CS209424B2 - Method of making the anorganic-organic base for immobilization of enzymes - Google Patents

Description

(54) Způsob výroby anorganlcko-organického základu pro immobilizaci enzymů

Vynález se týká způsobu výroby anorganicko-organického nosného základu pro immobilizaci enzymů;

Je známo, že enzymy, které jsou bílkovinného původu a které jsou obecně rozpustné ve vodě, obsahují biologické katalyzátory, které slouží k regulaci mnoha rozdílných chemických reakcí, které- se vyskytují v živém organismu. Enzymy mohou být také izolovány a použity v analýze, lékařství a průmyslu. Například nacházejí použití v průmyslových postupech při výrobě potravin, jako jsou sýry nebo máslo, stejně jako se používají při výrobě alkoholických nápojů.

Speciální použití nacházejí enzymy v průmyslu při štěpení aminokyselin, pří modifikaci penicilinu k vytvoření jeho rozdílných substrátů, použití různých prute as. při výrobě sýrů, zpracování masa, v detergentních směsích, zpracování kůže a jako pomocných prostředků pro podporu trávení; použití karbonhydras při hydrolýze škrobu^ inverzi- sacharózy, izomeraci glukózy atd., použití nukleas při zajišťování vůní nebo použití oxidas při prevenci oxidace a při zajišťování barev potravin. Tato použití, stejně jako mnoho jiných, jsou dobře popsána v literatuře.

Jak bylo zde předem· uvedeno, protože enzymy jsou obyčejně ve vodě rozpustné, stejně jako jsou obvykle nestabilní a snadno se deaktivují, je také obtížné buď je odstranit z roztoků, ve kterých se využívají pro následující opětné použití, nebo je obtížné udržet jejich katalytickou aktivitu po= relativně dlouhou dobu.

Výše uvedené potíže ovšem vedou k zvýšené ceně při použití enzymů pro komerční účely vlivem nutnosti časté náhrady enzymu, přičemž tato náhrada je obvykle nutná u každé aplikace. Vzhledem k vysoké ceně enzymů bylo navrhováno znehybnit nebo učinit je nerozpustnými před jejich použitím.

Znehybněním enzymů různými systémy, dosud podrobněji uvedenými, je možné relativně stabilizovat enzymy a tudíž umožnit opětné použití enzymu, který může jinak podlehnout deaktivaci nebo se může ztratit v reakčním prostředí. Immobilizované nebo nerozpustné enzymy se mohou použít v různých reakčních systémech jako v kolonách s náplní, reaktorech s mícháním atd., což závisí na povaze substrátu, který se přitom využívá.

Obecně znehybnění enzymů zajišťuje výhodnější nebo rozsáhlejší stabilitu vůči okolním podmínkám, minimum problémů s odpadem a s manipulací s materiály, stejně jako možnost zvýšení aktivity samotného enzymu.

Jak bylo dosud uvedeno, některé obvyklé způsoby, stejně jako mnoho jejich modifikací bylo popsáno, kterým lze dosáhnout immobilizace enzymů.

Jednou obvyklou metodou je adsorbování enzymu na pevný povrch, jako například, když se enzym, jako je acyláza aminokyselin adsorbuje na celulózovém derivátu jako je DEAE celulóza; papain nebo ribonukleáza se adsorbuje na porézním skle; kataláza se adsorbuje na aktivním uhlí; trypsin se adsorbuje na křemenném skle nebo celulóze; chymo-trypsin se adsorbuje na kaolinitu atd.

Jiným obvyklým způsobem je zachytit enzym v mřížce gelu, jako lze zachytit glukooxidázu, ureázu, papain atd. v polyakrylamidovém gelu; acetylcholinesterasu ve škrobovém gelu nebo silikonovém polymeru; glutamylpyrovyltransaminázu v polyamidovém gelu nebo· gelu acetátu celulózy atd.

Dalším obvyklým způsobem je zesítění pomocí bifunkčních činidel a může se provést v kombinaci s tou nebo onou předešlou obvyklou metodou immobilizace. Když se použije tohoto způsobu, bifunkční nebo polyfunkční reagenční činidla, která mohou vyvolat intermolekulární zesítění budou kovalentně vzájemně vázat enzymy, stejně jako k pevnému nosiči. Tento způsob může být vyložen na příkladu použití glutardialdehydu nebo bisdiazobenzidin-2,2-disuifonové kyseliny k vázání enzymu jako je papain k pevnému nosiči, atd.

Ještě · další způsob znehybnění enzymu zahrnuje způsob kovalentní vazby, při kterém enzymy jako je glukoamyláza, trypsin, papain, pronáza, amyláza, glukooxidáza, pepsin, rennin, plísňová proteáza, laktáza atd. jsou vázány kovalentními vazbami k polymernímu materiálu, který je vázán k organickému nebo anorganickému pevnému poréznímu nosiči. Tento způsob může být také kombinován s výše uvedenými immobilizačními postupy.

Výše . uvedené způsoby znehybnění enzymů mají všechny některé vady, které znevýhodňují jejich použití v průmyslových postupech. Například, když se enzym přímo adsorbuje na povrch nosiče, vazné síly, které se vytvoří mezi enzymem a nosičem jsou často docela slabé, ačkoli se uvádí, že lze získat relativně stabilní konjugáty tohoto typu, když jsou rozměry pórů nosiče a průměr spinu enzymu v korelaci. Rozměr póru nosiče ovšem nemůže překročit průměr asi 1 000 Angstromů.

Vzhledem k této slabé vazbě se enzym často snadno desorbuje za přítomnosti roztoků, jimiž je substrát upravován. Ještě navíc, enzym se může zcela nebo částečně dezaktivovat vlivem ztráty pohyblivosti nebo vlivem reakce mezi nosičem aktivním centrem. enzymu.

Jiným postupem, který se může využít, je uchycení enzymů v gelových mřížkách, což se může provést polymerací vodného roztoku nebo emulze obsahujících monomerní formu polymeru a enzym nebo začleněním enzymu do předem vytvořeného polymeru f různými způsoby, často za přítomnosti sífovadla. Zatímco tento způsob znehybnění i' enzymů má výhodu v tom, že reakční pod! minky použité k provedení uchycení jsou obvykle mírné, takže často dochází k malé změně nebo. deaktivaci enzymu, má také nevýhodu v tom, že konjugát má špatnou mechanickou pevnost, která má za následek zhutňování, když se použijí v kolonách v kontinuálních tekutých systémech, s průvodním ucpáváním kolony.

Tyto systémy mají také dost rozsáhlé kolísání velikosti pórů, což vede k tomu, že některé póry, které jsou dost veliké, umožňují ztrátu enzymu. Dále některé póry mohou být dost malé, takže velké difúzní překážky pro transport substrátu a produktu povedou k zpomalování reakce, což bude zvlášť závažné pří použití vysokomolekulárního substrátu.

Nevýhody, které jsou při immobilizování enzymu intermolekulárním zesítěním, jak bylo uvedeno, jsou způsobeny vlivem ztráty pohyblivosti s výslednou deaktivací, vzhledem k neschopnosti enzymu zaujmout přirozenou konfiguraci nutnou pro maximální účinnost, zejména, když se aktivní centrum zapojí do vazebného procesu.

Kovalentní vazné způsoby nalezly široké uplatnění a mohou se použít buď jako samostatné imobilizační způsoby, nebo jako integrální část mnoha způsobů již popsaných, ve kterých se využívá síťovací reakce.

Tento způsob se často· používá k vázání enzymu stejně jako nosiče bifunkčními přechodnými molekulami, ve kterých funkční skupiny molekuly, jako je například gama-aminopropyltriethoxysilan, jsou schopny reagovat s funkčními částmi přítomnými v . enzymu zároveň i v organickém nebo anorganickém porézním nosiči.

Rozsáhlé množství činidel a nosičů se využívá tímto způsobem a způsob má v mnoha případech výhodu vytvoření silných kovalentních vazeb v konjugovaném produktu stejně jako velké aktivity.

Kovalentní vazba enzymu k nosiči· musí být vytvořena funkčními skupinami enzymu, které nejsou podstatné pro jeho katalytickou účinnost jako volné aminové skupiny, karboxylové skupiny, hydroxylové skupiny, fenolové skupiny, sulfhydrylové skupiny atd. Tyto funkční skupiny budou také reagovat s mnoha jinými funkčními skupinami, jako jsou aldehydové izokyanátové, acylové, diazo, azido, anhydro, aktivované estery atd., k vytvoření kovalentních vazeb.

Přesto má tento způsob často také mnoho nevýhod, jako jsou nákladné reagencie a rozpouštědla, stejně jako. speciální a nákladné porézní nosiče a těžkopádné mnohastupňové postupy, které způsobují, že způsob přípravy je neekonomický pro komerční využití.

. Dosavadní stav techniky je tudíž naplněn různými způsoby pro znehybnění enzymů, které však v růzých bodech nevyhovují požadavkům průmyslového využití.

Jak však bude dále uvedeno, žádné ze známých složení nezahrnuje složení předmětu vynálezu, které tvoří anorganický porézní nosič obsahující polymerní hmotu vytvořenou in šitu z monomeru nebo předpolymeru, přírodního nebo syntetického původu, který je zachycen a také adsorbován částečně v pórech nosiče a který obsahuje funkií, přívěsné skupiny z něj prodloužené; přičemž enzym je zčásti adsorbován na základu a také kovalentně vázán к aktivním místům s koncovými nebo přilehlými částmi přívěsných skupin, čímž se takto umožňuje volnost pohybu, který dovolí enzymu dosáhnutí maximální aktivity.

Například US patent č. 3 556 945 se týká enzymových směsí, ve kterých je enzym adsorbován přímo na anorganický nosič, jako je sklo. US patent č. 3 519 538 se týká enzymových směsí, ve kterých jsou enzymy chemicky vázány pomocí mezilehlého silanového spojovacího činidla к anorganickému nosiči. Podobně US patent č. 3 783 101 také využívá organokřemičité sloučeniny jako spojovacího činidla, přičemž enzym je kovalentně vázán ke skleněnému nosiči pomocí mezilehlého silanového spojovacího činidla, přičemž křemíková část spojovacího činidla je připojena к nosiči, zatímco organická část 'spojovacího činidla je vázána к enzymu, přičemž směs obsahuje kysličník kovu na povrchu nosiče, uspořádaný mezi nosičem a křemíkovou částí spojovacího činidla. V US patentu č. 3 821 083 je inertní nosič pokryt předupraveným polymerem, jako je polykarolein, na který je vázán enzym.

Ovšem u většiny uvedených příkladů z patentů je nutná nejdříve kyselá hydrolýza směsi před uložením enzymu na polymer.

Jiný známý patent, US patent č. 3 705 084 zveřejňuje nakroporézní enzymový reaktor, v němž je enzym absorbován na polymerním povrchu makroporézního aktivního jádra reaktoru a potom se vhodně zesíťuje. Zesilováním enzymů na povrchu polymeru po jeho adsorpci, se enzym dále částečně immobilizuje a nemůže volně působit jako ve svém přirozeném stavu jako katalyzátor.

Zesítění enzymů je ve skutečnosti vázáno dohromady, čímž se brání volnému pohybu enzymu a snižuje se pohyblivost enzymu, která je nutným předpokladem maximální účinnosti.

Je tedy úkolem tohoto vynálezu vytvořit způsob výroby směsí látek, ve kterých jsou enzymy přítomny v immobilizovaném stavu.

Dále je úkolem vynálezu vytvořit způsob výroby látek, na kterých je enzym jak adsorbován na organickoanorganickém základě, tak kovalentně vázán к funkčním přívěsným skupinám připojeným к uvedenému základu, který je naopak adsorbován i uchycen v pórech anorganického porézního materiálu.

Vynález se týká způsobu výroby anorga nicko-organického nosného základu pro immobilizaci enzymů, jehož podstata spočívá v tom, že na anorganický porézní nosný materiál vybraný ze skupiny zahrnující gama-oxid hlinitý, oxid křemičitý, oxid zirkoničitý, směs oxidu křemičitého a oxidu horečnatého, směs oxidu křemičitého, fosforečnanu boritého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého, oxidu zirkoničitého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého a oxidu hlinitého, přičemž tento anorganický porézní nosný materiál má průměr pórů od 10 nm do 5500 nm a specifický povrch od 1 do 500 m²/g, se působí roztokem rozpustných polyaminů vybraných ze skupiny zahrnující ethylendiamin, diethylentriamin, triethylentetramin, tetraethylenpentamin, pentaethylenhexamin, hexamethylendiamin, a polyethylenimin ve vodě, po tomto zpracování se odstraní neadsorbované polyaminy a takto upravený nosný materiál se uvede do styku s roztokem obsahujícím molární přebytek bifunkčního monomerního materiálu vybraného ze skupiny zahrnující glutaraldehyd a toluendiisokyanát, při teplotě v rozmezí od 5 °C do 60 °C a nezreagovaný roztok bifunkčního monomerního materiálu se odstraní.

Jak bylo dříve uvedeno, použití enzymů v analytické, lékařské nebo průmyslové praxi se může značně zvýšit, jestliže jsou uvedené enzymy v immobilizovaném stavu, tj. enzymy, které jsou v immobilizovaném stavu s jinými pevnými materiály, jsou samy o sobě v takovém stavu, kdy nejsou rozpustné ve vodě a tudíž se mohou opakovaně použít, přičemž se zachovává katalytická aktivita uvedeného enzymu. Aby byly enzymy přítomny v immobilizovaném stavu, musí být enzymy do jisté míry vázány na vodou nerozpustný nosič, čímž jsou komerčně využitelné v nerozpustném stavu ve vodě.

Z jednoho hlediska provedení vynálezu spočívá ve způsobu výroby immobilizovaného enzymového konjugátu zahrnujícím kombinovaný organickoanorganický základ sestávající z anorganického porézního nosiče obsahujícího organický polymerní materiál adsorbovaný a uchycený v pórech uvedeného nosiče, přičemž polymerní materiál obsahuje funkční přívěsné skupiny a enzym adsorbovaný к uvedenému základu a kovalentne vázaný к funkčním místům přívěsných skupin organického polymerního materiálu nebo v přilehle к jejich koncovým částem.

Konkrétní provedení tohoto vynálezu spočívá ve způsobu výroby immobilizovaného enzymového konjugátu zahrnujícího organickoanorganický základ o nízké sypné hmotnosti, porézní křemičitohlinitý nosič o relativně vysoké ploše povrchu, který může také obsahovat anorganická aditiva a in šitu připravený tetraethylenpentaminglutarallehydový polymer, který je adsorbován, stejně jako uchycen v pórech hlinitokřemičitanu a enzym obsahující glukoamylázu je kovalentně vázán ke glutaraldehydovým přívěs2 0 9 4 2 4 ným skupinám polymeru v nebo přilehle ke koncové části uvedených skupin stejně jako je částečně adsorbován na základ.

Další provedení budou uvedena v následujícím dalším detailním popisu vynálezu.

Jak bylo dříve uvedeno, vynález se týká způsobu výroby immobilizovaných enzymových konjugátů zahrnujících kombinovaný organickoanorganický základ sestávající z anorganického porézního nosného materiálu obsahujícího organický polymerní materiál adsorbovaný a uchycený v pórech anorganického porézního nosiče. Dále polymerní materiál obsahuje přívěsné skupiny, přičemž uvedené přívěsné skupiny mají enzym kovalentně vázaný к těmto skupinám a/nebo přilehle к jejich koncovým částem a navíc je uvedený enzym také částečně adsorbován к základu.

Oproti směsím látek obsahujícím immobilizované enzymy, jak bylo uvedeno dříve v dosavadním stavu techniky, směsi látek tohoto vynálezu mohou být připraveny za použití relativně nenákladných reagencií, stejně jako užitím jednoduchých stupňů v postupu přípravy uvedených směsí.

Navíc mechanická pevnost a stabilita enzymových konjugátů předloženého vynálezu bude větší, než toho bylo dosaženo s dosud známými immobilizovanými enzymy. Je tudíž zřejmé, že směsi látek předloženého vynálezu přinášejí ekonomické výhody, které jsou užitečné pro průmyslové využití.

Způsob přípravy je relativně jednoduchý.

Při výhodném způsobu přípravy se anorganický porézní nosný materiál upraví roztokem výhodně vodným, bifunkčního nebo polyfunkčního monomeru hydrolyzátu polymeru nebo předpolymeru, potom se neadsorbovaný roztok odstraní jakýmkoli známým postupem jako je vypláchnutí atd. Lze také použít jiná nenákladná organická rozpouštědla jako je aceton, tetrahydrofuran, atd. jako nosiče pro výše uvedené monomery nebo polymery. Po odstranění neadsorbovaného roztoku se vlhký porézní nosič uvede do styku s relativně velkým přebytkem 5 až 20 molárních procent druhého bifunkčního monomeru, ve kterém jsou reaktivní skupiny vymezeny řetězcem obsahujícím od 4 do 10 uhlíkových atomů, přičemž tento bifunkční monomer se také přidá ve vodném roztoku, čímž se vytvoří polymerní základ, který je adsorbován a uchycen v pórech nosiče a z kterého vyčnívají přívěsné skupiny druhého monomeru. Tyto přívěsné skupiny budou obsahovat nezreagované funkční malé části, vzhledem ke skutečnosti, že bylo použito přebytečného množství druhého bifunkčního monomeru při úpravě nosiče.

Nezreagovaná funkční místa jsou pak dostupná pro kovalentní vazbu enzymu, který se přidá к výslednému organickoanorganickému základu znovu obvykle ve vodném roztoku.

Po odstranění nezreagovaných látek například promytím atd., je enzym, zatím koválentně vázaný к přívěsným funkčním skupinám v jejich koncových částech nebo přilehle к jejich koncovým částem, bude také zčásti adsorbován na základu.

Je tedy zjevné, že celý immobilizační postup se může provádět jednoduchým a nenákladným způsobem za využití vodného nebo laciného rozpouštědla, přičemž se postup provádí za různé teploty, která může být- v rozmezí pod teplotou místnosti' (asi 5°C) až do zvýšených teplot asi. 60 °G a výhodně při teplotě místnosti (asi 20 až 25 °C), přb čemž uvedený postup se provádí za použití minima operačních stupňů a navíc dovoluje snadné získání přebytku reagencií a konečné směsi látek.

Mnoho anorganických nosičů uváděných v dosavadním stavu techniky je výslovně uváděno jako materiály s „řízenými póry” jako je sklo, kysličník hlinitý atd., s průměrem pórů od 500 do 700 Angstrómů pro asi 96 % materiálu a s maximálním průměrem noru 100 nm, specifickým povrchem 40 až 70 m²/g a velikostí částic 177 mikrometrů až 350 mikrometrů. Navíc tyto nosiče mohou být pokryty kysličníky kovu, jako je kysličník zirkoničitý a kysličník titaničitý pro větší stabilitu.

Pro odlišení od těchto nosičů se uvažuje v rozsahu vynálezu, že použitý anorganický materiál bude tvořen materiály, které budou mít průměry pórů; v rozmezí od; 10 nm: do 1500 nm, s 25 až 60 % porézního nosného materiálu s póry o průměrech nad; 2 000; nm a specifickým povrchem 150 až 200 m?/g. Rozměr částic může také kolísat v širokém rozmezí od 840 mikrometrů až 1680 mikrometrů do jemného prášku, přičemž rozměr ~ásDc závisí na vlastním systému, který’ se použije.

Je třeba také uvést, že porézní nosné materiály mohou být pokryty různými kysličníky dříve uvedenými, nebo mohou mít v sobě zavedeny různé jiné anorganické materiály, jako je fosforečnan bóru.· atd., přičemž tyto anorganické materiály zavádějí speciální vlastnosti do nosného materiálu.

Zvlášť výhodnou formu nosiče bude tvořit keramické těleso s porožitou uvedenou; pro materiály vynálezu, nebo může mít voštinovou strukturu s průchozími makrokanálky, což jsou materiály obecně známé jako monolity a které může být pokryto různými druhy porézního oxidu hlinitého, zirkoničitého atd. Použití'takovéhoto typu nosiče má zvláštní výhodu v umožnění volného, proudění dokonce vysoceviskózních substrátů; s kterými se často počítá při; provozních enzymem katalyzQvaných reakcích.

Anorganické porézní nosné materiály, které se používají jako jedna složka kombinovaného organickoanorganického; základu;, zahrnují určité oxidy kovu, jako je oxid hll·· nitý a zejména gama-oxid hlinitý, oxid křemičitý, zirkoničitý nebo směsi oxidů kovu, jako je směs oxidu křemičitého a hlinitého, oxidu křemičitého a zirkoničitého, oxidu křemičitého a hořečnatého; oxidu křemičitého, oxidu zirkoničitého a oxidu hlinitého atd. nebo gama-oxid hlinitý obsahující jiné anorganické sloučeniny, jako jsou fosforečnany bóru atd; keramická tělesa apod., stejně jako kombinace výše uvedeného materiálu, jednoho z uvedených materiálů, který může sloužit jako povlak pro jiný materiál obsahující nosič.

Polymerní materiály, které jsou vytvořeny in šitu takovým způsobem, že je polymerní materiál jak částečně adsorbovaný, tak částečně uchycen v pórech anorganického nosiče typu, který byl dříve uveden, může být vytvořen obvyklými způsoby dříve zde popsanými, to je nejdříve adsorbováním roztoku obsahujícího od 2 do 25 % bifunkčního nebo polyfunkčního monomeru, hydrolyzátu polymeru nebo předpolymeru, přičemž monomer nebo polymer je syntetického nebo přírodního původu a které jsou výhodně rozpustné ve vodě nebo jiných rozpouštědlech, která jsou inertní k reakcím následně použitým.

Jak bylo uvedeno dříve, v rozsahu vynálezu se uvažuje, že se potom přidá druhý bifunkční monomer podobným způsobem k vytvoření organickoanorganického základu reakcí s původním aditivem adsorbovaným na anorganickém nosiči.

Funkční skupiny, které jsou přítomny na bifunkčním monomeru obsahují dobře známá reaktivní skupiny jako je amino, hydroxyl, karboxy, thiol, karbonyl atd. Jak bylo také dříve uvedeno reaktivní skupiny bifunkčních sloučenin jsou výhodně, ale ne nutně, odděleny řetězci obsahujícími 4 až 10 uhlíkových atomů. Reaktivní skupiny jsou schopny kovalentní vazby s jak původními aditivy, tak následně .po promytí nezreagovaných materiálů, s enzymem, který se přidá v následujícím stupni, přičemž uvedený enzym se váže kovalentně k funkční skupině v koncové části nebo přilehle ke koncové části funkčního řetězce, stejně jako je současně adsorbován na základu.

Po přidání enzymu k této směsi se vytvoří relativně stabilní enzymový konjugát, který má vysokou aktivitu a stabilitu. Směs látek předloženého vynálezu má také potřebnou · přizpůsobivost, navíc k ostatním výhodám, zde vyčísleným, v tom, že se může použít k přípravě konjugátů anorganického nosiče, který je rozpustný v kyselém nebo alkalickém prostředí.

Jak bude dále uvedeno podrobněji, v závislosti na použitých reegenciích, konjugáty si udržují svou stabilitu v takovém prostředí, když jsou připraveny v kombinaci s anorganickým nosičem známými postupy. S těmito vlastnostmi je možné rozšířit použití, ve kterých lze tyto konjugáty aplikovat.

Specifickými příklady bifunkčních nebo polyfunkčních monomerů, hydrolyzátu polymerů nebo· předpolymerů, které se mohou zpočátku adsorbovat na anorganický nosič, zahrnují ve vodě rozpustné polyaminy, jako je ethylendiamin, diethylentriamini, triethylenteramin, tetraethylenpentamin, pentaethylenhexamin, hexamethylendiamin, polyethylenimin atd; ve vodě nerozpustné polyaminy, jako je methylendicyklohexylamin, methylendianilin atd; přírodní a syntetické částečně hydrolyzované polymery a předpolymery jako je nylon, kollagen, polyakrolein, polymaleinanhydrid, alginová kyselina, hydrolyzát kaseinu, želatina atd.

Některé specifické příklady mezilehlých bifunkčních materiálů, které ' mohou být přidány k výše uvedeným produktům k vytvoření organickoanorganického základu a které mají nutné dříve uvedené vlastnosti, zahrnují sloučeniny, jako je glutardialdehyd, adipoylchlorid, sebakoylchlorid, toluendiizokyanát, hexamethylendiizokyanát atd.

Je třeba poznamenat, že když se nechá zreagovat polyethylenamin dříve uvedeného¹ typu s glutardialdehydem v nepřítomnosti anorganického porézního nosiče, získá se v kyselých vodných roztocích rozpustný materiál, zatímco když se polyethylenamin nechá zreagovat s diizokyanátem nebo acylhalogenidem, získá se ve vodě nerozpustný produkt. Obráceně, jestliže reakční komplex bez anorganického· nosiče obsahuje volné karboxylové skupiny, získá se v alkalickém roztoku rozpustný komplex. Vlivem, velkého* přebytku mezilehlých neboli rozpěrných bifunkčních molekul, které se použijí, polymerní základ, který je vytvořen, bude obsahovat přívěsné skupiny, zahrnující rozpěrné molekuly, přičemž tyto molekuly vyčnívají ze základu a mají reaktivní skupiny dostupné v koncových částech nebo přilehle k jejich koncovým částem, které jsou schopny reagovat s enzymem a vázat enzym k rozpěrným molekulám pomocí kovalentních vazeb.

Navíc enzym, když se nanese potom, když nezreagovaná reagenční činidla byla odstraněna z organicko-anorganického· základu promytím, bude také zákonitě podléhat částečné adsorpci s uvedeným základem. Vázání enzymu jen k organickému základu neovlivňuje obvykle závislost · rozpustnosti agregátu na pH roztoku, ale když je zahrnut anorganický nosič jak je dříve popsáno, celkový konjugát vykazuje vysokou stabilitu v relativně širokém rozmezí pH od 3 do 9, přičemž stabilita je ovšem také funkcí optimálních charakteristik pH určitého použitého enzymu, stejně jako použitého anorganického· nosiče.

Je tudíž zjevné, že vhodný organicko-anorganický základ, který je aplikovatelný · v mnoha situacích, je vytvořen nosným materiálem adsorbováním jakéhokoli typu dosud popsaných materiálů, které jsou známy a potom úpravou kteroukoli bifunkční molekulou, která je také známa a je vhodně uzpůsobena k reakci s původním aditivem, přičemž je zajištěn dostatečně velký přebytek

2Ό94 2 4 bifunkční molekuly pro zajištění přívěsných skupin, které jsou schopny následné reakce s enzymem, který se má immobilizovat. Užitím těchto funkčních přívěsných skupin jako vazných míst pro enzymy lze dosáhnout větší pohyblivostí enzymů a tak se umožní aby katalytická účinnost enzymu zůstala na vysoké úrovni po relativně dlouhou dobu, než by tak bylo, když by se enzym immobilizoval jakoukoli z ostatních metod, jako je uchycení v gelové mřížce, 'adsorpce na pevném povrchu nebo zesítění enzymu pomocí bifunkčních reagencií atd. Avšak ne všechny směsi vytvoří ekvivalentní výsledky pokud jde o stabilitu nebo účinnost.

Příklady enzymů, které se mohou immobilizovat kovalentní vaznou reakcí a které obsahují aminovou skupinu schopnou reagovat s aldehydickou ' nebo' izokyanátovou skuninou přívěsné skupiny, která je připojena k polymernímu materiálu uchycenému a adsorbovanému v pórech porézního' nosného materiálu zahrnují trypsin, papain, hexckinasu, betagalaktózidázu, ficin, bromelain, laktodehydrogenázu, glukoamylázu, chymotrypsin, pronázu, acylázu, invertázu, amylázu, glukooxidázu, pepsln, rennin, plísňovou proteasu atd.

Obecně se může použít jakýkoli enzym, jehož aktivní místa nejsou zahrnuta do kovalentní vazby.

Zatímco· předešlá diskuse byla zaměřena na přívěsné skupiny, které obsahují na sobě jako funkční místa aldehydové nebo izokyanátové skupiny, je třeba uvážit v ' souhlase s rozsahem vynálezu, že přívěsná skupina ' může obsahovat jiné funkční skupiny schopné reakce s karboxylovými, hydroxylovými nebo jinými skupinami, obvykle přítomnými v enzymech.

Ovšem kovalentní vázání enzymů obsahujících tyto jiné skupiny s jinými přívěsnými skupinami nemusí být nutně doprovázeno ekvivalentními výsledky a může také vyvolat ' příslušně vyšší náklady na přípravu meziproduktů.

Je třeba uvést, že výše uvedený ' seznam porézních pevných nosičů, monomerů, hydrolyzátů, polymerů a enzymů je jen představitelem různých typů sloučenin, které se mohou použít a vynález jimi není tudíž omezen.

Příprava směsí látek vynálezu se výhodně provádí přetržitým' postupem, jak již bylo podrobně popsáno, ačkoli je třeba uvést v '' souhlase s rozsahem vynálezu, že tvoření konečné směsi látek se může provádět také kontinuálním způsobem.

Když se použije kontinuální postup, určité množství porézního tuhého materiálu se umístí v příslušném zařízení, obvykle tvořícím kolonu. Porézní tuhý nosný materiál může být v jakékoli požadované formě jako je prášek, sbalky, monolitní tělesa atd. a plní se do kolony, načež se uvede vodný roztok např. polyfunkčního' aminu do' styku s ' porézním nosičem, až se nosič nasytí roztokem aminu a' přebytek se potom odtáhne. Rozpěrná nebo mezilehlá _ч bifunkční molekula, ' jako je gluterdialdehyd se potom' uvede- do styku s nasyceným nosičem. Vytváření polymerního základu se takto provádí ve vodném systému, přičemž se uvedená reakce provádí během doby, která může být v rozmezí od jedné do deseti hodin, ale ' obvykle trvá krátce.

Když se odstraní přebytek glutaraldehydu vypuštěním a promytím a vymytím ve vodě rozpustných a nezreagovaných materiálů, které se v případě polyaminu výhodně provádí ústojným roztokem o pH asi 4, ' vodný roztok enzymu se uvede do styku nebo do oběhu kolonou, přičemž tento stupeň vyvolává kovalentní vázání uvedeného ' enzymu na koncové aldehydové skupiny funkčních přívěsných molekul, které vyčnívají ze základu. To probíhá až už dále ' není žádná ' fyzikální adsorpční a/nebo kovalentní vazba enzymu k organickoanorganickému základu a přívěsným molekulám.

Přebytek enzymu se získává ve výluhu po ' vypuštění a vymytí kolony. Kolona je takto' připravena pro použití k chemické reakci, ve které působí katalytický účinek enzymu.

Postupy se ve většině případech provádějí v takové době při takové teplotě a koncentracích, jaké byly dříve popsány při přetržitém postupu a výsledkem jsou srovnatelné komplexy immobilizovaného enzymu. Je třeba ' také uvést v souhlase s rozsahem tohoto vynálezu, že při vhodných modifikacích pH a teplotních parametrů, které jsou ' zjevné odborníkům v oboru, se postup může aplikovat ' na různé anorganické porézní nosiče, reagenční činidla tvořící polymer a . ' enzymy.

Dále jsou uvedeny příklady pro účely znázornění nových směsí látek vynálezu a pro způsoby jejich přípravy. Tyto' příklady ' jsou však uvedeny pouze pro znázornění ' a . vynález jimi není vůbec omezen.

Příklad 1

V tomto příkladu byly použity dva gramy porézní směsi kysličníku křemičitého a ;.· kysličníku hlinitého, která obsahovala fosforečnan bóru v ní začleněný, přičemž směs měla rozměr částic 177 až 350 mikrometrů, ' průměr pórů v rozmezí od asi 10,0 nm do . ' asi 5500,0 nm a specifický povrch asi 150 ' až 200 m²/g, . jako anorganický nosič pro novou směs látek tohoto vynálezu. Nosič byl . kal· cinován při teplotě asi 260 °C pro odstranění jakékoli adsorbované vlhkosti v něm obsažené. Posléze byl nosič upraven 25 ml čtyřprocentního' vodného roztoku ' tetraethylenptta· minu při teplotě místnosti po ' dobu 1 hodiny ve vakuu k usnadnění penerace roztoku do pórů nosiče. Přebytek neadsorbovaného' roztoku potom byl dekantován, a ' tak bylo asi 25 % tetraethylenpentaminu adsorbováno ' v pórech nosiče. Potom byl mokrý nosič upraven .25 ml 5% vodného roztoku glutardialdehydu při teplotě místnosti a uskutečnila se téměř bezprostřední reakce za vytvoření nerozpustného reakčního produktu jak na povrchu, tak v pórech nosiče.

Přebytek glutardialdehydového roztoku byl potom dekantován a . organickoanorganický komplex byl promyt pro odstranění nezreagovaných a neadsorbovaných reagencií, přičemž' promytí bylo provedeno nejdříve vodou · a potom 0,02 molárním ústojným roztokem acetátu, který měl pH 4,2, přičemž promývání bylo prováděno· při teplotě 45 °C. Poté byl přidán roztok enzymu obsahující asi 200 ml glukoamylázy v 25 ml vody a ponechán reagovat se směsí při teplotě místnosti · po dobu 1 hodiny. Nakonec této jednohodinové periody byl přebytek roztoku glukoamylázy dekantován a enzymový konjugát byl promyt vodou pro odstranění jakéhokoli nevázaného a/nebo neadsorbovaného enzymu. Směs byla · poté vyluhována po dobu 24 hodin ústojným octanovým roztokem podobným dříve popsanému roztoku.

Množství adsorbovaného a/nebo kovalentně vázaného enzymu bylo určeno mikrochromatografickou plynovou analýzou podle Dumase jak před, tak po přidání enzymu.

Účinnost enzymového konjugátu potom byla· určena množstvím glukózy vytvořené při použití 30% zředěného roztoku škrobu jako substrátu při pH 4,2 a teplotě 60 °C a za použití Worthingtonova glukostatického postupu pro analýzu glukózy, což se ukázalo být spolehlivějším postupem pro určení použitelnosti konjugátu. Aktivita 28 jednotek na gram nosiče s enzymem v množství 29 mg/g nosiče byla zjištěna tímto postupem (1 jednotka představuje produkci jednoho gramu glukózy za hodinu při 60 °C v souhlase se zkušebními podmínkami).

Je třeba poznamenat, že navzdory známé rozpustnosti enzymového· konjugátu při pH

4,2 · když se připravuje v nepřítomnosti anorganického nosiče, vyskytla se zanedbatelná ztráta enzymu z kombinovaného anorganickoorganického komplexu během vyluhování ústojným roztokem s pH 4,2. To bylo zjištěno zkoušením výluhu z této úpravy.

Příklad 2

V tomto příkladu byl opakován postup z příkladu 1 s výjimkou toho, že anorganický porézní nosič měl rozměr částic 500 až 1680 nm. Tato hlinitokřemičitá směs obsahující fosforečnan bóru v ní začleněný, byla zpracována tetraethylenpetaminem, glutardialdehydem a glukoamylázou podobným způsobem, jaký je uveden výše. Byl získán aktivní komplex immobilizovaného enzymu o snížené aktivitě způsobené pravděpodobně difúzním problémem vytvořeným většími rozměry částic směsi.

Příklad 3

Způsobem podobným způsobu uvedenému v příkladu 1 byly dva gramy hlinitokřemičité směsi, mající tytéž fyzikální vlastnosti částic, rozměr částic, průměr pórů a specifický povrch, jako bylo uvedeno v příkladu 1, zpracovány acetonovým roztokem· tetraethylenpentaminu a potom roztokem toluendilzokyanátu také· v acetonu namísto vodného roztoku glutardialdehydu.

Po dekantací přebytku roztoku diizokyanátu a promytí vodou byl organi.ckoanorganický · komplex dále zpracován vodným roztokem glukoamylázy. Jako · v příkladu 1 konečný produkt obsahoval aktivní zcela nerozpustný enzymový komplex.

Příklad 4

Pro ilustraci toho, že se mohou použít různé koncentrace roztoků · k přípravě žádaného produktu, byl postup uvedený v příkladu opakován s výjimkou toho, že byly ' použity koncentrovanější roztoky činidel. Například g 500 mikrometrů až 1 680 mikrometrů hlinitokřemičité směsi byly zpracovány 25 ml 20% roztoku tetraethylenpentaminu a· po· dekantování bylo přidáno 50 ml 25% roztoku glutardialdehydu. Tento komplex byl po promytí zpracován vodným roztokem glukoamylázy pro přípravu immobilizovaného enzymového konjugátu, který vykázal aktivitu asi 12 jednotek na gram v glukostatickém testu.

Příklad 5

Ke křemičitohlinité směsi obsahující 2 g částic velikosti 500 až 1 680 mikrometrů bylo přidáno 25 ml 5% vodného roztoku · částečně hydrolyzovaného kolagenu namísto tetraethylenpentaminu. Po · dekantací a zpracování glutardialdehydem byl organickoanorganický základ promyt a potom zpracován roztokem· glukoamylázy.

Konečná směs látek byla zpracována způsobem podobným jako v příkladu 1, dekantováním, promytím a vyluhováním ústojným roztokem (pH 4,2), aby se získal immobilizo váný enzymový konjugát, který měl aktivita asi 10 jednotek na gram.

Příklad 6

V tomto příkladu byla křemičitohlinitá směs s rozměrem částic 500 až 1680 mikrometrů průměru pórů v rozmezí od 10,0 do 5500,0 nm a specifickému povrchu asi 150 až 200 m²/g upravena přidáním tetraethylenpentamínu v 1% vodném roztoku částečně hydrolyzovaného kolagenu, přičemž kolagen byl použit jako přídavné vazné činidlo. Po vypuštění a zreagování s glutaraldehydem byl organickoanorganický základ potom zpracován roztokem glukoamylázy v souhlase s o becným postupem příkladu 1 pro přípravu aktivního enzymového konjugátu.

Příklad 7

Pro znázornění toho, že různé enzymy se moh,ou použít pro přípravu požadovaných směsí látek byla křemičitohlinitá směs obsahující fosforečnan bóru v ní začleněný, zpracována tetraethylenpentaminovým roztokem, dekantována, promyta, poté byl přidán roztok glutaraldehydu a výsledná směs byla potom zpracována vodným roztokem laktázy. Takto byl vytvořen aktivní enzymový konjugát.

Podobné postupy se mohou použít к vázání enzymů, jako je proteáza, glukoisomeráza a glukooxidáza к vytvoření aktivních konjugátů.

Příklad 8

V tomto příkladu byla připravena kolona o vnitrním průměru 20 mm obsahující 14,2 g aktivního enzymového konjugátu připraveného z glukoamylázy, která byla vázána na 500 až 1680 mikrometrů, křemičitohlinitý porézní nosič obsahující fosforečnan bóru v něm začleněný, přičemž konjugát byl připraven způsobem podobným, jako v příkladu

1. Kolona byla používána kontinuálně po dobu 30 dnů při teplotě 45 °C к hydrolýze vodného 30% zředěného roztoku škrobu, který byl upraven ústojným roztokem na pH 4,2.

Ve výluhu byla zjišťována produkce glukózy za použití Worthingtonova glukostatického postupu. Bylo zjištěno, že nedocházelo к žádné zjevné ztrátě aktivity enzymu během této doby a že procento konverze škrobu na glukózu při této teplotě a rychlosti proudění asi 150 ml/h bylo 62 %.

Příklad 9

К znázornění skutečnosti, že se mohou použít různé substráty nebo nosiče к přípravě požadovaných směsí látek byl kysličníkem hlinitým pokrytý monolit, který sestával z keramického voštinového tělesa se spojujícími makrokanálky, zpracován podobným způsobem jak bylo uvedeno dříve v příkladu 1, tj. monolit byl zpracován roztoky tetraethylenpentaminu, glutardialdehydu a enzymu glukoamylázy, přičemž zpracování bylo prováděno v následných operacích, které zahrnovaly dekantaci, promývání a vyluhování, jak bylo uvedeno dříve.

Původní keramický monolit měl hmotnost 256 g za sucha, z čehož 13 % patřilo povlaku kysličníku hlinitého. Konečný immobilizovaný enzymový konjugát byl vpraven do kolony uvnitř skleněné trubice s vnitřním průměrem 70 mm, aby mohl být v provozu kontinuálně pomocí vhodného čerpacího zařízení v teplotně řízeném pouzdru, přičemž uvedené pouzdro se udržovalo při teplotě 45 °C.

Po 40 denní periodě kontinuálního použití pro hydrolýzu 30% zředěného roztoku škrobu bylo zjištěno, že jen asi 3 % původní aktivity enzymového konjugátu bylo ztraceno, zatímco byla udržována rychlost proudění asi 85 ml za hodinu. Navíc bylo zjištěno, že během 40 denní periody došlo přibližně к 80% konverzi škrobu na glukózu.

Pro další studium vlastností systému byly provedeny následující změny rychlosti proudění, během nichž bylo zjištěno, že při rychlosti proudění asi 38 ml/h bylo možné získat konverzi v rozmezí 92 až 93 % škrobu na glukózu. Relativně dlouhá časová perioda, během které byl tento enzym používán к přeměně škrobu na glukózu bez význačné ztráty aktivity enzymu buď desorpcí, nebo deaktivací ukazála dlouhý poločas katalyzátoru.

Příklad 10

V tomto příkladu byl připraven monolitický typ konjugátu a kolona podobná jako bylo popsáno v příkladu 9 s tou výjimkou, že enzym, který byl použit к přípravě komplexu obsahoval laktózu namísto glukoamylázy. Konjugát byl zkoušen na stabilitu za kontinuálního proudění, přičemž se udržovala teplota 37 °C po dobu 29 dnů. Bylo znovu zjištěno že nedošlo к žádné zjevné ztrátě aktivity immobilizovaného enzymového konjugátu. Tento immobilizovaný enzym byl použit při zpracování 5% roztoku laktózy, který byl upraven ústojným roztokem na pH 4,2, přičemž uvedený roztok laktózy byl dávkován do kolony rychlostí 54 ml/h. Bylo zjištěno během 20 denní periody, že došlo asi к 35% konverzi laktózy na glukózu a galaktózu.

Claims (3)

1. pRedmét vynalezu

   1. Způsob výroby anorganicko-organického nosného základu pro immobilizaci enzymů, vyznačený tím, že na anorganický porézní nosný materiál vybraný ze skupiny zahrnující gama-oxid hlinitý, oxid křemičitý, oxid zirkoničitý, směs oxidu křemičitého a oxidu hořečnatého, směs oxidu křemičitého, fosforečnanu boritého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého, oxidu zirkoničitého a oxidu hlinitého, směs oxidu křemičitého a oxidu hlinitého¹, přičemž tento anorganický porézní nosný materiál má průměr pórů od 10 nm do .5500 nm a specifický povrch od 1 do 500 m²/g, se působí roztokem rozpustných polyaminů vybraných ze skupiny zahrnující ethylendiamin, diethylentriamin, triethylentetramin, tetraethylenpentamin, pentaethy lenhexamin, hexamethylendiamin a polyethylenimin ve vodě, po tomto zpracování se odstraní nenaabsorbované polyaminy a takto upravený nosný materiál se uvede do styku s roztokem obsahujícím molární přebytek bifunkčního monomerního materiálu vybraného ze skupiny zahrnující glutaraldehyd a toluendiizokyanát, při teplotě v rozmezí od 5 °C do 60 ^CC a nezreagovaný roztok bifunkčního monomerního materiálu se odstraní.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že bifunkční monomerní materiál je přítomen v přebytku od 3 do 50 nebo více molů bifunkčního monomeru na mol ve vodě rozpustného polyaminů.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že nosným materiálem je gama-oxid hlinitý.