JP2013504763A - 中空微粒子体 - Google Patents

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Abstract

中空微粒子と、前記中空微粒子の外側に配置された表面ポリマーとをもち、固相合成、特にペプチド及びオリゴヌクレオチドの製造で使用するのに好適な微粒子体。本微粒子体はクロマトグラフィー固定相カラムとして使用することができ、物体の浮力によりカラムは底部から効率的に充填することができ、固定相への損傷の危険性を低下させる。微粒子体の浮力により、液相に触媒などの種を懸濁させることができ、たとえば反応領域から触媒が失われるリスクを低下させつつ、植物油の加水分解及びバイオ燃料を製造するためのエステル化を実施することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、中空微粒子体(hollow particulate body)、前記物体を製造する方法、及び固相プロセスにおける前記物体(body)の使用、特に中空、浮揚性(buoyant)の微粒子ポリマー体に関する。本物体は、特に、たとえば固相合成、固相抽出、固相試薬、種(species)の固定、細胞培養、触媒、クロマトグラフィーなどの基質と相互作用が求められる多様な物理的及び化学的プロセス並びに医療診断機器(medical diagnostic)において有用である。
固相合成プロセスで有用な固相担体材料(solid support material)は公知である。多様な物理的化学的プロセスでは、有機分子、特にペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの合成、種の固定化、触媒の担持、イオン交換、材料からの種の抽出、診断及びクロマトグラフィーなど固体担持材料を使用する。
通常、有機分子の多段階合成には、それぞれの段階で生成した中間体を分離するために多くの単離段階が含まれ、それから次の段階に進む。これらのプロセスは時間を浪費することが多く、費用がかかり、収率に関しては非効率であるかもしれない。中間体は過剰の試薬及び反応副生成物を除去するために精製が必要なことが多く、沈殿、濾過、二相溶媒抽出、固相抽出、結晶化及びクロマトグラフィーなどの手順を使用することができる。
固相合成は、液相合成よりも多少好都合な点がある。たとえば液相合成で使用される単離手順は、固体担体に標的分子を可逆的に結合することによってある程度回避することができる。過剰量の試薬と副生成物の一部は濾過及び固体担体の洗浄によって除去することができる。標的分子はプロセスによっては本質的に定量的な収量で回収することができるが、これは通常、固相合成では特に難しい。さらに、固体担体で実施する操作に必要な時間は通常、液相合成で同等の段階を実施するのに必要な時間よりもずっと短い。
一連のプロセスにおける種の固定化も公知である。たとえばポリマー担体は通常、化学(chemo)及び生体(bio)触媒などの従来の有機化学で使用するための触媒の固定化に使用される。固定化された酵素は、二級アルコールの分割のために固定化ペニシリンアミダーゼの使用(E. Baldaroら、Tet. Asym. 4, 1031頁(1993年)：非特許文献１)など、有機化学反応の実施に、またはキラル分割に使用することができ、固定化ペニシリンGアミダーゼも、アモキシシリンの製造におけるベンジルペニシリンの加水分解に使用される(Carleysmith, S.W.及びLilly, M.D. Biotechnol. Bioeng., 21, 1057-73頁，1979年：非特許文献２)。
固体担体は、医学的及び診断用途のための生物学的高分子(macromolecule)を固定化するのにも使用される。これには、タンパク質、モノクローナル及びポリクローナル抗体の固定化も含まれる。細胞培養は通常、特異的な表面特徴及びモルフォロジーをもつ固体担体上で実施される。ビーズに固定された酵素は、シグナルを生成するためのセンサとして使用することができる。一例としては、グルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ結合酵素システムによるグルコースの検出があり、ここではグルコースが存在すると過酸化水素を生成し、これは順に様々な基質を酸化するための過酸化水素用の基質であり、着色された蛍光または発光シグナルを与える。
その蛍光が特定のカチオンまたはアニオンに対して感受性である様々な蛍石(fuor)を使用して、pH測定用の水素イオンなどの特定のイオンの濃度を示すことができる。
ポリマー微粒子は、固体担体が固定相(stationary phase)と称されるクロマトグラフィーで使用されることが多い。クロマトグラフの特定のモードでは、固定相のコストは制限的でありうる。他のモードでは、固定相の物理的性質のせいで、方法の有効性を減じてしまう可能性がある。たとえば、アフィニティー、イオン交換及びゲル透過クロマトグラフィーで使用されることが多い軟質ポリマーは、微粒子が変形性であるため、高い流速では使用することができない。クロマトグラフィーの他の多くのモードで使用される硬質マクロポーラスポリマーは、機械的に脆いことが多いので、耐用年数が短い。
クロマトグラフィー分離において固体担体または固定相を適用することは、薬学的及びバイオテクノロジー業界で使用される複雑な最先端分離並びに鉱業で使用されるより大きなスケールのプロセスには非常に高価である。薬学業界で最も高価な薬剤の一部は分取クロマトグラフィーで精製され、優れたクロマトグラフィー分離は技術的に都合が良く、且つ経済的に有利であろう。鉱業及び貴金属回収業界では、世界の大部分のパラジウム、触媒変換体及び高価な製品を製造するなどの広範な工業用途及びプロセスにおける重要成分は、固定化クラウンエーテルを使用して精錬することができる(Traczyk, F.P.; Bruening, R.L.；Izatt,N.E．"The application of Molecular Recognition Technology(MRT) for Removal and Recovery of Metal Ions from Aqueous Solutions"; In Fortschritte in der Hydrometallurgie; 1998, Vortrage beim 34. Metallurgischen Seminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus-und Weiterbildung der GDMB; 18-20頁1998年11月; Goslar：非特許文献３)。
固相抽出及び固相試薬の製造でポリマー微粒子を使用することは、化学、薬学及びバイオテクノロジー業界でも公知である。
公知の固相担体は通常、用途に合うように特定のサイズ及び物理的性質のポリマー微粒子を含む。使い易さに関しては、これらのポリマー微粒子は球形であることが多く、規定の粒径分布をもつ。微粒子が球形の性質をもつと、ポリマーの流動性及び濾過特性が改善する。固体担体を使用することは操作的に好都合であるが、固相アプローチに対しては不都合な点がある。たとえば、ペプチド及びオリゴヌクレオチドの固相合成に通常使用される市販の担体は、複雑な製造プロセスなどのため高価なことがよくある。マイクロポーラス(microporous)ポリマー及びマクロポーラス(macroporous)ポリマーが通常使用される。マイクロポーラスポリマーは比較的低レベルの架橋剤(cross-linker)を含むので、ポリマー微粒子は好適な溶媒中で溶媒和して、膨潤する。マクロポーラスポリマーはポリマーマトリックス中に高レベルの架橋剤を含み、大きな細孔を含む。これらのポリマー微粒子は通常硬質であり、優れた流動特性をもち、充填カラムで使用するのに適している。
ポリマー微粒子は通常、分散重合または乳化重合プロセスにより製造することができ、ここでモノマーの溶液は、重合開始前に非混和性溶媒(連続相)に分散される。次いで、形成したポリマー微粒子を通常、濾過し、洗浄し、分類して必要とされる粒径分布に区分けする。
E. Baldaroら、Tet. Asym. 4, 1031頁(1993年) Carleysmith, S.W.及びLilly, M.D. Biotechnol. Bioeng.， 21, 1057-73頁, 1979年 Traczyk, F.P.; Bruening, R.L.; Izatt, N.E．"The application of Molecular Recognition Technology (MRT) for Removal and Recovery of Metal Ions from Aqueous Solutions"; In Fortschritte in der Hydrometallurgie; 1998, Vortrage beim 34. Metallurgischen Seminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus-und Weiterbildung der GDMB; 18-20頁1998年11月; Goslar
これらのプロセスは、重合、面倒な粒径分類、たとえば篩分け及び空気分級(air classification)の間に、連続相にとってのモノマー損失、様々な粒径の生成、及び微細粒子の不都合な生成などの幾つかの点において不都合な点がある。
製造及び製造の間の損失という不都合なコストに加えて、特に物理的安定性が低いという公知のポリマー微粒子の物理的特性に関して特定の不都合な点が発生しえる。マイクロポーラスポリマー微粒子は通常軟質であり、通常、充填カラム床で高い流速でクロマトグラフィー用途で使用するのに適していない。さらに、軟質微粒子は、濾過の間などで不都合なことに圧縮されて、付着してしまい、カラム底部で使用されている焼結物(sinter)またはメッシュに圧縮貫入してしまうことが多い。硬質マクロポーラス及び巨大網状(macroreticular)微粒子は、充填カラム床での高い流速により適している。しかしながら、硬質という性質のため、微粒子は物理的応力の下では脆性で、分断し易い。
これらの問題は、ポリマー微粒子が不都合な大きな応力に暴露されるように、底部から上部へカラム内にポリマー微粒子を挿入し、微粒子に物理的脆弱化または損傷をもたらし、クロマトグラフィープロセスに対してカラムを非効率にしてしまいうる従来の充填手順によって悪化する。
本出願人は、場合によりその表面にポリマーが配置された、中空中心をもつ予備形成された担体ポリマーを含む微粒子体を提供することによって、公知ポリマー微粒子に関連するこれら及び他の問題が改善されることを知見した。この中空中心は、低密度の微粒子体を提供し、液相中で好適な浮揚性を提供する。
PCT国際特許出願国際公開第WO2008/012064号は、ポリマーを浸透させたビーズを含む固体担体について記載しており、ここで前記ビーズには穴があり、ポリマーはその穴の中に配置されている。このビーズは全体にわたって固体であり、穴の中のポリマーを支持するための骨組みとして作用する。固体担体を製造する際、ポリマーはビーズ上と穴の中に形成し、ビーズ外側のポリマーは磨耗などによって除去されると言われている。しかしながらPCT国際特許出願国際公開第WO2008/012064号は、ビーズが中空であるとも、シェルの形状であるとも開示も示唆もしていない。
図１及び図２はそれぞれ、本発明の微粒子体の具体例の断面を示す図である。図１は、微粒子(1)に均一にコーティングされた表面ポリマー(2)を有する中空微粒子(1)を含む、均一形状をもつ中空微粒子体を示す図である。 図１及び図２はそれぞれ、本発明の微粒子体の具体例の断面を示す図である。図２は、中空微粒子(1)が表面ポリマー(2)でコーティングされ、不揃いな形状を有する、中空微粒子体を示す図である。 図３は、微粒子体が均一形状を持つように、表面ポリマー(2)でコーティングされた複数の中空微粒子(1)を含む中空微粒子体を示す図である。 図４は、微粒子体が非均一または不揃いな形状を持つように、表面ポリマー(2)でコーティングされた複数の中空微粒子(1)を含む中空微粒子体を示す図である。
第一の側面において、本発明は、ポリマーを含む中空微粒子と、場合により前記中空微粒子の外側に配置された表面ポリマーとを含む浮揚性微粒子体を提供する。
好適には微粒子体は浮揚性である。微粒子体は、液相で使用するのに適しており、ここで微粒子体は液相よりも低い密度をもつ。好ましくは、微粒子体は1g/cm3未満の密度、より好ましくは0.8g/cm3未満の密度、特に0.7g/cm3未満の密度をもつので、ジエチルエーテル中で浮揚性であることが可能である。さらに好ましくは、微粒子体は、0.5g/cm3未満の密度、より好ましくは0.3g/cm3以下の密度をもつ。好適には、微粒子体は少なくとも0.005g/cm3の密度、好適には少なくとも0.01g/cm3の密度をもつ。好ましくは、微粒子体は、0.01〜0.05g/cm3、より好ましくは0.01〜0.03g/cm3、たとえば0.015g/cm3の密度をもつ。望ましくは、微粒子体は、バッチ式の操作で使用することができ、迅速処理が可能になる。
本明細書中で使用する「微粒子体」なる用語は、微粒子体を包含し、固相合成などで担体として使用することができる。
本明細書中で使用する「ポリマー」なる用語は、ポリスチレン及びポリアクリロニトリルなどの有機ポリマーを包含する。好ましくは、中空微粒子体のポリマーは、ニトリル基などの誘導体化しえる官能基を含む。
本発明の文脈において、「中空」なる用語は、微粒子がシェルで、ガスが充填されているか、または何もない空隙(empty space)であるように、空間を完全に取り囲むポリマー壁をもつことを意味する。
好都合なことには、中空微粒子は硬質で且つ機械的に強固であり、充填カラム床中、高い流速で使用することができる。
中空微粒子は、好適にはポリマーを含む不活性材料を含むことができ、好ましくは本質的にポリマーからなる。
好ましい態様では、中空微粒子は、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリレート、ポリ塩化ビニル及びポリマーの混合物から選択されるポリマーを含む。コポリマーを使用することができ、好ましくはコポリマーは、スチレン、アクリロニトリル、アクリレート、メタクリレート及び塩化ビニルから選択される複数のモノマーを含み、たとえばポリメタクリレート及び/またはポリ塩化ビニルを含むポリアクリルニトリルがある。様々なホモポリマーまたはコポリマーのブレンドも所望により使用することができる。
好適な中空ポリマー微粒子は、Akzo Nobel、Expancel、Box 300、S-850 13、Sundsvall、スウェーデンなどの市販品を入手することができ、これらはExpancel（登録商標）のもと販売されている。
好適には、本発明の微粒子体は、球状、球状に近いか、楕円体である。好都合には、物体は球形である。球形の物体は、カラムへの充填及び、濾過の間に床に対する優れた流動特性など、多くの用途及び設備で有益である。しかしながら、不規則な、楕円及び他の形状の微粒子も使用することができる。
外径と、シェルの内壁の直径である内径とが異なる中空ポリマー微粒子の多くのグレードが利用可能であるので、所望の用途に応じたシェルのポリマー微粒子壁の厚さが可能になる。好適には、微粒子体は1〜500μm、好ましくは5〜150μmの粒径であり、粒径は所望の用途に従って選択する。好ましい一態様において、粒径は１〜50μmであり、好ましくは5〜20μmであり、たとえば10μmである。この範囲の粒径は、高圧液体クロマトグラフィーに適している。別の好ましい態様では、粒径は好適には50〜500μmであり、好ましくは50〜200μmであり、たとえば100μmである。この範囲の粒径をもつ微粒子体は、固相合成、特にペプチド合成、DNA合成及びRNA合成で使用するのに適している。
中空微粒子のそれぞれのグレードの密度は、製造の間に容易に制御され、中空微粒子の内径対外径の比によって異なる。この比が高くなれば高くなるほど、最終製品の密度は低くなり、より浮揚性が高くなる。
好適には、中空微粒子中のポリマーは、種が共有結合的に結合するか、共有結合的に結合するように変性されえる表面、またはコーティングが適用され、好ましくは中空微粒子のポリマーに結合する表面を提示する。微粒子表面は、特定の用途、たとえばペプチドまたは核酸配列の合成で直接使用するための共有結合を提供するように変性することができる。一態様において、表面ポリマーを使用して、微粒子の外側をコーティングまたはこれに結合することができる。ポリマーは微粒子に直接または間接的に共有結合することができる。微粒子が活性部位をもつ材料でできている場合、ポリマーは直接結合することができる。微粒子がより不活性ポリマーでできている場合、表面ポリマーが結合できる活性部位を提供するように微粒子を処理するのが望ましい。
微粒子は、表面ポリマーとの反応用の活性部位を提供するように誘導体化することができる。好ましい態様では、ポリマーは、ニトリル基を含み、これらは他の官能基に誘導体化されるか、転換することができる。たとえば、ニトリルは、酸またはアルカリとの加水分解によりカルボン酸に、メタノール性塩酸を使用してメチルエステルに、テトラヒドロフラン中の水素化リチウムアルミニウムを使用するなどして還元によりアミンに転換することができる。ニトリルは、直接アミンと反応してアミジンを形成することも可能であり、たとえばエチレンジアミン及びビスアミノPEGSを使用して一級アミン表面を取り込むことができる。ニトリルは誘導体化して、所望によりアルデヒドまたはアルコール官能基または他の官能基を生成することもできる。
表面ポリマーは、所望の用途に従って任意の好適な材料でありえる。好ましい態様では、表面ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セルロース、寒天、ポリアクリレート、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリ尿素、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール、シリカ、ポリベータヒドロキシエステル及びポリアクリロニトリルなどの様々な種類のポリマーから選択されるが、これらに限定されない。
中空微粒子ポリマーまたは表面ポリマーは、さらに所定の用途のために特定の官能基性を提供するために反応することができる。好適には、中空微粒子ポリマーまたは表面ポリマーは、一つは中空微粒子ポリマーまたは表面ポリマーと反応するためのもので、もうひとつは所望の用途で使用するために自由な官能基性(free functionality)を提供するためのものである、少なくとも二つの官能基をもつ化合物と反応する。好ましい態様では、ポリマー、たとえば、N-アクリロイルサルコシンメチルエステルとのポリジメチルアクリルアミド及びポリアクリロイルモルホリンコポリマーは、ジアミン化合物、たとえばエチレンジアミンと反応する。たとえば、アミン官能基化物(amine functionalized body)は、ペプチド合成、オリゴヌクレオチド合成、たとえばDNA及びRNA並びに固相有機化学で使用するのに適している。アミノ官能基ポリマー(amino functional polymer)はペプチド合成及びオリゴヌクレオチド(DNA/RNA)合成に使用することができ、ここで連結剤(linkage agent)が結合し、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法を使用して段階的に組み立てられる。
アミン官能基化物は、たとえば所望の通りコハク酸を使用してカルボン酸に転換することにより、さらに官能基化することができる。たとえば、アミン官能基化物は、プロテインAなどのタンパク質を固定化するための調製で、N-ヒドロキシスクシンイミド及び1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩で処理することができる。
更なる態様において、物体はポリマー微粒子と表面ポリマーと、前記微粒子をコーティングしている不活性物質も含む。特に好ましい不活性材料はポリハイプ(Polyhipe)である。ポリハイプは高度内部相エマルションポリマー(high internal emulsion polymer)であり、多孔質且つ高度吸収剤である。この材料は、ある材料が微粒子体により吸収される用途に特に好ましい。
本発明に従った微粒子体は、表面ポリマーにより担持された機能性材料も含むことができる。好適な機能性材料の例としては、触媒、ペプチド合成用の開始剤種、薬学的活性剤、農業化学的活性剤、高分子、酵素、核酸配列及びタンパク質が挙げられる。
一態様において、複数層の表面ポリマーを中空微粒子に適用して、各層に関して様々な特性を提供する。好ましい態様では、本発明は、ポリマーを含む中空微粒子と、前記中空微粒子上に配置された複数層の表面ポリマーとを含む浮揚性微粒子体を提供する。各層は、下部の中空粒子状物または物体の全て若しくは一部を表面ポリマーで包み込むことができる。特に好ましい態様では、微粒子体は、親水性表面ポリマー、たとえばポリアクリルアミドと、疎水性ポリマー、たとえばポリスチレンとを含む。望ましくは、親水性ポリマーは、中空微粒子の一部若しくは好ましくは全体を包み込み、疎水性層は、親水性層の一部若しくは好ましくは全体を包み込む。好都合には、多重表面コーティングにより、微粒子体の特性を調整することができる。
別の態様では、本発明は、ポリマーを含む中空微粒子と、前記中空微粒子に配置された複数層の表面ポリマーとを含む浮揚性微粒子体を提供し、前記微粒子体はさらに活性成分、たとえば薬学的及び農業化学的成分を含み、複数層の表面ポリマーは、前記活性成分の制御放出を提供する。
この活性成分は、微粒子からの放出制御に好適な、任意の公知の薬学的または農業化学的成分でありえる。
本発明は、貴金属触媒、たとえばパラジウム触媒を担持する際に特に有用である。特に好都合な例は、ポリ尿素に担持された酢酸パラジウムである。
本発明の微粒子体は、効率的で且つ比較的単純なプロセスにより製造することができる。さらなる側面において、本発明は、中空中心をもつポリマーを含む微粒子を準備する、前記微粒子と、モノマーまたはモノマー溶液とを接触させる、モノマーを重合させて、前記中空微粒子の表面に表面ポリマーを形成させる各工程を含む、微粒子体材料を製造する方法を提供する。
好適には、重合は当業者に公知のプロセスにより開始する。たとえば、モノマーまたはモノマー溶液と混合した微粒子を、モノマー溶媒と非混和性の溶媒に添加し、加熱して重合を生じさせる。このモノマー溶媒が水溶性の場合には、前記溶媒はたとえば灯油(kerosene)である。
好ましい場合には、表面ポリマーは、重合の間または重合後のいずれかで前記中空微粒子に共有結合することができる。あるいは、表面ポリマーに対して前駆体である一種以上の構成要素のモノマーは、重合開始前に微粒子表面に共有結合することができる。
本発明の微粒子体は、固体担体を使用する任意の化学的または物理的プロセスで使用することができる。
微粒子体は、電子伝導及び発光ポリマーを含む用途で使用することができる。発光ポリマーを含む微粒子体はディスプレイパネル上に配置することができる。
比較的高密度の固体微粒子と一部分関連する従来の固体ポリマー微粒子の使用に伴い、多くの実施上の問題がある。本発明の中空微粒子体の低密度により、多様な用途に好都合な点を提供する。
本発明の微粒子体は、バイオ燃料の新規製造プロセスで使用することができる。化学的プロセスによりバイオディーゼル燃料を製造することは公知である。しかしながら、これには化石源から誘導した原材料であるメタノール及び苛性ソーダ、エネルギーの使用が必要であり、かなりの資本投資及びプロセス由来の廃棄物の取り扱い管理が必要である。バイオディーゼルは酵素加水分解によっても製造することができ、これは化学的プロセスよりもより経済的であり、環境的により受け入れられ易いと考えられている。しかし、公知の酵素方法には、プロセスから酵素が失われるかもしれないという欠点がある。プロセスの間に脂肪酸及びグリセロールが生成し、グリセロールは反応プロセスの重質画分として反応器底部から回収される。望ましくないことに、かなりの量の酵素が反応器底部に面して配置されていることがあり、何かの事情でグリセロールと共に回収してしまうことがある。
さらなる側面において、本発明は、反応領域に成分または触媒を保持するための浮揚性、中空微粒子体の使用を提供し、前記物体は物体に結合した反応成分または触媒を有し、ここで前記反応により前記微粒子体及び成分または触媒よりも密度の高い重質成分が生成し、前記重質成分は反応領域から回収されて、反応領域に微粒子体及び成分または触媒を残す。
好ましい態様では、微粒子状成分を使用して、反応領域中に酵素などの触媒を保持する。
その表面に結合した酵素をもつ中空の浮揚性微粒子体は、微粒子体の浮揚性により、グリセロールを回収する領域から離れて酵素が存在できるようにすることによって、プロセスから酵素の損失を減らす。この原理は、反応の成分または触媒を反応器に保持する予定で、前記成分または触媒は、本発明に従った浮揚性微粒子体により運ぶことができる任意の反応に適用することができる。
好ましい態様において、本発明は、反応領域で物体に結合したCal Bなどのリパーゼなどの酵素を有する浮揚性、中空微粒子体と植物油とを接触させて脂肪酸及びグリセロールを生成し、前記反応領域からグリセロールを回収して、反応領域に酵素を残す、各工程を含むバイオディーゼル製造法を提供する。結合酵素を有する中空微粒子体は浮揚性であり、重質成分のグリセロールが反応領域底部から回収されるにつれて反応領域に保持される。バイオディーゼルを形成するためのエステル化は、同一固定化酵素を使用して同一反応容器中で実施すると予測することもできる。
微粒子体は、有機種、特に高分子の固相合成に特に有用である。
さらなる側面において、本発明は、反応生成物(reacted product)の合成プロセスであって、反応領域に、密度Dlの液体、密度Dtを有する本発明に従った微粒子体を充填する、ここでDtはDlよりも小さく、前記粒子状物の表面は反応部位を含む、前記物体上の反応部位と反応させるために一つ以上の反応体に関する条件下で反応領域に一つ以上の反応体を供給して反応生成物を提供する、各工程を含む前記合成プロセスを提供する。
好適には、反応生成物はそれ自体、さらなる反応体と反応するための反応部位を有する。本プロセスは好適には、前記反応生成物と反応させるために反応領域に反応体を供給してさらなる反応生成物を製造する少なくともひとつのさらなる工程を含む。この工程は、所望の高分子生成物に従って選択された様々な反応体で繰り返すことができ、これによる反応生成物は高分子である。
好適には、前記高分子はオリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖であるが、特にペプチドまたは核酸配列の合成で好都合である。前記高分子がペプチドである場合、反応体は、反応生成物中にアミノ酸部分を提供しえる種またはアミノ酸である。前記高分子が核酸配列、たとえばDNAまたはRNAである場合、前記反応体は、反応生成物に核酸部分を提供しえる種またはヌクレオシドである。
本発明の微粒子体は特に、ペプチド及びヌクレオチド合成で有用である。本発明に従った微粒子体は、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)で好適に洗浄される。結合剤、たとえばFmoc-Am-Rink-OH及び2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)は、DMFなどの溶媒に溶解することができる。4-メチルモルホリン(NMM)を添加し、混合物を予備活性化してから、洗浄済み微粒子体に添加することができる。
カップリング反応は好適には、好ましくは30分以内にニンヒドリンアッセイにより完了する。担体は好適にはDMF及びアミノ酸で洗浄し、次いで式：Fmoc-X-OH(式中、Xは所望のアミノ酸である)の化合物と結合剤とを微粒子状担体上で反応させることにより、担体に結合させる。
次いでFmoc-X-OHを前記微粒子体と結合剤に結合させて、ピペリジン/DMFなどの溶媒で処理する。所望のペプチド配列中のそれぞれのアミノ酸を、ペプチド鎖が完了するまで、同一手順により順番に添加する。
次いで公知の方法を使用してペプチドを好適に開裂させる。たとえば微粒子体は好適には、たとえばジクロロメタン及びトリフルオロ酢酸(TFA)を含有する水で洗浄する。たとえば5%v/vを好適に添加する。溶液がうまく赤色に変色すれば、これは開裂が進行中であることを示している。10分後、好適にはさらにTFAを添加し、混合物を1時間、開裂させておく。微粒子体を好適にTFAで洗浄する。混合したTFA開裂溶液と洗浄液を、ロータリーエバポレーターなどで好適に油状物に還元する。油状物はジエチルエーテルで粉砕(triturate)すると、白色固体が形成する。エーテルは好適にデカンテーションにより除去し、ペプチドを一晩、風乾する。
中空微粒子体のポリマーまたは表面ポリマーは、存在する場合には、望ましくは、ペプチド合成で特に好都合なポリアクリロニトリル、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール及びポリスチレンから選択される。
固相合成において、ペプチド合成などの用途で公知の固体ポリマー微粒子を使用するプロセスは通常、多孔質フィルタープレート上で好適な溶媒中に微粒子を懸濁させる、及び前記微粒子に機械的に損傷を与えないように静かに微粒子を攪拌する、各工程を含む。公知の微粒子は密であり、通常使用される溶媒中、フィルター上に積もる。微粒子の製造プロセスでは、フィルタープレートを閉塞させる微細粒子(fine)が生成することが多く、濾過が遅くなったり、フィルターを取り替えたり、掃除したりする必要性が生じる。さらに、固体微粒子を攪拌すると、破砕して、フィルターの閉塞問題を拡大する微細粒子が生成してしまいうる。
薬学及び関連する業界では、現行の良好な製造工程(cGMP)の元、厳格な品質規制は、フィルタープレートから除去した材料で続くバッチが汚染されないように、各製造バッチ後にフィルタープレートを交換することを求めている。
本発明に従った浮揚性微粒子体は、慣用のものよりもより簡単な装置を使用することによって、固相合成を簡略化する。
微粒子体の攪拌を簡便化し、フィルタープレートの使用をやめる。本発明の浮揚性微粒子体を使用すると、固相合成は、標準的な溶液相反応器で実施することができる。これは、分離漏斗中、最も簡単な形態で固相合成を実施できる実験室では好都合である。プロセススケールでは、専門家によって濾過をする特注の固相反応器及び攪拌システムの必要性を回避することができる。本発明の微粒子体を使用すると、cGMP操作は、慣用のフィルタープレート取替え工程を回避することにより稼動停止時間が短くなることに加えて、より簡単な洗浄及び洗浄確認で好都合に簡便化することができる。
好ましい態様では、本発明の微粒子体は、同一反応器で二種類の製品の製造に使用することができる。たとえば、浮揚性微粒子と従来の密な微粒子を含む反応器中でペプチドまたは核酸配列を組み立てると、任意の工程でデカンテーションなどにより、微粒子を分離できるだろう。これにより、ペプチド配列の一方または両方の組み立てを独立して構築することができる。これは、類似体の製造または固相コンビナトリアル・ケミストリーで特に有用であるかもしれない。
本発明は、密度Dlの液体、密度Dtを有する本発明に従った微粒子体を反応領域に充填する、上部合成反応用に物体と、密度Dbをもつ固体物体を提供する、底部合成反応用に物体を提供する、ここでDtはDlよりも小さく、DlはDbより小さい、上部合成反応と底部合成反応が起きるような条件下で反応領域に上部合成反応用及び底部合成反応用反応体を供給して、上部合成生成物及び底部合成生成物を生成させる、及び場合により固体物体から微粒子体を分離し、これにより上部合成生成物及び底部合成生成物を分離する、各段解を含む単一反応領域で二種類の生成物を同時に製造するプロセスを提供する。
好適には、上部合成反応及び底部合成反応は、ペプチド合成反応及びヌクレオチド合成反応から独立して選択される。
本発明はさらに、クロマトグラフィープロセスにおける固相として本発明に従った微粒子体の使用を提供する。
これまでは、クロマトグラフィーカラムは通常、好適な溶媒中に微粒子のスラリー、または固定相(stationary phase)を製造し、これを中に低カラムフィルタープレートが入っているカラムに移すことにより充填している。クロマトグラフィーカラムに床が不均一に充填(settle)されると、固定相が不均一及び均一にひびが入り、劣悪及び再生不可能な分離となってしまうことがある。必要な性能を達成するには、カラムをたびたび空にして、数回再充填しなければならない。これでは、プロセススケール操作では特に不都合で面倒な稼動停止時間の原因となってしまうことがある。
本発明の浮揚性微粒子物により、スラリーの調整プロセス及びスラリーをカラムに移動するプロセスが簡便化できる。微粒子体の浮力により、固定相は物体の浮遊により形成することでき、これによりプロセスがより簡便になり、カラムはより均一に充填することができる。好都合には、固定相は、所望によりカラムを空にしたり再びスラリー化する必要なくカラム内に微粒子を再び浮遊させることによって容易に移動(mobilize)させることができる。その上、微粒子はカラム内を浮遊し、デカンテーションにより除去できるので、カラムを空にするプロセスは簡便化される。これはプロセススケール操作において特に好都合である。
さらに好ましい態様では、それぞれ異なる密度をもつ二種以上の微粒子体を使用して、所定のバンドをもつ混合床カラムを提供することができる。たとえば、プロテインAベースの固定相でのIgGのアフィニティー分離は、イオン交換と組み合わせて、同一カラムで溶脱(leached)プロテインAを除去することができる。そのようなプロセスの後、固定相は、二種以上の微粒子体の異なる密度を利用して分離することができる。さらなる態様では、本発明はキラル分割を実施するために使用することができ、ここでは異なる微粒子体は同一カラムでR及びSキラル選択剤を運ぶ。
微粒子は、モノリスポリマーが充填されたカラム間隙(interstitial space)及びカラムに充填または詰めてモノリス(monolith)を形成することもできる。本発明はさらに、好ましくはカラム配置の、モノリスを提供するために詰められた本発明に従った複数の微粒子体を含む微粒子体のモノリスを提供する。
所望により、モノリス内の微粒子体の間の間隙は、微粒子体及び表面ポリマーとは異なるポリマーで好適に充填される。
別の態様では、モノリス内の微粒子体の間の間隙は、細胞培養用の養分などの異なる成分で充填することができる。この例において、細胞は微粒子をコーティングしている表面ポリマー上で培養することができる。
好ましい態様では、本発明は、ポリアクリルニトリルを含む中空微粒子と、前記中空微粒子の外側に配置された表面ポリマーとを含む、微粒子体を提供する。
ポリアクリロニトリルは、通常、それ自体、化学的に安定であるが、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解性であり、ポリアクリロニトリル壁を持つ中空微粒子体は、希DMF溶液が浸透するが、原形を保つことができる。これにより、材料は中空の微粒子体の壁の中を通って内部に運ばれ、中空微粒子の内寸の領域内でプロセスに暴露される。これにより、非常に狭い粒径分布の微粒子を製造することが可能になる。
本発明は、狭い粒径分布を持つ微粒子を製造するためのポリアクリロニトリルを含む中空微粒子の使用を提供する。さらなる側面において、本発明は、溶液がシェルを通過して物体内部に通過するようにDMF及び水を含む溶液と、モノマーと、ポリアクリロニトリルシェルを含む中空微粒子体とを接触させる、この溶液をモノマーの重合を開始させる条件に暴露して、中空微粒子体内にポリマー微粒子を形成させ、及び微粒子シェルを溶解させるために前記微粒子体をDMFと接触させてポリマー微粒子を提供する、各工程を含むポリマー微粒子の製造法を提供する。
好適にはDMF溶液は、浸透すべきポリマーに依存して、20〜80重量％、好ましくは35〜65重量％、最適には40〜60重量％、たとえば50重量%のレベルでDMFを含む。DMFの個々の希釈は、溶液が膜の形状であるポリマー壁を通るように選択すべきである。溶液が薄すぎると、浸透は起き難くなり、濃度が濃すぎると、ポリマー膜は破けてしまうかもしれない。ポリマーを破くのが望ましい場合には、ポリマーに浸透するのに必要な濃度よりも濃いDMF濃度を使用する。
好都合には、狭い粒径分布及び望ましい多孔性をもつ微粒子を得ることができる。従来は、粒径分布の狭い微粒子は、ふるいにかけることによって得ていたが、これは資本集約的であり、微粒子の物理的劣化を引き起こすことがある。ポリマー微粒子を大きくすることが知られているが、このアプローチは、微粒子が多孔性を失うかもしれないという欠点がある。
本発明の微粒子体は、たとえばイオン抽出及びイオン交換などの、バッチ式であれ物体上の流れとしてであれ、物体と接触する液体から種を除去するための固相抽出でも有用である。固相抽出は通常、抽出下で混合物から固相を分離するためのフィルタープレートを備えたシステムまたはカラム内で実施される。本明細書中で引用した固相合成及びクロマトグラフィーに関して観察された問題点は、同様に固相抽出でも観察される。本発明の浮揚性微粒子体は、クロマトグラフィー及び固相合成で提供されるのと同様の好都合な点を提供する。
本発明の浮揚性微粒子体は、溶媒非混和性を利用して種を分離するのに使用することができる。水性相及び有機相、たとえばジクロロメタンを含む二成分相では、ジクロロメタン相に浮いている疎水性微粒子体と水性相に浮いている本発明の親水性浮揚性微粒子体は、個別の領域を提供し、ここで分離、抽出または合成などのプロセスを実施することができる。この配置は好適には、四つの相抽出システムを効率的に提供する。
本発明の物体は、抗体、オリゴヌクレオチド、酵素または蛍石(fluor)などの種を固定化するのに使用することができ、列に配置することができ、それぞれの物体は溶液の異なる成分をアッセイする。その表面に、または表面に表面ポリマーを介して共有結合したリガンドを持つ微粒子体は、「ウエル」として使用することができる。抗原または相補(complimentary)DNAまたはRNA配列などの標的リガンドの特異的結合は、確立された方法を使用して検出することができる。
本発明の微粒子体は、生体触媒を固定化するのにも使用することができる。生体触媒は、抽出下、混合物から固相を分離するためのフィルタープレートのついたシステムまたはカラムで使用することが多い。本明細書中で引用される固相合成及びクロマトグラフィーで観察される問題点は、固相抽出で観察されるものと同様である。本発明の浮揚性微粒子体は、クロマトグラフィー及び固相合成で提供されるのと同様の好都合な点を提供する。
固体物体上の固定化酵素などの慣用の固定化生体触媒は、反応器の基部に不都合に定着して、生体触媒と基質との接触を減じてしまうことがある。本発明の微粒子体は、生体触媒の最大有効面積が基質に対して利用可能なままであるように容易に攪拌することができる。
本発明は、同一カラムまたは反応器中に二種以上の様々な固定化生体触媒または共同因子(cofactor)を持つシステムも想定する。好都合には、固相抽出に関して記載したものと類似する非混和性溶媒系を使用して、異なる微粒子体上に固定化した生体触媒の異なる反応領域を提供することもできる。本発明の浮揚性微粒子体は、向流または渦分離形を使用する系にも応用性がある。
本発明の微粒子体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体、全細胞及びポリマーなどの固相試薬、金属及び他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、抗体などの種を固定化するのに特に有用である。本発明は酵素を担持するのに特に好適であり、たとえば、リパーゼCal Aは、特にポリジメチルアクリルアミド及び他の同様の親水性ポリマーと組み合わせると効果がある。本発明は、プロテインAなどの親和性リガンドの固定化にも特に有用である。
さらなる用途では、本発明の微粒子体は、たとえば遷移金属触媒及びリガンドを固定化することにより、化学触媒でも使用することができる。
さらなる用途では、本発明は細胞培養で使用することができる。動物細胞系の大量培養は、ウイルスワクチン及びバイオテクノロジーの多くの製品の製造になくてはならない。動物細胞培養における組換えDNA技術により製造されたバイオ製品としては、酵素、合成ホルモン、免疫生物学的物質(モノクローナル抗体、インターロイキン、リンホカイン)及び抗がん剤が挙げられる。多くのより単純なタンパク質は、細菌培養物中でrDNAを使用して産生することができる；グリコシル化(炭水化物変性)されているより複雑なタンパク質は現在、動物細胞中で製造しなくてはならない。そのような複雑なタンパク質の重要な例としては、ホルモン・エリトロポイエチンがある。哺乳類細胞培養を成長させるコストは高いので、各社とも絶えず技術改良をしている。
細胞は、懸濁液中または接着培地(adherent culture)として成長することができ、これは、接着細胞は接着特性を高め、成長及び分化に必要な他のシグナルを提供するために細胞外マトリックス成分でコーティングすることができる表面が必要である。通常、固体組織から誘導した細胞は接着性である。器官型培地(organotypic culture)は、二次元培養皿とは対照的に三次元環境で細胞を成長させることを含む。この3D培地系は生化学的及び生理学的にin vivo組織に似ているが、多くの因子(たとえば拡散)により、保持するのは技術的に課題がある。
さらなる側面において、本発明は、物体の表面で細胞を培養するために本発明に従った浮揚性微粒子体の使用を提供する。好適には、幹細胞を本発明の微粒子体上で培養して、無制御分化を減少し、所望の分化を制御することができる。微粒子体の取り扱い性及び物体の浮揚性により表面積を高度に利用することは、本出願において好都合である。
本発明は特に、イムノアッセイなどの医療診断試験で有用である。本発明はさらに、本発明に従った微粒子体と、検出すべき化合物と選択的に反応または結合するための微粒子体中に表面ポリマーにより支持された酵素、たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼなどの機能性材料とを含む、診断すべき化合物の存在を検出するための、医療診断機器を提供する。
多くの医療診断機器は、種々の診断用リガンドを固定化するための固体担体に依存している。本発明の微粒子体は、液相を介して固相を物理的に分離する医薬診断手順で使用することができる。
さらなる用途では、微粒子体は吸収剤として使用することができる。この用途では、物体が、微粒子体に結合していて、これに表面ポリマーが結合している不活性、吸収性材料を含む場合に特に好都合である。ポリハイプは特に好ましい不活性材料である。微粒子体は、家庭内でこぼしてしまったもの、たとえば茶、コーヒー及びワインを吸収するのに使用することができ、また漏出物から油分を吸収するなど、大スケールでの用途に使用することができる。吸収剤は、漏出物を吸収するのに使用することができ、次いで水中に油分が漏出した場合には、物理的に除去することができるか、回収及び廃棄のために浮揚性塊(buoyant mass)中に油分を効果的に捕捉及び油分を保持する。
本発明の微粒子体は、薬学的または農業化学的化合物または組成物など、一定期間にわたって放出すべき化合物を運ぶキャリヤとして使用することができる。この使用により、物体に化合物を充填することに応じて化合物の投薬計画を調整する手段を提供する。薬剤の場合には、化学療法など、患者に定期的に大量摂取させることを要求するのではなく、正確な用量の活性剤を連続的に持続放出し易くするのに好都合であるかもしれない。
本発明を添付図面を参照して説明する。
図１及び図２はそれぞれ、本発明の微粒子体の具体例の断面を示す図である。
図１は、粒子(1)に均一にコーティングされた表面ポリマー(2)を有する中空微粒子(1)を含む、均一形状をもつ中空微粒子体を示す図である。
図２は、中空微粒子(1)が表面ポリマー(2)でコーティングされ、不揃いな形状を有する、中空微粒子体を示す図である。
図３は、微粒子体が均一形状を持つように、表面ポリマー(2)でコーティングされた複数の中空微粒子(1)を含む中空微粒子体を示す図である。
図４は、微粒子体が非均一または不揃いな形状を持つように、表面ポリマー(2)でコーティングされた複数の中空微粒子(1)を含む中空微粒子体を示す図である。
本発明を以下の非限定的な実施により説明する。
実施例１：表面ニトリルのカルボン酸への転換
Expancel 920 DEX 80 d30(80μmポリアクリロニトリルバルーン)(100cm3)を水酸化カリウム溶液(4：1v/v水：メタノールの200cm3中200%w/v)、80℃で３時間処理した。中空微粒子を水(3×100cm3)、濃塩酸(３×100cm3)及びメタノール(３×100cm3)で洗浄してから風乾した。
カルボン酸含有量は、フェノールフタレイン指示薬を使用して、水酸化ナトリウム水溶液(5.85mmo/dm3)でポリマー(250mg)を粉砕して測定した。結果は、過剰量の水酸化ナトリウム溶液(5.85mmol/dm3)を添加し、続いて塩酸水溶液(6mmol/dm3)で逆滴定しても確認した。カルボン酸充填量は、0.30mmol/gであった。
実施例２：表面ニトリルのカルボン酸への転換
Expancel 920 DEX 80 d30(80μmポリアクリロニトリルバルーン)(100cm3)を水酸化カリウム溶液(4：1v/v水：メタノールの200cm3中200%w/v)、80℃で20時間処理した。中空微粒子を水(3×100cm3)、濃塩酸(３×100cm3)及びメタノール(３×100cm3)で洗浄してから風乾した。
カルボン酸含有量は、フェノールフタレイン指示薬を使用して、水酸化ナトリウム水溶液(5.85mmo/dm3)でポリマー(250mg)を粉砕して測定した。結果は、過剰量の水酸化ナトリウム溶液(5.85mmol/dm3)を添加し、続いて塩酸水溶液(6mmol/dm3)で逆滴定しても確認した。カルボン酸充填量は、1.0mmol/gであった。
実施例３：表面ニトリルの一級アミンへの転換
Expancel 920 DEX 80 d30(200cm3)をテトラヒドロフラン(THF)(400cm3)中に分散させて、THF中の水素化リチウムアルミニウム(2mmol/dm3の30cm3)をゆっくりと20分で添加した。反応を50℃で16時間、放置した。過剰量の水素化リチウムアルミニウムは水(100cm3)をゆっくりと添加して破壊し、次いでポリマーを水(5×200cm3)、THF(2×100cm3)、メタノール(5×200cm3)及びジエチルエーテル(1×100cm3)で洗浄してから、風乾した。収量5.8g。
ポリマーは、一級アミン含有量を測定するのに使用したニンヒドリンアッセイに対して陽性であった。
実施例４：アミン充填量の増加
実施例３の生成物を、溶媒としてジクロロメタン(DCM)(100cm3)中のジイソプロピルカルボジイミド(0.76g，6mmol)及びN-メチルモルホリン(0.61g，6mmol)の存在下、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(1.8g，3mmol)と1時間反応させた。ポリマーをDCM(3×100cm3)で洗浄し、DCM中のピペリジン(100cm3，20%v/v)で30分間処理した。次いでポリマーをDCM(3×100cm3)、MeOH(3×100cm3)、水(3×100cm3)、MeOH(3×100cm3)及びジエチルエーテル(1×100cm3)で洗浄してから風乾した。収量6.3g(〜0.6mmol/g)。
実施例５：アルファ−ブロモイソブチリルブロミド(BIB)との反応
実施例４のポリマー(1.9g)をDCM(30cm3)及びBIB(2cm3，8.8mmol)中に分散させ、続いてピリジン(2cm3)を添加した。反応を2時間放置し、次いでポリマーをDCM(3×30cm3)、MeOH(3×30cm3)、水(3×30cm3)、MeOH(3×30cm3)及びジエチルエーテル(1×30cm3)で洗浄してから風乾した。
実施例６：BIB官能基化ポリマーのポリマーコーティング
実施例５で製造したBIB官能基化ポリマー(0.6g)を、ジメチルアクリルアミド(8.43g，85mmol)、エチレンビス-アクリルアミド(1.6g，9.8mmol)及びアクリロイルサルコシンメチルエステル(1.57g，10mmol)を含む水性モノマー溶液(100cm3)中に分散させた。CuBr(186mg，1.3mmol)及びN,N,N’,N”,N”-ペンタメチルジエチレントリアミン(PMDETA)(0.675g，3.9mmol)をMeOH(5cm3)に溶解し、上記分散液に添加して重合を開始した。
1.5時間後、混合物が増粘した。水(100cm3)を添加してポリマーを再分散させて、反応をさらに16時間放置した。ポリマーを水、DMF、MeOH、次いでジエチルエーテルで十分に洗浄してから風乾した。収量5.1g。
実施例７：コーティング化ポリマーの一級アミンへの転換
実施例６で製造したポリマーでコーティングした中空球(2.5g)を一晩、エチレンジアミン(50cm3)で処理した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから、風乾した。
実施例８：コーティング化ポリマーの一級アミンへの転換
実施例６で製造したポリマーでコーティングした中空球(2.5g)を一晩、1,2-ビス(2-アミノエトキシ)エタン(50cm3)で処理した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから、風乾した。
実施例９：表面ニトリルのメチルエステルへの転換
Expancel 920 DEX 80 d30(100cm3)をMeOH中の濃塩酸(300cm3，1：1v/v)に分散して、80℃で4時間攪拌した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから、風乾した。
実施例１０：表面メチルエステルの一級アミンへの転換
実施例９で製造したポリマー(50cm3)をエチレンジアミンに分散して、メチルエステルを置き換えて、室温で16時間攪拌した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから、風乾した。
ポリマーは、一級アミン含有量を測定するのに使用したニンヒドリンアッセイに対して陽性であった。
実施例１１：表面メチルエステルの一級アミンへの転換
実施例９で製造したポリマー(50cm3)をJeffamine 800(ビス-アミノEPG)に分散させて、メチルエステルを置き換え、90℃で6時間攪拌した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから、風乾した。
ポリマーは、一級アミン含有量を測定するのに使用したニンヒドリンアッセイに対して陽性であった。
実施例１２：モールドとしての中空ポリマー球
Expancel 920 DEX 80 d30(80cm3)を、ジメチルアクリルアミド(1.455g，14.7mmol)、メチレンビス-アクリルアミド(0.231g，1.5mmol)及びアクリロイルサルコシンメチルエステル(0.314g，2mmol)を含む水性DMF(30cm3，1：1v/v)中に分散させ、1時間放置した。
過剰量のモノマー溶液を排水し(〜10cm3)、ポリマー微粒子をトルエン(100cm3)に分散させた。過硫酸アンモニウム溶液(0.25cm3，10%w/v)、続いてテトラメチレンエチレンジアミン(TEMEDA)(0.25cm3)を添加し、混合物を80℃で2時間攪拌し、次いで一晩、室温に放置した。ポリマーは、DMF、DCM及びジエチルエーテルで十分に洗浄してから風乾すると、ポリジメチルアクリルアミドベースのポリマーの球状粒子が得られた(収量、0.6g)。
実施例１３：ポリジメチルアクリルアミドベースポリマーの一級アミンへの転換
実施例１２で製造したポリマーコーティング化中空球(0.5g)をエチレンジアミン(20cm3)で一晩処理した。ポリマーを水及びMeOHで十分に洗浄してから風乾した。
ポリマーは、一級アミン含有量を測定するのに使用したニンヒドリンアッセイに対して陽性であった。
実施例１４：中空ポリマー球のシリカコーティング
実施例９に記載の通りに製造したメチルエステル官能基中空ポリマー球(50cm3)を、MeOH(50cm3)中の3-アミノプロピルトリメトキシシラン(10cm3)で室温で一晩処理した。この微粒子をMeOH中の水(1：1v/v)で十分に洗浄し、次いで水酸化アンモニウム(0.1%v/v)を含有するMeOH(1：1v/v)中の水で3時間処理して、メトキシシランの加水分解を開始してシリカを形成した。このポリマーをアセトンで十分に洗浄して、アセトン中に１週間保存したままにしておいてから、濾過し、風乾した。
実施例１５：ペプチド合成における微粒子体の使用
実施例６のポリマーを使用して、結合剤を微粒子体にカップリングさせ、次いでオキシトシンのアミノ酸を順にカップリングし、合成したペプチドを開裂してオキシトシンを生成することによる公知の慣用のペプチド合成法を使用して、ペプチドオキシトシンを製造した。
本発明の微粒子体は、慣用のペプチド合成担体よりも製造コストが安価であるので、ペプチドは、慣用のペプチド合成担体を使用して得られたものよりも高いかこれに匹敵する高レベルの純度及び安価で生成した。
オキシトシン及び他のペプチド類の製造で使用するのに好適なペプチド合成法は、アミン官能基ポリジメチルアクリルアミドポリマーを有するような、微粒子体を準備し、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)で洗浄し、前記微粒子体を、以下に詳説されたように公知のペプチド合成法にかけることを含む。
たとえばFmoc-Am-Rink-OH及び2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TBTU)などの結合剤をDMFに溶解することができる。4-メチルモルホリン(NMM)を添加し、混合物を2〜3分間、予備活性化してから、洗浄済微粒子体に添加することができる。カップリング反応は好適には、30分以内にニンヒドリンアッセイにより完了する。担体は好適にはDMFで洗浄する。
アミノ酸Fmoc-X-OH(式中、Xは所望のアミノ酸である)のカップリング
次いでFmoc-X-OHを微粒子体と結合剤に結合させて、結合剤のカップリング用に設定された手順を使用してピペリジン/DMFで処理する。所望のペプチド配列中のそれぞれのアミノ酸は、ペプチド鎖が完了するまで、同一手順により順に添加する。
ペプチド開裂
微粒子体は、水を含有するジクロロメタン及びトリフルオロ酢酸(TFA)で好適に洗浄し、たとえば5%v/vを好適に添加する。溶液は好適には赤に変色し、このことは開裂が進行中であることを示している。10分後、好適にはさらにTFAを添加し、混合物を１時間放置して開裂させた。
微粒子体は、分離漏斗中でTFAで洗浄するのが好ましい。混合したTFA開裂溶液と洗浄液は、ロータリーエバポレーターなどで還元して油状物とする。この油状物をジエチルエーテルで粉砕すると、白色固体が形成する。好適にはエーテルはデカンテーションにより取り除き、ペプチドを一晩、風乾する。
このペプチドは、逆相HPLCにより一種類の主成分を含むことが判明し、MALDI-TOF質量分析により測定したように予想分子量を有していた。

Claims (36)

  1. ポリマーを含む中空微粒子と、場合により前記中空微粒子の外側に配置された表面ポリマーとを含む、微粒子体。
  2. 前記物体が、液相中で使用するためのものであり、且つ前記液相中で浮揚性である、請求項１に記載の微粒子体。
  3. 前記微粒子体が、1g/cm3未満の密度を有する、請求項１または２に記載の微粒子体。
  4. 前記微粒子体が0.01〜0.05g/cm3の範囲の密度を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微粒子体。
  5. 前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリ塩化ビニル並びに、スチレン、アクリロニトリル、アクリレート、メタクリレート及び塩化ビニルから選択される複数のモノマーを含むコポリマーから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微粒子体。
  6. 前記ポリマーが、ニトリル基及び/または誘導体化ニトリル基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の微粒子体。
  7. 前記中空微粒子が、通常、球形または楕円体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微粒子体。
  8. 前記物体が、表面ポリマーコーティングに複数の中空粒子を含む球形、楕円体または他の均一形状の凝集体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微粒子体。
  9. 前記中空微粒子が、1〜500μmの粒径を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の微粒子体。
  10. 前記中空微粒子に直接または間接的に共有結合している表面ポリマーを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の微粒子体。
  11. ポリアクリルアミド、ポリスチレン、セルロース、寒天、ポリアクリレート、ポリジメチルアクリルアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリ尿素、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール、シリカ、ポリベータヒドロキシエステル及びポリアクリロニトリルから選択される一つ以上の表面ポリマーを含む、請求項１０に記載の微粒子体。
  12. 前記中空微粒子の前記ポリマー、または、存在する場合には表面ポリマーが、ペプチド合成、オリゴヌクレオチド合成または固相合成で使用するためのアミン官能基を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微粒子体。
  13. 前記物体が、前記中空微粒子をコーティングしている不活性材料を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の微粒子体。
  14. 前記不活性材料に結合、または、前記不活性材料が多孔質である場合には、前記不活性材料の細孔内に保持されている表面ポリマーを含む、請求項１３に記載の微粒子体。
  15. 前記不活性材料が、ポリハイプ及び多孔質シリカから選択される、請求項１３または１４に記載の微粒子体。
  16. 前記中空微粒子状ポリマーまたは前記表面ポリマーにより担持されているか、またはこれと反応した機能性材料をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の微粒子体。
  17. 前記機能性材料が、触媒、ペプチド合成用開始剤種、オリゴヌクレオチド合成用開始剤種、固相有機合成用開始剤種、薬学的活性成分、農業化学的活性成分、タンパク質または他の生物学的高分子から選択される、請求項１６に記載の微粒子体。
  18. 前記機能性材料が酵素を含む、請求項１７に記載の微粒子体。
  19. 表面ポリマーの複数層が、親水性表面ポリマーを含む第一の層と、疎水性表面ポリマーを含む第二の層とを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の微粒子体。
  20. 薬学的または農業化学的活性成分を含み、表面ポリマーの前記複数層が前記活性成分の制御放出を提供する、請求項１９に記載の微粒子体。
  21. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の微粒子体と、検出すべき検体と相互作用しえる物体により結合または保持される機能性材料とを含む、検体を検出するための医療診断機器。
  22. 前記機能性材料が、前記表面ポリマーにより担持された酵素を含む、請求項２１に記載の医療診断機器。
  23. 三次元形状に配置、好ましくはカラムに含まれる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の複数の微粒子体を含むモノリス。
  24. 前記微粒子を準備する工程、前記中空微粒子とモノマーまたはモノマーの溶液とを接触させる工程、前記モノマーを重合させて、(単数または複数の)中空微粒子をコーティングする表面ポリマーを形成する工程を含む微粒子体材料を製造する方法。
  25. モノマーまたはモノマーの溶液を前記中空微粒子に添加し、前記モノマーまたはモノマー溶液と非混和性である溶媒の存在下で重合を実施する、請求項２４に記載の方法。
  26. 化学的、生物学的または物理学的プロセスにおける、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の微粒子体の使用。
  27. ペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖から選択される種の固相合成；固相抽出；固相有機化学；固相試薬、金属及び他の触媒、生体触媒、酵素、タンパク質、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む抗体、全細胞及びポリマーから選択される種の固定化；細胞培養；クロマトグラフィー分離用固定相の調製から選択されるプロセスにおける；または吸収剤としての微粒子体の請求項２６に記載の使用。
  28. 反応領域において成分または触媒を保持するための、浮揚性、中空微粒子体の使用であって、前記物体は前記物体に結合している反応性分または触媒を有し、前記反応は、前記微粒子体及び前記成分または触媒よりも高い密度の重質成分を生成し、前記重質成分は前記反応領域から引き出されて、前記反応領域に前記微粒子体及び成分または触媒を残す、前記使用。
  29. 酵素触媒が前記担体に結合し、植物油を前記反応領域に供給し、前記反応領域からグリセロールを引き出す、請求項２９に記載の使用。
  30. 脂肪酸及びグリセロールを製造するために反応領域中で浮揚性、中空微粒子体質と結合した植物油を加水分解しえる触媒を有する浮揚性、中空微粒子体と植物油とを接触させる工程、前記反応領域からグリセロールを引き出し、前記酵素を前記触媒領域に残す工程を含む、脂肪酸の製造方法。
  31. アルコールを前記反応領域に導入する工程、エステル化触媒の存在下で前記脂肪酸と前記アルコールとを接触させてバイオディーゼルを製造する工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 反応領域に、密度Dlの液体、密度Dtを有する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の微粒子体を充填する工程を含む反応生成物の合成プロセスであって、ここでDtはDlよりも小さく、前記粒子状物の表面は、反応生成物を提供するために前記物体上の反応部位と反応する一つ以上の反応体用の条件下で反応領域にひとつ以上の反応体を供給する反応部位を含む、前記プロセス。
  33. さらに反応生成物と反応させるために前記反応領域に反応体を供給して反応生成物を生成する工程、場合によりこの工程を同一または異なる反応体で繰り返して高分子を生成する、少なくとも一つのさらなる工程を含む、請求項３２に記載のプロセス。
  34. オリゴヌクレオチド、ペプチドから選択される高分子を製造するための請求項３３に記載のプロセスであって、前記高分子はペプチドであり、前記反応体はアミノ酸または反応生成物中にアミノ酸部分を提供しえる種であり、前記高分子は核酸配列であり、前記反応体はヌクレオシドまたは反応生成物中に核酸を提供しえる種である、前記プロセス。
  35. 前記表面ポリマーが、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール及びポリスチレンから選択される、請求項３２〜３４のいずれか１つに記載のプロセス。
  36. 単一反応領域で二種の生成物を同時に製造するためのプロセスであって、前記反応領域に、密度Dlの液体、密度Dtを有し、上部合成反応用の物体を提供する本発明の微粒子体、及び密度Dbを有し、底部合成反応用の物体を提供する固体物体を充填する工程（ここでDtはDlよりも小さく、DlはDbより小さい）、前記上部合成反応用と前記底部合成反応用の反応体を、上部合成生成物と底部合成生成物とを生成させるために上部合成反応及び底部合成反応用の条件下で反応領域に供給する工程、場合により前記固体物体から前記粒状物を分離して、これにより上部合成生成物と底部合成生成物とを分離する工程を含む前記プロセス。
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