Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebniania orgoteiny.Orgoteina jest niesystematyczna nazwa, ustalona przez United States Adopted Name Council dla czlonków grupy rozpuszczalnych w wodzie bialek pokrewnych, wystepujacych w postaci zasadniczo czystej, nadajacej sie do wstrzykiwania, to znaczy zasadniczo nie zawierajacych innych bialek.Na podstawie dotychczasowej literatury mozna stwierdzic, iz ta grupa metaloprotein obejmuje bialka, wyodrebnione juz uprzednio w róznym stopniu czystosci, którym nadano takie nazwy jak hemokupreina i hepa- tokupreina (Mann, Keilin, Proc. RoyaL Soc, opisane w Biol. Sci., 126, 303 (1939)), cerebrokupreina (Porter, Ainsworth, J. Neurochem., 1, 260 (1957)), erytrokupreina (Markowitz i inni, J. Biol. Chem., 234, 40 (1959)) i cytokupreina (Carrico, Deutsch, J. Biol. Chem., 244 6087 (1969)). Na ten temat pisali równiez Mohamed, Greenberg (J. Gen. Physiol., 37, 433 (1954)), Porter, Folch (Arch. Neurol. Psychiat., 77, 8 (1957)), Porter, Ainsworth (J. Neurochem., 5, 91 (1959)), Krimmel i inni (J. Biol. Chem., 234, 46 (1959)), Wyman (Biochem.Biophys. Acta, 45, 387 (1960)), Shields i inni (j. Clin. Inv., 40, 2007 (1961)), Markowitz i inni (Anal. Chem., 33, 1594 (1961)), Porter i inni fArch. Biochem. Bioph., 105, 319 (1964)), Stansell, Deutsch (J. Biol. Chem., 240, 4299 (1965)),' ibid, 240, 4306 (1965)), Stansell, Deutsch (Clin. Chem. Acta, 14, 598 (1966)), McCord, Fridovich (J. Biol. Chem., 244, 5753 (1969)), Hartz, Deutsch (J. Biol. Chem., 244, 4565 (1969), McCord, Fridovich (J.Biol. Ohem., 244, 6056 (1969)) i Carrico, Deutsch, (ibid. 245, 723 (1970)). Niektórzy autorzy donosza, iz niektóre z tych metaloprotein wykazuja wysoki stopien aktywnosci nadtlenkowej dismutazy (McCord, Fridovich, J. Biol. Chem., 244, 6049 (1969) i Keele, McCord, Fridovich., J. Biol. Chem., 245, 7176 (1970), 246, 2875 (1971)).W brytyjskim opisie patentowym nr 1 160 151 i opisach patentowych St. Zjedn. Amer. nr 3 637 640 i 3 579 495 opisano wieloetapowy sposób wyodrebniania orgoteiny z mieszaniny rozpuszczalnych bialek.W opisach patentowych St. Zjedn. Amer. nr 3 637 641 i 3 634 251 podano sposób usuwania z orgoteiny pozosta¬ lych sladowych ilosci zanieczyszczen bialkowych na drodze ogrzewania w temperaturze okolo 70°C lub tez na drodze rozdzialu chromatograficznego na slabo zasadowych wymieniaczach jonowych takich, jak dwuetylo- aminoetyloceluloza, przy pH o wartosci okolo 6, prowadzonego ze zmiana sily jonowej.Sposób wedlug wynalazku jest bardzo prostym sposobem wyodrebniania i oczyszczania orgoteiny. Polega on na poddaniu mieszaniny bialek, zawierajacej orgoteine, dzialaniu enzymu proteolitycznego, które powoduje selektywna enzymatyczna degradacje obcych bialek, obecnych w mieszaninie.2 88 837 s Nieoczekiwanie stwierdzono, ze w praktyce orgoteina zasadniczo nie ulega degradacji pod wplywem enzy¬ mów proteolitycznych. Z tego tez powodu, w sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac jakikolwiek enzym proteolityczny, a wiec surowe lub czyste egzopeptydazy i endopeptydazy lub ich mieszaniny, obejmujace amino- peptydazy leucynowe i inne aminopeptydazy, karboksypeptydaze A i B, pepsyn, trypsyne, a-chymotrypsyne, chymotrypsyne B, aminopolipeptydaze, prolinaze, prolidaze, katepsyny, leucylopeptydaze, dwupeptydaze, pa- paine, bromelaine, ficyne, asklepaine, meksykaine, pomiferaine, plazmine, tetrahymena proteinaze, B. subtilis proteinaze, Ps. aeruginosa proteinaze, Streptococcus proteinaze, Streptomyces griseus proteinaze, na przyklad „Pronase", i inne, lub czesciowo oczyszczony ekstrakt z tkanki, na przyklad wyciagi enzymów proteolitycznych z trzustki, sledziony lub nerki.Korzystne jest stosowanie Streptgrieseus proteinazy, pankreatyny, subtilizyny, papainy i bramelainy,a zwla* szcza pankreatyny, która jest wyjatkowo odpowiednia do usuwania duzych ilosci zanieczyszczen bialkowych.Oczyszczone proteinazy, takie jak „Pronase", sa bardzo dobre do usuwania malych ilosci pozostalych bialek z zasadniczo czystej orgoteiny.Poniewaz enzymy proteolityczne same sa bialkami, przeto sposób wedlug wynalazku poczatkowo pro¬ wadzi do zwiekszenia ilosci zanieczyszczen bialkowych w mieszaninie. Enzymy jednak sa zazwyczaj samo- degradujace sie i dlatego mozna je latwo oddzielic od orgoteiny na przyklad za pomoca dializy. Czasami enzymy obdarzone sa ladunkiem lub tez maja odpowiednie rozmiary, dzieki czemu latwo je oddzielic. Ponadto stosunek wagowy zastosowanego enzymu do bialek rozlozonych proteolitycznie w mieszaninie bialek, zwykle jest mniej¬ szy od jednosci (Chance, Advanc. Enzymol., 12, 153,171 (1951)). Dlatego tez w zasadzie dzialanie enzymu polega na calkowitej lub prawie calkowitej prrzemianie obcych bialek z mieszaniny wyjsciowej w niskoczaste- czkowe fragmenty bez zmiany orgoteiny.W celu unikniecia wprowadzania zanieczyszczen bialkowych nalezy stosowac enzymy nierozpuszczalne, na przyklad, pankreatyne lub proteinaze na nierozpuszczalnym nosniku. (Emery A. N„ Kent C. A., Birmingham Univ., Chem. Eng., 21, 71-76 (1970)).Sposób wedlug wynalazku mozna stosowac do mieszanin bialek rozpuszczalnych, zawierajacych kazda ilosc orgoteiny, równiez zawierajacych mniej, niz 5%, a korzystnie mniej, niz 1% orgoteiny, na przyklad, cala mieszanine rozpuszczalnych bialek, wyekstrahowanych ze zródla orgoteiny, jak na przyklad, krwinki czerwone lub tkanka taka, jak na przyklad watroba, miesien prazkowany, nerka, miesien sercowy, tkanka plucna i jelito, lub tez czesciowo oczyszczone ekstrakty, na przyklad takie, które zawieraja 5—50% orgoteiny, i takie, które skladaja sie glównie z orgoteiny, to znaczy zawieraja wiecej, niz 50% orgoteiny, jak czesciowo oczyszczona orgoteina i zasadniczo czysta orgoteina, na przyklad 90% i wyzej procentowa. Takwiec sposób wedlug wynala¬ zku mozna stosowac jako czesc sposobu wyodrebniania orgoteiny lub tez w celu wyeliminowania sladowych ilosci zanieczyszczen bialkowych z juz wyodrebnionej, zasadniczo czystej orgoteiny.W jednej z korzystnych odmian sposobu wedlug wynalazku jako surowiec stosuje sie wodny roztwór rozpuszczalnych bialek, zawierajacy orgoteine, wyekstrahowana z jej zródla, korzystnie z watroby, a najkorzy¬ stniej z watroby wolowej.Sposób wedlug wynalazku korzystnie jest tez stosowac do wyodrebnienia orgoteiny z mieszaniny bialek, wzbogaconych w orgoteine to znaczy, do oczyszczania czesciowo wyizolowanej orgoteinyz krwi lub ekstraktu z tkanki, na przyklad z watroby lub erytrocytów, które ogrzewano w celu wytracenia bialek, nieodpornych na ogrzewanie.Sposób wedlug wynalazku korzystnie jest stosowac, ze wzgledu na jego skutecznosc, w celu wyeliminowa¬ nia wiekszosci, korzystnie co najmniej 80% obcych bialek z mieszaniny bialek, zawierajacej jedynie bardzo maly procent orgoteiny, to znaczy mniej, niz 5%, na przyklad okolo 0,01%—1%. Mieszanina taka jest na przyklad mieszanina wszystkich bialek rozpuszczalnych, wyekstrahowanych ze zródla orgoteiny, na przyklad z krwinek czerwonych, nerek i korzystnie z watroby, zwlaszcza watroby wolowej.Sposób wedlug wynalazku jest bardzo korzystny ekonomicznie ze wzgledu na zastosowany w nim, bardzo efektywnyr rozdzial chromatograficzny. Bez wstepnego frakcjonowania jedynie okolo 4 gramorównowazniki, rozpuszczalnych bialek z watroby mozna rozdzielic na 1 ml DEAE-celulozy. Po wstepnym poddaniu dzialaniu proteaz ilosc ta wzrasta co najmniej od 5 do 10 razy.Sposoby ekstrahowania mieszaniny rozpuszczalnych bialek, zawierajacych orgoteine z jej naturalnych zródel i sposoby wyodrebniania zasadniczo czystej orgoteiny z tych mieszanin opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 1 160 151 i opisach patentowych St. Zjedn. Amer. nr 3 579 495 i 3 637 640.W najkorzystniejszym przypadku rozpuszczalne bialka to takie, które pozostaja po ogrzewaniu calej mie¬ szaniny wyekstrahowanych bialek rozpuszczalnych, na przyklad w temperaturze 60—80°C, jak to opisano, na przyklad, w opisach patentowych St. Zjedn. Amer. nr 3 624 251 lub 3 579 495.Wyjsciowa mieszanine bialek, zawierajaca orgoteine, poddaje sie rozkladowi enzymatycznemu pod wplywem wybranego enzymu proteolitycznego przy takim pH, temperaturze, czasie i stosunku bialek do enzy¬ mu, w których wybrany enzym dobrze dziala. Warunki te sa dobrze znane.88 837 3 Wyjsciowa mieszanie bialek mozna stosowac w kazdym wodnym rozpuszczalniku, w którym orgoteina sie rozpuszcza i jest trwala. Korzystnie jest stosowac roztwór buforowy, na przyklad o pH = 1-13, korzystnie 4—10, na przyklad 5-6 lub okolo 7,5, przy czym korzystnie jest, jezeli zawiera on mala ilosc jednego lub wiecej metali dwuwartosciowych o promieniu jonów od 0,65 do 1,00A, na przyklad Co, Cu, Fe, Ge, Mg, Ni, Zn, Mn lub Ca, a korzystnie o sile jonowej nizszej, niz 0,1 m.Mieszanine bialek, zawierajaca orgoteine, mozna stosowac w kazdym odpowiednim stezeniu w wybranym wodnym roztworze, na przyklad tak niskim, jak 0,01% do 10% lub w wyzszym. Korzystnie jest, jezeli roztwór ma sile jonowa, zawarta w granicach 0,001 m — 0,1 m, co mozna uzyskac przez dodanie NaCI, lub buforu takiego, jak Tris, Trisglicyna, bufor fosforowy, a pozadane, zeby zawieral jeden lub wiecej metal dwuwartoscio- wyo promieniu jonu 0,65—1,00A, na przyklad Mn, Cu, Zn i/lub Mg.Rozklad enzymatyczny prowadzi sie zazwyczaj w temperaturze okolo 20—40°C, chociaz mozna równiez stosowac temperature nizsza lub wyzsza, na przyklad 0—60°C. Optymalna temperatura zalezy od aktywnosci i trwalosci wybranego enzymu.Stosunek enzymu do wyjsciowej mieszaniny protein zalezy przede wszystkim od stosunku orgoteiny do bialek obcych w wyjsciowej mieszaninie, to znaczy, im wiekszy stosunek obcych bialek do orgoteiny w miesza¬ ninie wyjsciowej, tym wiecej trzeby uzyc enzymu. 1ksc enzymu zalezy równiez od aktywnosci wybranego enzymu. Optymalna proporcje moz/ia obliczyc ze znanej aktywnosci proteolitycznej enzymu i ilosci bialek obcych w mieszaninie, które powinny byc rozlozone. Zazwyczaj nie zalezy to od stezenia orgoteiny w tej mieszaninie. Zazwyczaj stosunek wagowy enzymu do wyjsciowej mieszaniny bialek jest mniejszy od 1, i wynosi na przyklad, od 1 : 2 do 1 :1000, wlasciwy stosunek, jak juz wspomniano, zalezy od aktywnosci enzymatycznej wybranego enzymu i proporcji obcych bialek w mieszaninie.Tak oczyszczona orgoteine mozna wyodrebnic lub dalej oczyszczac róznymi sposobami. Proteolitycznie rozlozone bialka, oligopeptydy lub aminokwasy, mozna latwo oddzielic od tak oczyszczonej orgoteiny, na przyklad jednym lub wieloma sposobami takimi, jak chromatografia jonowymienna lub na zelu, frakcjonowane wytracanie przy uzyciu rozpuszczalnika lub siarczanu amonowego, i/lub ultrasaczenie, badz tez dializa, korzy¬ stnie przynajmniej tym ostatnim sposobem, który jest szybki, wydajny i niedrogi.W przypadku, gdy zanieczyszczenia bialkowe pozostaja, mozna je oddzielic, korzystnie po dializie, aby usunac bialko rozlozone proteolitycznie, na drodze adsorpcji na lub kolejnej elucji ze slabo alkalicznego, lub slabo kwasnego wymieniacza jonowego, na przyklad sposobem, opisanym w podanych ponizej przykladach.Mozna stosowac równiez inne sposoby, jak na przyklad filtracja na zelu, frakcjonowane wytracanie za pomoca rozpuszczalnika na przyklad acetonu lub etanolu, badz tez siarczanu amonowego, oraz ogrzewanie, na przyklad w temperaturze 70—75°C sposobem, opisanym w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3 624 251, co prowadzi do wytracenia pozostalych zanieczyszczen bialkowych.Ponizej podane przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku. < Przyklad I. 1 kg watroby wolowej mieszano z 2 litrami buforu Tris o stezeniu 0,025 mopH = 7,5, zawierajacego 0,3 m sacharozy i 0,05 m KCI. Zawiesine wirowano przy 13000 G w ciagu 1—2 godzin. Otrzymano 2150 ml metnej cieczy znad osadu o pH = 6,3. « 100 ml porcje tej cieczy, zawierajacej 60 mg bialka/ml, i 0,15 mg — 0,3 mg orgoteiny/ml, poddawano w temperaturze otoczenia w ciagu okolo 20 godzin dzialaniu enzymu proteolitycznego takiego, jak podano w tablicy I. Dobór ilosci kazdego enzymu oparto raczej na ich wzglednych kosztach (2 centy) ml, z wyjatkiem pankreatyny, która kosztuje 1 cent (ml), niz na spodziewanej skutecznosci ich dzialania, poniewaz chodzilo o to, by w pierwszym rzedzie uzyskac sposób, nadajacy sie do zastosowania w duzej skali, dajacy jak najwieksze korzysci ekonomiczne. i Lp i * a b c d ~~~~*"" ""' " 1 Enzym • \ 1 Strep. grlseus j proteinaza j (Pronase) i Pankreatyna | Subtilizyna Peptydaza swini Tabi i ca 1 < Ilosc enzymu | (na 100 ml ekstraktu ' z watroby) ! 200 mg ] 15g 40 mg 166 mg pH j bufor „_ ^ ! 8,0, 1 m roztwór j Tris + 1 ml 0,1 m CaT " | (koncowa objetosc —114 ml) 7,5,1 m roztwór Tris (koncowa objetosc -150 ml) 7,5, 1 m roztwór Tris (koncowa objetosc —105 ml) 7,0,1 m roztwór Tris (koncowa objetosc —112 ml) Stopien oczyszczania* 100 razy razy razy 1,5 razy4 88837 ¦ e f ""¦¦" .^.:£a.Qaina (z carica papaya) Bromelaina 16 mg 9g 6,3 (koncowa objetosc —100 ml) ,2, 1 m roztwór octanu sodowego pH = 5,0 (136 ml) 7 razy 7 razy *) Calkowite oczyszczenie odpowiada okolo 300 razom. • Analiza elektroforogramów (po dializie wykonanej w celu usuniecia rozlozonych bialek i po filtracji) cieczy znad osadu po dzialaniu enzymu wykazala, ze przy zastosowanych ilosciach, najwiecej zanieczyszczen bialkowych usunela Pronase i pankreatyna, a nastepnie w kolejnosci subtilizyna, papaina i bromelaina. Najgorsze wyniki uzyskano w przypadku peptydazy swini. Zanieczyszczenia bialkowe pozostale po dzialaniu pankreatyny i bromelainy byly najlatwiejsze do usuniecia za pomoca chromatografii jonowymiennej na DEAE-celulozie.Przyklad II. 408 g swiezej watroby zmieszano z 816 ml 0,025 m roztworu Tris, o pH = 7,5, zawieraja¬ cego 0,3 m sacharozy i 0,05 m KCI. Zawiesine wirowano przy 13000 G w ciagu 1 godziny. Otrzymano 800 ml metnej cieczy znad osadu o pH = 6,3. ¦ 100 ml porcje tej cieczy, zawierajace 15—30 mg orgoteiny, poddano dzialaniu enzymu proteolitycznego w ciagu 2 dni w temperaturze 37°C w ilosciach i warunkach, opisanych w tablicy 2, a nastepnie zastosowano dia¬ lize (dodano 0,1% azydku sodowego jako srodka konserwujacego).Tablica II I t ! I Stopien j Lp I Enzym ; Ilosc enzymu ! pH ! ! ; (na 100 ml ekstraktu) | bufor i '' l a b c d Pronase 40 mg ( \ pH = 8,0, 1 m roztwór Tris | + 1 ml 0,1 mCa** Pankreatyna 6 mg ; pH = 7,5, 1 m roztwór Tris Subtilizyna j 8 mg pH = 7,5,1 m roztwór Tris Papaina j 3,2 mg j pH = 6,2 Stopien oczyszczenia i 8,po trawieniu razy razy razy razy Najlepsze wyniki uzyskano w przypadku uzycia pankreatyny, Pronase i subtilizyny. I znów najlatwiejsze do usuniecia na drodze chromatografii jonowymiennej na DEAE-celulozie bylo bialko, pozostale po dzialaniu pankreatyny. « Przyklad III. 300 g watroby zmieszano z 600 ml 0,025 m roztworu Tris o pH = 7,5, zawierajacego 0,025 m gliceryny i 0,01 m Mn*/. Mieszanine wirowano. Pozostalosc byla duzo lepiej upakowana w roztworze buforowym. Otrzymano 570 ml cieczy znad osadu, zawierajacego 110 mg bialka/ml. Porcje tej cieczy poddano trawieniu enzymatycznemu pankreatyna lub Pronase w stezeniach, podanych w tablicy 3, a nastepnie przeprowa¬ dzono dialize w celu oddzielenia orgoteiny od rozlozonych bialek.Tablica III [ . . i ! Ilosc enzymu Lp ! Enzym (na 100 ml ekstraktu) a b i c d iI r Pronase Pronase Pankreatyna Pankreatyna 2 mg 4 mg 300 mg 600 mg ! Stopien Warunki \ oczyszczania f 38°C, pH = 8,0, 1 m roztwór Tris; 0,1% azydku Na 0,001 m Ca"" 38°C, pH = 8,0, 1 m roztwór Tris; 0,1% azydku Na 0,001 m Ca** 38°C, pH = 7,5, 1 m roztwór Tris; 0,1% azydku Na 38°C, pH = 7,5, 1 m roztwór Tris; 0,1% azydku Na 3 razy razy razy razy i \- We wszystkich badanych stezeniach (13—150 mg/ml) pankreatyna dzialala prawie jednakowo skutecznie, natomiast Pronase byla mniej skuteczna po rozcienczeniu z 2 mg/ml do 0,02 lub 0,04 mg/ml.Przyklad IV. Watrobe wolowa zmieszano z 0,025 m roztworem Tris, o pH = 7,5, zawierajacym 0,025 m glicyny i 0,01 m Mn**, w ilosci 2 ml buforu na 1 g watroby. Calosc wirowano w temperaturze 0°C przy88 837 20000 G wciagu 60 min. Otrzymana ciecz znad osadu zawierala 60 g ekstrahowanych bialek/litr, a 150 mg orgoteiny/litr. Przygotowano równiez podstawowy roztwór pankreatyny (Grade VI; z trzustki swinskiej; równo¬ waznik aktywnosci 4ANF) o stezeniu 100 mg/ml w roztworze buforowym o stezeniu 0,05 m Tris-HCI, o pH = 7,5. pH cieczy znad osadu o pH = 6,7 doprowadzono do wartosci 7,5 za pomoca 1 m roztworu Tris. Do kazdej 100 ml porcji ekstraktu z watroby wolowej dodano 6 ml (0,6 g) podstawowego roztworu pankreatyny i 1 mi 10% roztworu azydku sodowego. Mieszanine o pH - 7,5 inkubowano w temperaturze 37°C w ciagu 2 dni, podczas których kolor mieszaniny z czerwonego zmienil sie na brazowy. Pozostalo bialko w ilosci 3 g/l, a orgo- teina w ilosci okolo 150 mg/l.Mieszanine po inkubacji poddano dializie wobec odjonizowanej wody przez noc i w koncu wobec 0,005 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 6,0. Roztwór po dializie wirowano w temperaturze 0°C przy 20 000 G wciagu 1 godziny i nastepnie saczono przez mikrofiltr Versapore. Uzyskano przesacz o pH = 6,3 i przewodni¬ ctwie okolo 250 umho.Zawartosc bialek, pozostalych w orgoteinie, byla wieksza, niz 5%, w porównaniu z okolo 0,2% w przypa¬ dku ekstrakcji rozpuszczalnych bialek z wyjsciowej mieszaniny. Czysta orgoteine wyodrebniono z przesaczu w sposób, opisany ponizej.Mala kolumne o objetosci wypelnienia, równej 8,5 ml, napelniono DEAE 52 dwuetyloaminoetylocelulo- za. Ustalono pH o wartosci 6 za pomoca 0,005 m roztworu buforu fosforanowego. Rozdzial prowadzono przy szybkosci przeplywu okolo 20 ml/godz. Przez kolumne przepuszczano 253 ml wyzej opisanego przesaczu, odpo¬ wiadajacego 82 g watroby (9,6 g watroby/ml). Kolumne przemyto 30 ml 0,005 m roztworu buforu fosforano¬ wego opH = 6. Orgoteine wymyto laczna objetoscia 170 ml eluentów przy zastosowaniu elucji gradientowej liniowej. Elucje rozpoczeto 0,005 m roztworem buforu fosforanowego o pH = 6, a zakonczono 0,005 m roztwo¬ rem buforu fosforanowego o pH = 6, zawierajacego 0,075 IMaCL, Pik orgoteiny zlokalizowano za pomoca próby z enzymem NBT, a pik zanieczyszczen za pomoca próby bialkowej z blekitem coomasie na elektroforogramach na agarozie. Probówki, zawierajace orgoteine i zasadniczo nie zawierajace zanieczyszczen/zebrano razem w 1 fra¬ kcje, a probówki, zawierajace orgoteine i piwne zanieczyszczenia w 2 frakcje. Obie frakcje poddano dializie, dodano stabilizujaca sacharoze, przesaczono i poddano liofilizacji.Otrzymano 27,6 mg czystej orgoteiny (0,034% masy watroby, 62% w stosunku do calej ilosci orgoteiny, zawartej w watrobie) i 10,0 mg zasadniczo czystej orgoteiny (0,012% masy watroby, 22% w stosunku do calej ilosci orgoteiny, zawartej w watrobie). Calkowity odzysk orgoteiny wyniósl zatem 84%.Zasadniczo czysta orgoteine mozna zawrócic lub oczyszczac dalej na drodze traktowania innym enzymem proteolitycznym, na przyklad Pronase, lub tez za pomoca chromatografii jonowymiennej lub na zelu.Przyklad V. Postepowano w zasadzie w sposób, opisany w przykladzie I lub II, stosujac Pronase, naniesiona na acetyloceluloze lub hydrazyd karboksymetylocelulozy (Enzite) w ilosci, enzymatycznie odpowia¬ dajacej Flosci Pronase, stosowanej w tych przykladach. Po trawieniu Pronase oddzielono na drodze saczenia, a orgoteine wyodrebniono z przesaczu sposobem, opisanym powyzej.Przyklad VI. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie V, stosujac 1% roztwór orgo¬ teiny (o czystosci 70—97%), zawierajacy pozostale bialka obce, w 0,025 m roztworze Tris, zawierajacym 0,025 m glicyny i 0,001 m CaCI2. Po 2 dniach przechowywania w temperaturze 37°C roztwór orgoteiny byl calkowicie pozbawiony obcych bialek. Czysta orgoteine wyodrebniono na drodze saczenia, dializy i liodilizacji. < Przyklad VII. Rozpuszczone bialka oddzielono od nierozpuszczonych, znajdujacych sie w watrobie wolowej, sposobem, opisanym w przykladzie IV, lub tez na drodze saczenia pod bardzo niskim cisnieniem. Po odwirowaniu doprowadzono pH cieczy znad osadu do 6, szybko podgrzano do temperatury 65—80°C i utrzy¬ mywano w tej temperaturze w ciagu 15—90 minut. Nastepnie fcalosc oziebiono do temperatury 37°C i usunieto osad przez wirowanie lub saczenie. Pozostalo 10% bialek w przeliczeniu na ekstrahowane bialka, a orgote¬ iny — okolo 200 mg/litr. pH ogrzewanego ekstraktu doprowadzono do 7,5 za pomoca 1 m roztworu buforowego Tris i dodano, w temperaturze 37°C, okolo 3 g pankreatyny lub okolo 50 mg Pronase na litr ekstraktu. Po dwóch dniach oziebiono calosc do temperatury pokojowej i poddano dializie w sposób, opisany w przykladzie IV. Roztwór po dializie zawieral orgoteine, która mozna wyodrebnic z niego, w razie potrzeby, na drodze chromatograficznej na DEAE-celulozie, na przyklad w sposób, opisany w przykladzie IV.Przyklad VIII. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie VII, lecz ogrzewano cala mieszanine zhomogenizowanej watroby wolowej i ekstraktu wodnego przed wirowaniem, zamiast powirowaniu.W ten sposób eliminowano 1 etap oddzielania. Taodmiana pozwolila na zmniejszenie o ponad 80% ilosci obcych bialek, ekstrahowanych wspólpradowo z orgoteina z watroby. * Przyklad IX. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie VII lub VIII, stosujac w eta¬ pie traktowania enzymami najpierw pankreatyna, a potem, po 2 dniach, Pronase, zaadsorbowana na nierozpusz¬ czalnym nosniku, w ilosciach, podanych w przykladzie VII.6 88 837 Przyklad X. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie VIII, zmniejszajac objetosc ekstrahujacego roztworu buforowego o 25—75%.Przyklad XI. Postepowano zasadniczo w sposób, opisany w przykladzie VIII, zastepujac watrobe po¬ dobna iloscia przemytych, upakowanych erytrocytów z krwi bydlecej, konskiej lub ludzkiej.Przyklad XII. Postepowano zasadniczo w sposób opisany w przykladach I—IV lub VII-XI, stosujac po trawieniu pankreatyna, frakcjonowane stracanie 1/2 i 1,5 objetosci acetonu w celu dalszego zmniejszenia zanie¬ czyszczenia obcymi bialkami i w celu dalszego zatezenia koncentratu ogroteiny. Nastepnie oczyszczano osad chromatograficznie na DEAE-celulozie, stosujac próbke w ilosci, odpowiadajacej co najmniej 30 g watroby na ml adsorbentu. < Przyklad XIII. W celu okreslenia wplywu prowadzenia etapu trawienia proteolitycznego w róznych etapach wyodrebniania orgoteiny, dzialaniu pankreatyny poddano pelna watrobe wolowa, rozpuszczalne bialka z watroby wolowej i rozpuszczalne bialka z watroby wolowej po ogrzewaniu. < W celu otrzymania ekstraktu rozpuszczalnych bialek z watroby wolowej, 500 g (150 g skladników sta¬ lych) watroby wolowej zmieszano w mieszalniku z 1 litrem roztworu buforowego, zawierajacego 0,25 m Tris, 0,025 m glicyny i 0,01 m Mn** o pH = 7,5, otrzymujac 1380 ml zawiesiny. 100 ml porcje otrzymanej zawiesiny poddano obróbce sposobami, opisanymi ponizej.Sposób A. Zawiesine wirowano przy 13 000 G w ciagu 1 godziny, otrzymujac 78 ml (okolo 6 g skladni¬ ków stalych, okolo 2/3 calosci) cieczy znad osadu, zawierajacej 100% rozpuszczalnych bialek i 100% orgoteiny z wyjsciowej watroby. « Sposób B. 78 ml cieczy znad osadu ze sposobu A poddano rozkladowi proteolitycznemu przy uzyciu 300 mg pankreatyny przy pH = 7,5, w temperaturze 37°C wciagu 24—48 godzin. Pozostalo 100% orgoteiny i ponizej 10% calkowitej ilosci rozpuszczalnych bialek z wyjsciowej watroby.Sposób C. 100 ml zawiesiny wyjsciowej watroby poddano ogrzewaniu w temperaturze 65°C w ciagu 15 mi¬ nut, nastepnie ja oziebiono i poddano wirov/aniu otrzymujac 78 ml cieczy znad osadu i 7,6 g (89,5%) wytraco¬ nych nierozpuszczalnych bialek. 78 ml ciecz/ znad osadu poddano dzialaniu enzymów, zgodnie ze sposobem B.Pozostalo 100% orgoteiny i ponizej 6% wszystkich rozpuszczalnych bialek z wyjsciowej watroby.Sposób D. 78 ml cieczy znad osadu, otrzymanej po wirowaniu w sposobie A, ogrzewano w sposób, opisany w sposobie C. Po wirowaniu otrzymano 60 ml (2,7 g skladników stalych) cieczy znad osadu i 2,05 g osadu. 60 ml tej cieczy poddano nastepnie dzialaniu enzymu proteolitycznego sposobem B. Pozostalo 3—6% rozpusz¬ czalnych bialek.Z wyników, uzyskanych w przykladzie XIII, widac, iz stosowanie etapu ogrzewania przed poddaniem dzialaniu enzymów zwieksza skutecznosc dzialania anzymów. W przykladzie C i D pozostalo 3—6% z calkowitej ilosci bialek rozpuszczonych, natomiast w sposobie B ilosc ta byla wieksza od 6%.Opisane przyklady mozna powtórzyc z podobnym skutkiem, zastepujac reagenty i warunki, opisane w tych przykladach reagentami i/lub warunkami, opisanymi ogólnie lub szczególowo w niniejszym opisie. PL