JPH05507736A - 酵素による光学活性シアンヒドリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素による光学活性シアンヒドリンの製造法本発明はシアンヒドリンの製造法に 関する。更に詳しくは、本発明はアルデヒドをＳ−オキシニトリラーゼの存在下 で青酸と反応させることを特徴とする周知のピレスロイド殺虫剤の製造の中間体 として有用な光学活性（Ｓ）シアンヒドリンの改良製造法に関する。

アルデヒドを酵素オキシニトリラーゼおよび溶媒ジイソプロピルエーテルの存在 下で青酸と反応させて光学活性シアンヒドリンを製造する方法は周知であり、た とえばエラフェンバーガーらの米国特許第４．８５９．７８４号に記載されてい る。該米国特許を引用によってここにくみ入れる。この米国特許に記載されてい るように、この反応は不動化された形体の酵素、たとえばガラス球、イオン交換 樹脂またはセルロース粒子の表面に結合させた不動化された形体の酵素、を用い て行なわれる。この不動化粒子はスラリの形体にあり、生成物を回収する前に溶 液からまず濾過しなければならない。この方法は意図する用途には有効であるけ れとも、不動化酵素を通る反応試剤の単一通過を特徴としており、その通過の完 了には５〜６日を要する。同様に、キュラらのオーストラリア特許出願３８１０ ４／’８９には酵素旦−オキシニトリラーゼが粒子状の資源（ｓｏｒｇｈｕｍｂ ｉｃｏｌｏｒ）から誘導される類似の方法が記載されている。この方法では１つ の態様において酵素を不動化させるためにアクリルビーズか使用されている。す なわち商業的に入手しつるアクリルビーズてあり、このものは反応物質中に又は カラム中に懸濁させるに有用である。いづれの場合にも、それは種々の有機溶媒 によるアクリルビーズへの攻撃を避けるために水性系においてのみ使用されなけ ればならない。その上、この後者の結合酵素を使用する方法では、約５５ｔｖｔ ％の収率がえられるが、それはアルデヒドとして４−ヒドロキシベンズアルデヒ ドを使用して３日の連続操業の後にのみえられる。またネイダーメイヤーの米国 特許第５、００８．１９２号：欧州特許第３２６．０６３号、米国特許第３．８ ６２．　ｏａｏ号、および西独特許公開第３８２３８６４Ａ　−４を参照された い。これらは前記の米国特許およびオーストラリア特許に対応する。

上記の特許のそれぞれにおいて、［酵素・隔膜・反応器」が参照される。対応す る技術文献、（たとえば、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｒ　Ｅ ｎｚｙｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’　、およびその脚注すなわちクラゲルらの Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａ。

Ｓｃｉ、　６１３．　ｐｐ、１６７−１７５　（１９９０）　、およびバスイッ ク・ラッキイらのＡｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　３１．　ｐｐ、２１５−２ ２２（１９８９）を参照）に示されているように、このような反応器は酵素が物 理的に不浸透性できる濾過膜によって分離された一連の容器以上の何物でもない 。すなわち、この種の反応器において、反応は反応試剤が究極的に拡散によって 接触する分散酵素含有の溶液中で行なわれる。

ポリマー膜を使用して酵素を結合させることはブルース・ニス・ゴールレバーク の米国特許第４．１０２．７４６号および同第４．１６９．０１４号から一般に 知られている。また、１９８４年５月ｌＯ日に米国ニューシャーシー州イースト ・ブルンスウイックで開催された第２７年会春季シンポジウムＡＩＣＨＥにおい てブルース・ニス・ゴールドバーブが発表した「ＡＮｏｖｅｌ　［ｍｍｏｂｉｌ ｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅａｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｊにはこれら２つの 米国特許の膜反応器が記載されている。これらの２つの米国特許および１９８４ 年５月１０日のＡＩＣ）ｒＥ集会も引用によってここにくみ入れる。

本発明によれば、アルデヒドを触媒酵素Ｓ−オキシニトリラーゼおよび溶媒の存 在において青酸と反応させることによる光学活性（Ｓ）−シアノヒドリンの周知 の方法における反応時間および反応試剤の取扱いの容易さか、Ｓ−オキシニトリ ラーセ酵素を下記のように化学的に結合させた化学的に活性な多孔質膜にアルデ ヒドと酸の溶液を通すとき、上記の方法よりも著るしく改良される。

すなわち、シアンヒドリンの（Ｓ）−および（Ｒ）一対掌体は立体選択性触媒の 存在しない場合、通常は等しい量ですなわち５０：５０の比で生成するのに対し て、本発明の目的は改良された触媒と反応条件との適切な選択によって（Ｓ）− 異性体と（Ｒ）−異性体との比（“Ｓ／Ｒ”）を増大させようとするものである 。本発明の更なる目的はＳ−異性体とＲ−異性体との比を選択的に増大させるば かりてなく、生成物への高い転化率をできるだけ短い時間で与えることにある。

更に別の目的は最終生成物から酵素を物理的に分離することなしにこれらの目的 をえることにある。

所望の光学的に活性なシアンヒドリンを製造する本発明の方法は、上記のように して、すなわちアルデヒドと青酸の溶液を、酵素を化学的に結合させた限られた 多孔質膜に、バッジ式または連続式にえらばれた時間通し、そして所望の光学的 に活性なシアンヒドリンを回収することによって、容易に行なうことができる。

このようにして行なわれたとき、反応時間は従来法で６〜７日たったのとは対照 的に１日程度の短い時間に驚異的に減少することかできること、然も同時に生成 物の全収率、ならびに所望のＳ−異性体の選択率を従来法に比へて同等に保持す るか又はある場合には増大させる、ということか発見された。逆に、そして更に 好ましくは、本発明の方法によって全収率は、数日たとえば６〜７日を要した従 来法の時間を使用するとき、比例的に数倍になりつるということが理解されるで あろう。

望ましくは、反応は実質的に水不溶性のアルデヒドおよび生成シアンヒドリンか 可溶である有機系において行なうへきである。少量の水性緩衝液すなわち系の全 重量を基準にして約１ｗｔ％までの状態を使用することかできるけれとも、でき るだけ少ない水すなわち約く０．０３％の水しか使用しないのか好ましい。従っ て、本発明は有機溶媒（任意に水性緩衝液を含む）、アルデヒドおよび酸の反応 試剤、および下記に詳しく述へる多孔質膜に化学的に結合させた酵素、から成る 系を実質的に含む。

反応は広範囲の温度およびｐＨ条件のもとで行なうことができ、これらは重要な 二とてはない。すなわち、たとえば約−６°Ｃ〜＋３０°Ｃ１好ましくは＋６° Ｃ〜２５°Ｃの温度か許容しつる。ｐＨ条件は、臨時的ではないけれとも、酢酸 ナトリウム、クエン酸ナトリウム、またはリン酸ナトリウムのような緩衝系によ って制御することができ、約３．５〜７，５のｐＨの範囲てありうる。

使用するアルデヒドは米国特許第８５９．７８４号（上記）に記載されているよ うな通常のものである。該米国特許を引用によってここにくみ入れる。この特許 に記載されているように次式のアルデヒドが含まれる。

ここにＲは飽和または不飽和の脂肪族または芳香族であり、ハロゲン、硫黄・窒 素、または酸素・含有基で置換されていてもよい。

本発明にえらばれるアルデヒドは望ましくは実質的に水不溶性であるへきである 。すなわちそれらは好ましくは本発明の有機溶媒に可溶であるへきである。従っ て約２．０〜０．Ｏ１■／−未満の水中溶解度をもつのか好ましく、最も好まし くは０．１■／ｍＩ！未満の更に０．０１■／−迄の溶解度をもつものである。

これらの水不溶性アルデヒドの例として次式によって表わされるものがあげられ る。

ただしＡは水素または弗素であり；Ｂは水素、弗素、塩素または臭素である。こ れらのうちで３−フェノキシ−ベンズアルデヒドか好ましい。

アルデヒドと青酸のモル比は望ましくは約１：１−１：１００、更に好ましくは 約ｌ・ｌ−１：２である。

使用する有機溶媒の種類は使用する膜または反応の性質に悪影響を及はさないも のから容易にえらぶことかできる。すなわち、たとえばジ−ｎ−ブチルエーテル の使用が一方で好ましいが、米国特許第４．８５９．７８４号（上記）の方法で 使用されるジ−イソプロピルエーテルは本発明の方法を実施不能にすることが予 想外にも見出された。

Ｓ−オキシニトリラーゼ酵素触媒（Ｅ　Ｃ４，１，２，１１）はシグマ・ケミカ ル・カンパニーから商業的に入手することかでき、あるいは周知の方法酵素の量 は望ましくはアルデヒドＩｇ当り約５０〜２５００単位であり、更に好ましくは アルデヒドＩｇ当り約５００〜７５０単位である。酵素は下記の多孔質膜に常法 により化学的に結合させることかできる。たとえば５ｗｔ％のポリエチしンイミ ン水溶液で膜を処理し、次いて５ｗｔ％のゲルタールアルデヒド水溶液で処理し 、最後に適当な緩衝液中のＳ−オキシニトリラーゼ酵素溶液で膜を処理する。

有利には、酵素は一回で数日間膜に固定されてととまり、従って従来技術の方法 に比へてより安定で持続性のある配列を表わすばかりでなく、米国特許第４．８ ５９．７８４号および同第５．００８．１９２号のスラリ状態の酵素の分離と回 収という余分な工程を避けてもいる。

ここに使用する多孔質膜は米国特許第４．１０２．７４６号（上記）に十分に記 載されている。この米国特許はこれらの酵素結合性材料、その性質と製造法、お よびこのような材料上への酵素の固着と回収を述べている。

基本的に、えらばれた厚さ及び／又は層のこれらの材料は微粉砕の充てん剤粒子 をバインダー中にくまなく分散させた不溶性の三次元ポリマー状樹脂質バインダ ーから成り、実質的に相互連結した孔を内部に含むネットワーク構造をもってお り、孔の寸法は広範囲に変化することができ、最も望ましくは約０．０１〜約１ ００ミクロンであり、そして材料の全多孔質は約５０〜７５％であり、そして分 散した充てん剤粒子は組成物の全重量を基準にして少なくとも約２５重量％の量 で存在する。

このような膜の１つはＭＰＳ膜（米国ペンシルバニア州フィラデルフィアのＦＭ Ｃコーポレーションの商標）であり、このものは７０〜８０％の範囲の孔容積を もつ微孔性ポリ（塩化ビニル）−シリカシートである。孔容積は水銀インストロ ンポロシメータで測定して一般に０．２μｍ〜２．０μｍの範囲にある。この支 持体は非常に親水性であって、正に変化しうる負の電荷、および８０ｒｒＩ／ｇ の表面積をもつ。またこの材料は通常の条件下では非圧縮性であって、０．４５ ｇ／ａ１１の低い乾燥密度をもつ。活性の場は多孔質マトリックス内に含まれる シリカ上にある。この多孔質マトリックスはシリカ付着化学を有して有機官能基 の付加を可能にする。このＭＰＳ膜は少なくとも約２６０μｇ／ａｄのＤＮＡ結 合能力をもつ。その上、この膜ならびにここに使用しうる他の好適な膜は、通常 は水性環境においてのみ使用されているけれども、本発明の有機溶媒の条件下で は驚異的に安定できる、ということが見出された。

バインダーすなわち膜のマトリックスを形成するポリマーは広範囲に変えること ができるけれども、それらは望ましくは熱可塑性の商業的に入手しうる樹脂であ り、そのなかでもポリ（塩化ビニル’）（ＰＶＣ）が好ましい。然しなから、シ リカ充てんポリエチレン、またはＰＶＣと少量のモノエチレン性モノマー（たと えば酢酸ビニル、塩化ビニリデン、プロピレンなと）とのコポリマーのような材 料を使用することもできる。

あるいはまた、マトリックスはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セル ロースアセテートまたはトリアセテート、ポリアミド（たとえばナイロン）など のような材料から製造することもできる。ＰＴＦＥを使用する場合、それはたと えば親水吸収性粒子を配合したフィブリル材料（米国特許第４．１５２．６６１ 号および同第４．３７３．５１９号参照）の形体でありうる。すなわち、溶媒に よって容易に可塑化される、または熱もしくは圧力によって焼結される、または 浸透性マトリックスで出発して容易に成形されうる、そして本発明の条件下で化 学的および物理的に安定である任意の樹脂を一般に使用することができる。

充てん剤、好ましくは粒状形体の充てん剤として、無機材料たとえば上記のシリ カ化合物、またはアルミニウム化合物たとえば酸化アルミニウムまたは水酸化ア ルミニウム：あるいは有機材料たとえば活性化セルロース誘導体を含む多糖類、 があげられる。（他方、非活性セルロースはＰＶＣとの組合せにおいて育生でな いことがわかった。）生成する膜はそれと酵素との間で、すなわち充てん剤粒子 と酵素との間で、化学結合剤を与えるような周知の方法でこれを処理することに よって活性化することかできる。この結合は中間試剤と酵素との間の化学吸着、 共有結合によって、または交差結合によって起る。膜に付与しうる結合性官能基 として、遊離アミノ残基ならびにＳ−オキシニトリラーゼ酵素を膜と結合させる カルボキシル、イソニトリル、アルデヒド、またはケトン基かあげられる。これ らのなかで、充てん剤上に化学吸着されうるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が次 いて酵素を結合させるたとえばゲルタールアルデヒドとの組合せにおいて好まし い。

米国特許第４．１０２．７４６号（上記）に記載されているように、本発明の方 法に使用される膜は、微粉砕ポリマー樹脂、微粉砕無機光てん剤、溶媒（たとえ ばシクロヘキサノン）および非溶媒（たとえば水）のそれぞれ好適な量を低い剪 断条件下で混合して安定な湿めった自由流動性の粉末にすることによって容易に 製造することかできる。この粉末混合物を次いて押し出し及び好ましくはカレン ダリングして所望の寸法の実質的に平らな製造物またはシートにし、次にこれを 水性溶に通して溶媒を洗い出し、そして次に加熱空気オーブンに通して水を除く 。本発明によれば、微孔性、寸法安定性の半剛性の不溶性、流体浸透性の形体の 生成物品は次いてこれに酵素を結合させるように処理されつる。

１つの好ましい態様において、初期の、化学的に活性化されていない膜は次のよ うにして製造することができる。１８０μｍ篩（８０メツシユ）を通る粒径をも つＣｏｎｏｃｏ５３８５ポリ（塩化ビニル）樹脂の２０．０ボンド（９，０７ｋ ｇ）、および沈殿水和シリカＨｉＳｉ　１２３３の４０．０ボンド（１８，１４ ｋｇ）をパダーリン・ケレイの低剪断液体・囲体ブレングー中で約３分間まず乾 式ブレンドすることによって多孔質材料のシートを製造する。その後に、および これにつづく攪拌中に、５４．６ボンド（２４，８ｋｇ’）の溶媒（シクロヘキ サノン）をポンプによって２０分間にわたって加える。

次いて２９．０ボンド（２６，８ｋｇ）の量の水を、攪拌ブレングー中の混合物 に次の２０分間にわたって加えて湿めった自由流動性の粉末を製造する。この粉 末を次いで約１２０°Ｆ（４８，９°Ｃ）の胴部温度をもつスクリュー押出し機 に導入し、押出し物をカレンダーのロール間に通して０．０２インチ（０，５ｎ ｕｎ）の厚さをもつ実質的に平らなシートを得る。このシートを次いで１７０’ Ｆ（７６，７℃）の抽出水溶に通し、次いで２２５°Ｆ（１０７，２℃）の熱風 オープン中で６分間乾燥する。仕上げ多孔質シートは水銀インストロン法で測定 して約０．０１ミクロンから約１００ミクロンにのびる比較的広いボア・サイズ 分布および約０．１５　ミクロン−約０．２５ミクロンの範囲の平均孔半径をも つ。この物質の全多孔度は約６５容量％てあり、分散光てん剤（たとえばシリカ ）の含量は約５６重量％である。たとえば日常試験において、液体の水は圧力を 加えることなしに容易にこの物質中に浸漬する。このことは微孔が表面から表面 に実質的に相互接続していることを示すものである。

上記のように製造した膜は次いで所望ならば結合剤で化学的に変成して次の手段 によってより強固にＳ−オキシニトリラーゼを結合させる。

未処理膜を分子量５０．０００の枝分かれ鎖ポリエチレンイミン（ＰＥ　Ｉ）の ５％（重量／容量）水溶液中で室温で１時間加温する。処理した支持体を水およ びＬＭのＮａＣｌでフラッシュ洗浄して吸着されなかったＰＥＩを除去する。分 析はトリニトロベンゼンスルホン酸試験によって行なうことができる。強いオレ ンジ色のトリニトロフェニルアミン誘導体が処理された支持部材の表面に観察さ れ、従って実質的な脂肪族アミノ官能基か実証される。処理した支持部材上の窒 素荷重は元素分析によって定量化され、たとえば乾燥重量基準で１．２５％の窒 素か定量化され、これに対して処理していない支持部材の窒素は乾燥重量基準で ０．０２％窒素である。処理した支持部材上のＰＥＴの化学吸着は実質的に非可 逆的である。すなわちそれは３〜９のｐＨ値の高いイオン強度の溶液（たとえば ＩＭのＮａＣＩまたはＩＭのに、ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ，）による加温によって 除去することができない。強い酸性条件（１ＭのＨＣｎ中で２時間の加温）の場 合においてのみ、元素分析によって示されるような窒素含量の５０％に達する部 分吸着の証拠が存在しつる。標準ＢＥＴ法による処理支持体の表面積は５５．４ ｒｒｆ／ｇてあり、これに対して対照標準の表面積は８１．１ｄ／ｇである。Ｐ ＥＩで処理した支持部材は使用する緩衝液またはイオン強度に関係なく未処理支 持部材に比へて同し流れ性質を示す。

次いて酵素を膜に結合させる。この膜は上記のようにまずＰＥＩで化学的に活性 化し、次いで酵素か最終的に結合するゲルタールアルデヒドのような結合性の基 で化学的に活性化したものである。次いて反応試剤を膜の孔に流れるように酵素 と接触させる。反応物質の流れはハウジングまたはホルダー中に膜または膜の層 を支持することによって制御されるのが望ましい。このハウジングまたはホルダ ーは膜の縁を保持することによって反応器ユニットを形成し、これらの縁を流れ に対して不浸透性にする。所望ならば入口および出口ポートを膜の表面に接近さ せ、それによって反応試剤を反応器コアの孔に指向させて酵素と接触させるボー トを備えることもてきる。ディスクの形体のこの種の代表的な反応器としてＡｃ ＴＩ−ＤＩＳＫおよびＡＣＴｒ−ＭＯＤ（米国ペンシルバニア州フィラデルフィ アのエフ・エム・シー・コーポレーション）かあげられる。特に後者のディスク はより完全な回収を確保するために数層の膜から構成されている。それ故、用語 「膜」は一層または多層の膜を包含し、必要な最終の厚さは日常試験によって容 易に決定されるということがこの記述を通して理解されるであろう。従って、以 下の実施例において、ＡＣＴＩ−ＤＩＳＫマトリックスは１〜約５層の膜を含み 、たとえば実施例２．　３．　６および７では一層の膜であり、実施例１．　４ および５では５層の膜である。

所望のシアンヒドリン反応生成物は次いて青酸および溶媒を蒸留により除去する ことによって回収されうる。

本発明を以下の実施例によって更に説明する。ここに使用する篩の寸法はＡ　Ｓ 　ＴＭ陣準Ｅｌｌ−８７に命名されている。

実施例１ 室温のシーｎ−ブチルエーテル中ての青酸と３−フェノキシベンズアルデヒドか らの（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）−メタノールの製造 工程Ａ　多孔質マトリックス上のＳ−オキシニトリラーゼ酵素の不動化ポリ（塩 化ビニル）およびシリカの膜（米国ペンシルバニア州フィラデルフィアのエフ・ エム・シー・コーポレーションからのＭＰＳシート）を含み、ポリエチレンイミ ンで予備処理したＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支持マトリックスを標準ポンプ回転反応器 に取付けた。この反応器は流体計量ポンプから成り、最大１ｅｄ１分をポンプ給 送しつるものであり、透明な柔軟性プラスチック管によってその入口からＡＣＴ Ｉ−ＤＩＳＫ支持マトリックスの入口ポートに接続され、その出口ポートから１ ００−受器に接続されているものであった。この受器を配管によってポンプの入 口に接続した。ＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支持マトリックス（バイオサポート、マテリ アルズ、ケミカル・プロダクッグーブ、米国ペンシルバニア州フィラデルフィア のエフ・エム・シー・コーポレーション）は直径６３，５■、厚さ６．４ｍｍの プラスチック・ハウジングから成り、その平らな面の１つに入口ボートをもち、 その反対側の平らな面と出口ポートをもつものであった。このプラスチック・ハ ウジング内には５層の流体浸透性多孔質膜が含まれており、この膜はポリ（塩化 ビニル）の疏水性ポリマー、マトリックス、このマトリックス中に分散させた微 粉砕親水性光てん剤シリカ、およびこの物質中に形成した相互連結微孔のネット ワークから成るものであった。

酵素のＮ−末端をＰＥＴ変性ＡＣＴＩ−ＤＩＳＫに結合させるための５％（ｗｔ ／ｒ）ゲルタールアルデヒド溶液の２５ｙｄを受器に入れ、８ｒＩＬｌ／分の割 合で６０分間ＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支持マトリックス中にポンプ給送した。この溶 液を５０ｄの水に取替えてこれをＡＣＴＩ−ＤｒｓＫ支持マトリックス中に３０ 分間ポンプ給送した。次いでこの水を受器から除いた。

ツルガム／スウダン草ヒイブリド（蛋白分析　５．４■蛋白１ｍｌ；酵素活性分 析：１０．７単位／■蛋白）の７日間日をあてずに育てたシュートからえたＳ− オキシニトリラーゼ酵素の水溶液２８ｍ１を０．０５Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ＝５．　４）で１００ｍＮに希釈し、受器に入れた。この溶液をＡＣＴＩ −ＤＩＳＫ支持マトリックス中に３０分間ポンプ給送した。この時間の後に、Ａ ＣＴＩ−Ｄ　ＩＳＫ支持マトリックスを通る流れをポンプ回転反応器中で反転さ せて完全で均一な酵素荷重を促進させた。酵素溶液のポンプ給送を更に３０分間 続けた。次いでＡＣＴｌ−ＤＩＳＫ支持マトリックスを上記のように３０分間５ ０ｍ１の水で洗浄した。この時間の後に、Ｓ−オキシニトリラーゼ酵素を不動化 したＡＣＴＩ−ディスク支持マトリックスを含むハウジングをポンプ回転反応器 から除いて、必要なときまで冷蔵庫中に貯蔵した。

工程Ｂ　室温でのジ−ｎ−ブチルエーテル中の青酸と３−フェノキシベンズアル デヒドからの（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）−メタノールの製 造 不動化酵素を含む工程へからのＡＣＴｒ−ＤＩＳＫ支持マトリックスを標準ポン プ回転反応器中に取付けた。この系の受器は２５〇−以上の容量をもっていた。

少量のジ−ｎ−ブチルエーテルをＡＣＴ　Ｉ　−Ｄ　Ｉ　ＳＫ支持マトリックス 中に３０分間連続的にポンプ給送することによってＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支持マト リックスから残存水を除いた。代表的なバッチにおいて、１００ｙｄのジ−ｎ− ブチルエーテル中の５．１ｇ（０゜０２６モル）〜２４．８ｇ（０，１２５モル ）の３−フェノキシベンズアルデヒドの溶液を受器に充てんした。これに、注射 器によって１．　１モル当量の青酸を加えた。この溶液を攪拌して青酸の完全な 溶解を確保した。１ｍ／／分〜５ＴＬｌ／分のポンプ給送速度でＡＣＴＩ−Ｄｒ ｓＫ支持マトリックスへの溶液の循環を始めた。試料を周期的にとって下記のよ うに分析した。反応が完了したら（代表的に約２４時間後に）、反応混合物を反 応器からポンプで取り出した。次いでＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支持マトリックスをこ れに２５ｒｄ！のジ−ｎ−ブチルエーテルをポンプ給送することによって洗浄し た。この洗浄の後に、反応器を別のバッチのプロセスの状態においた。

反応混合物から除いたそれぞれの試料について２つの分析を行なった。

１つの分析は３−フェノキシベンズアルデヒドから（シアノ）（３−フェノキシ フェニル）メタノールへの全転化率を決定するために行ない、第２の分析はこの ようにして製造した生成物のＳ／Ｒ比を決定するために行なった。

（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールへの転化率を決定するために 、反応混合物の０．　１ｍ！！の試料をガスクロマトグラフ自動サンプラーびん に入れてメチレンクロライドで約ＩＴｎｌに希釈した。これに約１ｍｌのＮ、Ｏ −ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを加えた。このびんを密 閉し、振とうし、その後にこれを１５分間放置した。この溶液の試料をほぼプロ グラムされたガスクロマトグラフに注入した。

（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールのＳ／Ｒ比を決定するために 、反応混合物の０．　５−の試料を１ドラムのびんに入れた。

これに、３滴のモッシャーの酸クロライド（Ｓ−（−）−α・メトキシ−α−（ トリフルオロメチル）フェニル酢酸クロライド）および５滴のピリジンを加えた 。えられた反応混合物を混合し、次いてｌｌｌｅ間反応させた。この時間の後に 、Ｉｄの水および１イのエチルアセテートをこの反応混合物に加えた。この混合 物を振とうし、エチルアセテート層を除いてガスクロマトグラフ自動サンプラー びんに入れた。この溶液の１つの試料をほぼプログラムされたガスクロマトグラ フに注入した。

（Ｓ）−（シアン）（３−フェノキシフェニル）メタノールを製造するための７ つのパンチのプロセスの結果を下記に示す。

生成物 １　０、０２６　１　ｍＬ／ｍｉｎ　２４ｈｒｓ　７６、３％　９１．４／８． ６２　０．０２６　５［Ｉ］Ｌ／＋ｎｉｎ　２３ｈｒｓ　９１−８％　９１．４ ／ｓ、　ｓ３　０、０２６　５　ｍＬ／ｍｉｎ　１９ｈｒｓ　８８．４％　９２ ．４／７．６４　０、０２６　５　ｍＬ／ｍｉｎ　２４ｈｒｓ　９１．２％　９ ３．７／６．３５　０、１２５　５　ｍＬ／ｍｉｎ　２４ｈｒｓ　９４．０％　 ９１．０／９．０６　０、１２５　５　ｍＬ／ｍｉｎ　２４ｈｒｓ　９０．７％ 　８５．７／１４．３７　０、０２６　５　ｍＬ／ｍｉｎ　２４ｈｒｓ　８０． ７％　７５．５／２４．６実施例２ ６°Ｃの温度のジ−ｎ−ブチルエーテル中の青酸と３−フェノキシベンズアルデ ヒドからの（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造 この実施例の（Ｓ）−（シアン）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施 例１で述へた方法によって製造した。ポンプ回転反応器は、ＡＣＴｌ−ＤＩＳＫ 支持マトリックスが単一層の流体浸透性微孔性膜のみを含み、この膜にＳ−オキ シニトリラーゼ酵素を不動化したという点て異なっていた。この方法で使用した ＡＣＴＴ支持マトリックスを６°Ｃに保った一定温度で浸漬した。合計１６バツ チを反応させた。それぞれのハツチは２５ｍ１１１のジ−ｎ−ブチルエーテル中 の１゜Ｏｇ（０，００５モル）の３−フェノキシベンズアルデヒドと０．４〜０ ．５ｙｄ（過剰）の青酸から成るものであった。

ポンプ給送速度は０．４〜５　ｍｌ１分に保った。（Ｓ）−（シアノ）（３−フ ェノキンフェニル）メタノールを製造するための１６バツチのプロセスの結果を 下記に示す。

実　験　生成物への　Ｓ／Ｒ ８２３ｈｒｓ　７０．０％　９５．０１５．０９　、　２６ｈｒＳ　６５．８％ 　９３．２／６．８１０　２４　ｈｒＳ　６２．８％　９４．０／６．０ＩＩ　 ２４　ｈｒｓ　６５．７％　９３．０／７．０１２　２７　ｈｒｓ　６３．９％ 　９３．０／７．０１３　２４　ｈｒｓ　６５．９　％　９３．４／６．６１４ 　３６　ｈｒｓ　７６．９％　９３．０／７．０１５　２４　ｈｒｓ　７５．０ ％　９３．５／６．５１６　２３　ｈｒｓ　７８．２％　９５．０１５．０１７ 　２４　ｈｒＳ　７７、１％　９６．０／４．０１８　２３　ｈｒｓ　７６、４ ％　９５．０１５．０１９　２４　ｈｒｓ　７２．７　’ｔｏ　９４．５１５． ５２０　２４　ｈｒｓ　６９．２％　９３．０／７．０２１　２４　ｈｒｓ　７ ０．２０１９０．０／１０１０２２　２４　ｈｒｓ　６８．２％　８７．０／１ ３．０２３　２４　ｈｒｓ　５６．１％　８１．０／１９．０実施例３ 室温のｔ−ブチルメチルエーテル中の青酸と３−フェノキシベンズアルデヒドか らの（Ｓ）−、（シアン）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造 二の実施例の（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施 例１で述へた方法によって製造した。ポンプ回転反応器はＡＣＴ　丁−ＤｒｓＫ 支持マトリックスが単一層の流体浸透性微孔性膜のみを含み、この膜にＳ−オキ シニトリラーゼ酵素を不動化した点てのみ異なっている。それぞれのバッチは１ ．Ｏｇ（０，００５モノりの３−フェノキシベンズアルデヒドおよび０．５ｍｆ の青酸（これは完全な転化を確保する目的で過剰であり、蒸発による損失を補償 するために過剰である）から構成された。第１バツチの溶媒はｓｏｍｉ！のジ− ｎ−ブチルエーテルであり、次の２つのバッチの溶媒はそれぞれ５０ｍ１のｔ− ブチル−メチルエーテルであった。それぞれのバッチを２４時間反応させた。ポ ンプ給送速度は５ｍ１１分に保った。（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェ ニル）メタノールを製造するための３バツチのプロセスの結果を下記に示す。

生成物への　Ｓ／Ｒ 実施例４ 室温のアセトニトリル中の青酸と３−フェノキシベンズアルデヒドからの（Ｓ） −（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造この実施例の（Ｓ） −（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施例１て述べた方法に よって製造した。単一のバッチは、１００ｍ１のアセトニトリル中の２５．０ｇ （０，１２６モル）の３−フェノキシベンズアルデヒドおよび６　ｔｎｌ　（過 剰）の青酸から成るものであった。

反応は５　ｍｌ１分のポンプ給送速度で２４時間続けた。生成物への転化率は８ ８，０％であり、生成物のＳ／Ｒ比は５２．０／７８．０であった。

実施例５ 室温のテトラヒドロフラン中の青酸と３−フェノキシベンズアルデヒドからの（ Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造 この実施例の（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施 例１で述へた方法によって製造した。単一のバッチは１００ｍ１のテトラヒドロ フラン中の５．０ｇ（０，０２５モル）の３−フェノキシベンズアルデヒドと１ ．５ｍｊ７（過剰）の青酸から成るものであった。

反応は５　ｒｎｌ／分のポンプ給送速度で２４時間行なった。生成物への転化率 は８２．０％であり、生成物のＳ／Ｒ比は４８．０１５２．０であった。

実施例６ 溶媒として青酸を使用する室温での３−フェノキシベンズアルデヒドからの（Ｓ ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造 この実施例の（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施 例１て述へた方法によって製造した。ポンプ回転反応器はＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支 持マトリックスが単一層の流体浸透性微孔性膜を含み、この膜上にＳ−オキシニ トリラーゼ酵素を不動化した点て異なる。

唯一のハツチは２０ｍｆの青酸中の１．Ｏｇ（０，００５モル）の３−フェノキ シベンズアルデヒドから成るものであった。反応は５　ｍｌ１分のポンプ給送速 度で２４時間行なった。生成物への転化率は９６．７％であり、生成物のＳ／Ｒ 比は５８．１／４１．９であった。

実施例７ 室温のジイソプロピルエーテル中の青酸と３−フェノキシベンズアルデヒドから の（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールの製造 次の実施例はたとえば米国特許第４，８５９，７８４号（上記）に使用されてい る溶媒ジイソプロピルエーテルか本発明の方法では溶媒として有効ではないこと を示すものである。

この実施例の（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェニル）メタノールは実施 例１に述べた方法によって製造した。ポンプ回転反応器はＡＣＴＩ−ＤＩＳＫ支 持マトリックスが単一層の流体浸透性微孔性膜を含み、この膜上にＳ−オキシニ トリラーゼが不動化されている点て異なっていた。合計２バツチを反応させた。

それぞれのバッチは２．１　ｇ（０，０１１モル）の３−フェノキシベンズアル デヒドおよび０．６ｍＩ！（過剰）の青酸から成るものであった。第１バツチの 溶媒は５０ｍＡ’のジ−ｎ−ブチルエーテルであり、第２バツチの溶媒は５０ｍ Ｉ！のジイソプロピルエーテルであった。その使用前に、５００ｍｎのジイソプ ロピルエーテルを２、５ｃｍＸ　２　Ｓｃｍカラムの天然アルミナに通すことに よって精製した。精製ジイソプロピルエーテルは使用されるまで窒素雰囲気下に 貯蔵した。

これらのバッチのあいだでポンプ回転反応器を７５ｍ１の精製ジイソプロピルエ ーテルでフラッシュした。それぞれのバッチを２３〜２４時間反応させた。ポン プ給送速度は５　ｍｌ１分に保った。（Ｓ）−（シアノ）（３−フェノキシフェ ニル）メタノールを製造するための２つのバッチプロセスの結果を下記に示す。

生成物への　Ｓ／Ｒ ２８１−Ｐｒ　２０　８０．０％　６６、０／３４．０要　約　書 酵素Ｓ−オキシニトリラーゼおよび溶媒の存在下でアルデヒドを青酸と反応させ ることによって光学的に活性な（Ｓ）−シアノヒドリンを製造する周知の方法に おける反応時間および反応試剤の取扱いの容易さは、微粉砕光てん剤粒子をバイ ンダー中にくまなく分散させたポリマー状樹脂質バインダーを含みこのバインダ ーにＳ−オキシニトリラーゼ酵素を分散させて成る多孔質膜にアルデヒドおよび 青酸の溶液を通過させるとき、周知の方法よりも著しく改良されつる。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．青酸とアルデヒドを含む有機溶媒を酵素Ｓ−オキシニトリラーゼと接触させ ることによってアルデヒドと青酸の反応により光学活性（Ｓ）シアノヒドリンを 製造する方法によって、反応試剤が通過する多孔質膜を含む不溶性複合体に酵素 を化学的に結合させること、多孔質膜が微粉砕充てん剤粒子をバインダー中にく まなく分散させたポリマー状樹脂質バインダーおよび内部に形成された実質的に 、相互接続の孔のネットワークを含むこと、及びこの多孔質膜が反応試剤を含む 流体の流れに対して浸透性であることを特徴とする方法。
2. ２．青酸とアルデヒドを含む有機溶媒を酵素Ｓ−オキシニトリラーゼと接触させ ることによってアルデヒドと青酸の反応により光学活性（Ｓ）シアノヒドリンを 製造する請求項１の方法において、反応試剤が通過する少なくとも１対の向き合 った面および予め定めた厚さをもつ多孔質の膜または複数の膜の層を含む不溶性 複合体に酵素を化学的に結合させること、多孔質膜が微粉砕充てん剤粒子をバイ ンダー中にくまなく分散させたポリマー状樹脂質バインダーおよび内部に形成さ れた実質的に相互接続の孔のネットワークを含み、これらの孔が樹脂質バインダ ー内に、充てん剤粒子と樹脂質バインダーとの間に、および隣接する充てん剤粒 子の間に形成されていること、分散充てん剤粒子が多孔質膜中に少なくとも約２ ５重量％の量で多孔質膜中に存在すること、孔の大きさの分布が膜面のそれぞれ を横切って及び予め定めた厚さを横切って不均一に、水銀インストロン法により ポロシメーターで測定して０．０１ミクロン〜１００ミクロンの範囲で変わるこ と、及びこの多孔質膜が少なくとも１つの膜面を通る流体の流れに対して浸透性 であることを特徴とする方法。
3. ３．膜がポリ（塩化ビニル）のバインダーおよびシリカの充てん剤から成ること を特徴とする請求の範囲１または２の方法。
4. ４．膜がハウジング中の縁によって収納されており、このハウジングか縁を通る 流体の流れを阻止することを特徴とする請求の範囲１まは２の方法。
5. ５．ハウジングが膜の一面に接近させた入口ポートまたは膜の反対側の面に接近 させた出口ポートにより変形されていることを特徴とする請求の範囲４の方法。
6. ６．膜が酵素の結合剤により化学的に活性化させていることを特徴とする請求の 範囲１または２の方法。
7. ７．酵素が結合剤と共有結合または交差結合していることを特徴とする請求の範 囲１または２の方法。
8. ８．膜がポリエチレンイミンおよびグルタールアルデヒドで化学的に活性化され ていることを特徴とする請求の範囲６の方法。
9. ９．アルデヒドの水中溶解度が約２．０ｍｇ／ｍｌより小さいことを特徴とする 請求の範囲１または２の方法。
10. １０．アルデヒドが３−フェノキシベンズアルデヒドであることを特徴とする請 求の範囲１または２の方法。
11. １１．有機溶媒がジ−ｎ−ブチルエーテルであることを特徴とする請求の範囲１ または２の方法。