DE2605797B2

DE2605797B2 - Immobilisiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2605797B2
Application number: DE19762605797
Authority: DE
Inventors: Joseph Northbrook; Fusee Murray Campbell Hoffmann Estates; 111. Levy (V.St.A.)
Original assignee: UOP Ine, Des Piaines, 111. (V.St.A.)
Priority date: 1975-02-18
Filing date: 1976-02-13
Publication date: 1977-09-22
Also published as: ZA76871B; DK145104B; CS209424B2; YU37476A; AT363890B; DK145104C; PT64790A; PL102119B1; LU74379A1; DK63776A; JPS571988B2; NL7601580A; PT64790B; JPS51106785A; NO760511L; SE434064B; CA1058538A; EG11923A; FR2301533A1; IE42482L

Description

Es ist bekannt, daß Enzyme, die Proteinnatur haben und gewöhnlich wasserlöslich sind, biologische Katalysatoren umfassen, die dazu dienen, viele und unter-

schiedliche chemische Reaktionen zu regulieren, die in lebenden Organismen auftreten. Die Enzyme können auch isoliert und auf analytischen, medizinischen und industriellen Anwendungsgebieten verwendet werden. Beispielsweise finden sie Verwendung in industrieller Anwendung bei der Herstellung von Lebensmittelprodukteri, wie Käse oder Brot, und außerdem weiden sie bei der Herstellung alkoholischer ' Getränke verwendet. Einige spezielle Anwendungen in der Industrie sind beispielsweise die Verwendung von Enzymen zur Auftrennung von Aminosäuren, bei der Modifizierung von Penicillin unter Bildung verschiedener Substrate derselben, die Verwendung verschiedener Proteasen bei der Käseherstellung, beim Zartmachen von Fleisch, für Detergenspräparate, bei der Lederherstellung und als Veidauungshilfen, die Verwendung von Carbohydrasen bei der Stärkehydrolyse, bei der Rohrzuckerinversion, bei der Glukoscisomerisierung usw., die Verwendung von Nucleasen bei der Gerucheinstellung oder die Verwendung von Oxidasen für die Oxidationsverhinderung und Farbeinstellung von Nahrungsmitteln. Diese Verwendungen sowie viele andere sind in der Literatur ausführlich beschrieben.

Wie oben ausgeführt wurde, sind Enzyme, da sie gewöhnlich wasserlöslich und allgemein instabil und leicht deaktivierbar sind, auch schwierig aus den Lösungen, in welchen sie benützt werden, für eine nachfolgende Wiederverwendung zu isolieren, bzw. es ist schwierig, ihre katalytische Aktivität über relativ lange Zeiträume zu erhalten. Diese Schwierigkeiten führen natürlich zu erhöhten Kosten bei der Verwendung von Enzymen für gewerbliche Zwecke infolge des Erfordernisses, dieses Enzym häufig zu ersetzen, wobei ein solcher Ersatz gewöhnlich mit jeder Anwendungerforderlich ist. Um den hohen Kosten eines Ersatzes oder Austausches entgegenzuwirken, wurde vorgeschlagen, die Enzyme vor ihrer Verwendung zu immobilisieren bzw. unlöslich zu machen. Durch eine Immobilisierung bzw. Trägerfixierung der Enzyme

«5 durch verschiedene Systeme, die nachfolgend im einzelnen noch erläutert werden, ist es möglich, die Enzyme relativ zu stabilisieren und daher die Wiederverwendung des Enzyms zu ermöglichen, das sonst einer

Ltivierung lintel liegen ode ι in dem keaktionsme-^K' vMlorengelien würde. Solehe immobilisierten ^llUI11 irieerüxierten oder unlöslich gemachten Ln^lZW. können in verschiedenen Reaktorsystemen ver^yll1Ci ι werden wie in gepackten Säulen, geiührten ^VlT"it -.reaktoren usw., je nach der Natur des SubiMsd-uin benutzt wird. Im allgemeinen liefert Äobilisicrungdcr Enzyme eme günstigere oder

it" Umgebungsstabilität, ein Minimum an Aus- !^irCfrimblemen und Materialbehandlung sowie die 'Ähkeit die Aktivität des Enzyms selbst aulzu-

i°

^eVn ausgeführt wurde, sind verschiedene all- ^Le Methoden sowie zahlreiche Modifikationen f en beschrieben, durch welche die Immobilisie- »5 ^dClSe^ En ynen erreicht werden kann. Eine auge- ZcSl besteht darin, das Enzym auf einer h zu adsorbieren, wie beispielsweise.

ι r Γe Al

adsorbiert wird und Chymotrypsin auf wird. Eine andere allgemeine Me-

Olutaminsaurcpyruv-

S££S3^

ine intermolekulare Vernetzung ,ndu,.erenJa kovalent die Enzyme aneinander sowie an den festen Träger. Diese Methode ist beispielhalber durch die Verwendung von Glutardialdehyd oder B.sd.azobeiv -2,2'-disulfonsäure zur Bindung eines Enzyms, /ueinundei gebracht weiden. Die l'orengroße de.. I layers kann jedoch einen Durchmesser von etwa 1000 Λ nicht überschreiten. Im Hinblick aul diese schwache Bindung wird das Enzym oltmals leicht in Gegenwart von Losungendes zu behandelnden b>uiv stiates desorbiert. Außerdem kann das knzym weise oder sch. stark infolge des ,Fehlens einer ta. oder infolge einer N^ehsolwi, kuny ^w.^ Träger und den aktiven Stellen des Lnzym werden. ,. ,

Die Methode des Einschlusses der Enzyme η Gel· _{giUcl odc}, Polyniergeruste, etwa gemäß der DT-OS 1955 MK. hat den Nachteil, daß der Verbund schlechte mechanische Fest_lgke.t hat die be u. u Verwendung in Säulen mit kontinuierlichen Fließ sterner, zu einer Verdichtung führt, was seinersc ts eme Verstopfung de, Säule nach s.eh z.eh^ So κ Systeme unterliegen auch z.eml.ch weiten Vc.ande

lur den I ransporl des Substu

einer Reaktionsverzögerung führe., und d,e

g eines

c as Enzym

Sttancn angewendet werden, benützt _{d W)rd oftmaIs dazu} verwendet,

^ _d"_n Träger über ein bifunktionelles j Trag ^ ^^

' des Moleküls, wie beisp.els-

?räger gebunden wird. Diese Methode kann auchin. 5S den oben erwähnten Immob.l.s.erungsvc.ah.cn

ν JΛΒ"g^g _{Biml dcs E}„_zyms an den

«^_Γ"»^ι^_{Γ funkltooc}|_te Gruppen an den, En-

Sr^eSr^

Sfechen. Wenn beispielsweise ein Enzym direkt auf der Oberfläche eines Trägers adsorbiert wird, sind die

g reagieren auch mit einer g.o-

^ £>,. _{f unkti}Sneller Gruppen, wie eine.

ten und Lösungsmittel eiiiscliliel.lt unil sehr spezielle und kostspielige poröse Trager und umständliche mehrstufige Verfahren verwendet, die das Herstellungsverfahren für gewerbliche Zwecke unwirtsehaltlieli machen.

Nach dem Stand der Technik gibt es daher viele Methoden zur Immobilisierung von Enzymen, doch erfüllen diese in verschiedenerlei Minsicht nicht die Erfordernisse industrieller Anwendung. Wie nachfolgend noch im einzelnen diskutiert wird, umfaßt keine der bekannten Zusammensetzungen jene nach der vorliegenden Erfindung. Diese bestehen aus einem anorganischen porösen Träger, der ein polymeres Material natürlichen oder synthetischen Lirsprungs, das in situ aus einem Monomer oder vorgeformten Polymer gebildet wurde, enthält, wobei dieses polymere Material in den Poren des Trägers eingeschlossen und teilweise adsorbiert ist und funktionell am Polymergerüst hängende, sieh voi· dort aus crstrekkende Gruppen enthält. Das Enzym ist erfindungsgemäß teilweise an das Grundmaterial adsorbiert und auch kovalent an die aktiven Stellen an den Endabschnitten der am Polymergerüst hängenden Gruppen oder in der Nähe dieser Endabschnitte gebunden, so daß das Enzym Bewegungsfreiheit bekommt, welche es ihm erlaubt, seine maximale Aktivität auszuüben. Beispielsweise betrifft die US-PS 3 556945 trägerfixierte Enzyme, bei denen das Enzym direkt an einem anorganischen Träger, wie Glas, adsorbiert ist. Die US-PS 3 519538 befaßt sich mit ti ägerfixier ten Enzymen, bei denen die Enzyme chemisch über ein intermediäres Silankupplungsmittel an einen anorganischen Träger gebunden sind. In ähnlicher Weise benützt auch die US-PS 3 783 101 eine Organosilanzusammensctzung als Bindemittel, wobei das Enzym kovalent an einen Glasträger mit Hilfe eines Silanzwischcnbindemittels gebunden ist, der Siliciumanteil des Kupplungsmittel an den Träger gebunden ist, während der organische Anteil des Kupplungsmittels an das Enzym gebunden ist, und die Zusammensetzung ein Metalloxid auf der Oberfläche des Trägers zwischen dem Träger und dem Siliciumanteil des Kupplungsmittels enthält. In der US-PS 3 821083 ist der inerte Träger mit einem vorgeformten Polymer, wie Polyacrolcin, überzogen, an das ein Enzym gebunden ist. Nach den meisten Beispielen in dieser Patentschrift ist es jedoch erforderlich, zunächst die Zusammensetzung sauer zu hydrolisiercn, bevor das Enzym auf dem Polymer abgelagert wird. Ein anderer Stand der Technik, die US-PS 3 705084, beschreibt einen macroporösen Enzymreaktor, worin ein Enzym auf der Polymeroberfläche eines macroporösen Reaktorkernes adsorbiert und danach an seiner Stelle vernetzt wird. Durch Vernetzung der Enzyme auf der Polymeroberfläche nach ihrer Adsorption wird das Enzym teilweise weiter immobilisiert und kann nicht frei wie in seinem natürlichen Zustand als Katalysator wirken. Die Vernetzung von Enzymen vernetzt sie im Effekt miteinander und verhindert dadurch eine freie Bewegung des Enzyms und vermindert die Mobilität des Enzyms, welche ein notwendiges Erfordernis für maximale Aktivität ist.

Die Erfindung betrifft nun neue Zusammensetzungen, die trägerfixiertes immobilisiertes Enzym umfassen. Spezieller befaßt sich die Erfindung mit neuen Zusammensetzungen, die einen immobilisierten Enzymverbund umfassen, der ein organisch-anorganisches Grundmaterial enthält, welches seinerseits aus einem a in >i gallischen porösen Träge ι material besieht, das ein organisches Polymcrmatci ial enthält, welches in situ aus einem Monomer, hydrolysis ten Polymer odei vorgeformten Polymer synthetischen ode! natür-

liehen Ursprungs durch Umsetzung mit einem geeignete reaktive Reste enthaltenden bifunktionellen Monomer gebildet wurde. Dieses Polyincrniaterial ist in ilen Poren des oben erwähnten T." ägei materials eingeschlossen und adsorbiert imd besitzt außerdem am

ίο Polymergerüst hängende und sich son diesem aus eislreckende Gruppen mit funktioneilen Resten, wobei die i'unklioiiellen Reste in ί\κ:η Endbereiciicn dieser Gruppen oder nahe diesen Endbereichen liegen. Ein Enzym ist kovalent an diese Gruppen mit lunktionelle.il Resten gebunden und außerdem teilweise an dem organisch-anorganischen Grundmaterial adsorbiert. Wie oben ausgeführt wurde, kann die Verwendung von Enzymen in analytischen, medizinischen oder industriellen Anwendungsbereichen stark verbessert werden, wenn diese Enzyme sich in einem immobilisierten oder trägerfixierten Zustand befinden, d. h.. wenn diese Enzyme sich durch Kombination mit anderen festen Materialien selbst in einem solchen Zustand befinden, indem sie nicht wasserlöslich sind und daher wiederholt verwendet werden können, wobei die katalytischc Aktivität des Enzyms erhalten bleibt. Um in einem immobilisierten Zustand vorzuliegen, müssen die Enzyme in irgendeiner Weise an einen wasserunlöslichen Träger gebunden werden, so daß sie dadurch in einem nichtwasserlöslichen Zustand industriell verwendet werden können.

Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neue Zusammensetzungen zu erhalten, in welchen Enzyme in einem immobilisierten oder trägerfixierten

Zustand vorliegen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Zusammensetzungen zu erhalten, in welchen ein Enzym an einem organisch-anorganischen Grundmaterial adsorbiert und gleichzeitig an funktionalisierle, an dem Grundmaterial hängende Gruppen kovalent gebunden ist. wobei dieses Grundmaterial seinerseits in den Poren des anorganischen porösen Trägermaterials adsorbiert und eingeschlossen ist.

Nach einem Aspekt betrifft eine Ausführungsform dieser Erfindung einen immobilisierten Enzymverbund, und dieser umfaßt ein kombiniertes organischanorganisches Grundmaterial aus einem anorganischen porösen Träger, der in den Poren des Trägers adsorbiert und eingeschlossen ein organisches PoIymermaterial enthält, wobei das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit funktioneilen Resten enthält, sowie ein Enzym, das an das Grundmaterial adsorbiert und an die funktioneilen Reste der an dem organischen Polymermaterial hängenden Gruppen in deren Endbereichen oder in der Nähe derselben kovalent gebunden ist.

Eine spezielle Ausführungsform dieser Erfindung betrifft einen immobilisierten Enzymverbund, der ein organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem porösen Kieselsäure-Toncrdeträger mit niedrigem Schüttgewicht und mit relativ großer Oberfläche, das auch anorganische Zusatzstoffe enthalten kann, sowie ein in situ hergestelltes Tetraäthylenpenlamin-Glutaraldehyd-Polymeimaterial, das in den Poren des Kieselsäure-Tonerdeträgers adsorbiert und eingeschlossen ist, und schließlich ein Enzym, das Giueoamylase umfaßt, welche kovalent an die an dem Polymermaterial hängenden Glutaraldehydgiuppen im

Endbereieh dieser Gruppen oder nahe derselben gebunden und außerdem teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert ist.

Andere Zielsetzungen und Ausführungsformen finden sich in der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung.

Wie oben ausgeführt, befaßt sich die vorliegende Erfindung mit immobilisierten Enzymverbundpräparaten, die ein kombiniertes organisch-anorganisches Grundmaterial aus einem anorganischen porösen Trägermaterial mit in den Poren des anorganischen porösen Trägermaterials adsorbiertem und eingeschlossenem organischen Polymermaterial umfassen. Außerdem enthält das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit an diese Gruppen in ihrem Endbereich oder nahe demselben gebundenen Enzym, und außerdem ist dieses Enzym auch teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert. Im Gegensatz zu den Zusammensetzungen, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik enthalten, können die Zusammensetzungen nach der Erfindung unter Verwendung relativ billiger Reaktanten sowie unter Benützung einfacherer Stufen in dem Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung gewonnen werden. Außerdem ist die mechanische Festigkeit und die Stabilität der Enzymverbundpräparate nach der vorliegenden Erfindung größer als diejenige, die immobilisierte Enzyme nach dem Stand der Technik besaßen. Daher ist leicht ersichtlich, daß die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung wirtschaftliche Vorteile besitzen, die sie für industrielle Anwendung brauchbar machen.

Die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung kann in relativ einfacher Weise hergestellt werden. Bei der bevorzugten Hcrstcllungsmcthodc wird das anorganische poröse Trägermaterial mit einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung, eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines PoIymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers behandelt, wonach die nichtadsorbierte Lösung in an sich bekannter Weise entfernt wird, wie durch Ablaufcnlassen. Es können auch andere billige organische Lösungsmittel, wie Aceton, Tetrahydrofuran oder dergleichen, als Träger für die oben erwähnten Monomere oder Polymere verwendet werden. Nach der Entfernung der nichtadsorbierten Lösung wird dann der feuchte poröse Träger mit einem relativ großen Überschuß von 5 bis 20 Mol.% eines zweiten bifunktionellen Monomers behandelt, in welchem die reaktiven Gruppen vorzugsweise durch eine Kette mit 4 bis K) Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind, wobei dieses zweite bifunktionelle Monomer ebenfalls in einer wäßrigen Lösung zugegeben wird. Dabei bildet sich ein polymeres Grundmaterial, das in den Poren des Trägers adsorbiert und eingeschlossen wird und von dem aus sich am Polymergrundgenist hängende Gruppen ties zweiten Monomers erst recken. Diese Gruppen enthalten funktionell«; Reste infolge der Tatsache, daß eine überschüssige Menge des zweiten bifunktionellen Monomeis bei der Behandlung des Trägers verwendet wurde. Die uinimgeset/.tcn i'imktioncllcn Reste sind dann für kovalentc Bindungen an das Hnzyin verfügbar, das zu «lern resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zugesetzt wird, und zwar wiederum gewöhnlich in einer wäßrigen Lösung. Nach Entfernung der unumgeselz ten Materialien, wie «lurch Behandlung, iluich Waschen usw.. ist «Ins Enzym nicht ihm kovnlcnt ;in ilkam Polymer hängenden Gruppen mit funktionellen Resten in deren Endbereichen oder nahe derselben gebunden, sondern ist teilweise auch an das Grundmaterial adsorbiert. Es ist daher leicht ersichtlich, daß das gesamte lmmobilisicrungsverfahren in einfacher und billiger Weise unter Benützung wäßriger bzw. billiger Lösungsmittelmedien durchgeführt werden kann, wobei das Verfahren über einen Temperaturunterschied durchgeführt wird, der im Bereich von unterhalb Umgebungstemperatur (etwa 5° C) bis zu erhöhten Temperaturen von etwa 60° C liegen kann und vorzugsweise bei Umgebungstemperatur (etwa 20 bis 25° C) liegt. Dieses Verfahren wird unter Benützung einer minimalen Zahl von Verfahrensstufen durchgeführt und gestattet außerdem eine leichte Entfernung der überschüssigen Reaktionspartner und der fertigen Zusammensetzung.

Viele der anorganischen Träger, die im Stand eier Technik beschrieben sind, sind Materialien mit »kon-

ao trollierter Porengrößc«, wie Glas, Tonerde usw., mit einem Porendurchmesser von 500 bis 700 A für etwa 96% des Materials und mit einem maximalen Porendurchmesser von 1000 A, einer Oberfläche von 40 bis 70 nr/g und Teilchengrößen von 40 bis 80 Ma-

»5 sehen (US-Siebreihe). Außerdem können diese Träger mit Metalloxiden, wie Zirkonoxid und Titanoxid, überzogen sein, um größere Stabilität zu erreichen. Im Gegensatz zu diesen Trägern liegt es im Erfindungsgedanken, daß die anorganischen porösen Träger, die hier benützt werden, Materialien sind, die Porendurchmesser im Bereich von 100 A bis zu 55 000 A besitzen, wobei so viel wie 25 bis 60% des porösen Trägermaterial Poren mit Durchmessern oberhalb 20000 A besitzen und die Oberfläche im Bereich von 150 bis 200 nv/g liegt. Die Teilchengröße kann auch über einen weiten Bereich von 10 bis 2C Maschen bis zu einem feinen Pulver variieren, wobei diese Teilchengröße von dem speziellen System abhängt, in welchem sie verwendet werden. Die poröser Trägcrmaterialicn können auch mit verschiedener Oxiden des oben beschriebenen Typs überzogen werden, oder sie können darin eingelagert verschiedene andere anorganische Materialien enthalten, wie Borphosphat usw., wobei diese anorganischen Matcrialici dem Trägermaterial spezielle Eigenschaften verlci hen. Eine besonders brauchbare Form vt>n Trägcrma terial besteht aus einem Keramikkörper, der den Po rositätstyp haben kann, welcher hier für Matcrialici nach der vorliegenden Erfindung beschrieben ist, ode er kann honigwabenartig aufgebaut sein mit verbin denden Maemkana'leti in «lern gesamten Körper, wo bei solche Materialien allgemein als M«>nolithe be kannt sind und mit verschiedenen Typen poröse Tonerde, Zirkonoxid usw. beschichtet sein können Die Verwendung solcher Trüget typen hat den beson deren Vorteil, «laß sic «lon freien Fluß selbst hochvis koscrSubstrate gestattet, die oftmals industriellen cn /ymkatalysierten Reaktionen unterzogen werden.

Die anorganischen porösen Trügei materialien, di als eine Komponente des kombinierten oiganisch-an organischen Gnnulmalcrials verwendet werden, siiv beispielsweise bestimmte Metalloxide, wie Toncril und besonders y-Tonculc, Kicselsiuiic, /,irkonoxi' oder Gemische der Metalloxide, wie Kieselsäure Tonerde, Kieselsiiurc-Zirkonoxid, Kkselsüute-Mii gnesia. Kiesclsüuie-Zirkonoxkl-Tonerdc usw., oili y-Tonerde, die andere anorganische Vcrbindungci wie Boiphosphat usw.. enthüll. Keramikkörper usv

sowie Kombinationen der obigen Materialien und eines der Materialien, die als Überzug für ein anderes Material dienen kann, welches selbst den Träger darstellt.

Die Polymermaterialien, die in situ in solcher Weise gebildet weiden, daß das Polymermaterial in den Poren des anorganischen Trägers des oben beschriebenen Typs teilweise adsorbiert und teilweise eingeschlossen ist, kann nach den oben beschriebenen allgemeinen Methoden hergestellt werden, d. h. indem zunächst eine Lösung mit 2 bis 25% eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers adsorbiert wird, wobei das Monomer oder Polymer ursprünglich synthetisch oder natürlich vorkommend ist und vorzugsweise in Wasser oder anderen Lösungsmitteln löslich ist, welche letztere gegenüber den anschließend verwendeten Reaktionen inert sind. Wie oben ausgeführt wurde, liegt es innerhalb des Erfindungsgedankens, daß ein zweites bifunktionelles Monomer dann in ähnlicher Weise zugesetzt wird, um durch Umsetzung mit dem auf dem anorganischen Träger adsorbierten ursprünglichen Zusatzstoff ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu bilden. Die funktionellen Gruppen, die auf dem bifunktionellen Monomer vorliegen, umfassen bekannte reaktive Reste, wie Amino-, Hydroxyl-, Carboxy-, Thiol-, Carbonyl- und ähnliche Reste. Wie bereits oben ausgeführt wurde, sind die reaktiven Gruppen der bifunktionellen Verbindungen vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise durch Ketten voneinander getrennt, die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten. Die reaktiven Reste sind in der Lage, sich kovalent mit den anfänglichen Zusatzstoffen und anschließend, nach dem Auswaschen unurngesetzter Materialien, mit dem Enzym zu verbinden, das in der anschließenden Stufe zugegeben wird, wobei das Enzym dann kovalent an die funktioneile Gruppe im Endbereich oder nahe dem Feldbereich der funktionellen Kette gebunden ist und gleichzeitig auch an das Grundmaterial adsorbiert ist. Nach Zugabe des Enzyms zu dieser Zusammensetzung bildet sich ein relativ stabiles trägerfixiertes Enzym, das hohe Aktivität und hohe Stabilität besitzt. Außerdem besitzt die Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung auch sehr vielseitige Verwendbarkeit zusätzlich zu den anderen oben aufgezählten Vorteilen, da man sie verwenden kann, um trägerfixiertc Enzyme in Abwesenheit eines anorganischen Trägers, der in sauren oder alkalischen Medien löslich ist, hei zustellen. Wie nachfolgend im einzelnen aufgeführt wird, behalten je nach den verwendeten Reaktionspaiinern die trägerfixierten Enzyme ihre Stabilität in solchen Medien, wenn sie in Kombination mit dem anorganischen Träger nach ilen bekannten Verfahren hergestellt wird. Durch diese Eigenschaften ist es möglich, die Verwendungen dieser tiäg'Jifixierten Enzyme auszuweiten.

Spezielle Beispiele bi- oiler polyfunklioncller Monomere, vom Polymerhydrolysuten oder vorgeformten Polymeren, 'ilie anfangs auf dem anorganischen Träger adsorbiert weiden können, sind etwa wasserlösliche Polyamine., wie Äthylendiamin, Diälhylentriamin, Triäthylcnlctramin, Tetiaäthylenpcnlamin, Pcntaäthylcnhexaniin, I lexamethyleiuliamin, Polyäthylcnimin usw., wasserunlösliche Polyamine, wie Methylen-(licyclohexylamin, Methylendianilin usw., natürliche und synthetische lcilhydrolysicrte Polymere und vorgcl'oimlc Polymere, wie Nylon, Kollagen, Polyacrolein, Polymaleinsäureanhydrid, Alginsäure, Kaseinhydrolysat. Gelatine usw. Einige spezielle Beispiele bil'unktionclicr Zwischenmaterialien, die zu den oben aufgezählten Produkten zugesetzt weiden können, um ein organisch-anorganisches Grundmaterial zu produzieren, und die die oben aufgeführten notwendigen Eigenschaften besitzen, sind etwa Verbindungen, wie Glutardialdehyd, Adipoylchlorid, Sebacoylchlorid, Toluoldiisouyanat, Hexamethylendiisocyanat usw. ίο Wenn ein Polyäthylenamin des oben beschriebenen Typs mit Glutardialdehyd in Abwesenheit eines anorganischen porösen Trägers umgesetzt wird, bekommt man ein in wäßriger Säure lösliches Material, während bei Umsetzung von Polyäthylenamin mit einem Diisocyanat oder Acylhalogenid ein wasserunlösliches Produkt erhalten wird. Umgekehrt, wenn ein Reaktionskomplex ohne den anorganischen Träger freie Carboxylgruppen enthält, bekommt man einen alkalisch löslichen Komplex. Infolge des großen Überao Schusses an intermediären bifunktionellen Molekülen mit Abstandshalterfunktion, die verwendet werden, enthält das Polymergrundmaterial, das gebildet wird, daran hängende Gruppen, die die Abstandshaltcrmoleküle umfassen, wobei sich diese Moleküle von dem Grundmaterial aus erstrecken und reaktive Reste haben, die in ihren Endbereichen oder nahe diesen vorliegen und in der Lage sind, mit dem Enzym zu reagieren und dieses über kovalcntc Bindungen an die Abstandshaltermoleküle zu binden. Außerdem wird das Enzym konkurrierend auch teilweise an dem Grundmaterial adsorbiert, wenn es zugegeben wird, nachdem die unumgesetzten Reagentien durch Waschen von dem organisch-anorganischen Grundmaterial entfernt wurden. Bindung des Enzyms lediglich an das organische Grundmaterial beeinflußt gewöhnlich nicht die Abhängigkeit der Löslichkeit des Aggregats von dem pH-Wert der Lösung, doch wenn der anorganische Träger entsprechend den obigen Angaben eingeschlossen wird, zeigt die Gesamtzusammcnsetzung bzw. das trägerfixierte Enzym hohe Stabilität über einen relativ weiten pH-Bereich von 3 bis 9, wobei die Stabilität natürlich auch eine Funktion der optimalen pH-Eigenschaften des verwendeten speziellen Enzyms und des verwendeten anorganischen Trägers ist. Daher ist leicht ersichtlich, daß ein geeignetes organisch-anorganisches Grundmaterial, das in vielen Situationen anwendbar ist, mit dem Trägermaterial gebildet wird, indem man irgendeine der oben beschriebenen Materialtypen, die dem Fachmann bckannl sind, adsorbiert und dann mit irgendeinem bifunktionellen Molekül, das dem Fachmann ebenfalls bekannt ist und zweckmäßige funktionellc Reste enthält, behandelt, um es mit dem ursprünglichen Zusatzstoff umzusetzen, vorausgesetzt, daß ein genügend großer Überschuß ties bifunklionellen Moleküls verwendet wird, um an dem Polymer hängende Gruppen zu liefern, die in der Lage sind, anschließend mit dem zu immobilisierenden Enzym zu reagieren. Durch Benutzung dieser funktionellen. an dem Polymer haugenden Gruppen als Bindungsstellen für die Enzyme liekommeiulie Enzyme eine größere Mobilität, so ilnt' die katalytisch^· Aktivität des Enzyms über eine relais längere Zeit auf einem hohen Stand bleibt, als diw möglich ist, wenn das Enzym nach irgendwelchen an deren Methoden immobilisiert wurde, wie durch '^;'" schluß in ein Gelgittci, Adsorption auf einer fester Oberfläche oder Vernetzung des Enzyms mit 1 luft bifunktionelki Reagentien. Selbstverständlich erpe-

ben jedoch nicht alle Rezepturen gleichwertige Ergebnisse hinsichtlich der Stabilität oder Aktivität.

Beispiele von Enzymen, die durch eine kovalunte Bindungsreaktion immobilisiert werden können und die eine Aminogruppe enthalten, welche mit einem Aldehydrest oder Isocyanatorest der an dem Polymer hängenden Gruppe reagieren kann, wahrend das Polymermaterial in den Poren eines porösen Trägermaterial eingeschlossen und adsorbiert ist, sind beispielsweise Trypsin, Papain, Hexokinase, ß-Galactosidase, Ficin, Bromelain, Milchsäuredehydrogenase, Glucoaniylase, Chymotrypsin, Pronase, Acylasc, Invertase, Amylase, Gluyoseoxidase, Pepsin, Rennin, Pilzproteasc usw. Im allgemeinen kann jedes Enzym verwendet werden, dessen aktive Stelle nicht in die kovalente Bindung eingeschlossen ist. Obwohl die obige Diskussion um am Polymermaterial hängende Gruppen kreiste, die als einen funktioneilen Rest eine Aldehyd- oder Isocyanatogruppe enthalten, liegt es auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß die am Polymer hängende Gruppe andere funktioneile Reste enthalten kann, die mit Carboxy-, Sulfhydroy- oder anderen Resten, die gewöhnlich in Enzymen vorhanden sind, reagieren kann. Die kovalente Bindung von Enzymen, die diese anderen Reste enthalten, mit anderen am Polymer hängenden Gruppen, erfolgt jedoch nicht notwendigerweise mit äquivalenten Ergebnissen und kann auch erheblich größere Kosten bei der Herstellung der Zwischenprodukte einschließen. Die obige Auflistung der porösen festen Träger, Monomere, Hydrolysate, Polymere und Enzyme ist lediglich repräsentativ für die verschiedenen Verbindungsklassen, die verwendet werden können, doch ist die vorliegende Erfindung nicht notwendigerweise hierauf beschränkt.

Die Herstellung der Zusammensetzungen nach der voi'liegenden Erfindung erfolgt bevorzugt ansatzweise, wie bereits im einzelnen beschrieben wurde, obwohl es innerhalb des Erfindungsgedankens liegt, das fertige zusammengesetzte Produkt gegebenenfalls auch in kontinuierlicher Betriebsweise herzustellen. Wenn ein kontinuierliches Verfahren angewendet wird, wird eine Menge des porösen festen Trägermaterial in eine geeignete Apparatur, gewöhnlich eine Säule, gegeben. Das poröse feste Trägermaterial kann in irgendeiner erwünschten Form vorliegen, wie als Pulver, Pellets, Monolithe und dergleichen, und wird in die Säule eingeführt, wonach eine vorzugsweise wäßrige Lösung, beispielsweise eines polyfunktionellen Amins, in Berührung mit dem porösen Träger gebracht wird, bis letzterer mit der Aminlösung gesättigt ist, und ilen Überschuß läßt man dann ablaufen. Ein Abstandshalter- oder intermediäres bifunktionelles Molekül, wie Glutardialdehyd, wird dann in Berührung mit dem gesättigten Träger gebracht. Die Bildung des polymeren Giundmateiials erfolgt somit in einem wäßrigen System, wobei die Umsetzung während einer Zeit erfolgt, die im Bereich von 1 bis 10 Stunden liegen kann, gewöhnlich aber von kurzer Dauer ist. Nach Entfernung des überschüssigen GIutardialdelvyds durch Ablaufenlassen und Auswaschen wasserlöslicher und unumgesetzter Materialien, was im Falle eines Polyamids vorzugsweise mit einer PuI-ferlösungmit einem pH-Wert von etwa 4 erfolgt, wird eine wäßrige Lösung des Enzyms in Kontakt mit dem Träger gebracht oder durch die Säule im Kreislauf geführt, und diese Stufe bewirkt eine kovalente Bindung des Enzyms an die endständigen Aldehydgi lippen der an dem Polymer hängenden Moleküle mit funktioneilen Resten, welche sich von dem Grundmaterial aus erstrecken. Dies geschieht solange, bis es keine weitere physikalische Adsorption und/oder kovalente Bindung des Enzyms an das organisch-anorganische Grundmaterial und die daran hängenden Moleküle mehr gibt. Das überschüssige Enzym wird in dem Auslauf nach Ablaufenlassen und Waschen der Säule zurückgewonnen. Die Säule ist jetzt fertig für die Ver-Wendung in chemischen Reaktionen, worin die katalytisehe Wirkung des Enzyms auftritt. Die Verfahren werden meistens in Zeit-, Temperatur- und Konzentrationsparametern durchgeführt, wie sie oben im Zusammenhang mit dem Ansatzverfahren beschrieben wurden, und führen zu vergleichbaren immobilisierten Enzymkomplexen. Es liegt auch innerhalb des Erfindungsgedankens, daß mit geeigneten Modifikationen des pH-Werts und der Temperatur, die für den Fachmann auf der Hand liegen, das Verfahren für eine große Vielzahl anorganischer poröser Träger, polymerbildendcr Reaktanten und Enzyme angewendet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In diesem Beispiel wurden 2 g einer porösen Kieselsäurc-Tonerdemasse mit darin eingelagertem Borphosphat, mit einer Teilchengröße von 40 bis 80 Masehen (US-Siebreihc), mit einem Porendurchmesscr im Bereich von etwa 100 bis etwa 55 000 A und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 nr/g als der anorganische Träger für die neue Zusammensetzung nach der Erfindung verwendet. Dieser Träger wurde bei einer Temperatur von etwa 260° C (500° F)calciniert, um darin enthaltene adsorbierte Feuchtigkeit zu entfernen. Danach wurde der Träger mit 55 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung von Tetraäthylcnpentamin bei Umgebungstemperatur während 1 Stunde im Vakuum behandelt, um die Eindringung der Lösung in die Poren des Trägers zu erleichtern. Die überschüssige nichtadsorbierte Lösung wurde dann abgegossen, wobei etwa 25% des Tctraäthylenpentamins in den Poren des Trägers adsorbiert waren. Danach wurde der feuchte Träger mit 25 ml einer 5%igcn wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd bei Umgebungstemperatur behandelt, und es fand eine fast unmittelbare Reaktion unter Bildung eines unlöslichen Reaktionsproduktes auf der Oberfläche und in den Porendes Trägers statt. Die überschüssige Glutardialdehydlösung wurde dann abgegossen und der organisch-anorganische Komplex gewaschen, um unuingesetzte und unadsorbiei te Reaktanten zu entfernen wobei das Waschen zunächst mit Wasser und dam mit einer 0,()2molaren Acetatpuffei lösung mit einen pH-Wert von 4,2 erfolgte und das Waschen auf eine Temperatur von 45" C durchgeführt wurde. Danacl wurde eine Enzymlösung mit einem Gehalt von etwi 200 mgGlucoamylasc je 25 ml Wasser zugesetzt, um man ließ diese Lösung mit tier Zusammensetzung be Umgebungstemperatur während 1 Stunde reagieren Am linde dieser I stündigen Periode wurde die über schüssige Cilucoiiinyliiselösung abgegossen, und da triigerfixierte Enzym wurde mit Wasser gewascher um ungebundendes und/oder uivadsorbicrtcs En/.yr zu entfernen. Die Zusammensetzung wurde dann 2 Stunden mit einer Acetatpufferlösung, ähnlieh dt oben beschriebenen, ausgelaugt. Die Menge anadsoi

bicrtcm und/oder kovalent gebundenem Enzym wurde durch Dumas-Mikrogaschromatographieanalyscn vor und nach der Zugabe des Enzyms bestimmt. Die Aktivität des trägerfixierten Enzyms wurde dann an Hand der Glucosemengc bestimmt, die unier Verwendung einer 30%igcn verdünnten Stärkelösung als Substrat bei pH 4,2 und 60° C und unter Verwendung des Worthington's Glucostatverfahrens zur Analyse der Glucose gebildet wurde, wobei letzteres Verfahren als das zuverlässigere Verfahren zur Bestimmung der Brauchbarkeit des trägerfixierten Enzyms angesehen wird. Eine Aktivität von 28 Einheiten/Gramm Träger mit einer Enzymbeladung von 29 mg/g Träger wurde nach diesem Verfahren erhalten (eine Einheit bedeutet die Produktion von 1 g Glucose'Std., bei 60° C gemäß den Testbestimmungen). Es sei bemerkt, daß trotz der bekannten Löslichkeit bei pH 4,2 des trägerfixierten Enzyms bei Herstellung in Abwesenheit eines anorganischen Trägers während der Auslaugung mit einer Pufferlösung von pH 4,2 ein vernachlässigbarer Enzymverlust aus dem kombinierten anorganisch-organischen Komplex auftrat. Dies wurde durch Analyse des Auslaufs aus der Behandlung demonstriert.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wurde das Verfahren des Beispiels 1 mit der Ausnahme wiederholt, daß der anorganische poröse Träger eine Teilchengröße von 10 bis 30 Maschen besaß. Die Kieselsäure-Tonerdemasse mit einem Gehalt an darin eingelagertem Borphosphat wurde mit Tetraäthylenpentamin, Glutardialdchyd und Glucoamylasc in ähnlicher Weise wie oben behandelt. Man erhielt einen aktiven immobilisierten Enzymkomplex, jedoch mit verminderter Aktivität, wahrscheinlich wegen eines Diffusionsproblems durch die größere Teilchengröße der Masse.

Beispiel 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 2 g einer Kiesclsäurc-Tonerdemassc, die die gleichen physikalischen Eigenschaften der Teilchengröße, des Porendurchmcsscrs und der Oberfläche wie in Beispiel 1 besaß, mit einer Acctonlösung von Tetraäthylenpentamin behandelt, und anschließend erfolgte die Behandlung mit einer Tolyldiisocyanatlösung auch in Aceton statt der wäßrigen Lösung von Glutardialdchyd. Nach dem Abgießen der überschüssigen Diisoeyanatlösung und nach Waschen mit Wasser wurde der organisch-anorganische Komplex weiter mit einer wäßrigen Glueoamylaselösung behandelt. Wie in Beispiel 1, umfaßte das fertige Produkt einen aktiven, vollständig unlöslichen Unzymkomplcx.

Beispiel 4

Um zu erläutern, daß verschiedene Konzentrationen von Lösungen verwendet werden können, um das erwünschte Produkt herzustellen, wurde das obige Beispiel I mit der Ausnahme wiederholt, daß höher konzentriere Lösungen der verschiedenen Rcagcntien verwendet wurden. Beispielsweise wurden 2 g ei inn Kiesclsäurc-Tonerdcmasse von K) bis 30 Maschen mit 25 ml einer 20%igenTctraiilhylenpentaininlösung behandelt, und nach dein Abgießen wurden 50 ml einer 25'/f.igeniilutaidialdchyiUösungzugesetzt. Dieser Komplex wurde nach dem Waschen dann mit finer wäßrigen Lösung von Glucoamylasc behandelt, um ein immobilisiertes tiiiueifixiertes linzym hcr/uMel len, das eine Aktivität von etwa 12 Einheiten/Gramm, bezogen auf den Glucostattcst, besaß.

Beispiel 5

Zu einer Kieselsäure-Tonerdemasse aus 2 g Teilchen mit K) bis 30 Maschen wurden 25 ml einer 5%igen wäßrigen, teilhydrolysiertcn Kollagenlösung zugegeben, die anstelle des Tetraäthylenpentamins verwendet wurde. Nach dein Abgießen und Behan-

dein mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial gewaschen und dann mit einer Glucoamylasclösung behandelt. Die fertige Zusammensetzung wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 durch Dekantieren, Waschen, Auslaugen

mit einer gepufferten Lösung (pH 4,2) behandelt, um ein immobilisiertes trägerfixiertes Enzym zu ergeben, das eine Aktivität von etwa 10 Einheiten/Gramm besaß.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde eine Kieselsäure-Tonerdemasse mit einer Teilchengröße von 10 bis 30 Maschen, einem Porendurchmesser im Bereich von etwa

a₅ 100 bis etwa 55000 A und mit einer Oberfläche von etwa 150 bis 200 nr/g durch Zugabe von Tetraäthylenpentamin in einer l%igen teilhydrolysiertcn wäßrigen Kollagcnlösung behandelt, wobei das Kollagen als zusätzliches Bindemittel benutzt wurde. Nach dem Ablaufcnlassen und Umsetzen mit Glutardialdehyd wurde das organisch-anorganische Grundmaterial dann mit einer Glucoamylasclösung nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 1 behandelt, um ein aktives trägerfixiertes Enzym herzustellen.

Beispiel 7

Um zu erläutern, daß verschiedene Enzyme bei der Herstellung der erwünschten Zusammensetzungen verwendet werden können, wurde eine Kieselsäure-Tonerdemassc, die darin eingelagert Borphosphat enthielt, mit einer Tctraäthylenpcntaminlösung behandelt, dekantiert und gewaschen, und dann wurde eine Glutardialdchydlösung zugesetzt, und die resultierende Zusammensetzung wurde nun mit einer wäß-

rigen Lactaselösung behandelt. Dies ergab ein aktives trägerfixiertes Enzym. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um Enzyme, wie Proteasen, GIucoseisomerasen und Glucoseoxidasen, zu binden und aktive trägerfixierte Enzyme zu bekommen.

Heispiel 8

In diesem Beispiel enthielt eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm 14,2 g eines aktiven trägci fixierten l.inzyins, das aus Glueoamylase hcrgc-

stellt worden war. welche an einen porösen Kiesclsäurc-Tonordcträgci von 10 bis 30 Maschen mit darin eingelagertem B01 phosphat gebunden war, wobei das Irägcrfixicrtc Hnzym in ähnlicher Weise wie in Beispiel I hergestellt worden war. Die Säule wurde kon·

6» tinuicilich während 30 Tagen bei einer Temperatur von 45" C verwendet, um eine wäßrige 30%ige verdünnte Stärkelösung/u hydrolysieren, die auf pll 4.2 gepuffert worden war. Der Auslauf wurde hinsichtlich der Glucoscproiluktion unter Verwendung des

f>5 Woithington-GliiLOstatVerfahrens analysiert. Hs wiirilc gefunden, daß es während dieses Zeitraumes keinen erkennbaren Verlust an linzyinaktivitiit gab und daß der IWcntsatz Ulm I Innviindlung von Stärke

in Glucose bei diesel Temperatur und hei einer IlieB-gesehwindigkeit von etwa 150 ml/h (>2% betrug.

Beispiel 9

Um die Tatsache zu erläutern, daß verschiedene Substrate oderTräger benutzt werden können, um die erwünschten Zusammensetzungen herzustellen, wurde ein mit Tonerde überzogener Monolith, der aus einem honigwabenartigen Keramikkörper mit verbindenden Macrokanälen bestand, in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 behandelt, d. h. der Monolith wurde mit Lösungen von Tetraäthylenpentamin, Glutardialdehyd und einem Glucoamylaseenzym behandelt, wobei die Behandlung mit einem Stufenverfahren erfolgte, das das oben beschriebene Dekantieren, Waschen und Auslaugen umfaßte. Der ursprüngliche Keramik-monolith besaß ein Trockengewicht von 256 g, wovon 13% aus Tonerdeüberzug bestanden. Das fertige immobilisierte trägerfixierte Enzym wurde zu einer Säule in einer Glasröhre mit einem Innendurchmesser von 70 mm gemacht, um kontinuierlich mit Hilfe einer geeigneten Pumpapparatur in einem temperaturkontroUicrten Behälter arbeiten zu können, wobei der Behälter auf einer Temperatur von 45° C gehalten wurde. Während einer 40tägigen Periode kontinuierlicher Benutzung für die Hydrolyse einer 3()%igen gepufferten verdünnten Stärkelösung fand man. daß nur etwa 3% der ursprünglichen Aktivität des trägerfixierten Enzyms verlorengingen, während eine Fließgeschwindigkeit von etwa 85 ml/h aufrechterhalten wurde. Außerdem wurde gefunden, daß während der 4()tägigen Periode etwa 80% der Stärke in Glucose umgewandelt wurden. l^!ni die Eigenschaften des Sysiems weiter zu studieren, wurden anschließend Veränderungen der Fließgeschwindigkeit vorgenommen, wobei gefunden wurde,' daß es bei einer Fließge-

sehwindigl.eit von etwa 38 ml/h möglich war, eine Umwandlung im Bereich von 92 bis 93% der Stärke in Glucose zu bekommen. Die relativ lange Zeit, während der dieses Enzym verwendet wurde, um Stärke in Glucose umzuwandeln, ohne daß ein wesentlicher

ίο Verlust an Enzymaktivität entweder durch Desorption oder Deaktivierung auftrat, zeigte die lange Lebensdauer des Katalysators.

Beispiel 10

In diesem Beispiel wurde ein Monolithtyp von trägerfixiertem Enzym in einer Säule ähnlich wie in Beispiel 9 hergestellt, wobei die Ausnahme darin bestand, daß das Enzym, das zur Herstellung des Komplexes verwendet wurde, Lactase statt Glucoamylasc war. Das trägerfixierte Enzym wurde hinsichtlich der Stabilität unter kontinuierlichem Fluß geprüft, wobei die Temperatur während 29 Tagen auf 37° C gehalten wurde. Es wurde wiederum gefunden, daß kein merklicher Verlust an Aktivität des immobilisierten trägerfixierten Enzyms eintrat. Dieses immobilisierte Enzym wurde bei der Behandlung einer 5%igen Lactoselösung verwendet, die auf pH 4,2 gepuffert worden war, wobei die Lactoselösung der Säule mit einer Geschwindigkeit von 54 ml/h zugeführt wurde. Während der 29tägigen Periode wurde gefunden, daß es eine etwa 35%igc Umwandlung von Lactose in Glucose und Galactose ergab.

Claims

Patentansprüche:

1. Immobilisiertes tiägerfixiertes Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem kombinierten organisch-anorganischen Grundmaterial aus einem unorganischen porösen Träger mit einem in dessen Poren adsorbierten und eingeschlossenen organischen Polymermaterial, wobei das Polymermaterial daran hängende Gruppen mit funktionellen Resten enthält, und einem an das Grundmaterial adsorbierten und kovalent an die funktioneilen Reste der an dem organischen Polymermaterial hängenden Gruppen in deren Endbereichen oder nahe derselben gebundenen Enzym besteht.

2. Immobilisiertes tiägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Polymermaterial in situ aus einem Monomer, einem hydrolysieren Polymer oder einem Polymer natürlichen oder synthetischen Ursprungs durch Umsetzung mit einem bifunktionellen reaktiven Monomer gewonnen wurde.

3. Immobilisiertes tiägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische poröse Trägermaterial y-Tonerde oder Kieselsäure-Tonerde, besonders Borphosphat enthaltende Kieselsäure-Tonerde, oder ein mit poröser Tonerde überzogener honigwabenartiger Keramikkörper mit verbindenden Macrokanälen ist.

4. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als organisches Polymermaterial das Reaktionsprodukt van Polyäthylenimin mit Glutardialdehyd, vonTetiaäthylenpentamin mit Glutardialdehyd, von Tetraäthylenpentamin mit Tolyldiisocyanat, von Pcntaäthylenhexamin mit Gluiardialdchyd oder eines Gemisches von Tetraäthylenpentamin und von teilhydrolysicrtem Kollargen mit Glutardialdehyd enthält.

5. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Enzym Giucoamylase, Lactase, Pilzprotease, Glucoseisomerase und/oder Glucoseoxydase enthält.

6. Immobilisiertes trägerfixiertes Enzym nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sein anorganisches poröses Trägermaterial Porendurchmesser im Bereich von 100 bis 55 000 A mit so viel wie 25 bis; 60% des porösen Trägermaterials mit Durchmessern oberhalb 20000 A und eine Oberfläche im Bereich von 150 bis 200 rrr/g besitzt.

7. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten trägerfixierten Enzymen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das anorganische Trägermaterial mit einer ersten Lösung eines bi- oder polyfunktionellen Monomers, eines Polymerhydrolysats oder eines vorgeformten Polymers behandelt, die nichtadsorbierte Lösung entfernt, das anorganische Trägermaterial mit einem relativ großen Überschuß einer zweiten Lösung eines bifunktionellen Monomers unter Bildung des organisch-anorganischen Grundmaterials behandelt, eine Enzymlösung zu dem resultierenden organisch-anorganischen Grundmaterial zusetzt und die unumgesetztcn Materia-

lien entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 7. dadurch gekennzeichnet, daß man als erste Lösung, als zweite Lösung und als Enzyinlösung wäßrige Lösungen verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 7 und S, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das bi- oder polyfunktionelle Monomer, das Polymerhydrolysai oder vorgeformte Polymer organische Lösungsmittel, wie Aceton oder Tetrahydrofuran, verwendet.

K). Verfahren nach Anspruch 7 bis M, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweite bifunktionelle Monomere solche verwendet, die reaktive Gruppen besitzen, welche durch eine Kette mit 4 bis K) Kohlenstoffatomen voneinander getrennt sind.