DE3713705A1 - Kationenaustauschermaterial und verfahren zur herstellung - Google Patents
Kationenaustauschermaterial und verfahren zur herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Kationenaustauschermaterialien und
Verfahren zum Herstellen derselben, vor allem Kationenaustauscherträgermaterialien
mit besonderer Eignung als Füllkörper
zur Flüssigchromatographie.
Die Hochleistungsanionen- und -kationenaustauscherchromatographie
hat sich zu einem leistungsfähigen Instrument zur
Analyse und Isolierung biologischer Moleküle entwickelt.
Kationenaustauscherschichten für Medien zur Hochleistungs-
Flüssigchromatographie hat man auf verschiedenen Wegen
hergestellt. Der einfachste Weg ist die Silylierung einer
Kieselsäureoberfläche mit einem anionischen Organosilan.
Derartige Reaktionen sind jedoch reversibel und können
restliche Silanole hinterlassen, welche Protein irreversibel
zu binden vermögen. Obgleich man dieses Problem umgehen
kann, indem man eine hydrophile organische Polymerenschicht
auf der Kieselsäureoberfläche bindet, ergibt dieses Verfahren
nicht die erforderliche Reproduktionsfähigkeit. Ein
anderer Weg zur Synthese einer Kationenaustauscherschicht
beginnt mit einer Organosilanreaktion, um auf einer Kieselsäureoberfläche
eine reaktive Funktion anzubringen. Die
funktionalisierte Kieselsäure wird dann mit einem vorgeformtem
Polymeren umgesetzt, wobei man eine kovalent gebundene
polymere stationäre Phase erhält. Die letzte Stufe modifiziert
das verankerte Polymer derart weiter, daß es anionisch
ist. Zwar ist die hergestellte Kationenaustauscherschicht
beständig und von großer Bindekapazität, doch ist
dieses Verfahren zum Herstellen von Kationenaustauscherschichten
ziemlich langwierig.
Frühere Arbeiten von Alpert und Regnier, die sich mit der
Chemie von adsorbiertem Polyethylenimin befaßten, wie in
US-PS 42 45 005 beschrieben, deren Kenntnis hier vorausgesetzt
wird, haben dessen äußert vielseitige Verwendbarkeit
zur Herstellung von stationären Anionenaustauscherphasen
gezeigt. Unter Anwendung der vorhandenen Adsorptionstechnologie
(für die Alpert und Regnier zur Synthese adsorbierter
polymerer Anionenaustauschermedien Pionierarbeit geleistet
haben), wurden gemäß Erfindung Kationenaustauschermaterialen
hergestellt.
Die europäische Patentanmeldung 01 43 423 schlägt Kationenaustauschermaterialien
vor, die aus Polyethylenimin hergestellt
sind, doch sieht diese Patentanmeldung eine poröse
Kieselsäure vor, an welche ein nicht-vernetztes Polyethyleniminopropylsilan
kovalent gebunden statt adsorbiert ist.
Gemäß dieser Patentanmeldung wird teilchenförmiges Siliciumdioxidgel
mit Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan umgesetzt
und die nicht-vernetzte kovalent gebundene Polyethyleniminopropylsilylkieselsäure
kann in an sich bekannter
Weise, beispielsweise mit einem geeigneten zweibasischen
Säureanhydrid in einem inerten organischen Lösungsmittel in
eine schwach saure carboxylierte Form übergeführt werden.
Gegenstand der Erfindung sind Kationenaustauschermaterialien
und Verfahren zum Herstellen derselben. Die Kationenaustauschermaterialien
der Erfindung eignen sich in hervorragender
Weise als Füllkörper oder Packungsmaterialien zur
Trennung von Proteinen und biologischen Polymeren in der
Hochleistungsflüssigchromatographie.
Zur Herstellung der Kationenaustauschermaterialien adsorbiert
man zuerst eine dünne Schicht eines Amingruppen
aufweisenden Adsorbats, vorzugsweise Polyethylenimin, an
einem organischen Trägermaterial wie Kieselsäure bzw.
Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Titandioxid. Die adsorbierte
Schicht wird dann gegebenenfalls mit einem Vernetzungsmittel
wie Epoxyharz oder Alkylbromid vernetzt. Dann
wird mindestens eine Amingruppe der adsorbierten vernetzten
Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenfängers
oder Protonenspülmittels (proton scavenger), mit einem Agens
in einer ausreichenden Menge zur Bildung mindestens einer
Carboxylgruppe umgesetzt. Vorzugsweise werden viele Amingruppen
der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer
ausreichenden Menge Reagenz umgesetzt, um Carboxylgruppen
via die Derivatisierung von Aminen zu bilden. Wenn
das angewandte Reagenz polyfunktional ist, dann enthält es
vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt
ein hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt
Polyacrylsäureanhydrid. Wenn das angewandte Reagenz monofunktional
ist, dann enthält es vorzugsweise ein hydrophiles
Monomeres, besonders bevorzugt ein hydrophiles monomeres
Anhydrid.
Alternativ werden Amingruppen der nicht-vernetzten adsorbierten
Beschichtung, vorzugsweise in Anwesenheit eines
Protonenspülmittels, mit einer ausreichenden Menge eines
polyfunktionalen Reagenz umgesetzt, um gleichzeitig die
Schicht zu vernetzen und mindestens eine Carboxylgruppe zu
bilden. Das polyfunktionale Agens enthält vorzugsweise ein
hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt hydrophiles polymeres
Anhydrid und am meisten bevorzugt Polyacrylsäureanhydrid.
Es ist daher eine Hauptaufgabe der Erfindung, ein beständiges
und reproduktionsfähiges Kationenaustauschermaterial
verfügbar zu machen. Eine andere Aufgabe besteht darin, ein
Kationenaustauschermaterial zu schaffen, das eine hohe
Belegungskapazität oder Beladungskapaziät und hervorragende
chromatographische Eigenschaften aufweist. Eine weitere
Aufgabe der Erfindung ist es, ein solches Kationenaustauschermaterial
durch ein einfaches und nicht teures
Verfahren herzustellen.
Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die
beigefügte Zeichnung beschrieben.
Die Fig. 1A, B, C und D sind graphische Darstellungen der
chromatographischen Evaluierung oder Wertung von vier ausgewählten
Kationenaustauschersäulen, die auf der Trennung
eines Proteingemischs von Cytochrom-c und Lysozym basieren.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Retention von
Lysozym als Funktion des pH-Werts an vier ausgewählten
Kationenaustauschersäulen.
Fig. 3 (A, B) und (C, D) ist eine graphische Darstellung
der chromatographischen Evaluierung bzw. Wertung von zwei
ausgewählten Kationenaustauschersäulen eines A. flos-aquae
(algae) Extrakts mit einem Gehalt an Cytochrom c533.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von
Kationenaustauschermaterialien, die vor allem als Packungsmaterial
zur Trennung von Proteinen und biologischen Polymeren
in der Flüssigchromatographie geeignet sind.
Zur Herstellung der Kationenaustauschermaterialien gemäß
US-PS 42 45 005 wird die Oberfläche eines Trägermaterials,
das eine Affinität für ein Adsorbat besitzt, mit einem
Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart in Kontakt gebracht,
daß eine membranartige Schicht das Adsorbats auf der
Oberfläche durch elektrostatische Kräfte adsorbiert wird.
Das Adsorbat ist vorzugsweise in einem Lösungsmittel enthalten
und die Adsorption kann teilweise durch Steuerung der
Polarität dieses Lösungsmittels erfolgen. Je weniger polar
das Lösungsmittel ist, desto stärker ist die Adsorption. Ein
geeignetes Lösungsmittel für diesen Zweck ist Methanol. Das
Adsorbat weist mindestens zwei funktionale Gruppen auf, von
denen eine unter Adsorption desselben mit der Oberfläche des
Trägermaterials in Wechselwirkung tritt, während die andere
zum Vernetzen gebraucht wird. Polyethylenimin ist das
bevorzugte Adsorbat, andere geeignete Adsorbate sind 1,3-Diamino-
2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin und Ethylendiamin.
Das Trägermaterial ist vorzugsweise ein anorganisches Trägermaterial
wie Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid,
wobei Siliciumdioxid das bevorzugte Trägermaterial
ist. Spezielle Beispiele geeigneter anorganischer Trägermaterialien
sind LiChrospher Si 500 (Teilchendurchmesser
10 Mikron), LiChrosorb Si 100 (Teilchendurchmesser 10 Mikron),
LiChrospher Si 100 (Teilchendurchmesser 10 Mikron),
Chromosorb LC-6, Partisil 10, Vydac TPB, kontrolliertes
Porenglas (Teilchendurchmesser 5-10 Mikron; Porendurchmesser
100 Å), Spherisorb Aluminiumoxid (Teilchendurchmesser 10 Mikron;
Porendurchmesser 150 Å), Bio-Rad basisches Aluminiumoxid,
Aktivität I (Teilchendurchmesser 40 Mikron), Bio-Rad
saures Aluminiumoxid, Aktivität I (Teilchendurchmesser 40 Mikron),
Corning Titandioxid (40/60 Maschen; Porendurchmesser
= 400 Å) Amicon Matrex Kieselsäuregele, zirconylplattiertes
Siliciumdioxid (eine Zirkonschicht auf Vydac TPB Siliciumdioxid),
und Magnesiumoxid.
Nachdem eine membranartige Schicht eines Amingruppen aufweisenden
Adsorbats auf die Oberfläche des Trägermaterials
adsorbiert ist, kann die adsorbierte Schicht vernetzt
werden, indem man die Oberfläche einem Vernetzer wie
Epoxyharz oder Alkylbromid aussetzt, wobei das bevorzugte
Vernetzungsmittel bzw. der bevorzugte Vernetzer ein polyfunktionales
Epoxyharz ist. Geeignete Epoxyharzvernetzer
umfassen 1,2-Ethandioldiglycidylether, 1,4-Butanoldioldiglycidylether
und 1,3-Diglycidylglycerin. Zur Herstellung eines
Kationenaustauschermaterials läßt man dann mindestens eine
und vorzugsweise viele Aminogruppen der vernetzten adsorbierten
Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit eines Protonenfängers
und vorzugsweise in einem trockenen protonenfreien
Lösungsmittel wie Dimethylformamid, mit einer ausreichenden
Menge eines Reagenz reagieren, um mindestens eine und
vorzugsweise mehr als eine Carboxylgruppe via Derivatisierung
der Oberflächenamine zu bilden. Das Protonenspülmittel
enthält vorzugsweise ein tertiäres Amin, besonders bevorzugt
Diisopropylethylamin. Das Agens, das mit den Amingruppen der
vernetzten adsorbierten Schicht unter Bildung von Carboxylgruppen
reagiert, kann monofunktional oder polyfunktional
sein. Wenn das angewandte Agens monofunktional ist, enthält
es vorzugsweise ein hydrophiles Monomeres, besonders bevorzugt
ein hydrophiles monomeres Anhydrid und am meisten
bevorzugt ein hydrophiles monomeres cyclisches Anhydrid.
Beispiele für geeignete monomere Anhydride sind Glutarsäureanhydrid,
Bernsteinsäureanhydrid, Diglykolsäureanhydrid und
Tetranhydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid. Wenn
das angewandte Reagenz polyfunktional ist, dann enthält es
vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, besonders bevorzugt
ein hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt
Polyacrylsäureanhydrid.
Alternativ dazu läßt man, nachdem eine membranartige Schicht
eines Amingruppen aufweisenden Adsorbats an die Oberfläche
des Trägermaterials adsorbiert ist, Amingruppen der nicht-
vernetzten adsorbierten Schicht, vorzugsweise in Anwesenheit
eines Protonenspülmittels, mit einer ausreichenden Menge
eines polyfunktionalen Agens reagieren, um die Beschichtung
zu vernetzen und mindestens eine und vorzugsweise mehr als
eine Carboxylgruppe via Derivatisierung der Oberflächenamine
zu bilden. Auch hier enthält das Protonenspülmittel
vorzugweise ein tertiäres Amin und besonders bevorzugt
Diisopropylethylamin. Das polyfunktionale Reagenz ist vorzugsweise
ein hydrophiles Polymer, besonders bevorzugt ein
hydrophiles polymeres Anhydrid und am meisten bevorzugt
Polyacrylsäureanhydrid. Wenn das angewandte polyfunktionale
Agens ein Anhydrid ist, wird eine vollständige Hydrolyse
jeglicher nicht-umgesetzter Anhydride durch Behandlung mit
verdünnter Säure sichergestellt.
Ein Gramm Vydac 101 TPB Siliciumdioxid (5,5 µm, kugelförmig,
330 Å) wurde in 10 ml einer Polyethylenimin-18 (durchschnittliches
Molekulargewicht 1800) in einer Konzentration
(Gewicht/Volumen) von 1% in Methanol enthaltenden Lösung
suspendiert. Die adsorbierte Schicht wurde dann unter
Anwendung von 10 ml einer Diglycidylglycerin in einer Konzentration
von 5% (Volumen/Volumen) enthaltenden methanolischen
Lösung vernetzt. 0,7 g der beschichteten und vernetzten
Kieselsäure wurden 30 Minuten bei 110°C in einen Ofen
gegeben. Dann wurde das trockene Siliciumdioxid in einer
Lösung suspendiert, die aus 4 ml trockenem Dimethylformamid,
250 µl (trockenem, redestilliertem) Diisopropylethylamin
(DIEA) und 200 mg Bernsteinsäureanhydrid (SUC) bestand.
Diese Acylierungsreaktion erzeugt Carbonsäuren über die
Derivatisierung von Oberflächenaminen. DIEA wurde als Protonenspülmittel
zugegeben, da bei der Reaktion des Anhydrids
und der Kieselsäure mit aufgebrachtem und vernetztem Amin
eine Säure gebildet wird, die benachbarte Amine "titrieren"
(unreaktiv machen) könnte. Diese Reaktion wurde dreimal
unter Anwendung verschiedener Anhydride, Diglykolsäureanhydrid
(DGA), Glutarsäureanhydrid (GLU) und Tetrahydrofuran-
2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid (TETRA) anstelle von
Bernsteinsäureanhydrid wiederholt. Man ließ die Reaktionen
über Nacht bei 60°C weitergehen. Dann wurde jedes Produkt
auf einem Trichter aus Sinterglas isoliert und sukzessive
mit Methanol, Wasser, Triethylamin und Methanol gewaschen.
Nach dem Trocknen im Vakuum wurden diese Materialien in
einem Exsikkator aufbewahrt. Je 50 mg der erhaltenen
Kationenaustauschermaterialien wurden auf ihre Kapazität, Pikrinsäure
zu binden, geprüft. Pikrinsäure "paart" sich mit
zugänglichen (nicht-ionisierten) Aminen, jedoch nicht mit
Amiden. Deshalb kann der Acylierungsgrad bzw. das Ausmaß der
Acylierung bestimmt werden als der prozentuale Verlust an
zur Ionenpaarbildung befähigten Aminen nach der Derivatisierung.
Zur Messung der Pikrinsäurekonzentrationen wurde ein Perkin-
Elmer Modell 55 Spektrophotometer verwendet. Die Ergebnisse
der Pikrinsäureprüfung sind in Tabelle I angegeben.
Der Ausdruck % SUB ist die prozentuale Substitution, die aus
den Versuchen zur Bestimmung der Pikrinsäure-Ionenpaarungskapazität
sowohl vor wie auch nach der Derivatisierung ermittelt
wurde:
Im allgemeinen konnten etwa 70% der Oberflächenamine acyliert
werden (Tabelle I). Geringfügige Abweichungen von
dieser Zahl (in Abhängigkeit von dem Anhydrid) ergaben sich
entweder aus Meßungenauigkeiten (±5%) oder Reaktivitätsvariationen.
Da Pikrinsäure an alle obigen Schichten adsorbiert
wurde, waren Amine vorhanden, die mit Carboxylresten
vermischt bzw. durchsetzt waren. Diese Kationenaustauschermaterialien
banden jedoch Hämoglobin bei pH 8 nicht (bei
diesem pH ist Hämoglobin negativ geladen), was anzeigt, daß
diese Amine für große Moleküle wie Protein nicht zugänglich
sind, sondern nur für kleine Moleküle wie Pikrinsäure.
Dann wurden je 50 mg der Kationenaustauschermaterialien auf
ihre Kapazität geprüft, Makromoleküle zu binden (rohes
Ringerhämoglobin vom Typ II bei pH 5,5, wobei das Protein
positiv geladen ist). Zum Messen der Hämoglobinkonzentrationen
wurde ein Perkin-Elmer Modell 55 Spektrophotometer
eingesetzt. Die mit Glutarsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid
und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid
synthetisierten Kationenaustauschermaterialien banden alle
etwa 40 mg Hämoglobin je Gramm beschichtetem Trägermaterial.
Das Diglykolsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterial band
etwas mehr Hämoglobin, möglicherweise aufgrund erhöhter
Derivatisierung (Tabelle I). Die Fähigkeit dieser Materialien
zur Bindung von Hämoglobin bei pH 5,5 wurde benützt, um die
Kationenaustauscher-Bindekapazität für Protein (Hb cec ) zu
demonstrieren.
Anschließend wurden je 0,5 g der mit Bernsteinsäureanhydrid
(SUC), Glutarsäureanhydrid (GLU), Diglykolsäureanhydrid
(DGA), und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid
(TETRA) erhaltenen Kationenaustauschermaterialien in
einzelne 0,41 × 5 cm ID Säulen zur chromatographischen
Bestimmung (siehe Tabelle I und Fig. 1A, B, C) gefüllt.
Die Chromatographie erfolgte (mit einem LDC Constametric I
und IIIG System mit Gradient Master, Laboratory Data
Control, Riviera Beach, Florida) unter Anwendung von 0,01 m
NaOac (pH 5,5) bis 0,5 m NaCl in 0,01 m NaOac (ph 5,5) als
Eluiermittel mit linearem Gradienten während 20 Minuten bei
einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Die analytische
Testprobe (20 µl) bestand aus 3 mg/ml Cytochrom c (Pferdeherzcytochrom c,
pI = 9,2) und 5 mg/ml Lysozym (Eiweißlysozym,
pI = 11) zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure zur
Verhinderung der Oxidation. Die Bestimmung (detection)
erfolgte bei A254, was mit einem Altex UV-Detektor, Modell
153 (Anspec, Ann Arbor, Michigan) überwacht wurde. Die
Retentionszeiten (t R ) der CYTc und LYZ Peaks sind in
Tabelle I angegeben und graphisch in Fig. 1 dargestellt.
Die Auflösung (R s in Tabelle I und Fig. 1) von CYTc und LYZ
wurde nach der Gleichung
R s = 2 (t R - t R )/(Δ t R + Δ t R )
berechnet. Die Symbole t R und t R sind die Retentionszeiten
jedes Peaks, während Δ t R und Δ t
R die Peakbreiten sind.
Die Indizes 1 und 2 beziehen sich auf den ersten und zweiten
aus der Säule eluierten Peak. Der höchste R s -Wert wurde
an der SUC-Säule erhalten. Dies war mehr das Resultat der
einzigartigen Selektivität als der verringerten Peakbreite.
Obwohl Lysozym stark zurückgehalten wurde, wurde Cytochrom
früh eluiert (Fig. 1C). Die Leistungsfähigkeit des Bernsteinsäureanhydridmaterials
war auch aus wirtschaftlichen
Gründen bemerkenswert, d. h. es ist das billigste der
Anhydride.
Es wurde Polyacrylsäureanhydrid (PAA) hergestellt, indem man
5 g Polyacrylsäure (M.G. 2000, Kettenlänge 28) in einen
100 ml Rundkolben gab und diesen dann in ein Ölbad bei 180°C
setzte. Der Kolben wurde dann mit einer Vakuumpumpe verbunden
und 3 Stunden evakuiert. Der erhaltene gelbe Festkörper
wurde aus dem Kolben gekratzt und in einem Exsikkator
aufbewahrt. Die NMR-Analyse zeigte, daß 79% der Carboxylgruppen
dehydratisiert waren, was etwa 11 Anhydridfunktionen
je Polymermolekül entspricht.
0,7 g Vydac 101 TPB Siliciumdioxid (5,5 µm, kugelförmig,
330 Å) wurden in 10 ml einer 1% (Gewicht/Volumen) Polyethylenimin-
18 enthaltenden Methanollösung suspendiert und
30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das adsorbierte
Siliciumdioxid wurde auf einem Sinterglastrichter
wieder isoliert und 30 Minuten bei 110°C in einen Ofen
gegeben. Dann wurde das trockene Medium in einen 50 ml
Rundkolben gegeben, der 4 ml trockenes Dimethylformamid,
250 µl trockenes redestilliertes Diisopropylethylamin und
50 mg des oben hergestellten Polyacrylsäureanhydrids
(1,2% PAA) enthielt. Diese Reaktion wurde zwei weitere Male
wiederholt, wobei verschiedene Mengen Polyacrylsäureanhydrid
verwendet wurden, 100 mg Polyacrylsäureanhydrid (2,4% PAA)
und 200 mg Polyacrylsäureanhydrid (4,7% PAA). Die Reaktionen
ließ man über Nacht bei 60°C weiterlaufen. Dann wurde jedes
Produkt auf einem Sinterglastrichter isoliert und sukzessive
mit Methanol, Wasser, Triethylamin und Methanol gewaschen.
Nach dem Trocknen im Vakuum wurden diese Materialien in
einem Exsikkator aufbewahrt. Je 50 g der mit verschiedenen
Konzentrationen an Polyacrylsäureanhydrid erhaltenen
Kationenaustauschermaterialien wurden auf ihre Kapazität Pikrinsäure
zu binden geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle II
aufgeführt.
Interessanterweise war die prozentuale Acylierung dieser
Kationenaustauschermaterialien geringer als die, die man mit
den monomeren Anhydriden von Beispiel I erhalten hatte. Der
Zugang des großen Polyacrylsäureanhydrids zu Aminen der
stationären Phase kann aus sterischen Gründen gehindert
sein. Da es zu keiner anionenaustauschenden Hämoglobinbindung
kam, nahm man an, daß die Kationenaustauschermaterialien
hinreichend vernetzt waren, ohne zugängliche restliche
positive Ladung (charge).
Je 50 mg der mit Polyacrylsäureanhydrid synthetisierten
Kationenaustauschermaterialien wurden dann auf ihre
Kationenaustauscherbindekapazität für Proteine (Hb cec ) geprüft,
wobei Hämoglobin (roh, vom Rind, Typ II) bei einem Puffer-pH
von 5,5 verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung
sind in Tabelle II zusammengestellt. Die Hämoglobinbindung
stieg mit der Polyacrylsäureanhydridkonzentration. Der
höchste Wert wurde auf dem Material erhalten, das mit der
größten Konzentration (4,7% PAA) synthetisiert war. Sowohl
dieses Material als auch das mit 2,4% PAA hergestellte
Material banden mehr Hämoglobin als das gemäß Beispiel I
hergestellte Diglykolsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterial.
Da alle Kationenaustauschermaterialien der Beispiele I und
II von einem handelsüblichen Ausgangsprodukt ausgingen
(nämlich dem unvernetzten, auf Vydac Siliciumdioxid adsorbiertem
Polyethylenimin), scheint die gesteigerte Hämoglobin-
Bindekapazität direkt mit dem Verhältnis von Amid zu
Carboxylgruppen des kovalent gebundenen PAA zusammenzuhängen.
Polyacrylsäureanhydrid ist ein lineares Polymeres. Anders
als die monomeren Anhydride von Beispiel I, wo die Carboxylgruppe
innerhalb von fünf Atomen von der Oberfläche sein
muß, können Abschnitte oder Längen (lengths) der Polyacrylsäure
(Stiele und Schleifen) in das Kieselsäureporenvolumen
bzw. -innere hineinreichen. Die Existenz solcher
Strukturen würde der Oberfläche eine gezähnte Topographie
geben und damit den Oberflächenbereich wirksam vergrößern.
Da die Bindekapazität direkt mit dem letzteren in Beziehung
steht, kommt es zu einer Steigerung. Das mit 1,2% PAA
vernetzte Kationenaustauschermaterial band 36 mg Hämoglobin
je g beschichtetem Träger, was dem Kationenaustauschermaterial
auf Basis von monomerem Anhydrid von Beispiel I
vergleichbar war. Bei niedrigen Konzentrationen an Polyacrylsäureanhydrid
können die Stiel- und Schleifenstrukturen
nicht überwiegen, da es weniger Konkurrenz für die Oberflächenamine
gibt und die Polyacrylsäureanhydridmoleküle
extensiv reagieren.
Jeweils etwa 0,5 g Polyacrylsäureanhydrid-Kationenaustauschermaterialien
wurden in 0,41 × 5 cm Säulen zur chromatographischen
Evakuierung gepackt. Die Chromatographie wurde
mit dem chromatographischen Instrumentarium und dem Detektor
von Beispiel I unter Verwendung eines Elutionsmittels
von 0,01 m NaOac (pH 5,5) bis 1 m NaCl in 0,01 m NaOac (pH 5,5)
mit linearem Gradienten während 20 Minuten bei einer
Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Die
analytische Testprobe (20 µl) bestand aus CYCc und LYZ
zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure wie in Beispiel I. Die
Retentionszeiten (t R ) der CYTc und LYZ Peaks und die
Trennschärfe oder Auflösung (berechnet wie in Beispiel I)
von oder zwischen CYTc und LYZ sind in Tabelle II angegeben,
die Retentionszeiten der CYTc und LYZ Peaks auf dem 1,2%
PAA-Material sind graphisch in Fig. 1 dargestellt. Die
Retentionszeiten von CYTc und Lysozym stiegen mit der
PAA-Konzentration. Tatsächlich konnte Lysozym von der 4,7%
PAA-Säule mit 1 m NaCl nicht eluiert werden, und es war
0,77 m NaCl zur Desorption von der 2,4% PAA-Säule erforderlich.
Diese Werte liegen wesentlich höher als jene, die mit
den Säulen von Beispiel I erhalten wurden. Zwar mag die
stark zurückhaltende oder retentive 4,7% Säule chromatographisch
nicht praktisch sein, da sie zu retentiv ist, sie
kann jedoch zur Immobilisierung von Protein von Vorteil
sein. Kationische Polypeptide wie Antikörper könnten bei der
Immunoaffinitätschromatographie fest an die Matrix adsorbiert
werden. Bei Anwendung von 0 bis 1 m NaCl während
20 Minuten (linearer Gradient) variierte die Auflösung
zwischen CYTc und LYZ von unendlich auf der 4,7% PAA-Säule
bis zu einem Wert von 4,9 auf der 1,2% PAA-Säule. Die 4,7%
PAA-Säule ergab eine unendliche R s wegen der unbegrenzten
Retention von LYZ. Die 1,2% PAA-Säule ergab den niedrigsten
R s -Wert unter den angegebenen Bedingungen; dieser Wert stieg
jedoch auf 6,1, wenn die Gradientenneigung (gradient slope)
um die Hälfte verringert wurde (siehe Fig. 1D).
Etwa 20 µl einer ähnlichen Testprobe wie in Beispiel I von
CYTc und LYZ, zusammen mit einer Spur Ascorbinsäure, wurden
an den Glutarsäureanhydrid-, Bernsteinsäureanhydrid- und
Diglykolsäureanhydridsäulen von Beispiel I und der 1,2%
Polyacrylanhydridsäule von Beispiel II chromatographiert,
wobei verschiedene Eluierungs-pH-Werte angewandt wurden,
während die anderen Bedingungen konstant blieben. In allen
Fällen stand die Retention in umgekehrtem Verhältnis zum pH
(Fig. 2 zeigt nur die Retention von Lysozym). Dieses
Verhalten ergibt sich aus einer Steigerung an positiver
Proteinnettoladung, wenn der Eluierungs-pH unter den isoelektrischen
Punkt sinkt. Eine genauere Prüfung zeigt, daß
die Glutarsäureanydridsäule am meisten pH empfindlich ist.
Da Glutarsäureanhydrid eine zusätzliche Methylengruppe aufweist,
kann eine kooperative hydrophob-ionische Wechselwirkung
verantwortlich sein. Dieser Versuch diente dazu, den
allgemeinen pH-Arbeitsbereich dieser Kationenaustauschermaterialien
zu bestimmen. Bei pH 5,5 bis 7,5 wurde eine
Trennschärfe von 4 oder mehr zwischen CYTc und LYZ erzielt.
Die Bernsteinsäureanhydridsäule von Beispiel I und die 1,2%
Polyacrylsäureanhydridsäule von Beispiel II wurden als repräsentative
Medien zur Fraktionierung eines Rohproteingemischs
gewählt. Die Probe bestand aus einem Extrakt von
Cyanbacteria Aphanizomenon flos-aquae, der Cytochrom c 553
(CYTc 553) enthielt. Dieses Protein hatte einen isoelektrischen
Punkt von 9,3, ein Molekulargewicht von 11 000 und
einzigartige Spektraleigenschaften. Im reduzierten Zustand
zeigte das sichtbare Absorptionsspektrum Maxima bei 280, 410
und 553 Nanometern.
Der rohe Zellextrakt wurde teilweise durch Ultrafiltration
(30 000 MG Abschlußmembran) aufbereitet. Das erhaltene
Filtrat, das weniger als 0,5 mg/ml Protein enthielt, wurde
gesammelt und auf pH 7 eingestellt. Jede Kationenaustauschersäule
(0,41 × 5 cm) wurde dann mit einem 80 µl Aliquot
dieses Gemischs beladen bzw. beschickt. Wie in Beispiel I
wurde die Chromatographie unter Anwendung eines Eluierungsmittels
mit linearem Gradienten von 0,01 m NaOac (pH 7) bis
0,5 m NaCl in 0,01 m NaOac (pH 7) während 20 Minuten bei
einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durchgeführt. Mit
einem HP 1040 A Detektorsystem (Hewlett Packard, Corvallis,
Oregon) wurde eine zweifache Wellenlängenüberprüfung (bei
260 und 410 nm) vorgenommen. Das 260 nm Signal erfaßte alle
Proteine, während das 410 nm Signal jene überwachte, die
Polyporphorinringe enthielten (z. B. CYTc 553).
Die Prüfung des von der Bernsteinsäureanhydridsäule (bei
260 nm) erhaltenen Chromatogramms zeigte eine beträchtliche
Anzahl an Ultraviolett adsorbierenden Materialien (Fig. 3A).
Jedoch wurde der kleine, bei 8,5 Minuten eluierende Peak als
CYTc553 (Fig. 3A) aufgrund seiner Spektraleigenschaften
identifiziert. Das 553/280 Absorptionsverhältnis am Peakapex
betrug 0,4. Da ein Wert von 1 als entsprechend einer
Reinheit von 90% angesehen wird, sind noch Verunreinigungen
vorhanden. Trotzdem wurde, wenn man den Peakbereich von
CYTc553 relativ zu den verbleibenden Peakbereichen beurteilt,
eine wesentliche Reinigung erzielt. Die Chromatographie
an der 1,2% Polyacrylsäureanhydridsäule unter identischen
Bedingungen ergab ähnliche Ergebnisse (Fig. 3C). Im
allgemeinen hatte dieser Träger eine etwas stärkere Retention
als die Bernsteinsäureanhydridsäule, war auch etwas
selektiver und trennte das Gemisch in 12 getrennte Peaks
gegenüber 10. Wiederum wurde CYTc553 durch seine sichtbare
Absorption (absorbance) bei einer Retentionszeit von 9,4
Minuten identifiziert. Die Spektralanalyse am Peakapex (peak
apex) ergab ein 553/280 Absorptionsverhältnis von etwa 0,45.
Obgleich die Erfindung anhand ihrer bevorzugten Ausbildungsweise
beschrieben wurde, können andere Ausbildungsweisen zum
gleichen Ergebnis führen.
Claims (41)
1. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials,
gekennzeichnet durch die Stufen:
- a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität für ein Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
- b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird;
- c) Umsetzung von Amingruppen der adsorbierten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Agens zum Vernetzen der Schicht und zur Bildung mindestens einer, vorzugsweise vieler, Carboxylgruppen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man als polyfunktionales Agens ein hydrophiles Polymeres
verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
der Reaktion von Amin und polyfunktionalem Agens in
Stufe c) ein tertiäres Amin enthaltender Protonenfänger
oder Protonenspülmittel (proton scavenger) zugesetzt
wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial
der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid
verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Adsorbat aus der Gruppe aus Polyethylenimin,
1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentaimin
und Ethylendiamin verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adsorbat in einem Lösungsmittel enthalten ist und
daß man die Adsorption mindestens teilweise durch
Steuerung der Polarität dieses Lösungsmittels durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man als hydrophiles Polymeres ein polymeres Anhydrid
verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
man als polymeres Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man das Kationenaustauschermaterial als Füllkörper in
der Flüssigchromatographie verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
man das chromatographische Füllkörpermaterial zum Trennen
von Proteinen oder anderen biologischen Polymeren
verwendet wird.
11. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials,
gekennzeichnet durch die Stufen:
- a) Bereitstellen eines Siliciumdioxid-Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
- b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Polyethylenimin enthaltenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird; und
- c) Umsetzung der adsorbierten Polyethyleniminschicht in Anwesenheit eines Protonenfängers mit einer zum Vernetzen der Schicht und zur Bildung von Carboxylgruppen ausreichenden Menge an Polyacrylsäureanhydrid.
12. Verfahren zum Herstellen eines Kationenaustauschermaterials,
gekennzeichnet durch die Stufen:
- a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
- b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht auf der Oberfläche elektrostatisch adsorbiert wird;
- c) Vernetzen der auf der Oberfläche adsorbierten Schicht; und
- d) Umsetzen mindestens einer, und vorzugsweise vieler, Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines Agens zur Bildung mindestens einer, und vorzugsweise vieler, Carboxylgruppen.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
der Reaktion von Amin und Agens in Stufe d) ein
tertiäres Amin enthaltender Protonenfänger zugesetzt
wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Trägermaterial ein anorganisches Trägermaterial
der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und Titandioxid
verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
man ein Adsorbat der Gruppe aus Polyethylenimin,
1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin und
Ethylendiamin verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Agens in Stufe d) ein polyfunktionales verwendet
wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß
man als polyfunktionales Agens ein hydrophiles Polymeres
verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß
man als hydrophiles Polymeres ein polymeres Anhydrid
verwendet.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß
man als polymeres Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid verwendet.
20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
man als Agens in Stufe d) ein monofunktionales verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß
man als monofunktionales Agens ein hydrophiles Monomeres
verwendet.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
man als hydrophiles Monomeres ein monomeres cyclisches
Anhydrid verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß
man ein monomeres Anhydrid der Gruppe aus Glutarsäureanhydrid,
Bernsteinsäureanhydrid, Diglykolsäureanhydrid
und Tetrahydrofuran-2,3,4,5-tetracarbonsäuredianhydrid
verwendet.
24. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die adsorbierte Schicht vernetzt wird, indem man die
Oberfläche einem Vernetzer der Gruppe aus Epoxyharz und
Alkylbromid aussetzt.
25. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
das Adsorbat in einem Lösungsmittel enthalten ist und
daß man die Adsorption mindestens teilweise durch
Steuerung der Polarität des Lösungsmittels durchführt.
26. Kationenaustauschermaterial, dadurch gekennzeichnet,
daß es durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das
die Stufen umfaßt:
- a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität für ein Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
- b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird; und
- c) Umsetzung von Amingruppen der adsorbierten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines polyfunktionalen Agens zum Vernetzen der Schicht und Bildung mindestens einer, vorzugsweise viele, Carboxylgruppen.
27. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das polyfunktionale Agens ein
hydrophiles Polymeres enthält.
28. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß ein ein tertiäres Amin enthaltender
Protonenfänger der Reaktion von Amin und polyfunktionalem
Agens in Stufe c) zugesetzt wird.
29. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein anorganisches
Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid
und Titandioxid ist.
30. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbat aus der Gruppe aus
Polyethylenimin, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan, Tetraethylenpentamin
und Ethylendiamin ist.
31. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 26, dadurch
gekennzeichnet, daß das Adsorbat in einem Lösungsmittel
enthalten ist und daß die Adsorption mindestens teilweise
durch Steuerung der Polarität des Lösungsmittels
durchgeführt wird.
32. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 27, dadurch
gekennzeichnet, daß das hydrophile Polymere ein polymeres
Anhydrid umfaßt.
33. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 32, dadurch
gekennzeichnet, daß das polymere Anhydrid Polyacrylsäureanhydrid
umfaßt.
34. Kationenaustauschermaterial, dadurch gekennzeichnet,
daß es durch ein Verfahren hergestellt worden ist, das
die folgenden Stufen umfaßt:
- a) Bereitstellen eines Trägermaterials mit einer eine Affinität zu einem Adsorbat aufweisenden Oberfläche;
- b) Kontaktieren der Oberfläche des Trägermaterials mit einem Amingruppen aufweisenden Adsorbat derart, daß eine membranartige Adsorbatschicht elektrostatisch auf der Oberfläche adsorbiert wird;
- c) Vernetzung der auf der Oberfläche adsorbierten Schicht; und
- d) Umsetzung mindestens einer und vorzugsweise vieler Amingruppen der adsorbierten vernetzten Schicht mit einer ausreichenden Menge eines Agens zur Bildung mindestens einer und vorzugsweise vieler Carboxylgruppen.
35. Kationanaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch
gekennzeichnet, daß das Agens in Stufe d) polyfunktional
ist.
36. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 35, dadurch
gekennzeichnet, daß das polyfunktionale Agens ein
hydrophiles polymeres Anhydrid enthält.
37. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch
gekennzeichnet, daß das Agens in Stufe d) monofunktional
ist.
38. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 37, dadurch
gekennzeichnet, daß das monofunktionale Agens ein
hydrophiles monomeres cyclisches Anhydrid enthält.
39. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch
gekennzeichnet, daß das Trägermaterial ein anorganisches
Trägermaterial der Gruppe aus Siliciumdioxid, Aluminiumoxid
und Titandioxid ist.
40. Kationenaustauschermaterial nach Anspruch 34, dadurch
gekennzeichnet, daß die adsorbierte Schicht dadurch
vernetzt worden ist, daß die Oberfläche einem Vernetzer
der Gruppe aus Epoxyharz und Alkylbromid ausgesetzt
wurde.
41. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
in Stufe d) alle reaktiven Amingruppen der adsorbierten
vernetzten Schicht, mit Ausnahme jener, die für große
Moleküle wie Eiweiß nicht zugänglich sind, mit dem
Agens zur Bildung von Carboxylgruppen umgesetzt werden.
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