JPH0416158B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は接触的に活性の固定化微生物細胞およ
びその製造方法に関し、固定化はグルクロン酸、
ラムノースおよびグルコースを含むポリサツカラ
イドから本質的に成る組成物により全微生物細胞
又は接触的に活性の生物学的物質を捕捉すること
により行なう。微生物細胞および酵素を水不溶性
支持体上に固定化する各種技術が提案された。こ
れらの方法は酵素活性に必須でない酵素の官能基
を使用する支持体への共有化学結合、基質および
生成物を自由に通過させると共に接触的活性物質
を保有する親水性ゲル格子内に微生物細胞又は酵
素の捕捉、イオン結合、又は親水性イオン交換樹
脂又は木炭又はガラスビーズ上への物理的吸収お
よび２官能性化合物との架橋結合による酵素の結
合を含んだ。

固定化の捕捉方法はもつとも変通性がある。例
えば米国特許第3791926号明細書は微生物細胞お
よび酵素を重合体マトリツクス内に捕捉する方法
を開示する。米国特許第3957580号明細書は微生
物細胞を重合体システム内に捕捉する方法を開示
し、システム内で固定化細胞はグルタルアルデヒ
ドのような多官能性剤を使用して重合体マトリツ
クスにさらに架橋結合する。

しかし、上記タイプの合成重合体システムはい
くつかの欠点を有する。固定化細胞の製造はモノ
マー、開始剤および架橋結合剤のような有毒物質
の使用を含む。支持体マトリツクスは商業規模の
バイオリアクターシステムで使用する場合変形又
は圧縮することができる。

従つて、本発明の全体的目的は酵素活性を保有
する接触的に活性の微生物細胞を固定化する方法
を供することである。

本発明の別の目的は良好な機械的強度を示す組
成物を形成する接触的に活性の微生物細胞を固定
化する方法を供することである。

本発明の尚別の目的は可溶性酵素に匹敵する動
力学を示す組成物を形成する固定化方法を供する
ことである。

本発明の尚別の目的は使用が容易で安価なカプ
セル化重合体を使用する固定化方法を供すること
である。

これらおよび他の目的および利点は次の記載お
よび例示例から明らかとなろう。

発明の記載 本発明は微生物細胞の改良固定化方法を供し、
この方法では細胞はグルキユロン酸、ラムノース
およびグルコースを含むポリサツカライドから本
質的に成る組成物にカプセル化する。特に、本発
明はゲランガムとして既知の組成物を使用する。
本発明の目的に対し「ゲランガム」とは、K.S.
Kangらに対し1982年４月20日発行の米国特許第
4326052号明細書に記載および特許請求した脱ア
セチル化ヘテロポリサツカライドＳ−60を意味す
る。本方法により形成する固定化細胞調製品は上
記開示のカプセル化方法以上に驚くべき利点、す
なわち機械強度、酸素安定性、容易／安価な製
造、および溶解性酸素に匹敵できる動力学を示
す。

安定で、固定化した接触的活性物質を得る好ま
しい方法は、微生物、ゲランガムおよび水の混合
物から形成する小滴をMgSO₄又は１価又は２価
カチオンを含有する他の塩の溶液により硬化する
ことである。他の各種形状は可能であるが、球状
ビーズはこの形状が単位容積につき最大表面積を
与えるので好ましい。本方法はカプセル化物質の
機械強度の決定にかなりの融通性を許容する。本
方法では1.2〜1.8重量％のゲランガムを脱イオン
水に溶解し、少なくとも80℃に加熱し、約25〜55
℃に冷却し、ゲランガム溶液の50重量％より多く
ない、好ましくは約25％より少ない重量の微生物
ペーストと混合する。ゲランガム／細胞混合物は
当業者に既知の通例方法によりビーズ形に成形
し、次に0.1〜0.4M硫酸マグネシウム（MgSO₄）
溶液又は別の２価カチオン溶液と室温で接触させ
るのがよい。形成ビーズは約10分硬化させ、次に
硫酸マグネシウム溶液から濾過する。所望の場
合、硫酸マグネシウム溶液は再使用できる。１価
カチオン塩溶液をビーズの硬化に使用する場合、
一層高濃度、約0.5〜2.0M塩が必要である。ゲラ
ンガム、細胞ペーストおよびMgSO₄溶液の許容
できる濃度に対する好ましい限界は狭い。その理
由はこれらの範囲外の条件は圧縮し過ぎか、又は
ビーズに容易に成形するには粘稠過ぎており、早
期硬化しやすい混合物であるビーズを与えるから
である。

ビーズはゲランガム／細胞混合物を小口径ピペ
ツト又は注射器を通すことによつて容易に形成で
きる。ビーズの大きさはピペツト又は注射器の周
りの同中心空気流により調整できる。C.D.Scott、
1985、Lnt′l Enzyme Conference；U.Matulovic
ら、Biotechnology Letters、８巻、７号、p.485
〜490（1986）；T.Rehgら、Biotechnology
Letters、８巻、２号、p.111〜114（1986）；およ
びA.C.Hulstら、Biotech.Bioengr.、17巻、p.870
〜876（1985）に記載のような他のビーズ製造方法
は使用できる。

他の捕捉方法とは異つて、ゲランガムの使用は
選択条件に非常に敏感であることがわかつた。こ
の敏感さに対する１つの理由は本方法では少量の
ゲランガムの使用である。カラギーナンに比し約
１／２〜1/3のゲランガムを使用し形成ビーズは機械
的に一層強い。

ゲランガム濃度の小変化は形成するビーズのタ
イプに変通性を供する。ゲランガム濃度は予期す
る使用に対し適当な強度を有するビーズを製造す
るのに十分である一方、ゲランガムの早期硬化を
防止するのに十分な低さであるべきである。好ま
しくは、ゲランガムの最初の濃度（細胞ペースト
の添加前）は1.2％以下であつてはならない。そ
うであるならビーズは容易に変形し、多くの場合
カラムリアクターに対し不適当になる。1.8重量
％以上のゲランガムの最初の濃度はゲランガム溶
液に存在するカチオンにより移動ライン中で早期
硬化し、ゲランガム／細胞混合物を小滴に分配で
きない問題を生ずる。

1.2〜1.8％の好ましい使用範囲についてさえ、
細胞の生長に使用する醗酵培地に依り細胞ペース
トに存在する残留物質は、細胞を添加する場合ゲ
ランガムを凝固させることができる。従つて、固
定化処理の調整を改良するために、細胞は好まし
くは脱イオン水中で洗滌し媒体から残留塩を除去
した後、細胞をゲランガムと合せる。細胞洗滌工
程は固化方法の一層良好な調整を与える。すなわ
ち、実質的にカチオンを含まない細胞ペーストは
早期固化を生ぜずに一層低温でゲランガムに添加
できる。細胞は十分な浸透圧強度の他の非イオン
溶液中で洗滌し、細胞溶解を防止することもでき
る。適当な非イオン溶液はブドウ糖および蔗糖の
ような糖溶液を含む。細胞洗滌工程は除外できる
が、その場合一定量のゲランガムに対し使用する
細胞ペースト量は減少しなければならない。細胞
を洗滌することにより、しばしば細胞密度、従つ
てバイオリアクターの容積生産性の相当する増加
と共に固定化調整品の活性密度を増加することが
できる。

同様に、処理は細胞ペーストの湿潤度に敏感で
ある。細胞と共に共存する水分量が多すぎると許
容しうるビーズ形成に必要な臨界レベル以下にゲ
ランガムの最終濃度を稀釈する。細胞ペーストは
出来るだけ濃厚で、移動および混合しやすくする
ためにのみ稀釈すべきである。本発明の目的に対
し、細胞ペーストの細胞含量はそこに含まれる細
胞の乾燥重量規準で約14重量％である。細胞ペー
ストは好ましくはゲランガム／細胞ペースト混合
物重量の約50％より少ない割合にすべきで、そう
でなければビーズは軟かくなり過ぎる。25重量％
より少ない細胞ペースト含量は多くの場合好まし
い。ペーストの細胞含量が14％より多い場合、細
胞ペーストは混合物の50％より多い割合にするこ
とができる。Mg⁺⁺イオンの濃度は臨界的ではな
いが、0.1M以下の濃度でビーズ強度の著しい減
少がある。

上記方法により製造した、固定化した接触的活
性物質は、通常他のカプセル化方法に必要である
付加的架橋結合処理を行なわずに驚くべき安定性
を有する。実際に一態様では、上記方法によりカ
プセル化した、E.coli細胞（ATCC11303）のア
スパルターゼ活性に対する半減期は少なくとも
150日であることが測定された。この安定度はグ
ルタルアルデヒド処理せずにカラギーナンでカプ
セル化した同じ細胞は僅かに70〜90日の半減期し
か示さない（米国特許第4526867号明細書参照）
事実に照して予期されない。遊離細胞の半減期は
僅か約17日に過ぎないから、ゲランガムによる固
定化は細胞が酵素反応に対し利用できる有用期間
を有意に延長する。

固定化による活性損失はカプセル化および硬化
に必要な条件が温和であるため無視できる。安定
性を付与する一方、活性をいくらか破壊するグル
タルアルデヒド処理は必要ではないが、固定化に
有害に作用することなく使用できる。新たに収穫
したE.coli細胞（ATCC11303）は固定化し、37
℃の基質で24時間活性化した同じ細胞より７〜８
倍低いアスパルターゼ活性を示す。遊離細胞はピ
ーク活性に到達するために基質中で約３日を必要
とするが、一方固定化細胞は18〜24時間後に最高
になる。ピーク活性に対するこれらの時間的差は
遊離細胞対固定化細胞の活性レベルの比較を困難
にする。他のカプセル化方法に対する活性保有の
刊行情報は分析時期に対し特定していない。活性
測定の臨界的タイミングは、ピーク（３日）活性
にある遊離細胞の固定化が、新鮮細胞（より低い
活性を有する）をカプセル化した場合と同じ活性
を有する固定化調製品を製造しないという事実に
より示される。

低分子量物質さえマトリツクスに拡散すること
の困難さのために、重合体物質にカプセル化され
る酵素はしばしば増加したミカエリス定数を有す
ることを当業者は認める。可溶性アスパルターゼ
に対するKmは0.15Mであると報告される（Sato
ら、BBA、570、179〜186、1979）。アスパルタ
ーゼを含有するE.coli細胞（ATCC11303）を固
定化したゲランガムに対するKmは0.2〜0.25Mと
実験的に測定された。ゲランガムシステムに対す
るKmが可溶性酵素のものに近似する事実は、酵
素に妨害環境効果を加えない固定化方法を示す。
E.coli細胞を捕捉したカラギーナンのアスパルタ
ーゼに対するKmは0.71〜0.85M（Sato、1979）で
あるからこの結果は全く予期されない。低い見掛
けミカエリス定数はゲランガム固定化に対し望ま
しく、かつ驚くべき利点である。

本発明の別の態様では、ゲランガムはイオン交
換樹脂ビーズ上に被覆し、樹脂上のカオチンによ
り効果できる。この態様の利点は：小さい、一層
薄い輸送層を有する機械的に安定なビーズであ
る。これはゲル化剤を架橋結合する新規方法であ
る。実際に、すべての先行技術方法はマトリツク
スを硬化するために可溶性カオチンを必要とす
る。このタイプの態様では、ゲランガムは樹脂の
孔隙内および外部表面上で硬化することが好まし
い。これは樹脂の孔隙が固定化する微生物細胞に
適応するだけの大きさであることを必要とする。
孔隙が小さ過ぎる場合、ゲランガム／細胞混合物
は多くの場合ゲルを硬化させる十分なカオチン密
度を有しないビーズの外部表面に強制される。

本発明は多様の酵素システムに対し同様に適用
できる。例えば、特にペニシリンアシラーゼ、グ
ルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、フマラーゼ、フエニルアラニンアンモニアリ
アーゼ、アスパルテートアミノトランスフエラー
ゼ、インベルターゼ、シス−トランスマレイン酸
イソメラーゼ、およびＬ−アスパルテートベータ
−デカルボキシラーゼは本発明方法によりすべて
調製できる。ペニシリンアシラーゼを所望する場
合、Protens retttgeriの細胞は使用できる。グル
コースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、
フマラーゼ、インベルターゼ、シス−トランスマ
レイン酸イソメラーゼ、又はＬ−アスパルテート
ベータ−デカルボキシラーゼ（特に）を含有する
細胞の固定化を所望する場合、使用できる微生物
はStreptomyces属、Bacillus属、Acetobacter
属、Pseudomonas属、およびAspergillus属のも
のを含むことができる。このタイプの微生物は必
ずしも完全な生活細胞でなくてもよく、本発明に
使用前に物理的又は化学的処理してもよい。

本システムは部分精製又は精製酵素の捕捉に適
することを当業者は認める。実際に、このアプロ
ーチは関心を有する酵素がプロテアーゼによる攻
撃を受けやすい場合有用である。別法では、ある
場合には所望の反応生成物をさらに異化する微生
物細胞に含まれる他の酵素を除去することが望ま
しい。精製酵素をゲランガムビーズから浸出する
場合、少量のゼラチンを含み、グルタルアルデヒ
ドのような適当な化学薬剤と架橋結合することに
より酵素の損失を減少することができる。

次例は本発明の実施を一層よく説明するために
供し、本発明の範囲を限定するためのものでは決
してない。

例 １ E.coli細胞、ATCC11303は標準醗酵条件下で
振盪フラスコで生育した。ブロスは８分間
8000XGで遠心分離し、細胞ペーストを得た。約
1.2ｇのペーストを100mlのブロスから得た。細胞
は５mlの水に４ｇの細胞を再サスペンドすること
により脱イオン（Milli−Ｑ）水中で洗滌し、５
分8000XGで遠心分離し、次いで２回洗滌工程を
行なつた。ゲランガム溶液は0.24ｇのゲランガム
を19.6mlの水に添加し、混合物を90℃に撹拌しな
がら加熱し、次に54℃に冷却することにより製造
した。洗滌細胞は１mlの水にスラリーにし、次に
54℃ゲランガム溶液に添加した。ゲランガム−細
胞混合物は室温に保持した0.2M MgSO₄溶液に
直ちにピペツトで滴加した。ビーズはおだやかに
10分間撹拌して硬化を完了させ、次にMgSO₄溶
液から真空濾過した。固定化調製品の最終重量は
16.9ｇであつた。固定化細胞は1.5Mフマール酸
基質溶液中で37℃で一夜インキユベートした。固
定化細胞はｇ細胞−時間につき0.0253モルアスパ
ラギン酸の生成割合を後に示した。

例 ２ 高度に多孔性（孔径≧１ミクロン）のカオチン
交換樹脂は標準技術を使用してMg⁺⁺イオン形に
した。次に樹脂は乾燥した。ゲランガムの１重量
％脱イオン水溶液を0.08ｇのゲランガムを８mlの
脱イオン水に溶解して調製する。ゲランガム溶液
は約80℃に加熱し、次に約40℃に冷却する。例１
記載のように得たE.coli細胞（ATCC11303）を
８mlのゲランガム溶液につき約１ｇの細胞ペース
トの量で上記ゲランガムに添加する。樹脂と約40
℃のゲランガム／細胞混合物を烈しく撹拌し、次
に室温（〜25℃）に冷却することによりゲランガ
ム／細胞混合物を乾燥多孔性カオチン交換樹脂上
に被覆する。十分量の樹脂を使用するので本質的
にすべての物質は樹脂に吸収される。冷却すると
ゲランガムは樹脂ビーズ内および上に細胞を捕捉
して硬化する。

例 ３ 固定化したE.coli細胞、ATCC11303を例１記
載のように製造した。半減期測定のため固定化細
胞をカラムバイオリアクターに詰めた。カラムへ
の供給流は1.5M NH₄−フマレート（工業用）、
1mM MgSO₄、PH8.5であつた。

１〜19日間カラムは８時間／日、供給割合を変
えて操作し、機能障害を生ずる温度調整が約20％
の酵素損失を生じた場合の３日間を含んだ。バイ
オリアクターは24時間／日、しかし20日から30日
に供給割合を変えて操作した。安定性データは１
時間につき２層−容積の供給割合および37℃で31
〜66日に得た。

動力学的データは１時間につき２層−容積の供
給割合で67％転換の零時間インターセプトを示
す。安定性データの線状回帰分析は約150日の半
減期を示す。

比較のため、グリセロール−フマレート培地に
生育し、ピークレベルの50％の活性に到達するま
での時間として計算した遊離細胞の半減期は約17
日と見積もられる。上記データは37℃で２時間の
バツチ反応およびPH8.5で1.5M NH₄−フマレー
トを使用して得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 接触的に活性の微生物細胞の固定化方法にお
   いて、 (a) 微生物ペーストとゲランガムの水性溶液を混
   合し、ゲランガム水性溶液の濃度は硬化する場
   合ビーズを形成するのに十分であり、かつ微生
   物ペースト中の残留物質により早期硬化しない
   濃度を有し、そして (b) 工程(a)の混合物の硬化を促進する十分な濃度
   および温度のカチオン水性溶液に工程(a)の混合
   物を滴下して混合し、それによつてこの微生物
   を含有する硬化ビーズを形成し、そして (c) 工程(b)で製造した硬化ビーズを回収すること
   を特徴とする、上記固定化方法。 ２ ゲランガム水性溶液は1.2〜1.8重量％のゲラ
   ンガム濃度を有し、微生物ペーストは形成混合物
   の約50重量％より少なく含む、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３ 微生物はアスパルターゼ活性を有する、特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 微生物はE.coliである、特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ５ 微生物はE.coli（ATCC11303）である、特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 ６ カチオン水性溶液は約0.1〜0.4M濃度でマグ
   ネシウムイオンを含む、特許請求の範囲第２項記
   載の方法。 ７ ゲランガムは1.2〜1.6重量％の濃度を有す
   る、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ８ 接触的に活性の微生物細胞の固定化方法にお
   いて、 (a) 微生物ペーストと約1.2〜1.8重量％のゲラン
   ガム濃度を有するゲランガム水性溶液を混合
   し、微生物ペーストは形成混合物の約50重量よ
   り少なく含み、そして (b) 工程(a)の混合物と多孔性カチオン交換樹脂を
   混合し、樹脂は微生物が進入できる十分な多孔
   性で、ゲランガムが硬化できる十分なカチオン
   装荷密度を有する ことを特徴とする、上記固定化方法。 ９ 微生物はアスパルターゼ活性を有する、特許
   請求の範囲第８項記載の方法。 １０ 微生物はE.coliである、特許請求の範囲第
   ８項記載の方法。 １１ 微生物はE.coli（ATCC11303）である、特
   許請求の範囲第８項記載の方法。 １２ カチオン交換樹脂はマグネシウムイオン形
   である、特許請求の範囲第８項記載の方法。