CS209424B2

CS209424B2 - Method of making the anorganic-organic base for immobilization of enzymes

Info

Publication number: CS209424B2
Application number: CS761011A
Authority: CS
Inventors: Joseph Levy; Murray C Fusse
Original assignee: Uop Inc
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-17
Publication date: 1981-12-31
Also published as: ATA116176A; FR2301533A1; IE42482L; AT363890B; BE838684A; DD123346A5; JPS571988B2; SE7601757L; CH634876A5; PT64790B; ES445248A1; EG11923A; AR215240A1; GB1537086A; PL102119B1; SE434064B; PT64790A; NO148600C; AU497243B2; DK63776A

Abstract

The enzyme fixed to a support is composed of a combined organic-inorganic base material, which consists of an inorganic porous support having an organic polymer, which contains functional groups, partially adsorbed and enclosed in its pores, and of an enzyme which is partially adsorbed to the base material and bound covalently to the functional groups of the organic polymer in the terminal regions of this polymer. Such immobilised enzymes are of use in the biochemical and fermentation industries. They are obtained, in particular, by drenching a porous support with a solution of a polyfunctional organic compound and treating the impregnated support with an excess of a bifunctional monomer. Subsequently, the enzyme is added, part of which enzyme then binds covalently to reactive groups of the polymer which has been formed and which is present in and on the support. During this procedure, the biochemically active residues of the enzyme must not be blocked or altered.

Description

(54) Způsob výroby anorganlcko-organického základu pro immobilizaci enzymů(54) A method for producing an inorganic-organic base for the immobilization of enzymes

Vynález se týká způsobu výroby anorganicko-organického nosného základu pro immobilizaci enzymů;The invention relates to a process for the production of an inorganic-organic support base for the immobilization of enzymes;

Je známo, že enzymy, které jsou bílkovinného původu a které jsou obecně rozpustné ve vodě, obsahují biologické katalyzátory, které slouží k regulaci mnoha rozdílných chemických reakcí, které- se vyskytují v živém organismu. Enzymy mohou být také izolovány a použity v analýze, lékařství a průmyslu. Například nacházejí použití v průmyslových postupech při výrobě potravin, jako jsou sýry nebo máslo, stejně jako se používají při výrobě alkoholických nápojů.It is known that enzymes, which are of protein origin and which are generally soluble in water, contain biological catalysts that serve to regulate the many different chemical reactions that occur in a living organism. Enzymes can also be isolated and used in analysis, medicine and industry. For example, they find use in industrial processes in the manufacture of foodstuffs such as cheese or butter, as well as in the production of alcoholic beverages.

Speciální použití nacházejí enzymy v průmyslu při štěpení aminokyselin, pří modifikaci penicilinu k vytvoření jeho rozdílných substrátů, použití různých prute as. při výrobě sýrů, zpracování masa, v detergentních směsích, zpracování kůže a jako pomocných prostředků pro podporu trávení; použití karbonhydras při hydrolýze škrobu^ inverzi- sacharózy, izomeraci glukózy atd., použití nukleas při zajišťování vůní nebo použití oxidas při prevenci oxidace a při zajišťování barev potravin. Tato použití, stejně jako mnoho jiných, jsou dobře popsána v literatuře.Enzymes have been found to be of particular use in the industry for the cleavage of amino acids, in the modification of penicillin to form its different substrates, the use of different prutes and s. in cheese production, meat processing, in detergent compositions, leather processing and as digestive aids; the use of carbonhydrases in the starch hydrolysis of sucrose inversion, glucose isomerization, etc., the use of nucleases in providing odors or the use of oxidases in preventing oxidation and in providing food colors. These uses, like many others, are well described in the literature.

Jak bylo zde předem· uvedeno, protože enzymy jsou obyčejně ve vodě rozpustné, stejně jako jsou obvykle nestabilní a snadno se deaktivují, je také obtížné buď je odstranit z roztoků, ve kterých se využívají pro následující opětné použití, nebo je obtížné udržet jejich katalytickou aktivitu po= relativně dlouhou dobu.As mentioned hereinbefore, because enzymes are usually water-soluble as well as usually unstable and readily deactivable, it is also difficult to either remove them from the solutions in which they are used for subsequent reuse or to maintain their catalytic activity for = relatively long time.

Výše uvedené potíže ovšem vedou k zvýšené ceně při použití enzymů pro komerční účely vlivem nutnosti časté náhrady enzymu, přičemž tato náhrada je obvykle nutná u každé aplikace. Vzhledem k vysoké ceně enzymů bylo navrhováno znehybnit nebo učinit je nerozpustnými před jejich použitím.However, the aforementioned difficulties lead to an increased cost in the use of enzymes for commercial purposes due to the need for frequent enzyme replacement, which replacement is usually necessary for each application. Due to the high cost of the enzymes, it has been proposed to immobilize or render them insoluble before using them.

Znehybněním enzymů různými systémy, dosud podrobněji uvedenými, je možné relativně stabilizovat enzymy a tudíž umožnit opětné použití enzymu, který může jinak podlehnout deaktivaci nebo se může ztratit v reakčním prostředí. Immobilizované nebo nerozpustné enzymy se mohou použít v různých reakčních systémech jako v kolonách s náplní, reaktorech s mícháním atd., což závisí na povaze substrátu, který se přitom využívá.By immobilizing the enzymes by the various systems discussed in more detail below, it is possible to relatively stabilize the enzymes and thus allow the reuse of an enzyme which may otherwise be inactivated or lost in the reaction medium. Immobilized or insoluble enzymes can be used in a variety of reaction systems such as packed columns, stirred reactors, etc., depending on the nature of the substrate being used.

Obecně znehybnění enzymů zajišťuje výhodnější nebo rozsáhlejší stabilitu vůči okolním podmínkám, minimum problémů s odpadem a s manipulací s materiály, stejně jako možnost zvýšení aktivity samotného enzymu.Generally, immobilization of enzymes provides more advantageous or wider stability to environmental conditions, minimal waste and material handling problems, as well as the possibility of increasing the activity of the enzyme itself.

Jak bylo dosud uvedeno, některé obvyklé způsoby, stejně jako mnoho jejich modifikací bylo popsáno, kterým lze dosáhnout immobilizace enzymů.As previously mentioned, some conventional methods, as well as many modifications thereof, have been described which can be used to immobilize enzymes.

Jednou obvyklou metodou je adsorbování enzymu na pevný povrch, jako například, když se enzym, jako je acyláza aminokyselin adsorbuje na celulózovém derivátu jako je DEAE celulóza; papain nebo ribonukleáza se adsorbuje na porézním skle; kataláza se adsorbuje na aktivním uhlí; trypsin se adsorbuje na křemenném skle nebo celulóze; chymo-trypsin se adsorbuje na kaolinitu atd.One common method is to adsorb the enzyme to a solid surface, such as when an enzyme such as an amino acid acylase is adsorbed onto a cellulose derivative such as DEAE cellulose; papain or ribonuclease is adsorbed on porous glass; the catalase is adsorbed on activated carbon; trypsin is adsorbed onto quartz glass or cellulose; chymo-trypsin is adsorbed to kaolinite etc.

Jiným obvyklým způsobem je zachytit enzym v mřížce gelu, jako lze zachytit glukooxidázu, ureázu, papain atd. v polyakrylamidovém gelu; acetylcholinesterasu ve škrobovém gelu nebo silikonovém polymeru; glutamylpyrovyltransaminázu v polyamidovém gelu nebo· gelu acetátu celulózy atd.Another conventional method is to capture the enzyme in a gel grid, such as glucooxidase, urease, papain, etc., in a polyacrylamide gel; acetylcholinesterase in a starch gel or silicone polymer; glutamylpyrovyltransaminase in polyamide or cellulose acetate gel, etc.

Dalším obvyklým způsobem je zesítění pomocí bifunkčních činidel a může se provést v kombinaci s tou nebo onou předešlou obvyklou metodou immobilizace. Když se použije tohoto způsobu, bifunkční nebo polyfunkční reagenční činidla, která mohou vyvolat intermolekulární zesítění budou kovalentně vzájemně vázat enzymy, stejně jako k pevnému nosiči. Tento způsob může být vyložen na příkladu použití glutardialdehydu nebo bisdiazobenzidin-2,2-disuifonové kyseliny k vázání enzymu jako je papain k pevnému nosiči, atd.Another common method is cross-linking with bifunctional reagents and can be carried out in combination with one or the other conventional immobilization method. When used in this method, bifunctional or polyfunctional reagents that can induce intermolecular crosslinking will covalently bind enzymes to each other, as well as to a solid support. This method may be exemplified by the use of glutardialdehyde or bisdiazobenzidine-2,2-disuiphonic acid to bind an enzyme such as papain to a solid support, etc.

Ještě · další způsob znehybnění enzymu zahrnuje způsob kovalentní vazby, při kterém enzymy jako je glukoamyláza, trypsin, papain, pronáza, amyláza, glukooxidáza, pepsin, rennin, plísňová proteáza, laktáza atd. jsou vázány kovalentními vazbami k polymernímu materiálu, který je vázán k organickému nebo anorganickému pevnému poréznímu nosiči. Tento způsob může být také kombinován s výše uvedenými immobilizačními postupy.Yet another method of enzyme immobilization includes a covalent bonding method in which enzymes such as glucoamylase, trypsin, papain, pronase, amylase, glucooxidase, pepsin, rennin, fungal protease, lactase etc. are bound by covalent bonds to a polymeric material that is bound to an organic or inorganic solid porous carrier. This method can also be combined with the above immobilization procedures.

Výše . uvedené způsoby znehybnění enzymů mají všechny některé vady, které znevýhodňují jejich použití v průmyslových postupech. Například, když se enzym přímo adsorbuje na povrch nosiče, vazné síly, které se vytvoří mezi enzymem a nosičem jsou často docela slabé, ačkoli se uvádí, že lze získat relativně stabilní konjugáty tohoto typu, když jsou rozměry pórů nosiče a průměr spinu enzymu v korelaci. Rozměr póru nosiče ovšem nemůže překročit průměr asi 1 000 Angstromů.Above. said methods of enzyme immobilization have all some of the defects that disadvantage their use in industrial processes. For example, when the enzyme is directly adsorbed to the surface of the carrier, the binding forces that are formed between the enzyme and the carrier are often quite weak, although it is reported that relatively stable conjugates of this type can be obtained when the pore dimensions of the carrier and enzyme spin diameter are correlated. . However, the pore size of the carrier cannot exceed about 1000 Angstroms in diameter.

Vzhledem k této slabé vazbě se enzym často snadno desorbuje za přítomnosti roztoků, jimiž je substrát upravován. Ještě navíc, enzym se může zcela nebo částečně dezaktivovat vlivem ztráty pohyblivosti nebo vlivem reakce mezi nosičem aktivním centrem. enzymu.Because of this poor binding, the enzyme is often easily desorbed in the presence of solutions to which the substrate is treated. In addition, the enzyme may be completely or partially inactivated due to loss of mobility or due to the reaction between the carrier and the active center. enzyme.

Jiným postupem, který se může využít, je uchycení enzymů v gelových mřížkách, což se může provést polymerací vodného roztoku nebo emulze obsahujících monomerní formu polymeru a enzym nebo začleněním enzymu do předem vytvořeného polymeru f různými způsoby, často za přítomnosti sífovadla. Zatímco tento způsob znehybnění i' enzymů má výhodu v tom, že reakční pod! minky použité k provedení uchycení jsou obvykle mírné, takže často dochází k malé změně nebo. deaktivaci enzymu, má také nevýhodu v tom, že konjugát má špatnou mechanickou pevnost, která má za následek zhutňování, když se použijí v kolonách v kontinuálních tekutých systémech, s průvodním ucpáváním kolony.Another method that can be used is to attach the enzymes to the gel lattices, which can be done by polymerizing an aqueous solution or emulsion containing the monomeric form of the polymer and the enzyme, or by incorporating the enzyme into the preformed polymer in various ways, often in the presence of a crosslinker. While this method of immobilization of the enzymes has the advantage that the reaction is reduced. The mines used to make the attachments are usually mild, so there is often little change or. enzyme deactivation also has the drawback that the conjugate has poor mechanical strength, which results in compaction when used in columns in continuous liquid systems, with concomitant column packing.

Tyto systémy mají také dost rozsáhlé kolísání velikosti pórů, což vede k tomu, že některé póry, které jsou dost veliké, umožňují ztrátu enzymu. Dále některé póry mohou být dost malé, takže velké difúzní překážky pro transport substrátu a produktu povedou k zpomalování reakce, což bude zvlášť závažné pří použití vysokomolekulárního substrátu.These systems also have a fairly large pore size variation, which results in some large pore sizes allowing for enzyme loss. Furthermore, some pores may be small enough so that large diffusion barriers to substrate and product transport will result in slowing the reaction, which will be particularly severe when using a high molecular weight substrate.

Nevýhody, které jsou při immobilizování enzymu intermolekulárním zesítěním, jak bylo uvedeno, jsou způsobeny vlivem ztráty pohyblivosti s výslednou deaktivací, vzhledem k neschopnosti enzymu zaujmout přirozenou konfiguraci nutnou pro maximální účinnost, zejména, když se aktivní centrum zapojí do vazebného procesu.The disadvantages of immobilizing the enzyme by intermolecular crosslinking, as mentioned, are due to the loss of mobility with the resultant deactivation, due to the inability of the enzyme to assume the natural configuration necessary for maximum efficiency, especially when the active center engages in the binding process.

Kovalentní vazné způsoby nalezly široké uplatnění a mohou se použít buď jako samostatné imobilizační způsoby, nebo jako integrální část mnoha způsobů již popsaných, ve kterých se využívá síťovací reakce.Covalent binding methods have found wide application and can be used either as separate immobilization methods or as an integral part of many of the methods already described in which a cross-linking reaction is utilized.

Tento způsob se často· používá k vázání enzymu stejně jako nosiče bifunkčními přechodnými molekulami, ve kterých funkční skupiny molekuly, jako je například gama-aminopropyltriethoxysilan, jsou schopny reagovat s funkčními částmi přítomnými v . enzymu zároveň i v organickém nebo anorganickém porézním nosiči.This method is often used to bind an enzyme as well as carriers with bifunctional transition molecules in which the functional groups of the molecule, such as gamma-aminopropyltriethoxysilane, are able to react with the functional moieties present in the enzyme. the enzyme also in an organic or inorganic porous carrier.

Rozsáhlé množství činidel a nosičů se využívá tímto způsobem a způsob má v mnoha případech výhodu vytvoření silných kovalentních vazeb v konjugovaném produktu stejně jako velké aktivity.A wide variety of reagents and carriers are utilized in this manner, and the process has in many cases the advantage of forming strong covalent bonds in the conjugated product as well as large activities.

Kovalentní vazba enzymu k nosiči· musí být vytvořena funkčními skupinami enzymu, které nejsou podstatné pro jeho katalytickou účinnost jako volné aminové skupiny, karboxylové skupiny, hydroxylové skupiny, fenolové skupiny, sulfhydrylové skupiny atd. Tyto funkční skupiny budou také reagovat s mnoha jinými funkčními skupinami, jako jsou aldehydové izokyanátové, acylové, diazo, azido, anhydro, aktivované estery atd., k vytvoření kovalentních vazeb.The covalent attachment of the enzyme to the support must be formed by functional groups of the enzyme which are not essential for its catalytic activity as free amino groups, carboxyl groups, hydroxyl groups, phenol groups, sulfhydryl groups etc. These functional groups will also react with many other functional groups, such as aldehyde isocyanate, acyl, diazo, azido, anhydro, activated esters, etc., to form covalent bonds.

Přesto má tento způsob často také mnoho nevýhod, jako jsou nákladné reagencie a rozpouštědla, stejně jako. speciální a nákladné porézní nosiče a těžkopádné mnohastupňové postupy, které způsobují, že způsob přípravy je neekonomický pro komerční využití.However, this process often also has many drawbacks, such as expensive reagents and solvents, as well. special and costly porous carriers and cumbersome multi-step processes that render the preparation process uneconomical for commercial use.

. Dosavadní stav techniky je tudíž naplněn různými způsoby pro znehybnění enzymů, které však v růzých bodech nevyhovují požadavkům průmyslového využití.. Thus, the prior art is filled with various methods for immobilizing enzymes, which at various points do not meet the requirements of industrial use.

Jak však bude dále uvedeno, žádné ze známých složení nezahrnuje složení předmětu vynálezu, které tvoří anorganický porézní nosič obsahující polymerní hmotu vytvořenou in šitu z monomeru nebo předpolymeru, přírodního nebo syntetického původu, který je zachycen a také adsorbován částečně v pórech nosiče a který obsahuje funkií, přívěsné skupiny z něj prodloužené; přičemž enzym je zčásti adsorbován na základu a také kovalentně vázán к aktivním místům s koncovými nebo přilehlými částmi přívěsných skupin, čímž se takto umožňuje volnost pohybu, který dovolí enzymu dosáhnutí maximální aktivity.However, as will be noted below, none of the known compositions includes compositions of the present invention which form an inorganic porous carrier comprising a polymeric mass formed in situ from a monomer or prepolymer of natural or synthetic origin which is trapped and also adsorbed partially in the pores of the carrier. , extended outboard groups; wherein the enzyme is partially adsorbed on the base and also covalently bound to the active sites with terminal or adjacent portions of the pendant groups thereby allowing freedom of movement that allows the enzyme to achieve maximum activity.

Například US patent č. 3 556 945 se týká enzymových směsí, ve kterých je enzym adsorbován přímo na anorganický nosič, jako je sklo. US patent č. 3 519 538 se týká enzymových směsí, ve kterých jsou enzymy chemicky vázány pomocí mezilehlého silanového spojovacího činidla к anorganickému nosiči. Podobně US patent č. 3 783 101 také využívá organokřemičité sloučeniny jako spojovacího činidla, přičemž enzym je kovalentně vázán ke skleněnému nosiči pomocí mezilehlého silanového spojovacího činidla, přičemž křemíková část spojovacího činidla je připojena к nosiči, zatímco organická část 'spojovacího činidla je vázána к enzymu, přičemž směs obsahuje kysličník kovu na povrchu nosiče, uspořádaný mezi nosičem a křemíkovou částí spojovacího činidla. V US patentu č. 3 821 083 je inertní nosič pokryt předupraveným polymerem, jako je polykarolein, na který je vázán enzym.For example, U.S. Patent No. 3,556,945 relates to enzyme compositions in which the enzyme is adsorbed directly onto an inorganic carrier such as glass. U.S. Patent No. 3,519,538 relates to enzyme compositions in which the enzymes are chemically coupled via an intermediate silane coupling agent to an inorganic carrier. Similarly, U.S. Patent No. 3,783,101 also uses organosilicon compounds as a coupling agent, wherein the enzyme is covalently bound to the glass support by an intermediate silane coupling agent, wherein the silicon portion of the coupling agent is attached to the carrier while the organic portion of the coupling agent is bound to the enzyme wherein the mixture comprises a metal oxide on the support surface disposed between the support and the silicon portion of the coupling agent. In U.S. Patent No. 3,821,083, the inert support is coated with a pretreated polymer such as polycarolein to which the enzyme is bound.

Ovšem u většiny uvedených příkladů z patentů je nutná nejdříve kyselá hydrolýza směsi před uložením enzymu na polymer.However, in most of the examples of the patents, acid hydrolysis of the mixture is required before the enzyme is deposited on the polymer.

Jiný známý patent, US patent č. 3 705 084 zveřejňuje nakroporézní enzymový reaktor, v němž je enzym absorbován na polymerním povrchu makroporézního aktivního jádra reaktoru a potom se vhodně zesíťuje. Zesilováním enzymů na povrchu polymeru po jeho adsorpci, se enzym dále částečně immobilizuje a nemůže volně působit jako ve svém přirozeném stavu jako katalyzátor.Another known patent, US Patent No. 3,705,084, discloses a proporous enzyme reactor in which the enzyme is absorbed on the polymeric surface of the macroporous active core of the reactor and is then appropriately crosslinked. By enhancing the enzymes on the polymer surface after adsorption, the enzyme is further partially immobilized and cannot freely act as a catalyst in its natural state.

Zesítění enzymů je ve skutečnosti vázáno dohromady, čímž se brání volnému pohybu enzymu a snižuje se pohyblivost enzymu, která je nutným předpokladem maximální účinnosti.In fact, the cross-linking of the enzymes is bound together, preventing the free movement of the enzyme and reducing the mobility of the enzyme, which is a prerequisite for maximum efficiency.

Je tedy úkolem tohoto vynálezu vytvořit způsob výroby směsí látek, ve kterých jsou enzymy přítomny v immobilizovaném stavu.It is therefore an object of the present invention to provide a process for preparing mixtures of substances in which the enzymes are present in an immobilized state.

Dále je úkolem vynálezu vytvořit způsob výroby látek, na kterých je enzym jak adsorbován na organickoanorganickém základě, tak kovalentně vázán к funkčním přívěsným skupinám připojeným к uvedenému základu, který je naopak adsorbován i uchycen v pórech anorganického porézního materiálu.It is a further object of the invention to provide a process for the production of substances on which an enzyme is both adsorbed on an organic-inorganic basis and covalently bound to functional pendant groups attached to said base, which in turn is adsorbed and retained in the pores of the inorganic porous material.

Vynález se týká způsobu výroby anorga nicko-organického nosného základu pro immobilizaci enzymů, jehož podstata spočívá v tom, že na anorganický porézní nosný materiál vybraný ze skupiny zahrnující gama-oxid hlinitý, oxid křemičitý, oxid zirkoničitý, směs oxidu křemičitého a oxidu horečnatého, směs oxidu křemičitého, fosforečnanu boritého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého, oxidu zirkoničitého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého a oxidu hlinitého, přičemž tento anorganický porézní nosný materiál má průměr pórů od 10 nm do 5500 nm a specifický povrch od 1 do 500 m²/g, se působí roztokem rozpustných polyaminů vybraných ze skupiny zahrnující ethylendiamin, diethylentriamin, triethylentetramin, tetraethylenpentamin, pentaethylenhexamin, hexamethylendiamin, a polyethylenimin ve vodě, po tomto zpracování se odstraní neadsorbované polyaminy a takto upravený nosný materiál se uvede do styku s roztokem obsahujícím molární přebytek bifunkčního monomerního materiálu vybraného ze skupiny zahrnující glutaraldehyd a toluendiisokyanát, při teplotě v rozmezí od 5 °C do 60 °C a nezreagovaný roztok bifunkčního monomerního materiálu se odstraní.The invention relates to a process for the production of an inorganic-organic support base for the immobilization of enzymes, characterized in that on an inorganic porous support material selected from the group consisting of gamma-alumina, silica, zirconia, a mixture of silica and magnesium oxide, silica, boron phosphate and alumina, a mixture of silica, zirconia and alumina, a mixture of silica and alumina, the inorganic porous support material having a pore diameter of 10 nm to 5500 nm and a specific surface area of 1 to 500 m ² / g, is treated with a solution of soluble polyamines selected from the group consisting of ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexamethylenediamine, and polyethylenimine in water, after which the unadsorbed polyamines are removed and the treated carrier material is contacted with the solution. containing a molar excess of the bifunctional monomer material selected from the group consisting of glutaraldehyde and toluene diisocyanate at a temperature in the range of from 5 ° C to 60 ° C and the unreacted solution of the bifunctional monomer material is removed.

Jak bylo dříve uvedeno, použití enzymů v analytické, lékařské nebo průmyslové praxi se může značně zvýšit, jestliže jsou uvedené enzymy v immobilizovaném stavu, tj. enzymy, které jsou v immobilizovaném stavu s jinými pevnými materiály, jsou samy o sobě v takovém stavu, kdy nejsou rozpustné ve vodě a tudíž se mohou opakovaně použít, přičemž se zachovává katalytická aktivita uvedeného enzymu. Aby byly enzymy přítomny v immobilizovaném stavu, musí být enzymy do jisté míry vázány na vodou nerozpustný nosič, čímž jsou komerčně využitelné v nerozpustném stavu ve vodě.As mentioned previously, the use of enzymes in analytical, medical or industrial practice can be greatly increased when said enzymes are in an immobilized state, i.e., enzymes that are immobilized with other solid materials are themselves in a state where they are insoluble in water and therefore can be reused, while maintaining the catalytic activity of said enzyme. In order for the enzymes to be present in the immobilized state, the enzymes must to some extent be bound to a water-insoluble carrier, thereby being commercially useful in an insoluble state in water.

Z jednoho hlediska provedení vynálezu spočívá ve způsobu výroby immobilizovaného enzymového konjugátu zahrnujícím kombinovaný organickoanorganický základ sestávající z anorganického porézního nosiče obsahujícího organický polymerní materiál adsorbovaný a uchycený v pórech uvedeného nosiče, přičemž polymerní materiál obsahuje funkční přívěsné skupiny a enzym adsorbovaný к uvedenému základu a kovalentne vázaný к funkčním místům přívěsných skupin organického polymerního materiálu nebo v přilehle к jejich koncovým částem.In one aspect of the invention, there is provided a method of making an immobilized enzyme conjugate comprising a combined organic-inorganic base comprising an inorganic porous carrier comprising an organic polymeric material adsorbed and retained in the pores of said carrier, the polymeric material comprising functional pendant groups and enzyme adsorbed to said base and covalently bonded the functional points of the pendant groups of the organic polymeric material or adjacent to their end portions.

Konkrétní provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu výroby immobilizovaného enzymového konjugátu zahrnujícího organickoanorganický základ o nízké sypné hmotnosti, porézní křemičitohlinitý nosič o relativně vysoké ploše povrchu, který může také obsahovat anorganická aditiva a in šitu připravený tetraethylenpentaminglutarallehydový polymer, který je adsorbován, stejně jako uchycen v pórech hlinitokřemičitanu a enzym obsahující glukoamylázu je kovalentně vázán ke glutaraldehydovým přívěs2 0 9 4 2 4 ným skupinám polymeru v nebo přilehle ke koncové části uvedených skupin stejně jako je částečně adsorbován na základ.A particular embodiment of the present invention resides in a method of making an immobilized enzyme conjugate comprising a low bulk density organic-inorganic base, a relatively high surface area porous silica-alumina carrier which may also contain inorganic additives and in situ prepared tetraethylene pentamine glutaraldehyde polymer that is adsorbed as well as entrapped in pores The aluminosilicate and the glucoamylase-containing enzyme are covalently bound to glutaraldehyde pendant polymer groups in or adjacent to the terminal portion of said groups as well as being partially adsorbed onto the primer.

Další provedení budou uvedena v následujícím dalším detailním popisu vynálezu.Further embodiments will be set forth in the following further detailed description of the invention.

Jak bylo dříve uvedeno, vynález se týká způsobu výroby immobilizovaných enzymových konjugátů zahrnujících kombinovaný organickoanorganický základ sestávající z anorganického porézního nosného materiálu obsahujícího organický polymerní materiál adsorbovaný a uchycený v pórech anorganického porézního nosiče. Dále polymerní materiál obsahuje přívěsné skupiny, přičemž uvedené přívěsné skupiny mají enzym kovalentně vázaný к těmto skupinám a/nebo přilehle к jejich koncovým částem a navíc je uvedený enzym také částečně adsorbován к základu.As previously mentioned, the invention relates to a method for producing immobilized enzyme conjugates comprising a combined organic-inorganic base consisting of an inorganic porous support material comprising an organic polymeric material adsorbed and retained in the pores of the inorganic porous support. Further, the polymeric material comprises pendant groups, said pendant groups having an enzyme covalently bound to these groups and / or adjacent to their end portions, and in addition said enzyme is also partially adsorbed to the base.

Oproti směsím látek obsahujícím immobilizované enzymy, jak bylo uvedeno dříve v dosavadním stavu techniky, směsi látek tohoto vynálezu mohou být připraveny za použití relativně nenákladných reagencií, stejně jako užitím jednoduchých stupňů v postupu přípravy uvedených směsí.In contrast to mixtures of substances containing immobilized enzymes, as previously mentioned in the prior art, mixtures of compounds of the invention can be prepared using relatively inexpensive reagents, as well as using simple steps in the process of preparing said mixtures.

Navíc mechanická pevnost a stabilita enzymových konjugátů předloženého vynálezu bude větší, než toho bylo dosaženo s dosud známými immobilizovanými enzymy. Je tudíž zřejmé, že směsi látek předloženého vynálezu přinášejí ekonomické výhody, které jsou užitečné pro průmyslové využití.Moreover, the mechanical strength and stability of the enzyme conjugates of the present invention will be greater than that achieved with previously known immobilized enzymes. It is therefore clear that the mixtures of the compounds of the present invention bring economic benefits that are useful for industrial use.

Způsob přípravy je relativně jednoduchý.The method of preparation is relatively simple.

Při výhodném způsobu přípravy se anorganický porézní nosný materiál upraví roztokem výhodně vodným, bifunkčního nebo polyfunkčního monomeru hydrolyzátu polymeru nebo předpolymeru, potom se neadsorbovaný roztok odstraní jakýmkoli známým postupem jako je vypláchnutí atd. Lze také použít jiná nenákladná organická rozpouštědla jako je aceton, tetrahydrofuran, atd. jako nosiče pro výše uvedené monomery nebo polymery. Po odstranění neadsorbovaného roztoku se vlhký porézní nosič uvede do styku s relativně velkým přebytkem 5 až 20 molárních procent druhého bifunkčního monomeru, ve kterém jsou reaktivní skupiny vymezeny řetězcem obsahujícím od 4 do 10 uhlíkových atomů, přičemž tento bifunkční monomer se také přidá ve vodném roztoku, čímž se vytvoří polymerní základ, který je adsorbován a uchycen v pórech nosiče a z kterého vyčnívají přívěsné skupiny druhého monomeru. Tyto přívěsné skupiny budou obsahovat nezreagované funkční malé části, vzhledem ke skutečnosti, že bylo použito přebytečného množství druhého bifunkčního monomeru při úpravě nosiče.In a preferred method of preparation, the inorganic porous support material is treated with a solution of preferably an aqueous, bifunctional or polyfunctional polymer hydrolyzate monomer or prepolymer, then the unadsorbed solution is removed by any known method such as rinsing etc. Other inexpensive organic solvents such as acetone, tetrahydrofuran, etc. as carriers for the abovementioned monomers or polymers. After removal of the unadsorbed solution, the wet porous carrier is contacted with a relatively large excess of 5 to 20 mole percent of the second bifunctional monomer, wherein the reactive groups are delimited by a chain of 4 to 10 carbon atoms, the bifunctional monomer also being added in aqueous solution. thereby forming a polymeric base that is adsorbed and retained in the pores of the carrier and from which the pendant groups of the second monomer project. These pendant groups will contain unreacted functional small portions due to the fact that an excess amount of the second bifunctional monomer has been used in the treatment of the carrier.

Nezreagovaná funkční místa jsou pak dostupná pro kovalentní vazbu enzymu, který se přidá к výslednému organickoanorganickému základu znovu obvykle ve vodném roztoku.Unreacted functional sites are then available for covalent binding of the enzyme, which is added to the resulting organic-inorganic base again usually in aqueous solution.

Po odstranění nezreagovaných látek například promytím atd., je enzym, zatím koválentně vázaný к přívěsným funkčním skupinám v jejich koncových částech nebo přilehle к jejich koncovým částem, bude také zčásti adsorbován na základu.After removal of unreacted substances by, for example, washing, etc., the enzyme still covalently bound to the pendant functional groups in their end portions or adjacent to their end portions will also be partially adsorbed on the base.

Je tedy zjevné, že celý immobilizační postup se může provádět jednoduchým a nenákladným způsobem za využití vodného nebo laciného rozpouštědla, přičemž se postup provádí za různé teploty, která může být- v rozmezí pod teplotou místnosti' (asi 5°C) až do zvýšených teplot asi. 60 °G a výhodně při teplotě místnosti (asi 20 až 25 °C), přb čemž uvedený postup se provádí za použití minima operačních stupňů a navíc dovoluje snadné získání přebytku reagencií a konečné směsi látek.Thus, it is apparent that the entire immobilization process can be carried out in a simple and inexpensive manner using an aqueous or inexpensive solvent, at different temperatures, which can range from below room temperature (about 5 ° C) to elevated temperatures. about. 60 ° C and preferably at room temperature (about 20 to 25 ° C), said process being carried out using a minimum of operating steps and, moreover, allows easy recovery of excess reagents and the final mixture of materials.

Mnoho anorganických nosičů uváděných v dosavadním stavu techniky je výslovně uváděno jako materiály s „řízenými póry” jako je sklo, kysličník hlinitý atd., s průměrem pórů od 500 do 700 Angstrómů pro asi 96 % materiálu a s maximálním průměrem noru 100 nm, specifickým povrchem 40 až 70 m²/g a velikostí částic 177 mikrometrů až 350 mikrometrů. Navíc tyto nosiče mohou být pokryty kysličníky kovu, jako je kysličník zirkoničitý a kysličník titaničitý pro větší stabilitu.Many prior art inorganic carriers are explicitly referred to as "controlled pore" materials such as glass, alumina, etc., with a pore diameter of from 500 to 700 Angstroms for about 96% of the material and a maximum pore diameter of 100 nm, a specific surface area of 40 up to 70 m ² / g and particle sizes from 177 microns to 350 microns. In addition, these supports can be coated with metal oxides such as zirconia and titanium dioxide for greater stability.

Pro odlišení od těchto nosičů se uvažuje v rozsahu vynálezu, že použitý anorganický materiál bude tvořen materiály, které budou mít průměry pórů; v rozmezí od; 10 nm: do 1500 nm, s 25 až 60 % porézního nosného materiálu s póry o průměrech nad; 2 000; nm a specifickým povrchem 150 až 200 m?/g. Rozměr částic může také kolísat v širokém rozmezí od 840 mikrometrů až 1680 mikrometrů do jemného prášku, přičemž rozměr ~ásDc závisí na vlastním systému, který’ se použije.To distinguish from these carriers, it is contemplated within the scope of the invention that the inorganic material used will consist of materials having pore diameters; ranging from; 10 nm: up to 1500 nm, with 25 to 60% porous support material with pores above; 2 000; nm and a specific surface area of 150 to 200 m 2 / g. The particle size can also vary within a wide range from 840 micrometers to 1680 micrometers to fine powder, the size of ásDDC being dependent on the system used.

Je třeba také uvést, že porézní nosné materiály mohou být pokryty různými kysličníky dříve uvedenými, nebo mohou mít v sobě zavedeny různé jiné anorganické materiály, jako je fosforečnan bóru.· atd., přičemž tyto anorganické materiály zavádějí speciální vlastnosti do nosného materiálu.It should also be noted that the porous support materials may be coated with the various oxides mentioned above, or they may incorporate various other inorganic materials such as boron phosphate, etc., which inorganic materials impart special properties to the support material.

Zvlášť výhodnou formu nosiče bude tvořit keramické těleso s porožitou uvedenou; pro materiály vynálezu, nebo může mít voštinovou strukturu s průchozími makrokanálky, což jsou materiály obecně známé jako monolity a které může být pokryto různými druhy porézního oxidu hlinitého, zirkoničitého atd. Použití'takovéhoto typu nosiče má zvláštní výhodu v umožnění volného, proudění dokonce vysoceviskózních substrátů; s kterými se často počítá při; provozních enzymem katalyzQvaných reakcích.A particularly preferred form of carrier will be a ceramic body having a porosity of the foregoing; for the materials of the invention, or may have a honeycomb structure with through-going macrochannels, which are materials commonly known as monoliths, and which may be coated with various types of porous alumina, zirconia etc. Use of this type of carrier has the particular advantage of allowing free, even highly viscous substrates. ; often envisaged in; operating enzyme-catalyzed reactions.

Anorganické porézní nosné materiály, které se používají jako jedna složka kombinovaného organickoanorganického; základu;, zahrnují určité oxidy kovu, jako je oxid hll·· nitý a zejména gama-oxid hlinitý, oxid křemičitý, zirkoničitý nebo směsi oxidů kovu, jako je směs oxidu křemičitého a hlinitého, oxidu křemičitého a zirkoničitého, oxidu křemičitého a hořečnatého; oxidu křemičitého, oxidu zirkoničitého a oxidu hlinitého atd. nebo gama-oxid hlinitý obsahující jiné anorganické sloučeniny, jako jsou fosforečnany bóru atd; keramická tělesa apod., stejně jako kombinace výše uvedeného materiálu, jednoho z uvedených materiálů, který může sloužit jako povlak pro jiný materiál obsahující nosič.Inorganic porous carrier materials which are used as one component of a combined organic-inorganic; the base; these include certain metal oxides such as aluminum oxide, and in particular gamma-alumina, silica, zirconia or mixtures of metal oxides such as a mixture of silica and alumina, silica and zirconia, silica and magnesium; silica, zirconia and alumina etc. or gamma-alumina containing other inorganic compounds such as boron phosphates etc.; ceramic bodies and the like, as well as a combination of the above material, one of said materials, which may serve as a coating for another carrier-containing material.

Polymerní materiály, které jsou vytvořeny in šitu takovým způsobem, že je polymerní materiál jak částečně adsorbovaný, tak částečně uchycen v pórech anorganického nosiče typu, který byl dříve uveden, může být vytvořen obvyklými způsoby dříve zde popsanými, to je nejdříve adsorbováním roztoku obsahujícího od 2 do 25 % bifunkčního nebo polyfunkčního monomeru, hydrolyzátu polymeru nebo předpolymeru, přičemž monomer nebo polymer je syntetického nebo přírodního původu a které jsou výhodně rozpustné ve vodě nebo jiných rozpouštědlech, která jsou inertní k reakcím následně použitým.Polymeric materials which are formed in situ in such a manner that the polymeric material, both partially adsorbed and partially retained in the pores of an inorganic carrier of the type previously mentioned, may be formed by conventional methods previously described herein, i.e. by first adsorbing a solution containing from 2 up to 25% of a bifunctional or polyfunctional monomer, polymer hydrolyzate or prepolymer, wherein the monomer or polymer is of synthetic or natural origin and which are preferably soluble in water or other solvents which are inert to the reactions subsequently used.

Jak bylo uvedeno dříve, v rozsahu vynálezu se uvažuje, že se potom přidá druhý bifunkční monomer podobným způsobem k vytvoření organickoanorganického základu reakcí s původním aditivem adsorbovaným na anorganickém nosiči.As mentioned previously, it is contemplated that a second bifunctional monomer is then added in a similar manner to form an organic-inorganic base by reaction with the original additive adsorbed on the inorganic carrier.

Funkční skupiny, které jsou přítomny na bifunkčním monomeru obsahují dobře známá reaktivní skupiny jako je amino, hydroxyl, karboxy, thiol, karbonyl atd. Jak bylo také dříve uvedeno reaktivní skupiny bifunkčních sloučenin jsou výhodně, ale ne nutně, odděleny řetězci obsahujícími 4 až 10 uhlíkových atomů. Reaktivní skupiny jsou schopny kovalentní vazby s jak původními aditivy, tak následně .po promytí nezreagovaných materiálů, s enzymem, který se přidá v následujícím stupni, přičemž uvedený enzym se váže kovalentně k funkční skupině v koncové části nebo přilehle ke koncové části funkčního řetězce, stejně jako je současně adsorbován na základu.The functional groups that are present on the bifunctional monomer include well known reactive groups such as amino, hydroxyl, carboxy, thiol, carbonyl, etc. As also mentioned earlier, the reactive groups of the bifunctional compounds are preferably, but not necessarily, separated by chains containing 4 to 10 carbon atoms. The reactive groups are capable of covalent bonding with both the original additives and subsequently, after washing the unreacted materials, with an enzyme that is added in the next step, said enzyme binding covalently to the functional group at the end portion or adjacent to the end portion of the functional chain as well. as it is simultaneously adsorbed on the base.

Po přidání enzymu k této směsi se vytvoří relativně stabilní enzymový konjugát, který má vysokou aktivitu a stabilitu. Směs látek předloženého vynálezu má také potřebnou · přizpůsobivost, navíc k ostatním výhodám, zde vyčísleným, v tom, že se může použít k přípravě konjugátů anorganického nosiče, který je rozpustný v kyselém nebo alkalickém prostředí.Upon addition of the enzyme to this mixture, a relatively stable enzyme conjugate is formed which has high activity and stability. The mixture of substances of the present invention also has the necessary flexibility, in addition to the other advantages enumerated herein, in that it can be used to prepare conjugates of an inorganic carrier that is soluble in an acidic or alkaline environment.

Jak bude dále uvedeno podrobněji, v závislosti na použitých reegenciích, konjugáty si udržují svou stabilitu v takovém prostředí, když jsou připraveny v kombinaci s anorganickým nosičem známými postupy. S těmito vlastnostmi je možné rozšířit použití, ve kterých lze tyto konjugáty aplikovat.As will be discussed in more detail below, depending on the used regimes, the conjugates retain their stability in such an environment when prepared in combination with an inorganic carrier by known methods. With these properties, it is possible to extend the applications in which these conjugates can be applied.

Specifickými příklady bifunkčních nebo polyfunkčních monomerů, hydrolyzátu polymerů nebo· předpolymerů, které se mohou zpočátku adsorbovat na anorganický nosič, zahrnují ve vodě rozpustné polyaminy, jako je ethylendiamin, diethylentriamini, triethylenteramin, tetraethylenpentamin, pentaethylenhexamin, hexamethylendiamin, polyethylenimin atd; ve vodě nerozpustné polyaminy, jako je methylendicyklohexylamin, methylendianilin atd; přírodní a syntetické částečně hydrolyzované polymery a předpolymery jako je nylon, kollagen, polyakrolein, polymaleinanhydrid, alginová kyselina, hydrolyzát kaseinu, želatina atd.Specific examples of bifunctional or polyfunctional monomers, polymer hydrolyzates or prepolymers that may initially be adsorbed onto an inorganic carrier include water-soluble polyamines such as ethylenediamine, diethylenetriamines, triethyleneteramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexamethylenediamine, polyethylenimine, etc; water-insoluble polyamines such as methylenedicyclohexylamine, methylenedianiline, etc; natural and synthetic partially hydrolyzed polymers and prepolymers such as nylon, collagen, polyacrolein, polymalein anhydride, alginic acid, casein hydrolyzate, gelatin etc.

Některé specifické příklady mezilehlých bifunkčních materiálů, které ' mohou být přidány k výše uvedeným produktům k vytvoření organickoanorganického základu a které mají nutné dříve uvedené vlastnosti, zahrnují sloučeniny, jako je glutardialdehyd, adipoylchlorid, sebakoylchlorid, toluendiizokyanát, hexamethylendiizokyanát atd.Some specific examples of intermediate bifunctional materials that may be added to the above products to form an organic-inorganic base and having the necessary previously mentioned properties include compounds such as glutardialdehyde, adipoyl chloride, sebacoyl chloride, toluene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate, etc.

Je třeba poznamenat, že když se nechá zreagovat polyethylenamin dříve uvedeného¹ typu s glutardialdehydem v nepřítomnosti anorganického porézního nosiče, získá se v kyselých vodných roztocích rozpustný materiál, zatímco když se polyethylenamin nechá zreagovat s diizokyanátem nebo acylhalogenidem, získá se ve vodě nerozpustný produkt. Obráceně, jestliže reakční komplex bez anorganického· nosiče obsahuje volné karboxylové skupiny, získá se v alkalickém roztoku rozpustný komplex. Vlivem, velkého* přebytku mezilehlých neboli rozpěrných bifunkčních molekul, které se použijí, polymerní základ, který je vytvořen, bude obsahovat přívěsné skupiny, zahrnující rozpěrné molekuly, přičemž tyto molekuly vyčnívají ze základu a mají reaktivní skupiny dostupné v koncových částech nebo přilehle k jejich koncovým částem, které jsou schopny reagovat s enzymem a vázat enzym k rozpěrným molekulám pomocí kovalentních vazeb.It should be noted that when polyethylene amine of the aforementioned type ¹ is reacted with glutardialdehyde in the absence of an inorganic porous carrier, a soluble material is obtained in acidic aqueous solutions, while when polyethylene amine is reacted with a diisocyanate or acyl halide, a water-insoluble product is obtained. Conversely, if the reaction complex without an inorganic carrier contains free carboxyl groups, a soluble complex is obtained in the alkaline solution. As a result of the large excess of intermediate or spacer bifunctional molecules to be used, the polymeric base that is formed will contain pendant groups including spacer molecules, these molecules protrude from the base and have reactive groups available in or adjacent to their terminal portions moieties that are capable of reacting with the enzyme and bind the enzyme to spacer molecules by covalent bonds.

Navíc enzym, když se nanese potom, když nezreagovaná reagenční činidla byla odstraněna z organicko-anorganického· základu promytím, bude také zákonitě podléhat částečné adsorpci s uvedeným základem. Vázání enzymu jen k organickému základu neovlivňuje obvykle závislost · rozpustnosti agregátu na pH roztoku, ale když je zahrnut anorganický nosič jak je dříve popsáno, celkový konjugát vykazuje vysokou stabilitu v relativně širokém rozmezí pH od 3 do 9, přičemž stabilita je ovšem také funkcí optimálních charakteristik pH určitého použitého enzymu, stejně jako použitého anorganického· nosiče.Moreover, the enzyme, when applied after the unreacted reagents have been removed from the organic-inorganic base by washing, will also inevitably undergo partial adsorption with said base. Binding of the enzyme to the organic base only does not usually affect the solubility of the aggregate on the pH of the solution, but when an inorganic carrier is included as previously described, the overall conjugate exhibits high stability over a relatively wide pH range of 3 to 9. The pH of a particular enzyme used as well as the inorganic carrier used.

Je tudíž zjevné, že vhodný organicko-anorganický základ, který je aplikovatelný · v mnoha situacích, je vytvořen nosným materiálem adsorbováním jakéhokoli typu dosud popsaných materiálů, které jsou známy a potom úpravou kteroukoli bifunkční molekulou, která je také známa a je vhodně uzpůsobena k reakci s původním aditivem, přičemž je zajištěn dostatečně velký přebytekThus, it is apparent that a suitable organic-inorganic base, which is applicable in many situations, is formed by the carrier material by adsorbing any type of materials described hitherto known and then treating with any bifunctional molecule that is also known and is suitably adapted to react with the original additive while providing a sufficiently large excess

2Ό94 2 4 bifunkční molekuly pro zajištění přívěsných skupin, které jsou schopny následné reakce s enzymem, který se má immobilizovat. Užitím těchto funkčních přívěsných skupin jako vazných míst pro enzymy lze dosáhnout větší pohyblivostí enzymů a tak se umožní aby katalytická účinnost enzymu zůstala na vysoké úrovni po relativně dlouhou dobu, než by tak bylo, když by se enzym immobilizoval jakoukoli z ostatních metod, jako je uchycení v gelové mřížce, 'adsorpce na pevném povrchu nebo zesítění enzymu pomocí bifunkčních reagencií atd. Avšak ne všechny směsi vytvoří ekvivalentní výsledky pokud jde o stabilitu nebo účinnost.2-94 2 4 bifunctional molecules to provide pendant groups capable of subsequent reaction with the enzyme to be immobilized. By using these functional pendant groups as enzyme binding sites, greater mobility of the enzymes can be achieved, thus allowing the catalytic activity of the enzyme to remain at a high level for a relatively long time than it would be if the enzyme were immobilized by any other method, such as attachment adsorption on a solid surface or cross-linking of an enzyme by bifunctional reagents etc. However, not all mixtures produce equivalent results in terms of stability or efficacy.

Příklady enzymů, které se mohou immobilizovat kovalentní vaznou reakcí a které obsahují aminovou skupinu schopnou reagovat s aldehydickou ' nebo' izokyanátovou skuninou přívěsné skupiny, která je připojena k polymernímu materiálu uchycenému a adsorbovanému v pórech porézního' nosného materiálu zahrnují trypsin, papain, hexckinasu, betagalaktózidázu, ficin, bromelain, laktodehydrogenázu, glukoamylázu, chymotrypsin, pronázu, acylázu, invertázu, amylázu, glukooxidázu, pepsln, rennin, plísňovou proteasu atd.Examples of enzymes that can be immobilized by a covalent coupling reaction and which contain an amine group capable of reacting with an aldehyde or isocyanate group of the pendant group that is attached to a polymeric material attached and adsorbed in the pores of the porous carrier material include trypsin, papain, hexckinase, betagalactosidase. , ficin, bromelain, lactodehydrogenase, glucoamylase, chymotrypsin, pronase, acylase, invertase, amylase, glucooxidase, pepsin, rennin, fungal protease, etc.

Obecně se může použít jakýkoli enzym, jehož aktivní místa nejsou zahrnuta do kovalentní vazby.In general, any enzyme whose active sites are not involved in covalent bonding may be used.

Zatímco· předešlá diskuse byla zaměřena na přívěsné skupiny, které obsahují na sobě jako funkční místa aldehydové nebo izokyanátové skupiny, je třeba uvážit v ' souhlase s rozsahem vynálezu, že přívěsná skupina ' může obsahovat jiné funkční skupiny schopné reakce s karboxylovými, hydroxylovými nebo jinými skupinami, obvykle přítomnými v enzymech.While the foregoing discussion has focused on pendant groups containing aldehyde or isocyanate groups as functional sites, it should be considered in accordance with the scope of the invention that the pendant group may contain other functional groups capable of reacting with carboxyl, hydroxyl or other groups usually present in enzymes.

Ovšem kovalentní vázání enzymů obsahujících tyto jiné skupiny s jinými přívěsnými skupinami nemusí být nutně doprovázeno ekvivalentními výsledky a může také vyvolat ' příslušně vyšší náklady na přípravu meziproduktů.However, covalent binding of enzymes containing these other groups to other pendant groups may not necessarily be accompanied by equivalent results and may also entail correspondingly higher costs for the preparation of intermediates.

Je třeba uvést, že výše uvedený ' seznam porézních pevných nosičů, monomerů, hydrolyzátů, polymerů a enzymů je jen představitelem různých typů sloučenin, které se mohou použít a vynález jimi není tudíž omezen.It should be noted that the foregoing list of porous solid carriers, monomers, hydrolysates, polymers and enzymes is merely representative of the various types of compounds that may be used and are therefore not limited thereto.

Příprava směsí látek vynálezu se výhodně provádí přetržitým' postupem, jak již bylo podrobně popsáno, ačkoli je třeba uvést v '' souhlase s rozsahem vynálezu, že tvoření konečné směsi látek se může provádět také kontinuálním způsobem.The preparation of the mixtures of the compounds of the invention is preferably carried out by a continuous process as already described in detail, although it is to be understood in accordance with the scope of the invention that the formation of the final mixture of substances can also be carried out in a continuous manner.

Když se použije kontinuální postup, určité množství porézního tuhého materiálu se umístí v příslušném zařízení, obvykle tvořícím kolonu. Porézní tuhý nosný materiál může být v jakékoli požadované formě jako je prášek, sbalky, monolitní tělesa atd. a plní se do kolony, načež se uvede vodný roztok např. polyfunkčního' aminu do' styku s ' porézním nosičem, až se nosič nasytí roztokem aminu a' přebytek se potom odtáhne. Rozpěrná nebo mezilehlá _ч bifunkční molekula, ' jako je gluterdialdehyd se potom' uvede- do styku s nasyceným nosičem. Vytváření polymerního základu se takto provádí ve vodném systému, přičemž se uvedená reakce provádí během doby, která může být v rozmezí od jedné do deseti hodin, ale ' obvykle trvá krátce.When using a continuous process, a certain amount of porous solid material is placed in an appropriate apparatus, usually forming a column. The porous solid support material may be in any desired form such as powder, wraps, monoliths, etc., and packed into a column, followed by contacting the aqueous solution of a polyfunctional amine with the porous support until the support is saturated with the amine solution. and the excess is then withdrawn. The spacer or intermediate _ч bifunctional molecule "as gluterdialdehyd then 'uvede- contacted with said impregnated support. The formation of the polymeric base is thus carried out in an aqueous system, the reaction being carried out for a period of time which may be in the range of from one to ten hours, but usually takes a short time.

Když se odstraní přebytek glutaraldehydu vypuštěním a promytím a vymytím ve vodě rozpustných a nezreagovaných materiálů, které se v případě polyaminu výhodně provádí ústojným roztokem o pH asi 4, ' vodný roztok enzymu se uvede do styku nebo do oběhu kolonou, přičemž tento stupeň vyvolává kovalentní vázání uvedeného ' enzymu na koncové aldehydové skupiny funkčních přívěsných molekul, které vyčnívají ze základu. To probíhá až už dále ' není žádná ' fyzikální adsorpční a/nebo kovalentní vazba enzymu k organickoanorganickému základu a přívěsným molekulám.When the excess glutaraldehyde is removed by draining and washing and washing out the water-soluble and unreacted materials, which in the case of the polyamine is preferably carried out with a buffer solution of about pH 4, the aqueous enzyme solution is contacted or circulated through the column, causing covalent binding of said enzyme to terminal aldehyde groups of functional pendant molecules that project from the base. This proceeds further 'there is no' physical adsorption and / or covalent binding of the enzyme to the organic-inorganic base and pendant molecules.

Přebytek enzymu se získává ve výluhu po ' vypuštění a vymytí kolony. Kolona je takto' připravena pro použití k chemické reakci, ve které působí katalytický účinek enzymu.Excess enzyme is recovered in the leach after draining and washing the column. The column is thus ready for use in a chemical reaction in which the catalytic action of the enzyme is produced.

Postupy se ve většině případech provádějí v takové době při takové teplotě a koncentracích, jaké byly dříve popsány při přetržitém postupu a výsledkem jsou srovnatelné komplexy immobilizovaného enzymu. Je třeba ' také uvést v souhlase s rozsahem tohoto vynálezu, že při vhodných modifikacích pH a teplotních parametrů, které jsou ' zjevné odborníkům v oboru, se postup může aplikovat ' na různé anorganické porézní nosiče, reagenční činidla tvořící polymer a . ' enzymy.The procedures are in most cases carried out at such a time and at such temperatures and concentrations as previously described in the continuous process, resulting in comparable immobilized enzyme complexes. It will also be appreciated that within the scope of the present invention, with suitable modifications of the pH and temperature parameters as would be apparent to those skilled in the art, the process may be applied to various inorganic porous carriers, polymer-forming reagents, and the like. enzymes.

Dále jsou uvedeny příklady pro účely znázornění nových směsí látek vynálezu a pro způsoby jejich přípravy. Tyto' příklady ' jsou však uvedeny pouze pro znázornění ' a . vynález jimi není vůbec omezen.The following are examples for illustrating the novel compositions of the invention and for methods for their preparation. However, these 'examples' are given for illustration only' and. the invention is not limited at all.

Příklad 1Example 1

V tomto příkladu byly použity dva gramy porézní směsi kysličníku křemičitého a ;.· kysličníku hlinitého, která obsahovala fosforečnan bóru v ní začleněný, přičemž směs měla rozměr částic 177 až 350 mikrometrů, ' průměr pórů v rozmezí od asi 10,0 nm do . ' asi 5500,0 nm a specifický povrch asi 150 ' až 200 m²/g, . jako anorganický nosič pro novou směs látek tohoto vynálezu. Nosič byl . kal· cinován při teplotě asi 260 °C pro odstranění jakékoli adsorbované vlhkosti v něm obsažené. Posléze byl nosič upraven 25 ml čtyřprocentního' vodného roztoku ' tetraethylenptta· minu při teplotě místnosti po ' dobu 1 hodiny ve vakuu k usnadnění penerace roztoku do pórů nosiče. Přebytek neadsorbovaného' roztoku potom byl dekantován, a ' tak bylo asi 25 % tetraethylenpentaminu adsorbováno ' v pórech nosiče. Potom byl mokrý nosič upraven .25 ml 5% vodného roztoku glutardialdehydu při teplotě místnosti a uskutečnila se téměř bezprostřední reakce za vytvoření nerozpustného reakčního produktu jak na povrchu, tak v pórech nosiče.In this example, two grams of a porous silica / alumina mixture containing boron phosphate incorporated therein was used, the mixture having a particle size of 177 to 350 microns, a pore diameter in the range of about 10.0 nm to about 10 nm. about 5500.0 nm and a specific surface area of about 150 to 200 m ² / g. as an inorganic carrier for a novel mixture of the compounds of the invention. The carrier was. calcined at a temperature of about 260 ° C to remove any adsorbed moisture contained therein. Subsequently, the support was treated with 25 ml of a four percent 'aqueous' solution of tetraethylenptaptamine at room temperature for 1 hour under vacuum to facilitate peneration of the solution into the pores of the support. The excess of unadsorbed solution was then decanted, so that about 25% of the tetraethylenepentamine was adsorbed in the pores of the support. Thereafter, the wet support was treated with 25 ml of a 5% aqueous glutardialdehyde solution at room temperature and an almost immediate reaction was performed to form an insoluble reaction product both on the surface and in the pores of the support.

Přebytek glutardialdehydového roztoku byl potom dekantován a . organickoanorganický komplex byl promyt pro odstranění nezreagovaných a neadsorbovaných reagencií, přičemž' promytí bylo provedeno nejdříve vodou · a potom 0,02 molárním ústojným roztokem acetátu, který měl pH 4,2, přičemž promývání bylo prováděno· při teplotě 45 °C. Poté byl přidán roztok enzymu obsahující asi 200 ml glukoamylázy v 25 ml vody a ponechán reagovat se směsí při teplotě místnosti · po dobu 1 hodiny. Nakonec této jednohodinové periody byl přebytek roztoku glukoamylázy dekantován a enzymový konjugát byl promyt vodou pro odstranění jakéhokoli nevázaného a/nebo neadsorbovaného enzymu. Směs byla · poté vyluhována po dobu 24 hodin ústojným octanovým roztokem podobným dříve popsanému roztoku.The excess glutardialdehyde solution was then decanted a. the organic-inorganic complex was washed to remove unreacted and unadsorbed reagents, washing first with water followed by 0.02 molar acetate buffer having a pH of 4.2, washing at 45 ° C. An enzyme solution containing about 200 ml of glucoamylase in 25 ml of water was then added and allowed to react with the mixture at room temperature for 1 hour. Finally, for one hour period, the excess glucoamylase solution was decanted and the enzyme conjugate was washed with water to remove any unbound and / or unadsorbed enzyme. The mixture was then leached for 24 hours with a buffered acetate solution similar to that previously described.

Množství adsorbovaného a/nebo kovalentně vázaného enzymu bylo určeno mikrochromatografickou plynovou analýzou podle Dumase jak před, tak po přidání enzymu.The amount of adsorbed and / or covalently bound enzyme was determined by the microchromatographic gas analysis of Dumas both before and after the addition of the enzyme.

Účinnost enzymového konjugátu potom byla· určena množstvím glukózy vytvořené při použití 30% zředěného roztoku škrobu jako substrátu při pH 4,2 a teplotě 60 °C a za použití Worthingtonova glukostatického postupu pro analýzu glukózy, což se ukázalo být spolehlivějším postupem pro určení použitelnosti konjugátu. Aktivita 28 jednotek na gram nosiče s enzymem v množství 29 mg/g nosiče byla zjištěna tímto postupem (1 jednotka představuje produkci jednoho gramu glukózy za hodinu při 60 °C v souhlase se zkušebními podmínkami).The activity of the enzyme conjugate was then determined by the amount of glucose produced using a 30% dilute starch solution as a substrate at pH 4.2 and 60 ° C and using the Worthington glucostatic glucose assay procedure, which proved to be a more reliable procedure to determine the usefulness of the conjugate. The activity of 28 units per gram of enzyme carrier at 29 mg / g carrier was determined by this procedure (1 unit represents the production of one gram of glucose per hour at 60 ° C in accordance with the test conditions).

Je třeba poznamenat, že navzdory známé rozpustnosti enzymového· konjugátu při pHIt should be noted that despite the known solubility of the enzyme conjugate at pH

4,2 · když se připravuje v nepřítomnosti anorganického nosiče, vyskytla se zanedbatelná ztráta enzymu z kombinovaného anorganickoorganického komplexu během vyluhování ústojným roztokem s pH 4,2. To bylo zjištěno zkoušením výluhu z této úpravy.When prepared in the absence of an inorganic carrier, there was a negligible loss of enzyme from the combined inorganic organic complex during leaching with a buffer solution of pH 4.2. This was determined by testing the extract from this treatment.

Příklad 2Example 2

V tomto příkladu byl opakován postup z příkladu 1 s výjimkou toho, že anorganický porézní nosič měl rozměr částic 500 až 1680 nm. Tato hlinitokřemičitá směs obsahující fosforečnan bóru v ní začleněný, byla zpracována tetraethylenpetaminem, glutardialdehydem a glukoamylázou podobným způsobem, jaký je uveden výše. Byl získán aktivní komplex immobilizovaného enzymu o snížené aktivitě způsobené pravděpodobně difúzním problémem vytvořeným většími rozměry částic směsi.In this example, the procedure of Example 1 was repeated except that the inorganic porous support had a particle size of 500 to 1680 nm. This aluminosilicate composition containing boron phosphate incorporated therein was treated with tetraethylenepetamine, glutardialdehyde and glucoamylase in a similar manner to that described above. An active immobilized enzyme complex with reduced activity was obtained, possibly due to the diffusion problem created by the larger particle sizes of the mixture.

Příklad 3Example 3

Způsobem podobným způsobu uvedenému v příkladu 1 byly dva gramy hlinitokřemičité směsi, mající tytéž fyzikální vlastnosti částic, rozměr částic, průměr pórů a specifický povrch, jako bylo uvedeno v příkladu 1, zpracovány acetonovým roztokem· tetraethylenpentaminu a potom roztokem toluendilzokyanátu také· v acetonu namísto vodného roztoku glutardialdehydu.In a manner similar to that described in Example 1, two grams of an aluminosilicate composition having the same physical particle properties, particle size, pore diameter, and specific surface area as described in Example 1 were treated with acetone solution · tetraethylenepentamine and then toluene diisocyanate solution in acetone instead of aqueous. solution of glutardialdehyde.

Po dekantací přebytku roztoku diizokyanátu a promytí vodou byl organi.ckoanorganický · komplex dále zpracován vodným roztokem glukoamylázy. Jako · v příkladu 1 konečný produkt obsahoval aktivní zcela nerozpustný enzymový komplex.After decanting the excess diisocyanate solution and washing with water, the organo-organic complex was further treated with an aqueous glucoamylase solution. As in Example 1, the end product contained an active completely insoluble enzyme complex.

Příklad 4Example 4

Pro ilustraci toho, že se mohou použít různé koncentrace roztoků · k přípravě žádaného produktu, byl postup uvedený v příkladu opakován s výjimkou toho, že byly ' použity koncentrovanější roztoky činidel. Například g 500 mikrometrů až 1 680 mikrometrů hlinitokřemičité směsi byly zpracovány 25 ml 20% roztoku tetraethylenpentaminu a· po· dekantování bylo přidáno 50 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Tento komplex byl po promytí zpracován vodným roztokem glukoamylázy pro přípravu immobilizovaného enzymového konjugátu, který vykázal aktivitu asi 12 jednotek na gram v glukostatickém testu.To illustrate that different concentrations of solutions can be used to prepare the desired product, the procedure of the example was repeated except that more concentrated reagent solutions were used. For example, g 500 micrometers to 1680 micrometers of the aluminosilicate mixture were treated with 25 ml of a 20% tetraethylenepentamine solution and, after decanting, 50 ml of a 25% glutardialdehyde solution was added. After washing, this complex was treated with an aqueous glucoamylase solution to prepare an immobilized enzyme conjugate which showed an activity of about 12 units per gram in the glucostatic assay.

Příklad 5Example 5

Ke křemičitohlinité směsi obsahující 2 g částic velikosti 500 až 1 680 mikrometrů bylo přidáno 25 ml 5% vodného roztoku · částečně hydrolyzovaného kolagenu namísto tetraethylenpentaminu. Po · dekantací a zpracování glutardialdehydem byl organickoanorganický základ promyt a potom zpracován roztokem· glukoamylázy.25 ml of a 5% aqueous solution of partially hydrolyzed collagen instead of tetraethylenepentamine was added to the silica-alumina mixture containing 2 g of particles of size 500 to 1680 microns. After decantation and treatment with glutardialdehyde, the organic-inorganic base was washed and then treated with a glucoamylase solution.

Konečná směs látek byla zpracována způsobem podobným jako v příkladu 1, dekantováním, promytím a vyluhováním ústojným roztokem (pH 4,2), aby se získal immobilizo váný enzymový konjugát, který měl aktivita asi 10 jednotek na gram.The final compound mixture was treated in a manner similar to Example 1 by decanting, washing and leaching with a buffer solution (pH 4.2) to obtain an immobilized enzyme conjugate having an activity of about 10 units per gram.

Příklad 6Example 6

V tomto příkladu byla křemičitohlinitá směs s rozměrem částic 500 až 1680 mikrometrů průměru pórů v rozmezí od 10,0 do 5500,0 nm a specifickému povrchu asi 150 až 200 m²/g upravena přidáním tetraethylenpentamínu v 1% vodném roztoku částečně hydrolyzovaného kolagenu, přičemž kolagen byl použit jako přídavné vazné činidlo. Po vypuštění a zreagování s glutaraldehydem byl organickoanorganický základ potom zpracován roztokem glukoamylázy v souhlase s o becným postupem příkladu 1 pro přípravu aktivního enzymového konjugátu.In this example, a silica-alumina mixture having a particle size of 500 to 1680 microns of pore diameter in the range of 10.0 to 5500.0 nm and a specific surface area of about 150 to 200 m ² / g was treated by adding tetraethylenepentamine in a 1% aqueous solution of partially hydrolyzed collagen. collagen was used as an additional binding agent. After being drained and reacted with glutaraldehyde, the organic-inorganic base was then treated with a glucoamylase solution in accordance with the general procedure of Example 1 to prepare an active enzyme conjugate.

Příklad 7Example 7

Pro znázornění toho, že různé enzymy se moh,ou použít pro přípravu požadovaných směsí látek byla křemičitohlinitá směs obsahující fosforečnan bóru v ní začleněný, zpracována tetraethylenpentaminovým roztokem, dekantována, promyta, poté byl přidán roztok glutaraldehydu a výsledná směs byla potom zpracována vodným roztokem laktázy. Takto byl vytvořen aktivní enzymový konjugát.To illustrate that the various enzymes can be used to prepare the desired compound mixtures, the boron-phosphate silica-containing mixture incorporated therein was treated with a tetraethylenepentamine solution, decanted, washed, then a glutaraldehyde solution was added and the resulting mixture was then treated with an aqueous lactase solution. Thus, an active enzyme conjugate was formed.

Podobné postupy se mohou použít к vázání enzymů, jako je proteáza, glukoisomeráza a glukooxidáza к vytvoření aktivních konjugátů.Similar procedures can be used to bind enzymes such as protease, glucoisomerase and glucooxidase to form active conjugates.

Příklad 8Example 8

V tomto příkladu byla připravena kolona o vnitrním průměru 20 mm obsahující 14,2 g aktivního enzymového konjugátu připraveného z glukoamylázy, která byla vázána na 500 až 1680 mikrometrů, křemičitohlinitý porézní nosič obsahující fosforečnan bóru v něm začleněný, přičemž konjugát byl připraven způsobem podobným, jako v příkladuIn this example, a 20 mm internal diameter column was prepared containing 14.2 g of an active enzyme conjugate prepared from glucoamylase bound to 500 to 1680 microns, a silica-aluminum porous support containing boron phosphate incorporated therein, and the conjugate was prepared in a manner similar to that in the example

1. Kolona byla používána kontinuálně po dobu 30 dnů při teplotě 45 °C к hydrolýze vodného 30% zředěného roztoku škrobu, který byl upraven ústojným roztokem na pH 4,2.1. The column was used continuously for 30 days at 45 ° C to hydrolyze an aqueous 30% dilute starch solution, which was adjusted to pH 4.2 with the buffer solution.

Ve výluhu byla zjišťována produkce glukózy za použití Worthingtonova glukostatického postupu. Bylo zjištěno, že nedocházelo к žádné zjevné ztrátě aktivity enzymu během této doby a že procento konverze škrobu na glukózu při této teplotě a rychlosti proudění asi 150 ml/h bylo 62 %.Glucose production was determined in the extract using the Worthington glucostatic procedure. It was found that there was no apparent loss of enzyme activity during this time and that the percentage of starch to glucose conversion at this temperature and flow rate of about 150 ml / h was 62%.

Příklad 9Example 9

К znázornění skutečnosti, že se mohou použít různé substráty nebo nosiče к přípravě požadovaných směsí látek byl kysličníkem hlinitým pokrytý monolit, který sestával z keramického voštinového tělesa se spojujícími makrokanálky, zpracován podobným způsobem jak bylo uvedeno dříve v příkladu 1, tj. monolit byl zpracován roztoky tetraethylenpentaminu, glutardialdehydu a enzymu glukoamylázy, přičemž zpracování bylo prováděno v následných operacích, které zahrnovaly dekantaci, promývání a vyluhování, jak bylo uvedeno dříve.To illustrate the fact that various substrates or carriers can be used to prepare the desired mixtures of substances, an aluminum oxide-coated monolith consisting of a ceramic honeycomb body with bonding macrochannels was treated in a similar manner to that described in Example 1, i.e. the monolith was treated with solutions tetraethylenepentamine, glutardialdehyde, and glucoamylase enzyme, and the processing was carried out in subsequent operations which included decanting, washing and leaching as previously described.

Původní keramický monolit měl hmotnost 256 g za sucha, z čehož 13 % patřilo povlaku kysličníku hlinitého. Konečný immobilizovaný enzymový konjugát byl vpraven do kolony uvnitř skleněné trubice s vnitřním průměrem 70 mm, aby mohl být v provozu kontinuálně pomocí vhodného čerpacího zařízení v teplotně řízeném pouzdru, přičemž uvedené pouzdro se udržovalo při teplotě 45 °C.The original ceramic monolith had a dry weight of 256 g, of which 13% was aluminum oxide coating. The final immobilized enzyme conjugate was loaded into a column inside a glass tube with an inner diameter of 70 mm to be operated continuously by means of a suitable pump device in a thermally controlled housing, maintaining said housing at 45 ° C.

Po 40 denní periodě kontinuálního použití pro hydrolýzu 30% zředěného roztoku škrobu bylo zjištěno, že jen asi 3 % původní aktivity enzymového konjugátu bylo ztraceno, zatímco byla udržována rychlost proudění asi 85 ml za hodinu. Navíc bylo zjištěno, že během 40 denní periody došlo přibližně к 80% konverzi škrobu na glukózu.After a period of 40 days of continuous use to hydrolyze a 30% dilute starch solution, it was found that only about 3% of the original enzyme conjugate activity was lost while maintaining a flow rate of about 85 mL per hour. In addition, it was found that during the 40 day period approximately 80% conversion of starch to glucose occurred.

Pro další studium vlastností systému byly provedeny následující změny rychlosti proudění, během nichž bylo zjištěno, že při rychlosti proudění asi 38 ml/h bylo možné získat konverzi v rozmezí 92 až 93 % škrobu na glukózu. Relativně dlouhá časová perioda, během které byl tento enzym používán к přeměně škrobu na glukózu bez význačné ztráty aktivity enzymu buď desorpcí, nebo deaktivací ukazála dlouhý poločas katalyzátoru.To further study the properties of the system, the following flow velocity variations were made during which it was found that at a flow rate of about 38 ml / h a conversion of 92 to 93% starch to glucose could be obtained. The relatively long period of time during which this enzyme was used to convert starch to glucose without significant loss of enzyme activity by either desorption or deactivation showed a long catalyst half-life.

Příklad 10Example 10

V tomto příkladu byl připraven monolitický typ konjugátu a kolona podobná jako bylo popsáno v příkladu 9 s tou výjimkou, že enzym, který byl použit к přípravě komplexu obsahoval laktózu namísto glukoamylázy. Konjugát byl zkoušen na stabilitu za kontinuálního proudění, přičemž se udržovala teplota 37 °C po dobu 29 dnů. Bylo znovu zjištěno že nedošlo к žádné zjevné ztrátě aktivity immobilizovaného enzymového konjugátu. Tento immobilizovaný enzym byl použit při zpracování 5% roztoku laktózy, který byl upraven ústojným roztokem na pH 4,2, přičemž uvedený roztok laktózy byl dávkován do kolony rychlostí 54 ml/h. Bylo zjištěno během 20 denní periody, že došlo asi к 35% konverzi laktózy na glukózu a galaktózu.In this example, a monolithic type of conjugate and a column similar to that described in Example 9 were prepared except that the enzyme used to prepare the complex contained lactose instead of glucoamylase. The conjugate was tested for stability under continuous flow while maintaining a temperature of 37 ° C for 29 days. It was again found that there was no apparent loss of activity of the immobilized enzyme conjugate. The immobilized enzyme was used to treat a 5% lactose solution, which was adjusted to pH 4.2 with buffer solution, and the lactose solution was fed to the column at a rate of 54 ml / h. It was found during the 20-day period that about 35% conversion of lactose to glucose and galactose occurred.

Claims

The object of the invention

A process for the production of an inorganic-organic support base for the immobilization of enzymes, characterized in that on an inorganic porous support material selected from the group consisting of gamma-alumina, silica, zirconia, a mixture of silica and magnesium oxide, a mixture of silica, boron phosphate and alumina, a mixture of silica, zirconia and alumina, a mixture of silica and alumina ¹ , the inorganic porous support material having a pore diameter of 10 nm to 5500 nm and a specific surface area of 1 to 500 m ² / g, is treated with a solution of soluble polyamines selected from the group consisting of ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, hexamethylenediamine and polyethylenimine in water, after which the unabsorbed polyamines are removed and the treated carrier material is contacted with a molar solution excess bifunctional monomer material selected from the group consisting of glutaraldehyde and toluene diisocyanate, at a temperature in the range of from 5 ° C to 60 ^° C, and the unreacted solution of the bifunctional monomer material is removed.

2. The process of claim 1 wherein the bifunctional monomer material is present in an excess of from 3 to 50 or more moles of bifunctional monomer per mole of water-soluble polyamines.

3. The process of claim 1 wherein the carrier material is gamma alumina.