DK145104B - Vandoploeseligt enzymkonjugat og fremgangsmaade til dets fremstilling - Google Patents

Description

(19) DANMARK (^)

if! (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 145104B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 637/76 (51) lnt.Cl.3 C 12 N 11/00 (22) Indleveringsdag 17· f eb. 1976 (24) Løbedag 17· féb. 1976 (41) Aim. tilgængelig 19· aug. 1976 (44) Fremlagt 30· aug. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 18. feb. 1975, 550898, US

(71) Ansøger UOP INC., Des Plaines, US.

(72) Opfinder Joseph Levy, US: Murray Campbell Fusee, US.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Vanduopløseligt enzymkonjugat og fremgangsmåde til dets frem= stilling.

Den foreliggende opfindelse angår et vanduopløseligt en-zymkonjugat omfattende et enzym bundet til en matriks bestående af en uorganisk porøs bærer indeholdende et organisk polymert materiale adsorberet og indesluttet i sine porer samt en fremgangsmåde til dets fremstilling.

Det er kendt, at enzymer, der er proteinholdige af naturen, og som er gængs vandopløselige, omfatter biologiske kata- B lysatorer, der tjener til regulering af mange og forskelligartede ;+ kemiske reaktioner, der finder sted i levende organismer. Enzy-— merne kan også isoleres og anvendes til analytiske, medicinske 5 og industrielle anvendelser. De finder f.eks. anvendelse inden ^ for industrien ved fremstillingen af levnedsmiddelprodukter, såsom ^ ost eller brød, ligesom de anvendes ved fremstillingen af alkoho- 3 liske drikke. Eksempler på specifikke anvendelser i industrien 2 145104 kan findes i anvendelsen af enzymer ved spaltningen af aminosyrer, ved modificeringen af penicillin til dannelse af forskellige derivater deraf, i anvendelsen af forskellige proteaser ved ostefremstilling, ved kødmørning, i detergentpræparater, ved læderfremstilling og som fordøjelseshjælpemidler, i anvendelsen af carbonhydraser ved f.eks. stivelseshydrolyse, saccharoseinversion og glucoseisomerisering, i anvendelsen af nucleaser ved smagsregulering samt i anvendelsen af oxidaser ved oxidationsforebyggelse og ved farvereguleringen af levnedsmiddelprodukter. Disse såvel som mange andre anvendelser er beskrevet grundigt i litteraturen.

Som angivet ovenfor er enzymer, forsåvidt de er gængs vandopløselige samt er generelt ustabile og let kan deaktiveres, også vanskelige enten at fjerne fra de opløsninger, hvor de anvendes, til påfølgende genanvendelse, eller det er vanskeligt at bevare deres katalytiske aktivitet i et relativ langvarigt tidsrum. Ovenstående vanskeligheder fører selvfølgelig til forøgede omkostninger ved anvendelsen af enzymer til kommercielle formål på grund af nødvendigheden af en hyppig erstatning af enzymet, idet denne erstatning sædvanligvis er nødvendig for hver anvendelse. Til modvirkning af de høje omkostninger ved erstatningen er det blevet foreslået at gøre enzymerne ubevægelige eller uopløselige forud for deres anvendelse. Ved ubevægeliggørelse af enzymerne ved hjælp af forskellige systemer, der er nærmere beskrevet nedenfor, er det muligt at stabilisere enzymerne og muliggøre genanvendelsen af enzymet, der ellers kan undergå deaktivering eller gå tabt i reaktionsmediet. Sådanne ubevægeliggjorte eller uop- løseligajorte enzymer kan anvendes ved forskellige reaktorsystemer, f.eks. fyldte søjler eller omrørte tankreaktorer, afhængigt af arten af det substrat, der anvendes derved. Almindeligvis tilvejebringer ubevægeliggørelsen af enzymerne en gunstigere eller bredere miljøstabilitet, et minimum af problemer med afgangsstrømmen og håndtering af materialer samt muligheden for at gøre selve enzymets aktivitet bedre.

Som anført ovenfor er der beskrevet adskillige generelle fremgangsmåder samt mange modifikationer ved disse, ved hjælp af hvilke ubevægeliggørelsen af enzymerne kan bevirkes. En generel fremgangsmåde består iadsorbering af enzymet på en fast overflade, f.eks. når et enzym, såsom aminosyreacylase, adsorberes på et cellulosederivat, såsom DEAE-cellulose, når papain eller ribonuclease adsorberes på porøst glas, når catalase adsorberes på trækul, når trypsin adsorberes på kvartsglas eller cellulose, eller når chymo- 3 1451ΟΛ trypsin adsorberes på kaolinit. En anden generel fremgangsmåde består i at holde et enzym tilbage i et gelgitter, f.eks. glucose--oxidase, urease eller papain, der er indesluttet i en polyacryl-amidgel, acetylcholinesterase, der er Indesluttet i en stivelsesgel eller en siliconepolymer, eller glutamin-pyrodruesyre-trans-aminase, der er indesluttet i en polyamid- eller celluloseacetat-gel. En yderligere generel fremgangsmåde er en tværbinding ved hjælp af bifunktionelle reagenser, og den kan gennemføres i kombination med en hvilken som helst af ovennævnte generelle fremgangs*-måder til ubevægeliggørelse. Ved anvendelse af denne metode binder bifunktionelle eller polyfunktionelle reagenser, der kan inducere intermolekylær tværbinding, enzymerne covalent til hinanden såvel som til en fast bærer. Denne fremgangsmåde kan eksemplificeres ved anvendelsen af glutardialdehyd eller bisdiazobenzidin-2,2'--disulfonsyre til binding af et enzym, såsom papain,til en fast bærer. Endnu en fremgangsmåde til at ubevægeliggøre et enzym omfatter fremgangsmåden til covalent binding, ved hvilken enzymer, såsom glucoamylase, trypsin, papain, pronase, amylase, glucose--oxidase, pepsin, rennin, svampeprotease og lactase, ubevægeliggøres ved covalent tilknytning til et polymert materiale, der er knyttet til en organisk eller uorganisk fast porøs bærer. Denne fremgangsmåde kan også kombineres med ovenstående ubevægeliggørel-sesmetoder.

De ovenfor opregnede fremgangsmåder til ubevægeliggørelse af enzymer er alle behæftet med nogle ulemper, der forringer deres anvendelse ved industrielle fremgangsmåder. Når et enzym adsorberes direkte på overfladen af en bærer, er de bindende kræfter, der fremkommer mellem enzymet og bærerunderlaget, f.eks. ofte ganske svage, selv om nogen kendt teknik har angivet, at der er opnået relativ stabile konjugater af denne type, når bærerens porestørrelse og enzymets spin-diameter korreleres. Bærerens porediameter kan imidlertid ikke overstige en diameter på ca. 1000 Angstrom. I betragtning af denne svage binding desorberes enzymet ofte let i nærværelse af opløsninger af det substrat, der behandles. Desuden kan enzymet deaktiveres delvis eller i stor udstrækning på grund af dets mangel på bevægelighed eller på grund af indbyrdes påvirkning mellem bæreren og enzymets aktive sted. En anden fremgangsmåde, der kan anvendes, er indeslutningen af enzymer i gelgitre, hvilket kan gennemføres ved polymerisering af en vandig opløsning eller 145104 4 emulsion indeholdende den monomere form af den polymere og enzymet eller ved inkorporering af enzymet i den præ-dannede polymere ved forskellige teknikformer, ofte i nærværelse af et tværbindende middel. Selv om denne fremgangsmåde til ubevægeliggørelse af enzymer har den fordel, at de reaktionsbetingelser, der anvendes til at bevirke indeslutningen, sædvanligvis er milde, således at der ofte kun sker en ringe ændring eller deaktivering af enzymet, er den også behæftet med de ulemper, der består i, at kon-jugatet har ringe mekanisk styrke, hvilket resulterer i sammenpresning ved anvendelse i søjler i systemer med kontinuerlig strømning med en medfølgende tilstopning af søjlen. Sådanne systemer har også temmelig vide variationer i porestørrelse, hvilket således fører til nogle porestørrelser, der er tilstrækkelig store til at tillade tab af enzym. Endvidere kan nogle porestørrelser være tilstrækkelig små, således at store diffusionsbarrierer for transporten af underlaget og produktet fører til reaktionsretardering, idet dette især er tilfældet ved anvendelse af et substrat med høj molekylvægt. De ulemper, der er til stede ved ubevægeliggørelse af et enzym ved intermolekylær tværbinding, skyldes som angivet ovenfor tabet af bevægelighed med påfølgende deaktivering på grund af enzymets manglende evne til at antage den naturlige konfiguration, der er nødvendig for den maksimale aktivitet, især når det aktive sted er involveret i bindingsprocessen.

Metoder til covalent binding har fundet vide anvendelsesmuligheder og kan anvendes enten som den eneste ubevægeliggø-relsesteknik eller som en integrerende del af mange af de fremgangs-. måder, der allerede er beskrevet, og ved hvilke der anvendes tværbindingsreaktioner. Denne fremgangsmåde anvendes ofte til binding af enzymet samt bæreren via et bifunktionelt mellemliggende molekyle, hvor molekylets funktionelle grupper, f.eks. γ-aminopropyl-triethoxysilan, er i stand til at reagere med funktionelle dele, der er til stede i både enzymet og enten en organisk eller en uorganisk porøs bærer. En bred mangfoldighed af reagenser og bærere er blevet anvendt på denne måde, og fremgangsmåden har den fordel, at den tilvejebringer stærke covalente bindinger igennem hele kon-jugatproduktet såvel som stor aktivitet i mange tilfælde. Enzymets covalente binding til bæreren skal gennemføres via funktionelle grupper på enzymet, der ikke er essentielle for dettes katalytiske aktivitet, såsom frie aminogrupper, carboxylgrupper, hydroxylgrupper, 5 1Λ 510 Λ phenoliske grupper og sulfhydrylgrupper . Disse, funktionelle grupper reagerer også med en bred mangfoldighed af andre funktionelle grupper, såsom en aldehyd-, isocyanato-, åcyl-, diazo-, azido-, anhydro- eller aktiveret estergruppe, til frembringelse af covalente bindinger. Ikke desto mindre er denne fremgangsmåde ofte behæftet med mange ulemper, der involverer kostbare reaktanter og opløsningsmidler såvel som specielle og kostbare porøse bærere og besværlige flertrinsprocesser, der gør fremstillingsfremgangsmåden uøkonomisk til kommerciel anvendelse.

Den kendte teknik er derfor fuld af forskellige fremgangsmåder til ubevægeliggørelse af enzymer, hvilke fremgangsmåder imidlertid på forskellige måder er ude af stand til at opfylde kravene til industriel anvendelse.

Ifølge USA-patentskrift nr. 3.821.083 er en indifferent bærer overtrukket med en præ-dannet polymer, såsom polyacrolein, hvortil der er bundet enzym. Ifølge de fleste af de i patentskriftet angivne eksempler er det imidlertid nødvendigt først at syre-hydrolysere det sammensatte materiale forud for enzymets afsætning på den polymere. Et andet tidligere patentskrift, nemlig USA-patentskrift nr. 3.705.084, beskriver en makroporøs enzymreaktor, hvor et enzym adsorberes på den polymere overflade af en makroporøs reaktorkerne og derpå tværbindes på plads. Ved tværbinding af enzymerne på den polymere overflade efter deres adsorption ubevægeliggøres enzymet yderligere delvis, og det kan ikke virke frit som en katalysator som i sin native tilstand. Tværbindingen af enzymer binder dem faktisk sammen, hvorved en fri bevægelse af enzymet forhindres, og enzymets bevægelighed nedsættes, hvilken bevægelighed er en nødvendig forudsætning for en maksimal aktivitet.

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt, vanduopløseligt konjugat omfattende et enzym bundet til en matriks bestående af en uorganisk porøs bærer indeholdende et organisk polymert materiale adsorberet og indesluttet i sine porer, og det her omhandlede enzymkonjugat er ejendommeligt ved, at det organiske polymere materiale er dannet in situ ud fra en polyamin og/ eller delvis hydrolyseret collagen ved omsætning med et relativt stort overskud af en bifunktionel monomer, idet enzymet delvis er adsorberet på matriksen og covalent bundet til de funktionelle dele af de vedhængende grupper i det organiske polymere materiale.

6 usm

Enzymet er således både adsorberet på en organisk-uor-ganisk matriks og covalent bundet til funktionaliserede vedhængende grupper, der er knyttet til det organiske polymere materiale, der altså igen er både adsorberet og indesluttet i det uorganiske porøse bærermateriales porer.

En specifik udførelsesform for den foreliggende opfindelse er et vanduopløseligt enzymkonjugat omfattende en organisk--uorganisk matriks bestående af en porøs siliciumoxid-aluminium-oxid-bærer med lav rumvægt i løst mål og med relativt stort overfladeareal, som også kan indeholde uorganiske additiver og in situ - fremstillet tetraethylenpentamin-glutaraldehyd-polymert materiale, der er adsorberet såvel som indesluttet i siliciumoxid-aluminium-oxidets porer, samt et enzym, der udgøres af glucoamylase, der er covalent bundet til de vedhængende glutaraldehydgrupper i det polymere materiale ved eller stødende umiddelbart op til disse gruppers endestillede dele såvel som delvis adsorberet på matriksen.

Andre udførelsesformer fremgår af nedenstående detaljerede beskrivelse af den foreliggende opfindelse. I modsætning til de i den kendte teknik beskrevne, vanduopløselige materialesammensætninger indeholdende enzymer kan de her omhandlede enzymkonju-gater fremstilles ved anvendelse af relativt billige reaktanter samt ved anvendelse af simplere trin end fremgangsmåder til fremstillingen af de kendte sammensætninger. Desuden er de her omhandlede enzymkonjugaters mekaniske styrke og stabilitet større end den mekaniske styrke og stabilitet, de kendte vanduopløselig-gjorte enzymer er i besiddelse af. Det fremgår derfor klart, at de her omhandlede enzymkonjugater har økonomiske fordele, der er nyttige til industrielle anvendelser.

I overensstemmelse hermed angår den foreliggende opfindelse tillige en fremgangsmåde til fremstilling af det her omhandlede, vanduopløselige enzymkonjugat, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man behandler et uorganisk bæremateriale med en første opløsning af en polyamin og/eller delvis hydrolyseret collagen, fjerner den uadsorberede opløsning, bringer det uorganiske bæremateriale i kontakt med et relativt stort overskud af en anden bifunktionel monomeropløsning til dannelse af en organisk--uorgahisk matriks, sætter en enzymopløsning til den fremkomne organiske-uorganiske matriks og fjerner de uomsatte materialer.

7 1451 OA

Den her omhandlede fremgangsmåde gennemføres på en relativt simpel måde. Ved den foretrukne fremstillingsfremgangsmåde behandler man det uorganiske bærermateriale med en opløsning, fortrinsvis af vandig natur, af en polyamin og/eller delvis hydrolyseret collagen, hvorpå man fjerner den uadsorberede opløsning på en hvilken som helst måde, der er kendt i teknikken, såsom bortledning. Det tilsigtes også, at andre billige organiske opløsningsmidler, såsom acetone eller tetrahydrofuran, ligeledes kan anvendes som bærer for ovennævnte polyamin og/eller delvis hydrolyseret collagen. Efter fjernelsen af den uadsorberede opløsning bringes den våde, porøse bærer dernæst i kontakt med et relativt stort overskud på fra 5 til 20 molprocent af en anden bifunktionel monomer, som også tilsættes i en vandig opløsning, hvorved der dannes en polymer matriks, der er både adsorberet og indesluttet i bærerens porer, og fra hvilken der strækker sig vedhængende grupper af den anden monomer. Disse vedhængende grupper indeholder uomsatte funktionelle dele, fordi der er anvendt en overskydende mængde af den anden bifunktionelle monomere ved behandlingen af bæreren. Særlig gode resultater i denne henseende opnås ifølge opfindelsen ved, at den anden bifunktionelle monomere har reaktive grupper, der er adskilt af en kæde indeholdende fra 4 til 10 carbonatomer. De uomsatte funktionelle dele er dernæst tilgængelig for covalent binding til det enzym, der sættes til den fremkomne organisk-uorganiske matriks, igen sædvanligvis i en vandig opløsning. Efter fjernelse af de uomsatte materialer, f.eks. ved bortledning eller vaskning, er enzymet foruden at være covalent bundet til de vedhængende funk-tionaliserede grupper i det organiske polymere materiale også delvis adsorberet på matriksen. Det fremgår derfor klart, at hele ubevasgeliggørelsesprocessen kan gennemføres på en simpel og billig måde under anvendelse af et vandigt eller billigt opløsningsmiddelmedium, idet processen gennemføres i et temperaturområde, der kan ligge i området fra under stuetemperatur (ca. 5°C) til forhøjede temperaturer på ca. 60°C, og fortrinsvis ved stuetemperatur (ca. 20-25°C), idet fremgangsmåden gennemføres under anvendelse af et minimum af driftstrin, og idet den endvidere muliggør en bekvem genvinding af de overskydende reaktanter og en bekvem udvinding af det færdige enzymkonjugat.

8 145104

Mange af de uorganiske bærere, der angives i den kendte teknik, specificerer materialer "med kontrollerede porer", såsom glas og aluminiumoxid, med en porediameter på fra 500 til 700 Angstrom for ca. 96% af materialets vedkommende og en maksimal porediameter på 1000 Angstrom, et overfladeareal på 40 - 70 m /g og partikler i størrelsesordenen 0,18 - 0,42 mm. Endvidere kan disse bærere være overtrukket med metaloxider, såsom zirconiumoxid og titanoxid til tilvejebringelse af større stabilitet. I modsætning hertil har det ifølge opfindelsen vist sig, at de bedste enzymkonjugater opnås ved, at det uorganiske porøse bærermateriale har porediametre i området fra 100 til 55.000 Angstrom, idet så meget som 25 - 60% af det porøse bærermateriale har porediametre på over 20.000 Angstrom og overfladearealer i området fra 150 til 200 m/g. Partikelstørrelsen kan også variere inden for et bredt område fra 0,84 - 2,00 mm til et fint pulver, idet partikelstørrelsen er afhængig af det specifikke system, hvor enzvmkonju-gatet skal anvendes. Det tilsigtes også, at de porøse bærermaterialer kan være overtrukket med forskellige oxider af den ovenfor beskrevne type eller kan have forskellige andre uorganiske materialer, såsom borphosphat, inkorporeret i sig, idet disse uorganiske materialer bibringer bærermaterialet specielle egenskaber. En særlig nyttig form for bærer udgøres af et keramisk emne, der kan have den type porøsitet, der er beskrevet for materialer ifølge den foreliggende opfindelse, eller Søm k^n yære gennemhullet med forbindende kanaler af makrostørreIse, idet sådanne materialer er alment kendte som monolitter, og som kan være overtrukket med forskellige typer porøst aluminiumoxid, zirconiumoxid osv. Anvendelsen af en sådan type bærer har den specifikke fordel, at den tillader den frie strømning af endog stærkt viskose substrater, som man ofte møder ved kommercielle enzymkatalyserede reaktioner.

9 145104

De uorganiske porøse bærematerialer, der anvendes som en komponent i den kombinerede organisk-uorganiske matriks, indbefatter visse metaloxider, såsom aluminiumoxid, især γ-aluminium-oxid, siliciumoxid, zirconiumoxid eller blandinger af metaloxiderne, såsom siliciumoxid-aluminiumoxid, siliciumoxid-zirconiumoxid, siliciumoxid-magnesiumoxid og siliciumoxid-zirconiumoxid-aluminium-oxid, eller γ-aluminiumoxid indeholdende andre uorganiske forbindelser, f.eks. borphosphat, keramiske emner samt kombinationer af ovennævnte materialer, hvor et af materialerne virker som overtræk for et andet materiale, der udgør bæreren.

Specifikke eksempler på anvendelige polyaminer er vandopløselige polyaminer, såsom ethylendiamin, diethylentriamin, tri-ethylentetramin, tetraethylenpentamin, pentaethylenhexamin, hexa-methylendiamin og polyethylenimin, og vanduopløselige polyaminer, f.eks. methylendicyclohexylamin. Nogle specifikke eksempler på bifunktionelle materialer, der kan sættes til de ovenfor angivne produkter til fremstilling af en organisk-uorganisk matriks, og som har de ovenfor angivne, nødvendige karakteristika, indbefatter sådanne forbindelser som glutardialdehyd, adipoylchlorid, sebacoyl-chlorid, toluendiisocyanat og hexamethylendiisocyanat.

Eksempler på enzymer, der kan ubevægeliggøres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er trypsin, papain, hexokinase, β-galactosidase, ficin, bromelain, mælkesyredehydrogenase, glucoamy-lase, chymotrypsin, pronase, acylase, invertase, amylase, glucose--oxidase, pepsin, rennin og svampeprotease. Generelt kan man anvende et hvilket som helst enzym, hvis aktive sted ikke er involveret i den covalente binding.

Fremstillingen af de her omhandlede materialesammensætninger gennemføres fortrinsvis ved chargevis drift som beskrevet detaljeret ovenfor, selv om dannelsen af den færdige1materialesammensætning også kan gennemføres ved kontinuerlig drift. Når der anvendes kontinuerlig drift, anbringes en mængde af det porøse faste bærermateriale i et hensigtsmæssigt apparat, der sædvanligvis udgøres af en søjle. Det porøse faste bærermateriale kan foreligge på en hvilken som helst ønsket form, f.eks. som pulver, pellets og monolitter, og det chargeres til søjlen, hvorpå en fortrinsvis vandig opløsning af f.eks. en polyfunktionel amin bringes i kontakt med den porøse bærer, indtil sidstnævnte er mættet med aminopløsningen, og overskuddet bortledes dernæst. En bifunktionel reaktiv monomer, såsom glutardialdehyd, bringes dernæst 10 145104 i kontakt med den mættede bærer. Dannelsen af den polymere ma-triks gennemføres således i et vandigt system, idet reaktionen gennemføres i løbet af et tidsrum, der kan strække sig fra 1 til 10 timer i varighed, men som almindeligvis er af kort varighed.

Efter fjernelse af overskud af glutardialdehyd ved bortledning og udvaskning af eventuelle vandopløselige og uomsatte materialer, hvilket ved anvendelse af en polyamin fortrinsvis sker med en pufferopløsning med en pH-værdi på ca. 4, bringes en vandig opløsning af enzymet i kontakt med eller recirkuleres igennem søjlen, idet dette trin bevirker en covalent binding af enzymet til de endestillede aldehydgrupper i de funktionaliserede vedhængende molekyler, der strækker sig ud fra matriksen. Dette sker, indtil der ikke er nogen yderligere fysisk adsorption og/eller covalent binding af enzymet til den organisk-uorganiske matriks og vedhængende molekyler. Det overskydende enzym genvindes i afgangsstrømmen efter tømning og vaskning af søjlen. Søjlen er således klar til anvendelse ved kemiske reaktioner, hvor enzymets katalytiske virkning skal finde sted. For størstedelens vedkommende gennemføres fremgangsmåderne med de tids-, temperatur- og koncentrationsparametre, der er angivet ovenfor ved den chargevise fremgangsmåde, og disse fremgangsmåder frembringer sammenlignelige ubevægeliggjort enzymkomplekser.

Nedenstående eksempler tjener til illustrering af de her omhandlede, hidtil ukendte materialesammensætninger og af fremgangsmåderne til deres fremstilling.

Eksempel 1 I dette eksempel anvendes 2 g af et sammensat porøst siliciumoxid-aluminiumoxid-materiale, der indeholder borphosphat inkorporeret, og som har en partikelstørrelse på 0,18 - 0,42 mm, en porediameter i området fra ca. 100 til ca. 55.000 Angstrom samt et overfladeareal på 150-200 m^/g, som den uorganiske bærer for den hidtil ukendte materialesammensætning ifølge den foreliggende opfindelse. Denne bærer kalcineres ved en temperatur på ca.

260°C til fjernelse af eventuelt adsorberet fugt indeholdt deri. Dernæst behandles bæreren med 25 ml af en 4%'s vandig opløsning af tetraethylenpentamin ved stuetemperatur i et tidsrum på 1 time i.vakuum for at lette opløsningens indtrængning i bærerens porer. Overskud af uadsorberet opløsning dekanteres dernæst, idet ca.

25% af tetraethylenpentaminen er blevet adsorberet i bærerens porer. Herefter behandles den våde bærer med 25 ml af en 5%'s vandig op li 14510 Λ løsning af glutardialdehyd ved stuetemperatur, og der finder en næsten øjeblikkelig reaktion sted med dannelse af et uopløseligt reaktionsprodukt både på overfladen og inde i porerne af bæreren.

Den overskydende glutardialdehydopløsning dekanteres dernæst, og det organisk-uorganiske kompleks vaskes til fjernelse af uomsatte og uadsorberede reagenser, idet denne vaskning først gennemføres med vand efterfulgt af vask med en 0,02 M acetatpufferopløsning, der har en pH-værdi på 4,2, idet vaskeoperationen gennemføres ved en temperatur på 45°C. Dernæst tilsættes en enzymopløsning indeholdende ca. 200 mg glucoamylase pr. 25 ml vand, og den får lov at reagere med det sammensatte materiale ved stuetemperatur i et tidsrum på 1 time. Ved afslutningen af dette 1 times tidsrum dekanteres den overskydende glucoamylaseopløsning, og enzym-konjugatet vaskes med vand til fjernelse af eventuelt ubundet og/eller uadsorberet enzym. Materialet udludes dernæst i et tidsrum på 24 timer med en acetatpufferopløsning mage til den ovenfor beskrevne. Mængden af adsorberet og/eller covalent bundet enzym bestemmes ved mikro-Dumasgasschromatografianalyser både før og efter tilsætningen af enzymet. Enzymkonjugatets aktivitet bestemmes dernæst ved den mængde glucose, der produceres under anvendelse af 30%'s fortyndet stivelsesopløsning som substrat ved en pH-værdi på 4,2 og ved 60°C, og under anvendelse af Worthingtons glucostat-fremgangsmåde til analyse af glucose, idet sidstnævnte anses for at være den mest pålidelige fremgangsmåde til bestemmelse af konju-gatets anvendelighed. En aktivitet på 28 enheder pr. g bærer med en enzymladning på 29 mg/g bærer opnås ved denne fremgangsmåde (idet 1 enhed repræsenterer produktionen af 1 g glucose pr. time ved 60°C ifølge prøvespecificationerne). Det må bemærkes, at der trods enzymkonjugatets kendte opløselighed ved en pH-værdi på 4,2, når det er fremstillet i fraværelse af en uorganisk bærer, forekommer et ubetydeligt tab af enzym fra det kombinerede uorganisk--organiske kompleks under udludningen med pufferopløsningen med en pH-værdi på 4,2. Dette påvises ved en styrkeprøvning af afgangsstrømmen fra denne behandling.

Eksempel 2 I dette eksempel følges fremgangsmåden ifølge eksempel 1 med den undtagelse, at den uorganiske porøse bærer har en partikelstørrelse på 0,59-2,00 mm. Dette sammensatte siliciumoxid-aluminium-oxid-materiale, der indeholder borphosphat inkorporeret, behandles med tetraethylenpentamin, glutardialdehyd og glucoamylase på samme måde som den ovenfor beskrevne. Der opnås et aktivt, 12 145104 ubevægeliggjort enzymkompleks, skønt af formindsket aktivitet, sandsynligvis fordi der frembringes et diffusionsproblem af det sammensatte materiales større partikelstørrelse.

Eksempel 3 På lignende måde som den i ovenstående eksempel 1 beskrevne behandles 2 g af et sammensat siliciumoxid-aluminiumoxid--materiale, der har samme fysiske karakteristika med hensyn til partikelstørrelse, porediameter og overfladeareal som angivet i eksempel 1, med en acetoneopløsning af tetraethylenpentamin og efterfulgt af en toluendiisocyanatopløsning ligeledes i acetone i stedet for vandigt glutardialdehyd. Efter dekantering af den overskydende diisocyanatopløsning og vask med vand behandles det orga-nisk-uorganiske kompleks yderligere med en vandig glucoamylaseop-løsning. Som i eksempel 1 omfatter det færdige produkt et aktivt, fuldstændig uopløseligt enzymkompleks.

Eksempel 4

Til illustrering af, at der kan anvendes forskellige opløsningskoncentrationer til fremstilling af det ønskede produkt, gentages den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde med den undtagelse, at der anvendes stærkere koncentrerede opløsninger af de forskellige reagenser. Por eksempel behandles 2 g af et 0,59-2,0 mm sammensat siliciumoxid-aluminiumoxid-materiale med 25 ml af en 20%'s tetraethylenpentaminopløsning, og efter dekantering tilsættes 50 ml af en 25%'s glutardialdehydopløsning. Efter vaskning behandles dette kompleks dernæst med vandig glucoamylase til fremstilling af et ubevægeliggjort enzymkonjugat, der viser en aktivitet på ca. 12 enheder pr. g, baseret på glucostatprøven.

Eksempel 5

Til et sammensat siliciumoxid-aluminiumoxid-materiale, der udgøres af 2 g 0,59-2,00 mur-partikler, sættes 25 ml af en 5%'s vandig, delvis hydrolyseret collagenopløsning, der træder i stedet for tetraethylenpentaminen. Efter dekantering og behandling med glutardialdehyd vaskes den organisk-uorganiske matriks og behandles dernæst med en glucoamylaseopløsning. Det færdige materiale behandles på lignende måde som den i eksempel 1 angivne ved dekante- 13 145104 ring, vask og udludning med en pufret (pH-værdi 4,2) opløsning til frembringelse af et ubevægeliggjort enzymkonjugat, der har en aktivitet på ca. 10 enheder pr. g.

Eksempel 6 I dette eksempel behandles et sammensat siliciumoxid--aluminiumoxid-materiale med en partikelstørrelse på 0,59-2,00 mm, en porediameter i området fra ca. 100 til ca. 55.000 Angstrom og 9 et overfladeareal på 150 - 200 m /g ved tilsætning af tetra-ethylenpentamin i en 1%'s delvis hydrolyseret vandig collagen-opløsning, idet collagenet anvendes som et yderligere bindemiddel. Efter tømning og omsætning med glutardialdehyd behandles den or-ganisk-uorganiske matriks dernæst med en glucoamylaseopløsning ifølge den generelle fremgangsmåde fra eksempel 1 til fremstilling af et aktivt enzymkonjugat.

Eksempel 7

Til illustrering af, at der kan anvendes forskellige enzymer ved fremstillingen af de ønskede materialer, behandles et sammensat siliciumoxid-aluminiumoxid-materiale, der indeholder borphosphat inkorporeret, med en tetraethylenpentaminopløsning, dekanteres og vaskes efterfulgt af tilsætning af en glutardialdehyd-opløsning, hvorpå det fremkomne sammensatte materiale behandles med en vandig lactaseopløsning. Dette producerer et aktivt enzym-konjugat. Lignende fremgangsmåder kan anvendes til binding af enzymer, såsom proteaser, glucose-isomerase og glucose-oxidase til fremstilling af aktive konjugater.

Eksempel 8 I dette eksempel indeholder en søjle, der har en indvendig diameter på 20 mm, 14,2 g af et aktivt enzymkonjugat, der er fremstillet ud fra glucoamylase, der er bundet til en porøs 0,59-2,00 mm siliciumoxid-aluminiumoxid-bærer, der indeholder borphosphat inkorporeret, idet konjugatet er fremstillet på en lignende måde som den i ovenstående eksempel 1. Søjlen anvendes kontinuerligt i et tidsrum på 30 dage ved en temperatur på 45°C til hydrolysering af en vandig 30%'s fortyndet stivelsesopløsning, der er pufret til en pH-værdi på 4,2. Afgangsstrømmen undersøges 145104 14 for glucoseproduktion under anvendelse af Worthington-glucostat-fremgangsmåden. Det konstateres, at der ikke er noget synligt tab af enzymaktivitet i dette tidsrum, og at procentsatsen for omdannelse af stivelse til glucose ved denne temperatur og ved en strømningshastighed på ca. 150 ml pr. time er 62%.

Eksempel 9

Til illustrering af, at der kan anvendes forskellige substrater eller bærere til fremstilling af de ønskede materialer, behandles en aluminiumoxidovertrukket monolit, der består af et keramisk legeme, der er gennemhullet af forbindelseskanaler i makrostørrelse, på en lignende måde som den i eksempel 1 beskrevne, dvs. at monolitten behandles med opløsninger af tetraethylenpent-amin, glutardialdehyd og et glucoamylaseenzym, idet behandlingen gennemføres ved sekvensdrift omfattende dekanterings-, vaske- og udludningsprocesser som beskrevet ovenfor. Den oprindelige keramiske monolit har en tørvægt på 256 g, hvoraf 13% udgøres af et aluminium-oxidovertræk. Det færdige ubevægeliggjorte enzymkonjugat opbygges til en søjle inde i et glasrør med en indvendig diameter på 70 mm for at den kan drives kontinuerligt ved hjælp af et hensigtsmæssigt pumpeapparat inde i en temperaturreguleret beholder, idet denne beholder holdes ved en temperatur på 45°C. Over et 40 dages tidsrum med kontinuerlig anvendelse til hydrolyse af en 30%'s pufret, fortyndet stivelsesopløsning konstateres det, at kun ca.

3% af enzymkonjugatets oprindelige aktivitet er gået tabt under opretholdelse af en strømningshastighed på ca. 85 ml pr. time. Det konstateres endvidere, at der under 40 dages tidsrummet er en ca.

80%'s omdannelse af stivelse til glucose. For yderligere at studere systemets egenskaber, foretages der påfølgende ændringer i strømningshastigheden, i løbet af hvilke det konstateres, at det ved en strømningshastighed på ca. 38 ml pr. time er muligt at opnå en omdannelse af 92-93% stivelse til glucose. Det relativ lange tidsrum, i løbet af hvilket dette enzym anvendes til omdannelse af stivelse til glucose uden et væsentlig tab af enzymaktivitet enten ved desorption eller deaktivering, indikerer en lang halveringstid for katalysatoren.

15 IAS 104

Eksempel 10 I dette eksempel fremstilles et konjugat og en søjle af monolittypen svarende til ovenstående eksempel 9 med den undtagelse, at det enzym, der anvendes til fremstilling af komplekset, udgøres af lactase i stedet for glucoamylase. Konjugatet afprøves for stabilitet under en kontinuerlig strømning under opretholdelse af en temperatur på 37°C i et tidsrum på 29 dage. Det konstateres igen, at der ikke er noget synligt tab af aktivitet af det ubevæge-liggjorte enzymkonjugat. Dette ubevægeliggjorte enzym anvendes ved behandlingen af en 5% lactoseopløsning, der er blevet pufret til en pH-værdi på 4,2, idet lactoseopløsningen chargeres til søjlen ved en hastighed på 54 ml pr. time. Det konstateres i løbet af 29 dages tidsrummet, at der er en ca. 35%'s omdannelse af lactose til glucose og galactose.

Claims (6)

16 145104 Patentkrav. Γ. Vanduopløseligt enzymkonjugat omfattende et enzym bvmdet til en matriks bestående af en uorganisk porøs bærer indeholdende et organisk polymert materiale adsorberet og indesluttet i sine porer, kendetegnet ved, at det organiske polymere materiale er dannet in situ ud fra en polyamin og/eller delvis hydrolyseret collagen ved omsætning med et relativt stort overskud af en bifunktionel reaktiv monomer, idet enzymet delvis er adsorberet på matriksen og covalent bundet til de funktionelle dele af de vedhængende grupper i det organiske polymere materiale.

2. Vanduopløseligt enzymkonjugat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det uorganiske porøse bærermateriale er γ-aluminiumoxid.

3. Vanduopløseligt enzymkonjugat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det organiske polymere materiale er reaktionsproduktet af en polyethylen-polyamin og glutardialdehyd.

4. Vanduopløseligt enzymkonjugat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at enzymet er glucose-isomerase.

5. Vanduopløseligt enzymkonjugat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det uorganiske porøse bærermateriale har porediametre i området fra 100 til 55.000 Angstrom, idet så meget som 25-60% af det porøse bærermateriale har diametre på over 20.000 Angstrom og overfladearealer i området fra 150 til 200 m2/g.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et vanduopløseligt enzymkonjugat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man behandler et uorganisk bærermateriale med en første opløsning af en polyamin og/eller delvis hydrolyseret collagen, fjerner den uadsorbe-rede opløsning, bringer det uorganiske bærermateriale i kontakt med et relativt stort overskud af en anden bifunktionel monomeropløsning til dannelse af en organisk-uorganisk matriks,