DE69832502T2

DE69832502T2 - Beschichtetes polymerarticle und seine verwendung

Info

Publication number: DE69832502T2
Application number: DE69832502T
Authority: DE
Inventors: Steinar Hagen; Rune Ringberg; Geir Fonnum
Original assignee: Amersham Bioscience AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-22
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: JP4156675B2; SE9702427D0; ATE310578T1; EP1015107A1; ES2255169T3; JP2002507934A; WO1998058734A1; US6420028B1; EP1015107B1; DE69832502D1

Description

Technisches Gebiet und Hintergrundstechnik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf beschichtete Polymergegenstände und Verfahren für die Herstellung davon und eine Verwendung des Gegenstandes als Chromatographiemedium. Speziell bezieht sich die Erfindung auf beschichtete Gegenstände, wobei die Beschichtung kovalent an die Polymeroberfläche über anhängende Doppelbindungen der Polymeroberfläche gebunden sind. Ein Beispiel von anhängenden Gruppen sind restliche Vinylgruppen, die nach der Polymerisation von Vinylmonomeren verbleiben, wie Divinylbenzolmonomere.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „beschichtet"/"beschichten", dass anhängende Alkengruppen auf der Oberfläche derivatisiert worden sind, um neue Funktionalitäten einzuführen, die an zwei spezielle Verwendungen des Gegenstandes angepasst werden können (chromatographischer Träger und Träger für Oligopeptid- und Oligonucleotid-Synthese). „Schicht" besitzt daher eine etwas andere Bedeutung im Vergleich zur Beschichtung im Sinne einer physikalischen Adsorption und Stabilisierung durch Vernetzen einer adsorbierten Lage (Schicht) innerhalb der Lage und/oder der ursprünglichen Oberfläche.
Die stationäre Phase (Träger, Matrix) in Flüssigkeitschromatographie besteht aus einer porösen Matrix und liegt am allgemeinsten in Kügelchenform vor. Eine breite Vielfalt von Materialien wird für Chromatographiematrizen verwendet, sowohl anorganische, wie auch organische Materialien. Die Anforderungen an die Matrix sind mehrere. Sie sollte chemisch und physikalisch stabil sein und fähig sein, extremen pH-Bedingungen zu widerstehen. Die Matrix sollte starr sein, um hohe Fließgeschwindigkeiten in Säulen zu ermöglichen, die mit Teilchen eines kleinen Durchmessers gepackt sind. Es muss also möglich sein, Teilchen mit einem breiten Bereich von Porositäten herzustellen.
Die Oberflächeneigenschaften der Matrix sind wichtig. Durch Einführen neuer chemischer Strukturen auf der Oberfläche der Matrix ist es möglich, stationäre Phasen zu gestalten, die mehr oder weniger spezifisch mit einem besonderen Molekül Wechselwirken. In der chromatographischen Trennung von Proteinen in wässriger Lösung ist die Matrix üblicherweise hydrophil. In der Umkehrphasenchromatographie (RPC) für Peptid- oder Proteintrennung sind Silikagels als Chromatographiemedium verwendet worden. Silikagels sind starr genug, um hohen Fließgeschwindigkeiten zu widerstehen, und verschiedene Hydrophobizitäten sind verfügbar (C4, C8, C18). Jedoch sind Silikagels oberhalb eines pH von 8,0 nicht stabil und können daher nicht unter Verwenden von Alkali gereinigt werden. Stattdessen ist es üblich, starre Matrizen aus organischen Polymeren zu verwenden, z.B. Polymethacrylat oder Polystyrol/Polystyrol-Divinylbenzol. Polystyrol-Divinylbenzol-Teilchen sind in wässrigen Lösungen hydrophob und große Mengen von organischen Lösungsmitteln wurden verwendet, um die absorbierten Moleküle zu eluieren. Die Selektivität ist auch begrenzt. Aufgrund der Tatsache, dass es nur eine kleine Variation in der Hydrophobizität dieser Teilchen gibt, ist die Verwendung von ihnen begrenzt. Im Gegensatz dazu kann das Verhältnis Hydrophobizität/Hydrophilizität von Silikateilchen durch chemische Reaktionen variiert werden. Es gibt eine große Vielfalt in der Chemie, die für die Modifikation der hydrophilen Silikaoberfläche verfügbar ist. Um die Möglichkeiten zum Verwenden von Teilchen aus Polystyrol-Divinylbenzol und anderen hydrophoben Polymeren zu vergrößern, ist es anerkannt, dass die Oberfläche der Teilchen modifiziert werden muss, um hydrophiler zu sein, bevor sie als chromatographisches Trennmedium verwendet werden können. Verschiedene Verfahren wurden für die Hydrophilisierung der Oberfläche von Teilchen basierend auf hydrophoben Polymeren vorgeschlagen:
WO 91/11241 bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen einer hydrophilen Beschichtung auf einer hydrophoben Oberfläche, durch die eine Verbindung, die eine hydrophobe und eine hydrophile Domäne aufweist, auf der Oberfläche adsorbiert wird. Die Nachteile mit diesem Verfahren sind mehrere. Das zu adsorbierende Polymer besitzt ein hohes Molekulargewicht und deshalb wird das Polymer sich nicht gleichmäßig in allen Poren verteilen. Die Kontrolle der Porengrößenverteilung geht dann verloren und einige Poren können dann sogar überhaupt nicht gleichmäßig beschichtet werden. Da die Polymerbeschichtung nur adsorbiert wird, kann sie sich von der Oberfläche beim in Kontakt kommen mit nicht-polaren Lösungsmitteln lösen. Deshalb muss die Beschichtung vernetzt werden.
WO 95/23022 offenbart ein Verfahren zum kovalenten Binden einer hydrophilen Beschichtung auf einer hydrophoben Oberfläche. Eine Beschichtung aus einem ungesättigten Polymer wird auf die Oberfläche über die nicht gesättigten Gruppen auf der Oberfläche gepfropft. Auch mit diesen Verfahren gibt es dasselbe Problem des Erhaltens der gleichmäßig auf der porösen Oberfläche der Matrix verteilten Beschichtung.
Verschiedene Verwendungen von Vinylgruppen, die an Vinylbenzolpolymeren anhängen, wurden während des Prioritätsjahres von Hubbard et al. (Reactive Functional Polymers 36 (1998) 1–16 und 17–30) überprüft. Die Verwendung von anhängenden Vinylgruppen zum Immobilisieren eines Katalysators auf einem makroporösen Polystyrolharz wurde von Faber et al. beschrieben (Reactive Polymers 11 (1989) 117–126). Modifizieren von auf Vinylbenzol basierenden Trägern durch andere Routen als über restliche Vinyle, wurde von Sun et al. beschrieben (J, Chromatog, 522 (1990) 95–105). Eine noch andere Route wurde von Moberg et al. beschrieben (Reactive Polymers 15 (1991) 25–35).
Aufgaben der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte beschichtete Polymergegenstände und verbesserte Verfahren zum Beschichten eines Polymergegenstandes zum Ändern der Oberflächeneigenschaften des Gegenstandes ohne die Nachteile bekannter Verfahren zu erhalten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Polymerteilchen mit geeigneten Oberflächeneigenschaften für eine chromatographische Verwendung zu erzeugen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Beschichtung bereitzustellen, die derivatisiert werden kann, um einen weiten Bereich verschiedener funktioneller Gruppen zur Verwendung in verschiedenen Typen der Chromatographie zu erzeugen. Die Absicht ist es, fähig zu sein, eine große Vielfalt sowohl in der Hydrophobizi tät/Hydrophilizität als auch der Selektivität zu erreichen und die Menge des in der Elution verwendeten Lösungsmittels zu verringern.
Die Anforderungen an Träger, die in der Synthese von Oligonucleotiden und Oligopeptiden verwendet werden sollen, in bezug auf die Balance zwischen Hydrophobizität und Hydrophilizität sind weniger entscheidend als für chromatographische Matrizen, obwohl es bleibt, dass das Aufrechterhalten offener Poren wichtig ist, um eine hohe Kapazität eines gegebenen porösen Trägers beizubehalten. Die primäre Aufgabe in diesem Aspekt der Erfindung ist es, einen einfachen gut definierten Weg des Einführens eines Halters in Form einer primären oder sekundären Aminogruppe in einen Polymerträger basierend auf einem hydrophoben Polymer bereitzustellen.
Die Erfindung
Die Aufgaben der Erfindung werden durch die Polymergegenstände und Verfahren, die in den Ansprüchen definiert sind, erreicht. Gemäß der Erfindung wird ein beschichteter Polymergegenstand erhalten, wobei der Gegenstand dadurch gekennzeichnet ist, dass die Beschichtung kovalent an die Polymeroberfläche über Doppelbindungen des Polymers gebunden ist. Der Gegenstand besitzt die Struktur:
wobei:
P umfasst die Basispolymerstruktur des Gegenstandes vor dem Beschichten und weitere Gruppen -L-CH(-X(R₁)_p)-CH₂(-Y(R₂)_p) ;L steht für einen Benzolring.
X und Y sind unabhängig ausgewählt aus Halogenen, insbesondere Br, und N, S und O, R₁ steht für Wasserstoff, eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkyl- oder Acylgruppe, wie C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₈-Acyl, oder R₂, wenn X für N, O oder S steht.
R₂ steht für Wasserstoff, ein geradkettiges, verzweigtes oder zyklisches Alkyl, wie C₁-C₁₈-Alkyl, -R₃ (-NH₂)_q, Alkylaryl oder Arylalkyl, in denen der Alkylteil 1–18 Kohlenstoffatome enthalten kann, -R₃ (-NH-CR₄=O)_q, -CR₄=O, oder niedere Polyalkyloxy-Gruppen, die terminal acyliert oder alkyliert worden sind (z.B. -((CH₂)_n-O)_n'OR', wobei n für eine ganze Zahl 2, 3 oder 4 steht und n' für eine ganze Zahl 2–100 steht und ein H in CH₂ durch Methyl ersetzt sein kann und R' eine beliebige der ausdrücklich erwähnten R₁-Gruppen sein kann.
p = 0, wenn Y = Br. p kann für 1 stehen, wenn Y = O oder S. p kann für 2 stehen, wenn Y = N oder S. p kann für 3 stehen für Y = N. In dem Fall, dass es mehr als ein R₂ gibt, können sie identisch oder verschieden sein.
R₃ steht für ein geradkettiges, zyklisches, oder verzweigtes Alkyl, -O-Alkyl, Hydroxyalkyl, Phenylalkyl mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen im Alkylteil.
R₄ steht für eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe, wie C₁-C₁₈-Alkyl.
q repräsentiert, dass einer oder mehrere (1, 2, 3, 4 etc., d.h. 1 – poly) Wasserstoffe in einer Basisalkylgruppe R₃ durch eine entsprechende primäre Aminogruppe (-NH₂) oder eine entsprechende Gruppe -NH-CR₄=O ersetzt ist.
In den oben erwähnten Alkyl- und Acylgruppen kann einer oder mehrere Wasserstoffe gegebenenfalls mit einer Amino- oder einer Hydroxy- oder einer Alkoxy-Gruppe substituiert sein und Kohlenstoffketten können gegebenenfalls an einer oder mehreren Stellen durch einen Ethersauerstoff oder einen Aminostickstoff unterbrochen sein, mit der Maßgabe, dass es höchstens eine Atom ausgewählt unter Sauerstoff und Stickstoff gibt, das an ein und dasselbe sp³-hybridisierte Kohlenstoffatom bindet. Unter besonders interessierenden Alkylgruppen mit unterbrochenen Kohlenwasser stoffketten können jene erwähnt werden, die repetitive Alkylenoxideinheiten aufweisen, wie -CH₂CH₂-O-, -CH₂CH₂-CH₂-O-, -CH₂CH(CH₃)-O- etc.
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen eines beschichteten Polymergegenstandes bereitgestellt, gekennzeichnet durch derivatisierte Doppelbindungen, die an die Basispolymerstruktur (P) des Gegenstandes durch die Gruppe L gebunden sind.
Gemäß eines noch anderen Aspektes der Erfindung wird ein beschichteter Polymergegenstand gemäß der Erfindung als ein Chromatographiemedium oder als ein Träger für die Festphasensynthese eines Oligopeptids oder eines Oligonucleotids verwendet.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Beschichtung auf einem beliebigen Polymergegenstand aufzubringen, der Doppelbindungen auf der Oberfläche besitzt, und so die Oberflächen in einer vorbestimmten Weise zu modifizieren. Bevorzugt wird das Verfahren verwendet, um chromatographische Medien herzustellen. Es wurde gefunden, dass ein weiter Bereich von Chromatographiemedien durch Einführen verschiedener chemischer Strukturen auf einer porösen Polymeroberfläche synthetisiert werden kann. Eine kontrollierte Menge einer erwünschten Gruppe und/oder Ladung kann auf der Oberfläche eingeführt werden. Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung wird die Beschichtung, einschließlich der erwünschten Gruppe und/oder Ladung, gleichmäßig über die Oberfläche auch in den Poren verteilt und dann wird die Porengrößenverteilung intakt gehalten. Außerdem kann die Porengrößenverteilung durch Variieren der Länge der Gruppen, die auf der Oberfläche eingeführt werden, variiert werden. Das Verfahren ist für die Herstellung von Umkehrphasenchromatographie(RPC)-Medien mit derselben Leistungsfähigkeit wie Silikamedien, aber ohne die Nachteile von Silika, geeignet. Neue RPC-Medien werden durch Einführen polarer Gruppen hergestellt, die lange Alkyl- oder Amidgruppen nahe der Oberfläche enthalten. Durch Variieren der Länge der Alkyl- und Amidketten können verschiedene Matrizen mit verschiedenen Hydrophobizitäten und Porengrößenverteilungen synthetisiert werden. Auch primäre und sekundäre Aminogruppen können eingeführt werden, die für die Verwendung des Trägers in der Synthese von Oligonucleotiden wesentlich sind.
Gemäß der Erfindung wird die Doppelbindung einer anhängenden Gruppe in ein Halohydrin oder ein vicinales Halogenid, d.h. -CHX₁-CHY₁-, wobei mindestens eine Gruppe von X₁ und Y₁ ein Substituent ausgewählt aus Halogenen, insbesondere Brom, ist und die verbleibende Gruppe von X₁ und Y₁ Hydroxy oder Alkoxy ist, oder in ein Epoxid oder entsprechende Stickstoff- oder Schwefelanaloga umgewandelt.
Halogen kann durch Zugabe bestimmter Halogen enthaltender Verbindungen, wobei das bevorzugte Halogen Brom ist, zu den auf der Polymeroberfläche vorhandenen Doppelbindungen eingeführt werden. Brom kann durch bekannte Verfahren, wie die Reaktion mit Br₂ in geeigneten Lösungsmitteln oder mit N-Br-Succinimid in einem geeigneten Lösungsmittel eingeführt werden. Die Synthese wird nun durch Diskutieren der Reaktion mit Brom veranschaulicht werden. Dies schließt nicht die Verwendung anderer Halogene, wie Chlor und Iod aus, die oft analoge Reaktionen durchlaufen.
Bevorzugt wird im ersten Schritt des Verfahrens eine Polymerverbindung mit einer oder mehreren Doppelbindungen eines Polymers (P-L-CH=CH₂, wobei P und L dieselbe Bedeutung wie oben besitzen) mit Br₂ in einer Lösung, die R₁OH oder eine Mischung von H₂O und einem organischen Lösungsmittel, das in H₂O löslich ist, enthält, umgesetzt, wodurch ein beschichteter Polymergegenstand mit der Struktur
oder eine Mischung der Strukturen: (1) und
erhalten werden, wobei
R₁ für Wasserstoff oder eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe steht, die Sauerstoffatome wie oben definiert enthält. Insbesondere R₁ kann Wasserstoff oder C₁-C₁₀-Alkyl sein.
Wie oben erwähnt kann das Verfahren gemäß der Erfindung auf Polymeroberflächen mit freien Doppelbindungen auf der Oberfläche angewandt werden. Als ein solches Polymer können Polymere von aromatischen Verbindungen, die Vinylgruppen enthalten, erwähnt werden. Die aromatischen Verbindungen können monofunktionell, di- oder polyfunktionell sein. Das Polymer sollte eine ausreichende Menge von Di- oder Polyvinylgruppen besitzen, um zu einer vernetzten Struktur zu führen. Als geeignete aromatische Verbindungen können z.B. Styrol, Divinylbenzol, Vinylbenzol, Vinylbenzylchlorid, Ethylvinylbenzol, Acetoxyvinylbenzol und andere Derivate von Vinylbenzol erwähnt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Basispolymerstruktur ein vernetztes Polymer aus Styrol, Divinylbenzol und Ethylvinylbenzol oder ein Polymer aus Divinylbenzol und Ethylvinylbenzol. Die anhängenden Gruppen sind die Benzolgruppen, die aus Vinylgruppen resultieren, die nicht vernetzt worden sind. Die Struktur kann wie folgt beschrieben werden:
Die freien Doppelbindungen von den Vinylgruppen auf der Oberfläche des Polymers werden für die Reaktion mit Brom verwendet.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die beschichteten Gegenstände Teilchen. Bevorzugt werden die beschichteten Teilchen durch Beschichten von unbeschichteten Teilchen mit einem Durchmesser von 1–200 μm, bevorzugt 3–50 μm hergestellt. Die Oberfläche der unbeschichteten Teilchen liegt innerhalb des Bereichs von 1–1000 m²/g, bevorzugt innerhalb 100–800 m²/g, und geeignete Porenvolumina betragen 0,1–3,0 ml/g. Der Gehalt an restlichen Vinylgruppen in den Kügelchen beträgt normalerweise 0,3–7,7 mmol/g und sollte bevorzugt 0,3–3 mmol/g, am meisten bevorzugt 1–2 mmol/g betragen.
Im ersten Schritt der Erfindung wird der unbeschichtete Polymergegenstand mit Brom, das im selben Lösungsmittel aufgelöst ist, in Kontakt gebracht. Oft liegt der Polymergegenstand in der Form von Teilchen vor, der für Beschichtungszwecke im selben Lösungsmittel wie Brom suspendiert ist. In der Reaktion mit Brom ist die Wahl des Lösungsmittels für das Ergebnis der Reaktion wichtig. Die Reaktion mit Brom kann zu einem Monobromid oder zu einem Dibromid oder einer Mischung davon führen, wie oben beschrieben. Üblicherweise wird eine Mischung erhalten, mit einem variierenden Gehalt an Mono- und Dibromid. Dieser Gehalt hängt von dem in dem Prozess verwendeten Lösungsmittel ab. Es ist bekannt, dass die Bromierung in nicht-polaren Lösungsmitteln, wie Tetrachlormethan, zu einem hohen Gehalt an Dibromid führt. In polaren Lösungsmitteln, wie die niederen Alkohole, d.h. geradkettige oder verzweigte C₁-C₁₀-Alkohole, wird ein hoher Gehalt des Monobromids erhalten. Jedoch ist in Wasser die erreichte Menge an Dibromid hoch, aufgrund der Tatsache, dass Brom in Wasser teilweise löslich ist. Falls Wasser mit einem organischen Lösungsmittel gemischt wird, das löslich in Wasser ist und in dem sich Brom auflöst, wird das Monobromid in einem großen Ausmaß erhalten. Mit längeren Alkylgruppen werden die Alkohole unpolarer und die Menge des Dibromids steigt an. Im allgemeinen kann gesagt werden, dass, falls die Polarität, ausgedrückt durch die Dielektrizitätskonstante ε, für die Lösungsmittel oder die Lösungsmittelmischungen niedrig ist, ein hoher Gehalt an Dibromid erhalten werden wird. Falls ε hoch ist, wird die Erzeugung des Monobromids begünstigt. In der vorliegenden Erfindung ist eine hohe Menge des Monobromids bevorzugt. Dann ist ein ε zwischen 6 und bis zu ungefähr 78 bevorzugt. Für die Erfindung geeignete Lösungsmittel sind C₁-C₁₀-Alkohole, wie Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 1-Butanol, 1-Hexanol. Falls eine Mischung von Wasser und einem organischen Lösungsmittel verwendet wird, werden Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, niedere Alkohole vorgeschlagen. In diesem letzteren Fall wird R₁ in der Formel oben H sein. Es gibt viele Berichte über die Bromierungsreaktion von Vinylgruppen. Die folgenden Literaturstellen können erwähnt werden: Yates, K., McDonald, R. S., und Shapiro., S. A., (1973): J. Org. Chem. 38, 2465; J. H. Rolston und K. Yates, (1969): J. Am. Chem. Soc. 91, 1469; R. C. Fahey, (1989): Topics in stereochemistry, Wiley, New York, Seiten 280–286.
Die Reaktion mit Brom wird geeigneterweise bei einer Temperatur zwischen –20–50°C, bevorzugt 0–20°C ausgeführt. Die Menge des verwendeten Broms beträgt geeigneterweise 0,1–10 Mole Brom/Mol Vinyl, bevorzugt 0,5–2 Mole Brom/Mol Vinyl. Die Menge des erhaltenen Monobromids hängt auch von der Bromkonzentration ab. Konzentrationen von 0,05–0,5 Mole/l Lösungsmittel können verwendet werden, bevorzugt 0,1–0,2 Mole/l.
Im nächsten Schritt der Erfindung werden die bromierten Gegenstände der Erfindung mit einer Verbindung Y(R₂)_p umgesetzt, wodurch ein beschichteter Polymergegenstand mit der Struktur
oder eine Mischung der Strukturen (3) und
erhalten werden, wobei
Y = N, S, O und R₂ und R₃ und p dieselbe Bedeutung wie oben besitzen.
Die Verbindung Y(R₂)_p kann aus der Gruppe gewählt werden: Ammoniak, Mono-Di- oder Poly-Alkylamine, Mono-Di- oder Poly-Alkylalkohole, Mono-Di oder Poly-Alkylthiole, wobei die Amin-, Alkohol- oder Thiolgruppe jeweils eine primäre Gruppe ist. Die Alkylgruppe kann linear oder verzweigt sein und die Länge der Alkylgruppe beträgt bevorzugt nicht mehr als C₁₈, um Löslichkeitserfordernissen für die bevorzugten Lösungsmittel zu entsprechen. Je länger die Alkylgruppe ist, desto hydrophober wird das chromatographische Medium sein. Längere Alkylgruppen werden auch zu einer Reduktion von Poren kleiner Größe (< 50 Å im Durchmesser) des Polymergegenstands führen.
Im zweiten Schritt wird eine wässerige Suspension der bromierten Gegenstände mit z.B. dem Amin gemischt. Es ist auch möglich, eine Mischung von Wasser und einem niederen Alkohol, wie Methanol oder Ethanol, als Suspensionsmedium zu wählen. Die Reaktionstemperatur beträgt geeigneterweise 50–100°C und die Reaktionszeit ungefähr 24 h.
Falls die bromierten Gegenstände mit Ammoniak oder einem primären Amin (Mono, Di oder Poly) umgesetzt werden, werden beschichtete Polymergegenstände mit der Struktur
oder eine Mischung der Strukturen: (5) oder eine Mischung der Strukturen: (5) oder
oder der Struktur:
oder eine Mischung der Strukturen: (16) und
erhalten, wobei R₁, R₂, R₃ und q dieselbe Bedeutung wie oben besitzen. Diese Verbindungen können weiter mit einem Säurechlorid, Säureanhydrid oder Isocyanat umgesetzt werden:
oder wodurch ein beschichteter Polymergegenstand mit der Struktur
oder eine Mischung der Strukturen: (9) und
oder mit der Struktur:
oder eine Mischung der Strukturen: (11) und
oder ein beschichteter Polymergegenstand mit der Struktur:
oder eine Mischung der Strukturen: (18) und
oder der Struktur:
oder eine Mischung der Strukturen: (20) und
erhalten werden, wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ und q dieselbe Bedeutung wie oben besitzen und Z für Halogen steht, wie Chlorid.
Die Reaktion der Aminsubstituenten mit einem Säurechlorid, Säureanhydrid oder Isocyanat wird in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, wie Aceton, oder einem anderen geeigneten industriellen Keton ausgeführt. Das Lösungsmittel darf keine Gruppen enthalten, die zum Reagieren mit dem Säurechlorid/anhydrid oder Isocyanat fähig sind. Es ist möglich, Wasser zu verwenden, falls die Temperatur unter 15°C gehalten wird. Während dieser Reaktion wird HCl erzeugt. falls ein Säurechlorid verwendet wird. HCl kann mit einem tertiären Amin neutralisiert werden, wie Di-isopropyl-ethylamin. Die Reaktion wird bei einer Temperatur von 20–50°C ausgeführt und die Reaktionszeit beträgt geeigneterweise 1–3 h.
Als eine Alternative zu diesem letzten Reaktionsschritt und falls der Substituent R₁ für H steht, können sowohl der Aminsubstituent, als auch die Hydroxylgruppe der Formeln 5, 6, 16 und 17 mit einem Säurechlorid, einem Anhydrid oder einem Isocyanat umgesetzt werden, wobei ein beschichteter Polymergegenstand mit der Struktur:
oder eine Mischung der Struktur: (14) und (10) oder mit der Struktur
oder eine Mischung der Strukturen: (15) und (12) oder mit der Struktur:
oder eine Mischung der Strukturen: (23) und (19), oder mit der Struktur:
oder mit einer Mischung der Strukturen: (24) und (21) erhalten werden.
Die Doppelbindungen der anhängenden Gruppen können auch zu Epoxidgruppen oder entsprechenden Schwefel- oder Amino-Analoga durch in der Technik gut bekannte Techniken umgewandelt werden. Für Halohydrine oder vicinale Dihalide kann eine geeignete Anpassung des pH zu Epoxiden führen, durch dies Ausführen bei Vorhandensein der geeigneten Schwefel- und Aminoverbindungen werden die entsprechenden Schwefel- und Stickstoffanaloga gebildet werden. Diese dreigliedrigen Ringe werden dann dazu neigen, einen nucleophilen Angriff durch dieselben Verbindungen, wie oben für Halohydrine und vicinale Dihalogenide ausgeführt, zu durchlaufen. Die resultierenden Produkte können dann weiter derivatisiert werden, auch wie oben ausgeführt. Eine Alternative zum Erhalten von Epoxiden ist es, die Doppelbindung mit einer Peroxyverbindung umzusetzen.
Weiter können dann die eingeführten Gruppen (Schicht) weiter derivatisiert werden, um zum Beispiel geladene Gruppen, wie -SO₃ ^– (Sulphonat), -PO₃ ^2– (Phosphonat), -O-PO₃ ^2– (Phosphat), geladene Ammoniumgruppen (primär, sekundär, tertiär und quaternäre Ammoniumgruppen) einzuführen (freie Valenzen binden an gesättigten oder ungesättigten Kohlenstoff).
Die beschichteten Polymergegenstände können als Chromatographiemedien verschiedener Typen verwendet werden. Durch Variieren des Grades der Halogenierung, zum Beispiel der Bromierung, des Typs und der Menge von z.B. Amin und des Typs und der Menge von Säurehalogenid, wie Säurechlorid oder Isocyanat, ist es möglich, Teilchen mit einer großen Vielfalt in Oberflächeneigenschaften herzustellen. So ist es mit der Erfindung möglich, die Oberflächeneigenschaften für die verschie denen Moleküle, die chromatographisch getrennt werden sollen, maßzuschneidern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die beschichteten Gegenstände als RPC-Medien verwendet.
Die Einführung von primären oder sekundären Aminogruppen wird es ermöglichen, dass der erfindungsgemäße Gegenstand in der Festphasensynthese von Oligonucleotiden und Oligopeptiden verwendet werden kann.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die jedoch nicht beabsichtigt sind, die Erfindung zu beschränken. Mit Teilen und Prozent sind gemeint Gewichtsteile und Gewichtsprozent, falls nicht anders explizit angegeben.
In den Reaktionen werden Divinylbenzolteilchen verwendet. Die Teilchen besitzen die folgenden Eigenschaften: Teilchengröße: 15 μm; Oberfläche: 714 m²/g; Porengröße: 2,2 ml/g; 1,5 mmol Vinylgruppen/g. Ausgehend von diesen Teilchen wurden elf verschiedene beschichtete Teilchen für RPC durch Variieren der Länge der Alkyl- und Amidketten synthetisiert. Die erhaltenen beschichteten Teilchen wurden durch Trennen von Peptiden getestet und mit dem unbeschichteten Teilchen und mit einem herkömmlichen Silikateilchen, Kromasil^TM C18 (von Eka Nobel AB), verglichen.
Experimenteller Teil
Beispiel 1: 100 g Divinylbenzolteilchen in Ethanol (Menge der trockenen Substanz 10,6%) wurden mit Ethanol gewaschen und in einen Reaktor gegeben und auf 15°C gekühlt. 25,50 g Brom (1,60 mmol/g Teilchen) wurden in 400 g Ethanol aufgelöst und in Portionen über eine Zeitdauer von 15 Minuten zugegeben. Die Teilchen wurden mit Ethanol nach zwei Stunden gewaschen.
Beispiel 2: 31,18 g Hexylamin wurden zu 199,90 g wässeriger Suspension (Trockengehalt: 20.0 g) der bromierten Teilchen aus Beispiel 1 zugegeben. Erwärmen auf 90°C wurde zu derselben Zeit begonnen. Nach 24 Stunden wurden 300 ml Ethanol m/10% Isopropanol während einer Zeitdauer von 10 Minuten zugegeben. Die Sus pension wurde 25 Minuten lang gerührt und dann filtriert und mit 0,8 l Wasser, 1,6 l 0,1 M NaOH und 2,0 l Wasser gewaschen.
Beispiel 3: 43,51 g Hexadecylamin wurden zu 120,0 g wässriger Suspension (Trockengehalt: 12,0 g) der bromierten Teilchen aus Beispiel 1 zugegeben. Erwärmen auf 90°C wurde zu derselben Zeit begonnen. Nach 24 Stunden wurden 180 ml Ethanol m/10% Isopropanol während einer Zeitdauer von 10 Minuten zugegeben. Die Suspension wurde 25 Minuten lang gerührt und dann filtriert und mit 0,4 l Ethanol m/10% Isopropanol, 0,48 l Wasser, 1,0 l 0,1 M NaOH und 1,2 l Wasser gewaschen.
Beispiel 4: 7,5 ml Lauroylchlorid und 0,95 ml Diisopropylethylamin wurden zu 90,13 Suspension (Trockengehalt: 9,0 g) der Teilchen aus Beispiel 2 in trockenem Aceton bei Umgebungstemperatur gegeben. Nach zwei Stunden wurde die Suspension filtriert und mit 360 ml Aceton und 360 ml Ethanol gewaschen.
Beispiel 5: 4,34 ml Capryloylchlorid und 0,95 ml Diisopropylethylamin wurden zu 90,0 g Suspension (Trockengehalt: 9,0 g) der Teilchen aus Beispiel 2 in trockenem Aceton bei Umgebungstemperatur gegeben. Nach 2 Stunden wurde die Suspension filtriert und mit 360 ml Aceton und 360 ml Ethanol gewaschen.
Beispiel 6: 4,25 ml Lauroylchlorid und 0,55 ml Diisopropylethylamin wurden zu 51,0 g Suspension (Trockengehalt: 5,10 g) der Teilchen aus Beispiel 3 in trockenem Aceton bei Umgebungstemperatur gegeben. Nach 2 Stunden wurde die Suspension filtriert und mit 200 ml Aceton und 200 ml Ethanol gewaschen.
Beispiel 7: 2,45 ml Capryloylchlorid und 0,55 ml Diisopropylethylamin wurden zu 50,96 g Suspension (Trockengehalt: 5,10 g) der Teilchen aus Beispiel 3 in trockenem Aceton bei Umgebungstemperatur gegeben. Nach 2 Stunden wurde die Suspension filtriert und mit 200 ml Aceton und 200 ml Ethanol gewaschen.
Beispiel 8: 16,65 g 1,3-Diaminopropan (15 mmol/g Teilchen) wurden zu 15 g der Teilchen aus Beispiel 1, in Wasser (149,5 g Suspension) gegeben. Die Mischung wurde auf 90°C 25 Stunden und 40 Minuten lang erwärmt und dann mit Wasser, NaOH (0,5 M), Wasser, 20% Ethanol und Aceton gewaschen.
Beispiel 9: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 8 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. Capryloylchlorid (9,18 g, 9,4 mmol/g Teilchen) und N-Ethyldiisopropylamin (1,10 g, 1,4 mmol/g Teilchen) wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden in Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 10: 33,37 g 2,2-Ethylendioxydiethylamin (15 mmol/g Teilchen) wurden zu 15 g der Teilchen aus Beispiel 1 in Wasser (150,20 Suspension) gegeben. Die Mischung wurde auf 90°C erwärmt. Nach 24 Stunden wurden die Teilchen mit Wasser, NaOH (0,5 M), Wasser und Aceton gewaschen.
Beispiel 11: 26,38 g Hexandiamin (15 mmol/g Teilchen) wurden zu 15 g der Teilchen aus Beispiel 1 in Wasser (149,97 g Suspension) gegeben. Die Mischung wurde auf 90°C erwärmt. Nach 24 Stunden wurden die Teilchen mit Wasser, NaOH (0,5 M), Wasser und Aceton gewaschen.
Beispiel 12: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 8 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. 9,55 g (7,3 mmol/g Teilchen) Lauroylchlorid und 1,11 g (1,4 mmol/g Teilchen) N-Ethyldiisopropylamin wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 13: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 10 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. 9,21 g (7,0 mmol/g Teilchen) Lauroylchlorid und 1,11 g (1,4 mmol/g Teilchen) N-Ethyldiisopropylamin wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 14: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 10 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. 5,68 g (5,8 mmol/g Teilchen) Capryloylchlorid und 1,10 g (1,4 mmol/g Teilchen) N-Ethylisopropylamin wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 15: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 11 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. 9,20 g (7,0 mmol/g Teilchen) Lauroylchlorid und 1,10 g (1,4 mmol/g Teilchen) N-Ethyldiisopropylamin wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 16: 6,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 11 wurden mit trockenem Aceton gewaschen. 5,65 g (5,8 mmol/g Teilchen) Capryloylchlorid und 1,10 g (1,4 mmol/g Teilchen) N-Ethylisopropylamin wurden zu 60 g Acetonsuspension gegeben. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Teilchen mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Beispiel 17: 10 g der porösen Teilchen in Methanol (Trockengehalt 12,4%) wurden in einen Reaktor gegeben und auf 15°C gekühlt. 2,53 g Brom (1,58 mmol/g Teilchen) wurden in Portionen mit einer Glasspritze über 15 Minuten zugegeben. Die Teilchen wurden mit Methanol gewaschen.
Beispiel 18: 15,93 g Hexylamin (17 mmol/g Teilchen) wurden zu 9,14 g der Teilchen aus Beispiel 17 in Wasser (91,0 g Suspension) gegeben. Die Mischung wurde auf 90°C 24 Stunden lang erwärmt und dann mit Wasser, Natriumhydroxid (0,5 M), Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.
Beispiel 19: 7,00 g der aminierten Teilchen aus Beispiel 18 wurden mit Aceton gewaschen. 5,18 g (3,5 mmol/g Teilchen) Dodecylisocyanat wurden zu 62 g Acetonsuspension der Teilchen gegeben und erwärmt, zuerst bei 30°C für 1 Stunde 35 Minuten, und dann bei 50°C für 1 Stunde. Die Teilchen wurden mit Aceton und Ethanol gewaschen.
Die erhaltenen Endteilchen wurden beim chromatographischen Testen durch Trennung von Peptiden entsprechend verwendet:
Beispiel 20: Trennung von Peptiden I
Eine Peptidmischung bestand aus (Ile⁷)-Angiotensin III, (Val⁴)-Angiotensin II, Angiotensin III und Angiotensin I.

Probe: 0,125 mg/ml (Ile⁷)-Angiotensin III

0,125 mg/ml (Val⁴)-Angiotensin II

0,125 mg/ml Angiotensin III

0,125 mg/ml Angiotensin I
Die Peptide werden in Lösung A aufgelöst.
Lösung A: 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser. 1 ml TFA wird in 1000 ml entionisiertem Wasser aufgelöst.

Lösung B: 60% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure (TFA). 600 ml Acetonitril wurden in 400 ml entionisiertem Wasser und 1 ml TFA aufgelöst.

Gradient:	0–2 Säulenvolumina 15% B
	2–22 Säulenvolumina 15–65% B
	22–25 Säulenvolumina 65% B
	25–27% Säulenvolumina 15% B
Injektionsvolumen:	25 μL
Lineare Geschwindigkeit:	300 cm/h
Detektor:	UV 214 nm, 0,2 AU

Peptidtrennung II

Die Angiotensine wurden alle bei diesem pH positiv geladen und als eine Mischung aufgebracht. Die Retentionszeit (t_R), der Kapazitätsfaktor (k) und die Selektivität (Trennfaktor α) wurden bestimmt.

Säule:	Glassäule Pharmacia HR 5/5 (Vol.: 1 ml)
Mobile Phase A:	0,1% TFA
Mobile Phase B:	0,1% TFA/60% Acetonitril
Gradient:	9–39% Acetonitril in 20 Minuten
Injektion:	25 μl 0,5 mg/ml Angiotensin-Mischung
Fließgeschwindigkeit:	5 cm/min (1 ml/min)
Detektor:	214 nm, 0,2 AU
System:	FPLC^® (Chromatographiesystem von Pharmacia Biotech)

Vor dem Aufbringen der Probe ließ man auf jeder Säule einen Gradienten laufen, und die Säulen wurden mit 10 Säulenvolumina 15% mobile Phase B (9% Acetonitril) ins Gleichgewicht gebracht.
Trennung der Peptide III
Die Angiotensine wurden aufgrund ihrer Unterschiede in der Hydrophobizität in einem aufsteigenden Gradienten aus Acetonitril getrennt.
Die Ergebnisse werden in den Tabellen unten und in den Chromatogrammen präsentiert.
Die Retentionszeit t_R ist die Zeit zwischen dem Beginn der Elution und dem Auftreten des Peakmaximums. Die Retentionszeit wird in Tabelle 1 präsentiert. Das Retentionsvolumen V_R ist das entsprechende Volumen der mobilen Phase zwischen dem Beginn der Elution und dem Auftreten des Peaks.
Der Trennfaktor α ist ein Maß dafür, wie gut zwei Peaks getrennt sind. Er ist gegeben durch das Verhältnis der Kapazitätsfaktoren der zwei Peaks (k₂/k₁). Der Trennfaktor ist in Tabelle 2 präsentiert.
Tabelle 2:
Die modifizierten Medien sind alle hydrophiler als die unmodifizierten Medien und auch hydrophiler als das zum Vergleich verwendete Silikamedium. Die Retentionszeiten stehen im Zusammenhang mit der Polarität der synthetisierten Medien. Je geringer die Retentionszeiten, desto geringer die Konzentration der Probe in der stationären Phase, desto polarer die Oberfläche. Die unter Verwenden von Lauroylchlorid synthetisierten Medien besitzen höhere Retentionszeiten als jene, bei denen Capryloylchlorid verwendet wurde. Die polarsten Medien waren Medien, die mit Diaminen und Capryloylchlorid gemäß Beispiel 9 und Beispiel 14 hergestellt wurden. Dies ist aus Tabelle 1 evident, in der die tR Werte die geringsten für Beispiel 9 und 14 sind. Demgemäss erscheinen die Peaks in den Chromatogrammen zuerst in Beispiel 9 und 14. Wie aus den Chromatogrammen gesehen werden kann, erscheinen alle Peaks von den Beispielen gemäß der Erfindung vor den Peaks des unmodifizierten Mediums und des Silikamediums, was zeigt, dass die Teilchen gemäß der Erfindung hydrophiler sind. Daher besitzen die Oberflächenmodifikationen gemäß der Erfindung einen ausgeprägten Effekt auf die Konzentration des für die Elution verwendeten Acetonitrils. Eine geringere Menge des für die Elution verwendeten Acetonitrils führt zu größeren Einsparungen in den Kosten der organischen Lösungsmittel.
Der Unterschied in Selektivitätsfaktoren zeigt, dass die Trennung zwischen den Peptiden einfach durch die Oberflächenmodifikationen derart geändert werden kann, dass ein Trennungsproblem durch kleine Änderungen im Produktionsverfahren optimiert werden kann.
Die aus monosubstituierten Aminen synthetisierten Medien besitzen geringere Trennfaktoren als jene, die aus disubstituierten Aminen synthetisiert sind. Die Diamino-Medien trennten (Ile⁷) Angiotensin III und (Val⁴) Angiotensin III viel besser und ergaben eine größere Variation in der Trennung als die auf Monoaminen basierenden Medien.
Die Medien gemäß Beispiel 9 und 14 besaßen auch den höchsten Trennfaktor für (Ile⁷) Angiotensin III und (Val⁴) Angiotensin III, was aus Tabelle 2 und der Peaktrennung in den Chromatogrammen evident ist. Im allgemeinen kann aus den Chromatogrammen gesehen werden, dass die Trennung mit den Medien gemäß der Erfindung auch viel besser ist als mit dem unmodifizierten Medium oder dem Silikamedium. Kromasil trennt die Peptide nicht genau, da die Peaks nicht getrennt sind.
Während des Prioritätsjahres haben wir gezeigt, dass Beschichtungen, in denen die Alkylgruppen von R₁ und/oder R₂ repetitive Einheiten von niederen Alkenyloxygruppen sind, wie -CH₂CH₂-O-, -CH₂CH₂CH₂-O-, -CH₂CH₂(CH₃)-O-, und Molekulargewichte bis zu mindestens 5000 Dalton besitzen, in chromatographischen Anwendungen funktionieren werden.
Während des Prioritätsjahres haben wir auch Aminogruppen eingeführt, um die Kügelchen für Festphasen-Oligonucleotidsynthese geeignet zu machen.
Zugabe von Brom: 10 Gramm Eis wurden mit 300 ml 0,5 M Natriumacetatpuffer pH 5 gewaschen. 62 g Poly(divinylbenzol-ethylvinylbenzol)-Teilchen in Natriumacetatpuffer pH 5,0 wurden in einen 100 ml Reaktor übertragen. Die Temperatur wurde auf 15°C gesetzt. Dann wurden 2,40 g Brom (1:1 Mmol Brom/mmol Vinyl) in 65 g Natriumacetatpuffer pH 5 aufgelöst und in den Reaktor gegeben. Nach fünf Minuten wurden die Teilchen mit 500 ml Wasser gewaschen.
Reaktion mit Ammoniak: 10 g Teilchen wurden in einen 100 ml Reaktor mit 54,4 g 25%-ige Ammoniaklösung übertragen. Die Reaktion wurde auf 60°C erhöht und die Suspension mechanisch bei 300 Upm gerührt. Nach 16 Stunden wurde die Mischung mit 700 ml Wasser und 300 ml 20%-igem Ethanol gewaschen. Amin: 0,30 mmol Amin/g Teilchen.
Es wurde gefunden, dass der Amingehalt 0,30 mmol/Gramm Teilchen betrug, durch Tiltration des Salzsäureaminsalzes mit Silbernitrat.
Die so erhaltenen aminierten Teilchen wurden erfolgreich in Festphasen-Oligonucleotidsynthese durch herkömmliche Verfahren verwendet.

Claims

Beschichteter Polymergegenstand, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschichtung kovalent an die Polymeroberfläche über Doppelbindungen des Polymers gebunden ist, wobei der Gegenstand die folgende Struktur besitzt:
a) P umfasst ein Basispolymer und weitere Gruppen -L-CH(-X(R₁)_p)-CH₂(-Y(R₂)_p) ;b) L steht für einen Benzolring; c) X und Y sind unabhängig ausgewählt aus Halogenen, insbesondere Br, und N, S und O; d) R₁ steht für Wasserstoff, eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkyl- oder Acylgruppe, wie C₁-C₁₀-Alkyl, C₁-C₁₈-Acyl, oder R₂, wenn X für N, O oder S steht; e) R₂ steht für Wasserstoff, ein geradkettiges, verzweigtes oder zyklisches Alkyl, wie C₁-C₁₈-Alkyl, -R₃(-NH₂)_q, Alkylaryl oder Arylalkyl, in denen der Alkylteil 1–18 Kohlenstoffatome enthalten kann, -R₃(-NH-CR₄=O)_q, -CR₄=O oder niedere Polyalkyloxy-Gruppen, die terminal acyliert oder alkyliert sein können; f) p steht für eine ganze Zahl von 0–3, mit der Maßgabe, dass, wenn X für Halogen steht, p gleich 0 ist, wenn X für O steht, p gleich 1 ist, wenn X für S steht, p gleich 1 oder 2 ist, und wenn X für N steht, p gleich 1, 2 oder 3 ist, und mit der weiteren Maßgabe, dass für p gleich 2 oder 3 die zwei oder drei Gruppen R₂ identisch oder verschieden sein können; g) R₃ steht für ein geradkettiges, zyklisches oder verzweigtes Alkyl, -O-Alkyl, Hydroxyalkyl, Phenylalkyl, mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen im Alkylteil, und R₄ steht für eine geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkylgruppe, wie C₁-C₁₈-Alkyl; h) q steht für eine ganze Zahl > 0, die repräsentiert, dass ein oder mehrere Wasserstoffe in R₃ durch eine jeweilige primäre Aminogruppe (-NH₂) oder eine jeweilige -NH-CR₄=O-Gruppe ausgetauscht worden sein können.
Beschichteter Polymergegenstand nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gegenstand in der Form von Teilchen mit einem Durchmesser von 3–100 μm vorliegt.
Verwendung des Polymergegenstands nach einem der Ansprüche 1 bis 2 als Chromatographie-Trennmedium.
Verwendung des Polymergegenstands nach einem der Ansprüche 1 bis 2, der primäre oder sekundäre Aminogruppen aufweist, als fester Träger in der Festphasen-Oligonucleotidsynthese.
Verwendung des Polymergegenstands nach einem der Ansprüche 1 bis 2 als Umkehrphasen-Chromatographiemedium.