DE2428248C3 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase durch Behandlung einer
verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher.
Es ist eine Anzahl von Verfahren zur Isolierung von Urokinase aus menschlichem Harn und zur Reinigung π
und Konzentration zu einem Produkt von hoher Wirksamkeit bekannt Es ist jedoch bisher noch kein
Verfahren beschrieben, nach dem Urokinase in einfacher, wirksamer und wirtschaftlicher Weise frei von
Pyrogenen gewonnen werden kann. w
Es sind bereits verschiedene Verfahren beschrieben worden, die eine große Zahl umständlicher Reaktionsstufen
zur Reinigung von Urokinase umfassen, wodurch nicht nur hochwirksame, sondern auch pyrogenfreie
Produkte erhalten worden sind. Im allgemeinen können die eigentlichen Reinigungs- oder Konzentrationsstufen
nicht von denjenigen Stufen unterschieden werden, die speziell die Entfernung der pyrogenen Substanzen
bewirken sollen. Außerdem ist festzustellen, daß die pyrogene Wirksamkeit in vielen Fällen in keiner Weise
mit der Wirksamkeit eines Urokinasepräparates verbunden ist Es wurde festgestellt, daß häufig eine
Urokinase mit hoher Wirksamkeit eine hohe pyrogene Wirksamkeit aufweist. Es besteht daher Bedarf an einer
Methode, die speziell auf die Entfernung von Pyrogenen aus Urokinase gerichtet ht.
In der US-PS 32 56 158 ist ein Verfahren zur
Reinigung von Urokinase von Pyrogenen und Thromboplastin beschrieben, bei dem unreine Urokinase mit
einem neutralen Dextrangel, das mit 6% Epichlorhydrin bo
vernetzt ist, behandelt wird.
Tn der DE-OS 21 43 815 wird ein Verfahren beschrieben,
nach dem Urokinase von Pyrogenen befreit wird. Dieses Verfahren besteht im wesentlichen in der
Adsorption an Amberlite-lRC-50-Harz, Elution der hs
reinen Urokinase.
Aus der DE-OS 22 46 969 ist bereits die Reinigung einer verunreinigten Urokinaselösung, die einen pH
zwischen 6 und 7 und eine Leitfähigkeit von mindestens 1500 Mikrosiemens besitzt, mit einem Celluloseanionenaustauscher
bekannt Die nach dieser Druckschrift erfolgende Behandlung mit dem Celluloseanionenaustauscher
liefert aber noch kein pyrogenfreies Produkt So rufen gereinigte Urokinasepräparate, die nach dem
bekannten Verfahren durch Behandlung mit Celluloseanionenaustauscher
erhalten worden sind, beim Kaninchen immer noch eine gewisse Hyperthermie hervor.
Urokinasepräparate mit einem noch stärker reduzierten Gehalt an pyrogenen Substanzen können nach den
Angaben der DE-OS 22 46 969 nur durch eine weitere partielle Sättigung der erhaltenen Lösung mit einem
Protein-Präzipitationsmittel erhalten werden.
Demgegenüber liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und wirksames
Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase zur Verfügung zu stellen, bei dem ein sehr hoher
Prozentsatz der anfänglichen Aktivität in dem pyrogenfreien Endprodukt wiedergewonnen wird.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier Urokinase durch Behandlung
einer verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher, das dadurch gekennzeichnet
ist daß man ein pyrogenhaltiges Urokinasepräparat mit verhältnismäßig hoher Aktivität in
einem der nachstehend genannten Phosphatpuffer löst, daß man die Lösung mit einem Celluloseanionenaustauscher
nach der Säulenchromatographiemethode behandelt, wobei 0,001 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert
von 6 bis 8 als Gleichgewichtspuffer, Trägerflüssigkeit und Elutionsmittel verwendet wird, und daß man die
pyrogenfreie Urokinase aus der Lösung gewinnt.
Somit stellen bei speziellen Bedingungen Celluloseanionenaustauscher
sehr wirksame Mittel zur Trennung der Urokinase von Pyrogenen dar. Celluloseanionenaustauscher
sind Cellulosen, bei denen ein TeU der Hydroxylgruppen durch basische Gruppen ersetzt ist.
Geeignete Beispiele sind Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) und Triäthylaminoäthylcellulose (TEAE).
Im Hinblick auf die Offenbarung der CA-PS 8 80 878 muß das erfindungsgemäße Verfahren als überraschend
angesehen werden, da dort festgestellt wird, daß DEAE-Cellulose zur Entfernung von Pyrogenen aus
einer rohen L-Asparaginase-Lösung völlig unwirksam ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren muß auch im Hinblick auf die DE-OS 22 46 969 als überraschend
angesehen werden, da nach dieser Druckschrift pyrogenfreie Produkte nur dann erhalten werden
können, wenn man die mit dem Celluloseanionenaustauscher behandelte Lösung anschließend noch mit einem
Protein-Präzipitationsmittel behandelt.
Der technische Fortschritt des Gegenstandes der vorliegenden Erfindung ergibt sich daraus, daß durch
Auswahl spezieller Bedingungen erfindungsgemäß eine pyrogenfreie Urokinase lediglich durch Behandlung der
verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher erforderlich ist. Eine weitere Behandlung
mit einem Protein-Präzipitationsmittel, wie es bei den Verfahren gemäß DE-OS 22 46 969 obligatorisch
ist, ist erfindungsgemäß nicht notwendig, so aau aurcn
das erfindungsgemäße Verfahren die angestrebte pyrogenfreie Urokinase in einer Stufe erhalten werden
kann.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
führt man die Behandlung bei einer Temperatur im
Für den mit der Chromatographie vertrauten Fachmann sind die anderen Reaktionsbedingungen klar,
wie beispielsweise die Wahl der besten Durchflußgeschwindigkeit in Verbindung mit der Teilchengröße des
Adsorptionsharzes, die Vorbehandlung zur Aktivierung des Harzes, die Gleichgewichtseinstellung des Harzes
und der gepackten Säule mit einer Pufferlösung gemäß dem Anspruch 1 bis zum Gleichgewichsstand und so
weiter.
Die äußere Form der in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Adsorbens verwendeten Cellulose ist an
sich nicht von entscheidender Bedeutung. Es wird jedoch eine fein zerteilte Form bevorzugt
Die Celluloseanionenaustauscher werden geeigneter- ι
weise durch ihre sogenannten »Kapazitäten« näher gekennzeichnet, d. h. die Austauschkapazitäten, ausgedrückt
in Miiliäquivalent pro Gramm Harz. Die Kapazität eines bestimmten Celluloseanionenaustauschers
wird bestimmt, indem das Harz zuerst mit NaOH in die Hydroxydform übergeführt und dann mit
Salzsäure titriert wird. Die Kapazitäten der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Celluloseharz
liegen im Bereich von etwa 0,2 bis 1 Milliäquivalente
pro Gramm Harz.
Wie oben festgestellt, besteht die Erfindung hauptsächlich
in der Entfernung der Pyrogenen aus Urokinase, obwohl ein pyrogenfreies Urokinaseprodukt
mit höherer Wirksamkeit als die Ausgangsurokinase ebenfalls erhalten wird. Demgemäß wird das erfindungsgemäße
Verfahren vorzugsweise angewendet, wenn die Entfernung von Pyrogenen aus Urokinasepräparaten
be'i obiger Wirksamkeit erforderlich und gewünscht ist, u,.abhängig vom Grad der Reinheit des
Ausgangsurokinasepräparates. !5
Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher
erläutert. Die angegebenen CTA-Einheiten beziehen sich auf die Definition, die von A. J. J ο h η s ο η et al.,
Thromb. Diath. Haemorrag. 21, 259 (1959) angegeben w
worden ist Die Pyrogenität wurde dabei nach dem USP-Pyrogentest (3 Kaninchen) bestimmt. Bei diesem
Test genügt das untersuchte Material den Erfordernissen für die Abwesenheit von Pyrogenen, wenn kein
Kaninchen einen individuellen Temperaturanstieg von « 0,6° C oder mehr über die jeweilige Kontrolltemperatur
zeigt und wenn die Summe der drei Temperaturanstiege nicht über 1,40C hinausgeht.
Beispiel 1 5()
DEAE-Cellulose mit einer Austauschkapazität von
1 Miiliäquivalent pro Gramm wurde in üblicher Weise aktiviert, mit 0,001 m Phosphatpuffer mit einem
pH-Wert von 7 ins Gleichgewicht gebracht und in eine Chromatographiesäule von 3,2 cm Durchmesser und
45 cm Höhe eingefüllt 510 mg pyrogenhaltige Urokinase mit einer Wirksamkeit von 59 000 CTA/mg wurden in
dem oben genannten Puffer gelöst, auf die Säule gegeben und bei 4° C unter Verwendung desselben
0,001 m Phosphatpuffers eluiert Die Fraktion mit einer
Absorption bei 280 ΐημ wurde aufgefangen, gefriergetrocknet,
und der Gehalt an Pyrogenen und die Wirksamkeit wurden ermittelt Es wurden 254 mg
Urokinase mit einer Wirksamkeit von 110 000 CTA/mg
erhalten. Die Bestimmung der Pyrogenwirksamkeit, bestimmt nach dem USP-Pyrogen-Test bei 15 000
CTA-Einheiten/kg, ergab eine Gesamttemperaturerhöhung (3 Kaninchen) von 1,2°; 93% der ursprünglichen
Aktivität wurden in dem pyrogenfreien Endprodukt wiedergewonnen.
Eine stark pyrogenhaitige Urokinase mit hoher Wirksamkeit wurde bei den Bedingungen des Beispiels 1
durch eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 3,2 χ 45 cm geleitet, die mit DEAE-Cellulose
gefüllt war.
Die spezifische Wirksamkeit der Urokinase stieg auf 89 000 CTA/mg an. Der Pyrogentest zeigte einen
Gesamttemperaturanstieg von 3,1°C.
Die Fraktion, die die Urokinaseaktivität enthielt wurde sodann durch eine ähnliche Säule geleitet, die mit
TEAE-Cellulose gefüllt worden war und die eine
Austauschkapazität von 0,5 mÄq/g hatte, wobei mit dem gleichen Puffer und bei den gleichen Bedingungen
wie oben gearbeitet wurde. Es wurde gefunden, daß die gesammelte Fraktion eine Wirksamkeit von
104 000 CTA/mg hatte. Sie genügte dem US-Pyrogentest bei 15 000 CTA/kg bei einem Gesamttemperaturanstieg
(3 Kaninchen) von 0,9° C.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß der 0,001-m-Phosphatpuffer bei
einem pH-Wert von 8 verwendet wurde. 400 mg stark pyrogenhaltige Urokinase mit einer Wirksamkeit von
30 000 CTA/mg wurde durch die Säule laufen gelassen, wobei 135 mg Urokinase mit einer Wirksamkeit von
88 000 CTA/mg erhalten wurde. Die aufgefangene Fraktion zeigte in dem oben beschriebenen Pyrogentest
eine Gesamtteinperaturerhöhung von 0,9°. Praktisch
die gesamte ursprüngliche Aktivität wurde in dem pyrogenfreien Urokinaseprodukt wiedergewonnen.
Beispiel 3 wurde wiederholt, wobei die Chromatographiesäule aus DEAE-Cellulose eine Austauschkapazität
von 0,7 Miiliäquivalent pro Gramm aufwies. Von den ursprünglichen 29 560 000 CTA-Einheiten wurden 25
380 000 Einheiten in der pyrogenfreien Urokinaseendfraktion wiedergewonnen. Die Gesamttemperaturerhöhung
bestimmt an drei Kaninchen nach dem USP-Pyrogen-Test bei 15 000 CTA-Einheiten/kg betrug 0,8°.
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung von pyrogenfreier '
Urokinase durch Behandlung einer verunreinigten Urokinaselösung mit einem Celluloseanionenaustauscher,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein pyrogenhaltiges Urokinasepräparat mit verhältnismäßig
hoher Aktivität in einem der nachstehend genannten Phosphatpuffer löst, daß man die Lösung
mit einem Celluloseanionenaustauscher nach der Säulenchromatographiemethode behandelt, wobei
0,001 m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6 bis 8 als Gleichgewichtspuffer, Trägerflüssigkeit und
Elutionsmittel verwendet wird, und daß man die pyrogenfreie Urokinase aus der Lösung gewinnt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Celluloseanionenaustauscher
DEAE-Cellulose verwendet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Celluloseanionenaustauscher
TEAE-Cellulose verwendet
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Behandlung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 10° C vornimmt.
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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