающийс тем, что, с целью увеличени выхода фермента, в качестве растительной ткани используют листь полыни, дл экстракции используют водный раствор, -содержащий NaCl в концентрации 0,490 ,51 М, и аскорбат натри в концентрации . 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации провод т ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе . или диэтиламиноэтилцеллюлозе .

Description

Изобретение относитс к биохимии и может быть использовано длд промышленного и лабораторного получени пероксидаэы Известны различные способы получени пероксидазы из корней хрена СИ и С 21 . Однако они не обеспечивают доста точно высоких выхода и активности фермента в силу длительности и многостадийнрсти процесса выделени . Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату вл етс способ получени пероксидазы, включающий гомогенизацию корней хрена, экстрак цию фермента водой, фракционировани . экстракта сульфатом аммони и его гель-фильтрацию С21. Однако способ характеризуетс недостаточно высоким выходом фермен га (удельна активность 11§0 1340 Е/мг белка). Целью изобретени вл етс увеличение выхода и активности перокси дазы. Указанна цель достигаетс тем, что согласно способу получени пероксидазы , включающему гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента , фракционирование экстракта сульфатом аммони и его гель-фильтрацию , в качестве растительной ткани используют листь полыни, дл экстракции используют водный раствор, содержащий NaCl в концентрации 0,490 ,51М, и аскорбат натри в концентрации 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации провод т ионообменную хроматографию на карбометилцеллюлозе или диэтиламиноэтилцеллюлозе. С целью увеличени выхода фермента в воду при экстракции добавл ют NaCl (0,49-0,51 М), дл предотвращени окислительного действи фенольных соединений добавл ют аскорбат натри (0,025-0,031 М). Это позвол ет значительно повысить выход целевого продукта. Пример. 70 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,5 М NaCl и отжимают через ткань. Балластные белки осаждают сульфатом аммони до 30%-ного насыщени . Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость добавл ют сульфат аммони до 80%-ного насыщени . Осадок отдел ют центрифугированием, перераствор ют в ацетатном буфере (0,005 М, рН 4,4) и пропускают через колонку с G-50. Затем провод т очистку на колонке с КМ-целлюлозой, Результаты выделени фермента представлены в таблице.

18

200 94,5

70

После

1 Пример 2.70 г полыни гомоге .визируют Б дистиллированной воде с NaCl (0,45 М). Дл осаждени балластных белков провод т высаливание балластных белков сульфатом аммони до 20%-ного насыщени . Осадок отбрасывают , а в надосадочную жидкость добавл ют сульфат аммони до 80%-ного насыщени .

Осадок отдел ют центрифугировани ,ем, перераствор ют в ацетатном буферё (0,005 М, рН 4,4) и пропускают

20,1 94,8

4,7

через колонку с G-50. Фракции, про вл ющие пероксидную активность, очищают на КМ-целлюлозе. Общий выход фермента 1,9 мг с активностью 2600 мкмоль/мин на 1 мг фермента.

ПримерЗ. 45 г полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,55 М NaCl. После удалени балластных белков, осаждаемых при 20%-ном насыщении сульфатом аммони , :провод т высаливание при 80%-ном на:сыщении . Осадок отдел ют центрифугированием и перераствор ют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 4,4). Предварительно обессоленный белок на колонке с G-50 пропускают через колонку с КМ-целлюлозой. Общий йыход белка 14,3 мг с активностью 1200 мкмоль/ми на 1 мг фермента. Пример 4, 1г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,029 М аскорбата натри . Гомогенат фильтруют и пропускают через колонку с сефадексом G-50. Получают частично очищенный ферментный препарат с активностью 372 мкмоль/мин на 1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг. ПримерЗ. 1г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде. Гомогенат фильтруют и пропуст кают через колонку с G-50. Получают частично очищенный ферментный препарат с активностью 226 мкмоль/мин на 1 мг белка с общим выходом белка 2,5 мг. . 70г полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,51 М NaCl и 0,03 М аскорбата натри . Гомогенат фильтруют и удал ют балластные белки высаливанием сульфатом аммони до 30%-ного насыщени . Супернатант высаливают суль- . фатом аммони до 80%-ного насьпцени . Полученный осадок перераствор ют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 7,7) и нанос т на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Пероксидаза злюируетс с колонки при концентрации NaCl 0,5 М. Выход белка 15 мг с удельнойактивностью 1314 мкмоль/мин на 1 мг белка. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение фермента пероксидазы с высокими выходом и удельной активностью из доступного и дешевого сырь .

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ^, включающий гомогенизацию рас тительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, содержащий NaCl в концентрации 0,490,51 М, и аскорбат натрия в концентрации. 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе. или диэтиламиноэтилцеллюлозе.