RU1799599C - Способ получени лектина - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии и касаетс  способа получени  лектина из коры робинии ложноакациевой. Целью изобретени   вл етс  повышение степени чистоты. Способ осуществл ют путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой , собранной в период распускани  почек 0,9%-ным водным раствором хлорида натри , высаливани , диализа, аффинной хроматографии на сорбенте ово- мукоид, полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного  йца, элюацию осуществл ют 1 %-ным раствором уксусной кислоты, высаливанием хлоридом натри , повторным диализом, очисткой на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, затем высаливают хлоридом натри  и лиофилизируют. Положительный эффект заключаетс  в повышении степени очистки, по данным диск-электрофореза лектин представлен двум  близко идущими изоформами.

Description

чИзобретение относитс  к получению биологически активных веществ, в частности , к способам получени  лектина из коры Robinia pseudoacacia L, Этот лектин может использоватьс  дл  проведени  исследований в биохимии и медицине, а именно, в гистохимических и цитохимических исследовани х , биотехнологии.

Цель изобретени  - повышение чистоты получаемого продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что очистку провод т на аффинном сорбенте овомуцин, полученном из нерастворимых гликопротеидов куриного  йца, высалива- ние провод т хлоридом натри , ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,07 М фосфатном буфере.

Способ получени  аффинного сорбента овомуцин дл  очистки лектинов опубликован 07.04.90., бюлл. Ms 13. А.С. № 1554961.

Сущность предлагаемого способа заключаетс  в том, что дл  очистки используют аффинный сорбент овомуцин. обладающий более высокой химической и механической прочностью, а также лучшими гидродинамическими свойствами, который к тому же обладает высоким средством к лектину коры Robinia pseudoacacia L.

Пример. Кору Robinia pseudoacacia L собирают в момент распускани  почек, когда активность лектинов максимальна. 1 кг измельченной коры экстрагируют 0,9% раствором хлорида натри  в соотношении коры к экстрагенту 1:10 на прот жении 1-3 часа при непрерывном перемешивании. Полученный экстракт отжимают через плотную ткань и центрифугируют при 2500 g на прот жении 10 мин. Затем рН раствора довод т до 3,0 и добавл ют NaCI из расчета 320 г/л. Осадок собирают центрифугированием 15 мин при 3000 д. Супернатант сливают, а

Ё

VI

Ч)

о ел о о

осадок размешивают в п тикратном количестве воды и рН раствора довод т до 8,0 ±0,5. Нерастворившийс  осадок отбрасывают.

Надосадочную жидкость, полученную на предыдущей стадии, диализируют против 0,1 М фосфатного буферного раствора, рН 7,5±0,5 с 0,5 М натри  хлорида. После диализа нанос т на колонну, заполненную аффинным сорбентом. Дл  очистки лектина, получаемого из 1 кг коры Robinia pseudoacacia L собранной в момент распускани  почек, достаточно 2,2±0,3 л сорбента . Колонку предварительно отмывают от консерванта и уравновешивают 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,5±0,5. После нанесени  раствора лектина колонку промывают тем же буферным раствором до тех пор, пока светопоглощение при 280 нм не станет ниже 0,05, затем лектин снимают с колонки путем промывки ее 1 % раствором ацетатной кислоты.

Фракции, содержащие лектин, объедин ют и белок высаливают при рН 7,0 320 г/л хлоридом натри . Осадок собирают центрифугированием , затем раствор ют в 5-кратном количестве дистиллированной воды и став т на диализ против 0,07±0,01 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0 с не менее, чем с трехкратной сменой растворител  с интервалом в 8 часов. Небольшой осадок, нерастворившийс  после диализа, отбрасывают.

,й

Отдиализованный раствор лектина нанос т на колонку, заполненную ДЭАЭ-цел- люлозой (НПО Биолар, Олайне), уравновешенную тем же буферным раствором . Объем колонки 50 см3. В этих услови х лектин проходит через колонку без задержки , тогда как пигмент и примесные белки при этом задерживаютс  на колонке.

Контроль выхода лектина провод т с помощью реакции гемагглютинации с эритроцитами человека.

10

15

20

25

30

35

45

40

Фракции, содержащие лектин, объедин ют , лектин высаливают хлоридом натри  (320 г/л), осадок раствор ют в п тикратном количестве дистиллированной воды и после диализа против воды лиофильно высушивают . Выход - 1,5±0,3 г лектина из 1 кг воздушно-сухой коры, собранной во врем  распускани  почек.

Готовый продукт после лиофильной сушки представл ет собой белый аморфный порошок, хорошо растворим в 0,9%-ном растворе натри  хлорида. Минимальна  концентраци , агглютинирующа  эритроциты человека I/O/ группы - 0,6 мкг/мл. Лучшим ингибитором активности лектина среди моносахаридов  вл етс  2-ацетами- до-2-дезоксигалактопиранозид (минимальна  концентраци , угнетающа  активность 4 гемагглютинирующих единиц лектана - 6,25 мМ). По данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле, в щелочной буферной системе, рН 8,6 в присутствии 0,1 % до- децилсульфата натри , лектин состоит из двух близко идущих изоформ, которые имеют мол.массу 56±2 кД и 60±2 кД.

Форму л а изо б р е т е ни   Способ получени  лектина путем экстракции измельченной коры робинии ложноакациевой (Robinia pseudoacacia 1.)0,9%-ным водным раствором хлористого натри , высаливани , диализа, аффинной хроматографии, элю- ции, повторного диализа и высушивани , отличающийс   тем, что, с целью повышени  степени чистоты, используют кору робинии ложноакациевой, собранную в период распускани  почек, аффинную хро- матографию провод т на сорбенте овому- , полученном из нерастворимых гликопротеидов белка куриного  йца, элю- цию осуществл ют 1%-ным раствором уксусной кислоты, высаливают хлоридом натри  и после диализа очищают на ДЭАЭ- целлюлозе в 0,07 м фосфатном буферном растворе, а перед лигофилизацией повторно высаливают хлоридом натри .