KR20110034116A - 고정화 포스포리파아제 a2에 의한 인지질의 지방산 치환의 선택성과 생산성의 향상 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포스포리파아제 A2 (PLA2) 에 의해 인지질 (phospholipid)을 기질로 지방산을 치환한 인지질을 생합성하는 방법으로서 지방산의 치환 위치와 지방산 종류에 대한 효소 선택성 (enzyme selectivity) 과 생산성 (productivity) 을 향상시켜 원하는 구조의 인지질로의 전환 수율 (yield) 을 높이는 방법에 관한 것이다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 고정화 효소의 제법과 보조인자(cofactor)의 첨가 순서, 기질의 용해 순서를 바꾸어서, 기질 분자들과 고정화 효소의 상호작용, 반응기의 운전 방식 등을 조절하였다.

본 발명은 포스포리파아제 A2 (PLA2) 을 실리카 담체에 고정화하는 제 1 단계; 인지질, 지방산, 보조인자(cofactor) 등을 선택적 순서로 고정화 효소와 혼합하는 제 2 단계; 혼합액을 일정온도에서 인지질의 지방산을 치환시키는 제 3 단계; 반응된 액체에서 고정화 효소와 반응되지 않은 지방산을 회수하고 지방산이 선택적 치환된 인지질을 분리시키는 제 4 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인지질 제조 방법을 제공한다([도 1]).

그 결과, 본 발명의 특별한 효과는, 지방산의 치환 위치와 지방산 종류의 선택적으로 조절하여 원하는 구조의 인지질로의 전환 수율과 생산성을 향상시키는 것이다.

포스포리파아제, 인지질, 지방산 치환, 효소 선택성, 효소 고정화, phospholipase, phospholipid, fatty acid replacement, enzyme selectivity, enzyme immobilization.

Description

고정화 포스포리파아제 A2에 의한 인지질의 지방산 치환의 선택성과 생산성의 향상 방법 { The improvement method for selectivity and productivity of fatty acid replacement in phospholipids by immobilized phospholipase A2 }

본 발명은 포스포리파아제 A2 (PLA2) 에 의해 인지질 (phospholipid) 을 기질로 지방산을 치환한 인지질을 생합성하는 방법으로서 지방산의 치환 위치와 지방산 종류에 대한 효소 선택성 (enzyme selectivity) 을 향상시켜 원하는 인지질로의 전환 수율을 높이는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 구현하기 위하여, 고정화 효소의 제법과 보조인자(cofactor)의 농도와 첨가 순서와 기질의 용해 순서와 반응 환경을 조절하였다. 즉, 기질 분자들과 고정화 효소의 상호작용을 조절하는 방법 등에 관련 분야의 기술을 개발하여야 하였다.

고정화 효소의 제법은 효소 가교법의 응용 기술로서, 1) 효소의 선별, 2) 담체의 표면 구조 선택, 3) 효소와 가교제와의 반응 조건, 4) 반응 후의 처리 등의 기술이 관련되어 있다.

보조인자의 농도와 첨가 순서와 기질의 용해 순서와 반응 환경 등은 고정화 효소의 수 활성 (water activity)를 조절하여, 수 활성이 높으면 포화 지방산이 주 로 치환되고 수 활성이 낮으면 불포화 지방산이 주로 치환되는 환경으로 조절하는 기술을 개발하였다.

생물 촉매 (biocatalyst) 로서의 효소(enzyme)는 여러 가지 형태의 지지체 (carrier) 에 고정화함으로써 효소의 재사용에 따른 효소 사용기간 연장으로 생산성 향상과 단위비용 감소라는 경제적 이익을 얻을 수 있으며, 생물 촉매의 관리 및 사용 환경이 용이해진다. 즉, 사용의 편리성과 함께 비용의 절감효과가 있다. 또한 최종 제품에 효소가 잔존하지 않아 제품의 오염을 원천적으로 차단할 수 있다. 더불어 고정화 효소 (immobilized enzyme) 는 일반적으로 자유 효소 (free enzyme) 형태에 비하여 증대된 안정성으로 인해 보존기간이 길어지고, 보관 기간 중 효소의 활성도가 보다 높게 유지되며, pH 또는 반응온도 등의 반응조건의 범위가 증가하여 반응 공정에서 야기될 수 있는 반응 조건의 변이 등에 저항력이 생긴다.

특히 산업적으로 가장 효율이 높다고 판단되는 충진 층 반응계 (packed-bed system) 의 경우에는, 교반 탱크 반응기 (stirred tank reactor) 와 달리, 반응 도중 pH 나 온도조건이 조금씩 변화될 때 이를 사전에 차단할 수 없으므로 효소의 안정성을 확보하는 노력이 무엇보다 중요하다. 최근에는 고정화 과정에서 문제되는 효소의 불활성화를 최대한으로 줄이고, 활성 (activity) 와 안정성 (stability) 을 향상시키는 다양한 기술들이 소개되어 있다.

결국, 고정화 하고자 하는 효소의 특성과 공정 특성을 동시에 고려하여 최대 활성도와 안정성을 달성하는 이상적인 생 촉매 (ideal bio catalyst) 제작을 위한 고정화 방법이 개발되어야 한다.

효소 고정화의 방법은 흡착(adsorption), 결합(binding), 포괄(entrapment) 등이 있다.

흡착은 가장 손쉬운 고정화 방법으로 거대 기공의 지지체 (macroporous carrier)의 기공 (pore) 에 효소가 포집되도록 하여 고정화하는 방법으로 대표적인 물리적 고정화 방법이다. 흡착 방법에는 일반적으로 실리카, 규조토(celite) 등 약 100nm ∼ 2,000nm 의 기공 (pore) 이 존재하는 무기질 담체 (inorganic carrier) 가 흔히 사용된다. 더불어 합성 폴리머비드, 또는 중간 기공 분자 체 (mesoporous molecular sieve) 등도 흡착 방법에 이용되는 추세다.

그러나, 흡착 방법은 고정화된 효소와 지지체와의 결합력이 매우 약하다. 따라서 계속된 반응 공정 중에 효소가 반응용액으로 점차 유리되는 효소의 탈착 현상이 나타난다. 그러므로 고정화 효소의 활성이 감소하여 재사용할 때 생산성이 크게 떨어지는 단점이 있다.

결합법(Binding methods)은 이온결합법(ionic binding)과 공유결합법(covalent binding) 이 있다.

이온 결합법은 비교적 약한 화학결합법으로 이온교환 레진과 효소를 반응시켜서 염기성, 혹은 산성 아미노산의 잔기 (side chain) 와 수지(resin) 표면의 기능기가 이온 결합 방식으로 결합되는 효소 고정화 방법이다.

이온교환수지는 가장 흔하게 사용되는 이온결합 지지체로 특히 음이온교환수지인 DEAE 셀룰로우스 (Di Ethyl Amino Ethyl cellulose) 가 대표적이다.

이온결합법은 공유결합법과 흡착법의 장단점을 보완한 예에 속한다. 즉, 지지체의 특별한 화학적 전처리가 필요 없기 때문에 고정화 반응이 매우 쉽고 경제적이며, 단순한 흡착법에 비해서 결합력이 높은 편이다. 따라서 상업적 공정에 대한 적용 가능성 또한 매우 높은 편이다. 최근에는 이온 결합력을 높일 수 있는 합성수지들이 개발되어 적용되는 추세를 보이고 있다.

공유결합법 (covalent binding)은 효소 고정화 방법 중 가장 강한 결합력을 지니고 있으며 일반적으로 많이 이용되는 결합법이다. 효소와 지지체 간에 강한 공유결합으로 묶여져 있어 재사용성 비율이 매우 높으며, 물리적 충격에도 강하다. 효소와 지지체 간의 결합은 반영구적으로 유지될 수 있다. 따라서 공유결합법은 오랜 시간 동안 고정화 효소를 사용할 수 있기 때문에 고가의 효소를 순도 높게 정제하는 경우 자주 사용되며, 대규모 상업적 공정에도 가장 널리 쓰이는 고정화 방법으로 알려져 있다.

그러나 공유결합법의 경우 단백질의 아미노 그룹(-NH₃ ⁺) 또는 카르복실기 그룹(COO^-)이 화학적으로 지지체와 결합하면서 단백질 구조의 변화로 인한 불활성화 (deactivation) 이 발생하거나, 활성부위의 아미노산이 결합에 참여하면서 활성을 잃는 등 화학적 변성이 야기된다. 이러한 효소의 화학적 변성은 기질 특이성의 변화, 활성도의 저하 등을 초래하는 단점이 있다.

포괄법(Entrapment) 은 가교법 (Cross-linking) 과 캡슐화 (Encapsulation) 가 있다.

가교법은 고분자 중합용 단분자 (monomer) 를 이용하여 효소와 효소 사이를 직접적으로 가교화하는 방법이다. 가장 흔히 쓰이는 글루타르알데히드 (Glutaraldehyde, GA) 는 인체에 대한 독성도 작고 반응조건이 간단하며, 효과가 우수하여 일반적으로 가장 많이 사용된다.

최근에는 CLEC (Cross linked Enzyme Crystals ), 또는 CLEA (Cross linked Enzyme Aggregates) 등 가교법 기술을 이용한 고정화 기법이 산업적 응용 부분에서 주목을 끌고 있다. 특히 CLEC 기술은 고정화된 효소의 활성도가 매우 높고, 반응에 참여한 대부분의 단백질이 고정화 될 수 있는 특징이 있어 고정화 수율이 90％이상 까지도 다다르는 장점을 가지고 있다.

캡슐화 (encapsulation) 은 알긴산 나트륨 (sodium alginate) 용액과 같은 친수성 고분자 콜로이드 (hydrophilic polymer colloid) 가 염화칼슘 (CaCl₂) 수용액과 접촉할 때 다가 음이온 (poly anion) 에 해당하는 알긴산 이온 (alginate ion) 와 2가 음이온 (dibasic cation) 인 칼슘 이온 (Ca²⁺) 이 콜로이드 액적 (colloidal droplet) 의 표면에서 접촉하면서 불용성 고분자 필름이 형성되면서 담체가 만들어진다.

이와 같은 액적분리법 (coacervation) 은 미세캡슐화 (microencapsulation) 의 한 방법으로 전형적인 포괄법의 한 예로써, 효소 고정화를 위한 방법 중에서 매우 경제적이고 손쉽게 구현할 수 있는 장점이 있다.

가용성 효소 (soluble enzyme) 를 불용성 겔 담체 (gel bead) 의 내부 또는 표면에 갇히게 되며, 겔 담체 (gel bead) 의 표면은 일종의 반투막 역할을 하면서 거대분자 (macro molecule) 에 해당하는 효소를 포괄 (entrapping) 한다. 반면 미세분자 (micro molecule) 에 해당하는 기질, 즉 지질과 지방산 분자나 이온 들은 반투막 기공 (membrane pore) 을 통해 출입하면서 반응 중에는 효소-기질 복합체 (enzyme-substrate complex) 를 형성하고, 반응 후 생성된 생성물은 기공을 통해 방출된다. 이 방법은 일반적인 흡착법에 비하여 상당히 강하게 효소를 고정화하는 효과가 있으나, 공유 결합법 (covalent binding) 과 같은 방법에 비해 효소의 이탈 가능성은 상당히 높다. 따라서 겔 담체의 물리적 지지력을 강화하기 위해 제3의 고분자 (실리카, 키토산 등)로 처리하여 공중합체 (co-polymer) 를 형성하는 방법들이 주로 사용되고 있다.

이러한 액적분리법 (coacervation) 은 실리카 졸-겔 공정 (silica sol-gel process) 을 이용한 실리카 겔의 효소 포집과는 좀 더 나은 특성을 보여준다. 실리카 겔 의 경우 반응 과정에서 매우 강한 시약을 사용하기 때문에 효소의 활성을 일부 또는 모두 상실할 수 있고, 생성된 실리카 겔은 수용액 내에서 응집된 응집체 (aggregate) 의 조직이 쉽게 물리적으로 붕괴될 수 있는 단점이 있다. 따라서 실리카와 같은 무기질 담체 (inorganic carrier) 를 사용하는 경우에는 흡착 또는 공유결합 등의 기법을 주로 사용한다.

본 발명의 대상이 되는 인지질(phospholipids)은 자연계에 존재하는 천연 유화제로서 인을 함유한 복합지질이다. 또한 친수기의 인산기와 소수기의 지방산을 가진 양친매성을 띠는 무독성의 계면활성제로써 식품, 화장품, 의약품, 그 밖의 산 업재의 제조에 천연 계면활성제로 널리 활용되고 있다. 더불어 인지질의 생리활성 기능인 콜레스테롤 조절, 혈액 순환 개선 및 두뇌 영양 공급 등의 기능성을 이용하여 기능성 식품의 원료로도 점차 그 사용이 확대되고 있는 추세다. 특히 높은 순도로 정제한 인지질의 경우, 현재 의학용 주사제의 원료로 사용되고 있다.

인지질의 산업적 이용 대상은 식물성 유래의 대두 인지질과 동물성 유래의 난황 인지질로 크게 구별되며, 두 종류의 인지질은 구성 성분과 그 쓰임새에 차이를 가지고 있다. 보통 대두 인지질이 식품의 유화제로 많이 쓰이는 반면 난황 인지질은 대두 인지질보다 뛰어난 물성과 유화 능력 때문에 화장품의 유화제 또는 유아용 조제분유의 원료로 사용되고 있다.

인지질의 구조는 글리세롤(glycerol) 골격에 두 개의 지방산과 한 개의 인산기로 이루어져있는데 글리세롤 골격에 어떠한 지방산이 붙는가에 따라서 인지질의 기능이 달라진다. 일반적으로 두 번째 위치의 아실(acyl)기는 고도불포화지방산(Poly-Unsaturated Fatty Acid, PUFA)과 구조적으로 안정적인 결합을 이루며 첫 번째 위치의 아실기는 상대적으로 짧은 탄소수를 가진 포화지방산(saturated fatty acid)과 결합을 한다.

인지질이 체내에서 소화, 흡수될 경우, 두 번째 위치의 지방산은 이자로부터 분비된 인지질 분해 효소인 포스포리파제 A2(PhosphoLipase A2)에 의하여 가수 분해되어, 라이소인지질 (lyso-phospholipids) 과 지방산으로 분리된다. 이 때 생성된 라이소인지질은 간의 라이소 포스파티딜 콜린 아실기 전이 효소 (lyso-phosphatidyl choline acyltransferase) 에 의하여 지방산을 다시 에스테르화 (esterification) 하여 킬로마이크론 (chylomicron) 이라는 지질 단백질의 형태로 림프관으로 운반되어 체내에 흡수되게 한다. 때문에 두 번째 위치에 결합해있는 지방산 중, 고도불포화지방산의 함량이 높을수록 체내로 흡수될 수 있는 확률이 높아진다.

이런 고도불포화지방산들은 대부분 불안정한 이중결합이 배 모양 (cis form) 을 취하고 있어 포화지방산이 체내에 축적되는 것과는 달리 생리작용에 필수적으로 필요한 역할을 한다. 특히 오메가-3계열의 지방산은 에이코사노이드류 (eicosanoids) 중 혈관 이완인자인 프로스타글란딘 (prostaglandin) 의 형성을 주도하여 혈전증이나 심근경색증의 감소에 생리적 활성기능을 나타내는 것으로 알려지고 있다.

또한 간에서 중성지방의 합성을 억제하며, 혈중 콜레스테롤의 수준을 저하시키는 기능도 가지고 있다. 일반적으로 WHO와 FDA(1994)에서는 오메가-3 계열과 오메가-6 계열의 지방산 섭취 비율을 1:5∼1:10으로 권장하고 있다. 이러한 불포화 지방산은 체내에서 합성이 제한적이기 때문에 식이 섭취가 필수적이다.

최근 고도불포화지방산과 인지질의 관계에 관한 연구 보고에 따르면, 글리세롤의 2번째 위치 (sn-2) 에 고도불포화지방산을 포함하는 포스파티딜콜린 (phosphatidyl choline, PC)은 다른 위치의 이성질체에 비하여 체내에서 더 쉽게 소화되기 때문에 영양학적, 의학적으로 적용하기에 유용하다고 밝혀졌으며, 또한 종양 세포의 저해제로 작용하는 생물학적 기능이 있어 백혈병에도 응용이 가능하다고 보고된 바 있다. (Hosokawa, 1999; Sakai, 1992; Jenski, 1995; Calviello, 1998) 더불어 인지질은 고도불포화지방산과 결합하여 뇌에 고도불포화지방산을 공급하는 주요 수단으로 알려져 있다. (Magret, 1998)

본 발명에서는 효소적 반응을 위해 리파아제 (lipase) 와 포스포리파아제 (phospholipase) 를 병용하였다.

리파아제(lipase)는 중성지방 (triglyceride, TG) 을 기질로 하여 글리세롤 골격과 지방산이 결합한 아실기의 분해와 결합을 촉매하여 반응을 촉진시키는 역할을 한다. 리파아제는 중성지방으로부터 지방산을 유리시켜 자유지방산을 생성하는 가수분해 (hydrolysis) 를 촉매하거나, 에틸 및 메틸알코올 존재 하에서 메틸 및 에틸기를 제공하여 에틸 및 메틸에스터를 생성하는 알코올 첨가 분해 반응 (alcoholysis) 을 촉매하기도 한다. 후자의 경우 최근 바이오디젤 (biodiesel) 과 관련하여 많은 적용 및 연구사례를 보이고 있다.

리파아제는 그 외에도 중성지방과 자유지방산, 또는 에틸에스터 등과 반응하여 중성지방의 지방산 조성을 변경하는 일종의 개량된 중성지방 (Modified Triglyceride, 또는 Structured Triglyceride) 를 제조하는 데 사용된다. 이러한 기술은 효소 반응공정을 통하여 포화지방산의 양을 증가시켜 유지의 경도(hardness)를 증가시켜 화장품 등의 산업에서 이용된다. 또한 최근에는 트랜스지방산의 유해성 논란과 더불어 천연적 포화지방산을 증가시킨 유지 들이 산업적 용도로 주목받고 있다. 이러한 유지들은 그 목적에 따라 지방산의 조성을 변경시켜 그 기능성을 증가시킨 예라고 할 수 있겠다.

리파아제는 중성지방을 주요 기질로 삼고 있으며, 위치 특이적 반응 성질을 지니고 있어 그에 따라 1,3-선택성 리파아제 (1,3-specific lipase; e.g. Lipozyme), 비-선택성 리파아제 (non-specific lipase; e.g. Novozyme 435) 으로 구분한다. 본 발명에서는 1,3-선택성 리파아제를 이용하였다.

리파아제는 중성지질을 주요기질로 삼고 있지만, 인지질의 반응에도 참여할 수 있는 것으로 보고되고 있다 (Peng et al., 2002). 이 반응은 다음과 같이 표현될 수 있으며, R₁, R₂, R₃ 는 지방산 (fatty acids)을, X는 작용기를 의미한다.

인지질 분해효소, 즉 포스포리파아제(phospholipase)는 뱀의 독(venome) 에서 발견된 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2, PLA2) 를 시초로 하여 초기 연구들이 이루어졌으나, 돼지췌장에서 상업적인 PLA2를 생산함에 따라 오늘날 가장 널리 이용되고 있는 PLA2는 췌장 포스포리파아제 (pancratic phospholipase) 이다.

이 반응은 다음과 같이 표현될 수 있으며, R₁, R₂, R₃ 는 지방산 (fatty acids)을, X는 작용기를 의미한다.

더불어 sn-1 위치의 아실기를 분해할 수 있는 포스포리파아제 A1 (phospholipase A1, PLA1)도 생산되고 있다.

인지질은 뇌와 간에 많이 함유되어 있으므로 신경전달이나 효소계의 조절작용에 중요한 역할을 하는데, 특히 결합된 지방산에 따라 다양한 생리작용이나 특이한 물성을 갖고 있어, 의약품, 식품소재, 유화제, 화장품 등의 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 인지질에 DHA 나 EPA 같은 불포화 지방산이 많이 포함되면 뇌 세포막에서의 주요 인지질로 막 관련 신경전달 과정에서 긍정적인 역할을 수행한다고 알려져 있다.

근래에는 건강기능식품용으로 DHA 나 EPA 같은 불포화 지방산은 노인성 치매증이나 기억장해 등의 예방이나 치료 등을 목적으로 이용되고 있다. 최근에는 포스파티딜세린(PS) 등의 인지질이 인지 장애가 없는 사람들에게도 인지를 최적화하는 것에 대해 도울 수 있다고 보고되고 있다. 이런 종류의 인지질은 효과적으로 빠르게 장에서 흡수되고, 혈액에 용해되고, 뇌혈관 장벽을 용이하게 가로질러 뇌에 있는 신경 세포에 도달한다.

그러나 DHA나 EPA는 지방산 상태에서 섭취할 때 인체의 구성 물질이 되기보다는 에너지 공급원으로 소모된다. 그래서 이런 고도 불포화 지방산은 지질에 결합된 상태로 섭취해야 체내에 흡수될 때 지질 분자 상태로 흡수되어 인체의 신경이나 세포막 등의 구성 물질로 되는 비율이 높아진다.

그래서 자연산으로 이와 같은 고도 불포화 지방산이 결합된 지질을 정제하는 기술이 개발되었다. 그러나 자연산으로는 그 양이 매우 적어서 해당하는 지질을 생산에 애로가 많았다.

최근에는 이를 극복하고자 고도 불포화 지방산으로 지질의 포화 지방산을 치환하는 기술이 개발되고 있다. 그러나 이들은 유기용매를 써서 식용으로 곤란하며, 효소반응의 선택성이나 효율이 낮다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하고자, 고정화 효소로 유기용매 없이 인지질에서 sn-2 지방산 부분만 고도 불포화 지방산으로 치환하되 그 치환 수율을 극대화하는 기술을 제공한다. 동시에 같은 sn-2에서 포화지방산으로 치환 수율을 높이는 기술도 제공한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다음과 같은 기술적 사항을 개발하였다.

1) 고정화 효소의 고정화 담체의 구조를 다공성 담체가 아닌 평탄면만으로 된 실리카 담체를 사용했다. 통상의 다공성 담체는 효소 고정화 효율은 높으나, 미세한 기공 입구가 인지질이나 지방산 등의 기질의 확산에 의한 이동에 방해가 된다. 그래서 기공 (pore) 이 없는 실리카 담체에 효소를 고정화하였다.

2) 효소를 포스포리파아제 A2 로서 Sn-2 위치에 선택적 효소만 사용하였다. 이는 인체의 소화흡수 과정에서 최후까지 지질의 글리세롤 골격에 남는 지방산이 Sn-2 위치의 지방산이라는 것에 착안한 것이다. 이 부분만을 고도 불포화 지방산으 로 치환하고자 하는 것은 소화 흡수될 때 지방산으로 더 효율적으로 흡수되기 때문이다.

3) 담체 표면의 수 활성 (water activity) 을 조절하기 위하여 보조인자인 칼슘이온 (Ca²⁺)의 수용액의 양과 첨가 순서를 조절하였다. 이때 혼합 순서의 조절로 불포화 지방산이 더 치환될 수 있다.

본 발명은 포스포리파아제 A2 (PLA2) 을 실리카 담체에 고정화하는 제 1 단계; 인지질, 지방산, 보조인자(cofactor) 등을 선택적 순서로 고정화 효소와 혼합하는 제 2 단계; 혼합액을 일정온도에서 인지질의 지방산을 치환시키는 제 3 단계; 반응된 액체에서 고정화 효소와 반응되지 않은 지방산을 회수하고 지방산이 선택적 치환된 인지질을 분리시키는 제 4 단계를 포함하는 인지질의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 특별한 효과는, 지방산의 치환 위치와 지방산 종류의 선택적으로 조절하여 원하는 인지질로의 전환 수율을 향상시키는 것이다.

본 발명은 고정화 효소 표면의 수 활성을 낮게 유지하여 고도 불포화 지방산을 Sn-2 위치에 선택적으로 고농도로 치환시켜서 생체내의 효과가 크게 향상되었다. 반대로 포화 지방산으로 치환하고자 한다면 고정화 효소 표면의 수 활성 (water activity) 을 높게 조절하면 원하는 대로 포화 지방산이 주로 치환되는 효과도 있다.

본 발명은 고도 불포화 지방산과 인지질을 기질로 사용하여, 효소 반응을 통한 고도 불포화 지방산을 다량 함유한 고기능성 인지질의 제조에 그 목표를 두고 있으며 그에 동반되는 기초 반응 실험 및 반응 조건의 최적화에 초점을 맞추었다. 더불어 조건을 역으로 조절하면 포화지방산을 치환하는 최적 조건이 된다.

기능성 인지질을 개발하기 위한 노력의 일환으로 인지질에 고도 불포화지방산 (Poly Unsaturated Fatty Acid, PUFA) 을 효소적 합성 과정을 발명하였다.

특히 DHA는 오메가-3 계열 지방산의 대표적인 물질로써 중추신경계 (Central Neural System, CNS) 의 시냅스를 구성하고, 망막의 로돕신 세포에 다량 함유되어 있어 생리활성과 관련한 다양한 기능을 보이고 있다.

특히 DHA가 분자적으로 인지질에 결합한 PL-PUFA 의 경우 생체 이용률 (bioavailability)이 높고 기능식품 소재 등으로의 활용이 기대되고 있어 산업적 필요성이 높다고 하겠다. 더불어 기존의 인지질 제품에 가치를 더하여 부가가치를 증대시킬 수 있는 기술이다.

본 발명을 통해 최종적으로 인지질 내 sn-2 부분의 DHA 함량을 60％ 까지 상승시킬 수 있었다. 보통 인지질의 총 지방산에 대해 DHA 를 30％ 까지 상승시킴이 가능하나, sn-2 부분의 DHA 함량을 선택적으로 치환해야 영양 흡수 측면에서 의미가 있다.

그래서 본 발명에서는 실리카에 PLA2 를 고정화 방법을 개발하여, 수분함량이 2％ 미만 수준의 비 수계 반응 시스템 상에서 활성을 발휘하는 안정된 고정화 방법을 고안하였다.

고정화된 인지질분해효소는 고도 불포화 지방산의 결합을 유도할 수 있는 장점을 가질 뿐 아니라, 라이소인지질 (lyso lecithin) 의 생산, 팔미트 산 (palmitic acid) 등의 포화지방산을 결합하여 수중 분산성을 높일 수 있는 유화제 개발에도 기여할 수 있는 실용적 제품들을 개발, 상품화 할 수 있는 가능성을 열었다.

본 발명을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 가장 중요한 사항은 고정화된 포스포리파아제 A2 (PLA2)에서 지방산과 인지질을 먼저 넣고 고루 혼합한 후, 마지막으로 Ca-수용액을 가하여 반응을 진행하는 것이다.

인지질 기질로는 포스파티딜콜린 (Phosphatidylcholine, PC) 함량이 높은 기질인 GL-90E [(주)고센바이오텍, PC 함량 약 80％] 가 적합하다고 사료되며, 온도는 50℃ 에서 반응하는 것이 적절하다. 이때 액상의 지방산을 인지질 질량의 4 ∼ 6 배를 첨가하는 것이 바람직하다. 이렇게 최적화한 조건하에서 지방산이 sn-2 위치에서 치환되는 비율이 60％ 정도로서 고도 불포화 지방산을 제조됨을 확인하였다.

본 발명에서는 칼슘 (CaCl₂ ) 수용액을 최종적으로 극미량 첨가함으로써 생성물의 조성을 고도 불포화 지방산으로 전환을 촉매하게 한다.

인지질에서 지방산을 고도 불포화 지방산으로 치환하여 고도 불포화 지방산 - 인지질의 제조 방법을 단계 별로 설명하면 다음과 같다.

제 1 단계 : 포스포리파아제 A2 (PLA2)의 고정화;

실리카 표면이 평탄면으로 노출된 담체에 포스포리파아제 A2 (PLA2)를 효소분자간의 가교결함과 담체와 공유결합을 시켜 효소를 고정화한다.

공유결합법을 이용한 고정화 반응에서는 아민실란기를 담체의 표면에 부착하기 위한 반응인 실란화 약품 (silanizing agent) 로서 반응에 사용되는 3-APTES (3-amino prophyltriethoxysilane)의 농도에 따른 영향과 환원제 (reducing agent) 를 이용하여 GA (glutaraldehyde)의 시프 염기 (shiff base) 를 제거했다.

제 2 단계 : 효소와 재료들의 순서적 혼합;

인지질, 지방산, 보조인자(cofactor) 등을 선택적 순서로 고정화 효소와 혼합하되 보조인자인 Ca-수용액을 최후에 혼합하면 생성된 인지질 속의 고도 불포화 지방산의 함량이 높아진다.

고정화 효소 표면에 수활성을 조절하는 방법으로서 Ca-수용액을 가장 먼저 고정화 효소에 가하는 경우에는 수분과 실리카 담체가 상호 작용하여 수 활성 (water activity) 이 높은 상태로 유지하면 포화지방산의 치환이 많아진다.

반대로, Ca-수용액을 미량으로 지방산 기질 용액에 녹이거나, 최후에 넣는 방식으로 조작하면 고정화 효소 표면의 수 활성이 작아져서 불포화 지방산이 더 많이 치환된다.

제 3 단계 : 인지질의 지방산 치환 반응;

혼합액을 일정온도에서 인지질의 지방산을 치환한다. 고정화 효소의 표면의 수 활성 (water activity) 에 따라 고도 불포화 지방산 또는 포화 지방산으로 치환 된다.

지방산이 치환되는 수율은 지방산의 종류와 농도 그리고 효소의 종류와 활성 등에 의해 좌우된다.

포화 지방산의 경우 치환 수율이 보통 40％ 정도이고, 불포화 지방산의 경우 보통 30％ 정도이다.

본 발명에서 불포화 지방산을 sn-2 위치에서만 60％ 정도 치환되도록 조작하였다. 이 이유는 sn-2 위치는 소화 흡수의 측면에서 매우 유효한 위치이기 때문이다.

제 4 단계 : 인지질의 정제;

반응된 액체에서 고정화 효소와 반응되지 않은 지방산을 회수하고 지방산이 선택적 치환된 인지질을 정제한다.

일반적인 실험분석이나 약품용으로 인지질을 정제하는 경우에는, 반응이 종료된 반응물을 에테르로 추출하고, 아세톤으로 인지질 만 침전시킨다.

본 발명에서는 식품 제조가 목적이기 때문에, 에탄올로 반응물을 추출하여 고정화 효소와 액상 기질 부분을 분리한다. 이를 초임계로 추출하면 미반응 지방산은 회수되고 인지질이 고형으로 정제되어 남는다.

이하, 실시 예와 비교 예에 의거 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이 실시 예는 발명을 이해시키기 위한 예시일 뿐 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

실시예의 효소 고정화의 실험 재료는 다음가 같다.

알긴산 나트륨 (Sodium Alginate), CaCl₂ (98％, Sigma Aldrich, USA), TMOS (Tetramethylorthosilicate, 99％, Across), 글루타를 알데히드 (Glutaraldehyde, Grade II, Sigma Aldrich), APTES (3- amino propyl triethoxy silane, Sigma Aldrich), Sodium Borohydride (99％, Sigma Aldrich) 등의 시약 들이 사용되었으며, 아세톤, 헥산, 등 사용된 용매들은 EP grade 급을 사용하였다. 정제수로는 탈 이온화 증류수를 사용하였다.

효소의 반응실험 및 활성도 검사를 위한 기질로 사용된 인지질(phospholipids)은 (주)고센바이오텍의 GL-90E(phospholipids, 순도 90％ 이상) 로, 인지질 분석법에 따라 아세톤 침전법, 및 HPLC를 이용하여 인지질 함량 및 포스파티딜콜린 (Phosphatidylcholine, PC) 함량 등을 검사하였다.

실시예의 효소 고정화의 분석 방법 다음가 같다.

부하 효율의 측정

부하 효율 는 초기 고정화 반응에 투입된 효소가 고정화를 통해 carrier에 고정화된 양을 비율로 나타낸 것으로 아래의 식으로 나타낼 수 있다.

1) Ci = initial amount of protein in free enzyme

2) Cf = non-incorporated amount of protein to the carriers

부하 효율 는 free enzyme 과 고정화 후 반응에 참여하지 못한 효소의 양을 각각 구하여 계산할 수 있다. 각각의 효소, 즉 단백질의 양은 Bradford Assay를 이용하여 산출한다.

고정화 수율의 측정

고정화 수율 는 고정화를 통해서 carrier에 부착된 효소의 specific activity 의 정도를 나타낸 것으로 아래의 식으로 나타낼 수 있다.

1) Am = specific activity (U/mg) of protein immobilized on the carrier

2) Ai = initial specific activity (U/mg) of free enzyme

고정화 수율 는 부하 효율 와 달리 고정화된 효소가 화학적 변성, poly peptide 구조 변경, mass transfer 와 같은 요소로 인해 고정화된 효소의 단위 mg당 발현되는 활성도를 기준으로 하여 initial activity 가 어느 정도 까지 유지되는지를 보여주는 지표이다. 따라서 부하 효율 가 우수한 결과를 보일지라도 고정화 수율 가 낮을 경우 활성도를 상당수 잃었다는 것을 의미한다.

고정화 효소의 안정성의 측정

고정화된 효소의 안정성을 측정하기 위해 열, pH, 반복 회분식 운전을 수행하고, 각각의 결과에 따른 열 안정성 (thermal stability), 수소 이온 안정성 (pH stability), 효소 활성 유지율 (enzyme activity retention) 을 알아본다. 또한, 상온조건에서 보관했을 때의 보존성을 알아본다.

각각의 안정성 지표는 단계별 또는 최종 활성도 변화를 통해 초기 활성도 (initial activity) 와의 비교를 통해 상대 활성도 (relative activity)로 표시한다.

실시예의 효소 반응용 실험 재료는 다음과 같다.

사용한 효소는 중성 지질의 지방산 분해 효소인 리포자임(Lipozyme)과 인지질의 지방산 분해 효소인 포스포리파제(Phospholipise)이며, 두 효소 모두 가수 분해와 에스테르 치환 반응을 촉매 하는 효소이다. 따라서 가수 분해를 최소화하며 동시에 에스테르 치환 반응의 효율을 높이기 위해 다양한 조건의 변화를 주었다. 효소는 리포자임 계열의 Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL 100L과 포스포리파제 계열의 Lecitase Ultra(Phospholipase A1), Lecitase 10L(Phospholipase A2, Novozyme, Denmark)를 사용하였다. (표 . 스크리닝 효소의 종류 및 특성)

아실기 공여체(Acyl donor)로 사용될 지방산은 자유지방산 형태의 DHA (DHA-FFA 80, DHA free fatty acids 80％ 이상, (주)켐포트)를 사용하였다.

인지질은 기질 별 반응 특성을 알아보기 위하여 난황유례 PC(Egg, Sn-1,2 glycero phosphatidylcholine min. 99％, Avanti polar lipids, Inc.), LPC (egg,Sn-2 lysophosphatidylcholine, min. 98％, Avanti polar lipids, Inc.), GL-90E (egg phospholipid, phospholipids min. 90％, Goshenbiotech,Inc.)를 사용하였다.

반응에 사용한 증류수는 미량의 금속성분을 제거한 deionized water를 이용하였으며, 반응 중에 첨가한 각종 유기용매는 주정 알코올(95％)을 제외하고 모두 시약 grade(99％ 이상.), 또는 HPLC/UV spectrometry 급(99.9％)을 이용하였다.

초임계 이산화탄소 추출(supercritical fluid extraction)에 사용된 용매인 이산화탄소는 고순도 이산화탄소(99.99％)를 사용하였다.

실시예의 효소 반응용 분석 방법 다음과 같다.

(1) 인지질 분석

(가) 인지질의 함량

인지질의 함량은 시료 내에 인을 함유한 지질의 양이 얼마나 되는지 정량적(wt. ％)으로 검사하는 것을 이른다. 본 발명에서는 식품첨가물공전 및 건강기능식품공전에 등재되어 있는 '아세톤 침전법'을 준용하였다.

(나) 인지질의 조성

인지질은 단일의 지질 조성물이 아닌, 복합지질로써 기능기라 할 수 있는 head group에 결합된 물질의 종류에 따라 다양한 프로파일을 가지게 된다. 이때의 head group에는 콜린(choline), 에탄올아민(ethanolamine), 세린(serine), 이노시톨(inositol) 등이 올 수 있다. 따라서, 인지질은 총 인지질 함량 외에 인지질의 각 조성을 분류하여 분석할 수 있는 데 정량적, 정성적 분석으로 나뉜다.

① 정량적 분석

대표적인 정량적 분석은 HPLC (High performance liquid chromatography) 를 이용하여 순상, 또는 역상방식을 이용하여 분석할 수 있다.

HPLC와 병행하여 사용될 수 있는 검출기(detector)에는 UV, RI, ELSD 방식이 있는데 아실기의 지방산 조성에 의한 영향력이 다소 적다고 할 수 있는 ELSD(Evaporative light scattering detector)가 주로 이용되고 있다.

본 발명에서 사용하고 있는 분석과정 및 시약, 기기, 컬럼 등의 정보는 표2.와 같다.

표 1. 인지질 분석을 위한 HPLC 조건

②정성적 분석

인지질의 조성을 분석하기 위해 HPLC/ELSD 를 이용할 경우 전처리 및 분석에 상당한 시간과 노력이 필요하다. 따라서, 신속하게 경향을 파악할 수 있는 정성적 분석 방법이 요구된다.

인지질의 정성적 분석에 가장 널리 이용되는 방법은 박층 크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography)로써 전처리가 거의 필요 없으며, 1,000 ppm 이하의 농도에서도 검출되는 민감도를 가지고 있어 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서 인지질 조성의 정성적 분석을 위해 사용한 TLC분석법은 표3 과 같다.

표 2 인지질 조성 분석을 위한 TLC 분석법

(2) 지방산 분석

지방산 (fatty acid) 분석은 지질 샘플을 0.5N 수산화나트륨 메탄올 용액 및 BF₃ (boron trifluoride) 메탄올 용액 상에서 메틸 에스테르화 (methyl esterification) 를 수행하여 글리세롤 골격에 아실 결합하고 있는 각 지방산을 메틸 에스테르 (methyl ester) 로 변환하는 유도체화 과정을 거치게 된다.

이렇게 유도체화 된 지방산은 극성 고정상 (polyethylene glycol) 이 도포되어 있는 모세관 칼럼을 통과하여 끓는점의 차이에 따라 이동상인 기체를 통해 용출된다. 용출된 각각의 성분들은 점화기 (igniter) 에서 모두 연소되게 되며 이때 방출되는 전자의 강도를 검출기를 통해 검사하여 시각적 크로마토그램으로 보여주는 GC-FID (Gas Chromatography - Flame Ionization Detector) 를 이용하여 분석한다.

본 발명에 사용된 GC-FID 기기 및 분석조건은 다음의 표5 와 같다.

표 3 GC operation condition for analysis of FAME(fatty acid methyl ester)

＃ 비교 예 1 알긴산-실리카 졸-겔 담체 (alginate-silicate sol-gel matrix)

알긴산(Alginic acid)의 염 형태인 알긴산 나트륨 (sodium alginate, 98％, Junsei chemical, Japan) 는 염화칼슘 (CaCl₂) 용액에 점적 되었을 때 알긴산 칼슘 겔 (calcium alginate gel) 복합체를 형성하면서 불용성 겔(gel)을 형성하면서 침전한다. 이렇게 침전된 불용화 겔은 내부 네트워크 구조상에 효소를 담고 있는 역 할을 함으로써 매우 경제적인 담체 역할을 한다. 보통 2％ ∼ 4％의 알긴산 나트륨 용액을 염화칼슘이 용해된 항온 수조에 피펫, 주사기 (syringe), 점적 노즐 등을 이용하여 점적하면 불용화 된 겔 담체가 형성된다.

이렇게 생성된 담체는 알긴산 칼슘 겔 (Ca-alginate gel) 로써 수분을 다량 함유하고 있다. 동결건조 등 건조처리를 한 후에는 밀도가 증가한다. 이렇게 생성된 담체는 훌륭한 담체 역할을 수행하지만, 반응 과정상에서 물리적 충격에 따라 효소가 조금씩 탈리될 수 있다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위해 담체의 표면을 다양한 고분자 물질로 코팅함으로써 효소의 이탈을 방지할 수 있다.

알긴산 담체의 가교 결합 피막 형성 (crosslinking coating) 재료로 이용될 수 있는 물질 중에는 키토산 (chitosan), 실리카 (silica) 등이 있다. 이들 재료는 모두 중합반응을 통해서 중간 중합체 (oligomer) 를 형성할 수 있는 물질들이다.

특히 실리카는 담체의 경도를 획기적으로 높이면서 담체의의 물리적 저항력, 효소의 담체로써의 안정성 등을 끌어올릴 수 있는 것으로 알려져 있다(Braun et al.). 실리카의 전구체 물질인 TMOS (Tetra-MethylOrthoSilicate), 또는 TEOS (TetraEthylOrthoSilicate)는 알긴산 겔 (alginate gel) 의 표면과 내면에서 졸-겔 주형 (sol-gel matrix) 을 형성하여 연약한 담체의 물리적 경도를 높이고, 효소의 이탈을 방지할 수 있는 가교결합 주형 (crosslinking matrix) 을 형성한다.

본 비교 예에서 알긴산-실리카 졸-겔 담체 (alginate-silicate sol-gel matrix) 를 이용한 고정화 방법은 Heicharl-Segal 등 (Heicharl-Segal O, Rappoport S, Braun S. Immobilization in alginatesilicate sol-gel matrix protects beta-glucosidase against thermal and chemical denaturation. Bio/Technology 1995;13:798∼800) 의 방법을 일부 변경하여 적용하였다.

고정화 과정은 다음의 순서를 따라 진행되었다.

1단계 : 알긴산-칼슘 겔 담체 (Ca-Alginate gel bead) 생성

액상효소 (5∼30mg solid/mL) 10mL를 2％(w/v) sodium alginate 25mL 용액과 잘 섞는다. 최소 1시간 이상을 교반한 sodium alginate/enzyme 용액을 10mL 시린지와 Coaxial orifice를 이용하여 0.2M CaCl2 용액에 점적한다. CaCl2용액은 Magnetic stirrer를 이용하여 약 150 ∼ 300 rpm 의 속도로 교반한다. 생성된 Gel bead들은 모두 Paper filter를 통하여 여과한다.

2단계 : Alginate-Silicate sol-gel matrix 생성 반응

생성된 알긴산-칼슘 겔 담체 들을 100mL 비이커에 담고 n-헥산 적당량을 부어서 담체 들을 모두 잠기게 한다. 이어서 실리카의 전구물질인 TMOS (Tetramethoxyorthosilicate) 를 담체와 비슷한 양을 취하여 20℃에서 12시간 이상 반응시킨다. 반응이 종결된 bead 들은 n-헥산을 이용해서 세척한 후 글리세롤 (glycerol) 75％ 수용액에 4시간 동안 침지시킨다. 침지가 끝난 bead 들은 여과를 거친 후 상온에서 7일간 경화과정 (hardening) 을 거친다.

이를 이용한 고정화 반응의 경우 CaCl₂ 수용액과 알긴산 나트륨 수용액에서 각각의 농도를 변수로 하여 영향을 분석하는 실험을 수행하였다.

CaCl₂의 경우 농도가 150mM, 200mM 일 때 비교적 가장 우수했고, 고정화 수 율의 경우 150mM 이 다소 높은 결과를 보였다. 반면 효소의 부하 효율은 200mM 이 가장 우수한 결과를 보였다.

다음으로 알긴산 나트륨 수용액의 농도를 달리하면서 고정화에 미치는 영향을 조사하였다. 알긴산 나트륨 수용액의 농도가 증가할수록 다소 부하 효율 가 증가하는 경향을 보였으나 상승폭은 크지 않았다. 반면, 고정화 수율는 큰 폭으로 감소하는 결과를 보였다. 이상의 결과로 볼 때 알긴산 (alginate) 과 규산 (silicate) 의 상호 가교결합 (crosslinking) 네트워크가 좀 더 조밀해지면서 고정화 운반체 (immobilized carrier)의 표면으로부터 내면으로의 물질전달이 어려워지면서 기질의 확산 속도 (diffusion rate) 가 감소한 것으로 추정된다.

＃ 비교 예 2 공유결합법에 의한 효소 고정화

공유결합법 중 가장 널리 알려진 방법은 다공성 실리카 (porous silica) 또는 다공성 유리 (porous glass) 를 실란화 (silanization) 하여서 표면에 아미노기 (NH₂) 를 부착하여 고정화용 지지체의 표면을 기능화 (functionalization) 한 후, 대칭적 구조를 가진 대표적인 물질인 글루타르 알데히드 (glutaraldehyde, GA) 를 반응시켜서 단백질의 자유아미노기 (free NH₂) 이 지지체에 부착될 수 있도록 하는 것이다. GA는 지지체의 물리적 표면과 효소 사이를 있는 가교 결합재로써 훌륭한 역할을 수행한다.

그러나, 반응에 참여하지 않은 GA 나, 담체에 결합된 GA의 free 알데하이드기는 효소의 활성을 감소시킬 수 있다. 즉, 잔여 알데하이드기와 효소의 아미노기 가 시프 염기 (Shiff-base) 를 형성하여 효소의 활성 부위 (active site) 의 변형을 초래할 수 있다. 이러한 시프 염기 (Shiff-base) 의 형성을 막기 위한 방법들이 제시될 수 있는데 본 발명에서는 대표적인 환원제 (reducing agent) 중 하나인 붕산 수소화 나트륨 (sodium borohydride) 을 사용했다.

본 발명에서 사용된 공유결합법은 Walsh 등 (SH Nam, MK Walsh. Covalent immobilization of bovine phospholipase A2. Journal of Food Biochemistry 2005; 29:11, 1-12, Blackwell Publishing.) 에 의한 고정화 방법을 변형하여 이용하였다.

1단계 : 실란화 (silanization) - 운반체 표면에 아미노기 도입

일반적으로 실란화는 APTES (3-aminopropyltriethoxysilane) 또는 APTMS (3-aminopropyltrimethoxysilane) 을 이용하여 아미노기를 실리카 표면에 부착하는 과정으로, 이렇게 함으로써 다양한 유기물이 쉽게 부착될 수 있도록 한다.

본 발명에서는 APTES를 사용하여 실란화를 수행하였으며, 실리카 겔 (pore size 60Å) 을 아세톤을 용매로 하여 15％(w/v)의 APTES에 침지한 후 50℃에서 12시간 동안 교반 반응기 (orbital shaker) 에서 반응시켰다.

2단계 : GA 처리 - 가교제 도입

실란화 반응이 종결된 실리카 겔을 여과한 후 GA 2％를 포함한 50 mM 인산 완충 용액 (phosphate buffer, pH 6.5)에서 4시간 동안 상온에서 반응시켰다.

3단계 : 효소 결합시키기

적정량의 효소 용액 (실리카 겔 1g 당, 효소 10 ml) 을 첨가한 후 4시간 동 안 상온에서 반응시킨다.

4단계 : 환원

반응이 종결된 실리카 겔에 붕소 수소화 나트륨 완충 용액 (sodium borohydride buffer 50mM, phosphate buffer, pH 6.5, sodium borohydride 700ppm) 을 첨가하여 반응시킨 후 과량의 1M NaCl 용액 (50mM phosphate buffer, pH 6.5)으로 실리카 겔을 세척하여 잔여 효소들을 씻어 내고, 완충 용액에 보관한다.

＃ 실시 예 1 가교법과 공유결합법을 동시에 적용하여 혼용한 고정화 방법

단백질로 구성된 효소는 글루타르알데히드 (glutaraldehyde, GA)와 같은 가교제 (crosslinker) 가 존재하는 환경에서 단백질 거대 분자 간의 가교화가 유도된다. 가교화의 정도와 최종적으로 가교화된 단백질의 크기 등은 GA의 첨가량, 반응 온도, 시간 등에 따라 다양하게 변화한다. 침전제 등을 이용하여 침전을 유도한 상태에서 각화 할 경우 눈에 띌 정도의 크기 (0.1mm∼2mm) 까지 커질 수 있는 반면 수용액 상에서 가교화할 경우 눈에 띄지 않는 수준으로 유지될 수도 있다.

또한, 공유 결합 (covalent binding) 방법에서 소개한 것처럼, 는 아민기를 가진 단백질 분자와 결합하여 시프-염기 (Shiff-base) 를 형성하여 다른 지지체와 단백질 분자를 띠우는 장치 (spacer) 역할을 수행할 수 있다.

이러한 사실에 착안하여 완충 용액 상에 GA를 첨가한 다음 GA와 친화성이 높은 지지체 (실리카 기반의 담체) 를 첨가한 후 장시간 교반을 수행하여 효소가 지지체 표면에서 GA 에 의해 결합되면서 동시에 단백질 분자 간에는 가교화가 이루어져 지지체의 표면을 덮는 형식의 고정화 방법을 시도하였다.

특히, 공유결합법의 경우 효소의 불활성화가 예상되기 때문에 효소의 부하 효율 보다 고정화 수율을 높이기 위한 조건을 찾는 것이 중요하였다.

실시 방법은 다음과 같다.

1단계 : 반응단계

먼저, 다양한 농도의 실란화제 (3-APTES) 를 투입한 결과를 점검하였다. 전반적으로 용매로 쓰인 아세톤의 10％(w/v)에서 30％ 범위 내에서는 효소가 고정화되는 비율이 큰 차이를 보이지 않았다. 최적 조건은 고정화 수율, 즉 비활성도가 가장 높게 나타난 것은 아세톤 20％ 농도인 것으로 나타났다.

실리카 겔(100um, non-porous) 2g, 효소용액 (pH 6.5 완충용액 혼합용액) 10ml 을 혼합한 다음 교반한다. 교반이 시작된 이후 GA를 점적하고 20시간 이상 교반을 수행한다. 교반 온도는 4℃ 를 유지한다.

2단계 : 수세

반응이 종료된 후 GA를 세척하기 위해 다량의 증류수로 세척한다. 10배 이상의 증류수로 3회 이상 세척한다.

3단계 : 환원

붕소 수소화 나트륨 (NaBH₄) 이 첨가된 완충용액 (pH 6.5) 을 이용하여 2회 이상 세척한다.

다음으로는 환원제 (reducing agent) 로 사용된 붕소 수소화 나트륨 (sodium borohydride, NaBH₄) 의 효과를 알아보기 위해 처리군과 미처리군 각각 10 건의 샘 플을 취하여 실리카 겔 1g당 총 활성 (total activity) 을 기준으로 통계 처리하였다.

그 결과 나트륨 붕소 수소화물 (sodium borohydride, NaBH₄) 을 이용한 환원 공정이, 효소의 총 활성도 (total activity) 를 20％ 이상 증가 시킨다는 것을 알 수 있었다. 즉, 잔여 알데히드기가 효소와 시프 염기 (Shiff base) 를 형성하지 않도록 함으로써 효소의 화학적 변성을 막고, 반응에 참여할 수 있는 효소의 활성 부위 (active site) 를 늘림으로써 활성을 좀 더 높게 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.

4단계 : 동결 건조 및 냉동 보관

고정화 효소를 동결 건조하여 섭씨 영하 15 도 (-25℃) 이하 냉동 보관하며 사용하였다.

＃ 실시 예 2 고정화 방법에 따른 고정화 효소의 안정성 비교

현재 까지 테스트한 두 가지 형태의 고정화 방법을 이용한 고정화 수율 및 고정화 효율 데이터를 기반으로 반복적인 사용을 했을 때 효소의 활성도 감소율을 알아보기 위해 4차례의 회분식 반응을 통해 결과를 관찰했다.

절대적인 활성도는 알긴산-실리카 졸-겔 담체 (alginate-silicate sol-gel matrix) 를 이용한 고정화 비드가 우월하였으나 반복적 사용에 따른 활성도 감소율 면에서는 공유결합법이 다소 우수한 결과를 보였다.

실험 결과의 표. 4 에서 보는 것처럼, 상대적으로 저렴하고 단순한 고정화 방법을 이용하여 액상의 고정화하지 않은 자유 효소 (free enzyme)에 비하여 높거나, 비슷한 활성을 유지할 수 있었다.

표 4 고정화 방법에 따른 고정화 효소의 안정성 비교

그리고 실리카 담체의 활성 테스트 결과 최종적으로 고정화 수율는 91％ 까지 달성되었으며, 실리카 담체의 고정화 PLA2 24시간 반응을 10회 반복 테스트 결과 초기 활성의 80％ 까지 유지할 수 있었으며, 각 회분식 반응 후 유기용매(클로로포름, 메탄올)로 세척한 것으로 인한 활성 저하가 매우 미미함을 확인할 수 있었다.

본 발명을 통해 최종적으로는 PLA2의 경우 고정화 수율 90％ 이상, 10회 사용 후 초기 활성도 80％를 유지하는 CLEA (CrossLinked Enzyme matrix bound to carrier) 방법을 달성하였다.

알긴산-규산 담체와 및 실리카-공유결합 담체는 매우 훌륭한 고정화 방법으로써 장점들을 보여주었지만, 두 방법 모두 고정화 과정이 오래 걸리고 고려요소가 매우 다양하다는 단점을 지니고 있다.

반면 효소간의 가교결합법과 담체와의 공유결합법을 혼합한 방법을 이용하여 24시간 내에 모든 고정화 과정이 완료되었고, 매우 높은 활성이 유지될 수 있는 효 소 고정화 방법을 제공하였다.

본 방법은 간단한 장치와 재료, 복잡하지 않은 공정 특성을 가지고 있으므로 공정의 재현성 (reproducibility) 과 확장성 (scalability) 이 높아서 산업화가 매우 용이하며, 지지체인 실리카 겔 의 물리적 강도가 높고 회수방법이 간단한 공정 (예: 여과, 원심분리 등) 으로 공업적 적용성이 매우 높다.

＃ 실시 예 3 기질과 효소의 준비 및 실험 기구

각 기질은 사용하는 효소에 따라 각기 다른 반응 환경 조건이 필요하였기 때문에 Lipozyme 계열의 효소와 PLA1 효소를 사용하는 경우, PLA2 효소를 사용하는 경우에 따라 달리 만들어져야 했다. Lipozyme 계열 효소와 PLA1효소는 수분의 영향으로 인한 가수 분해를 낮추기 위하여 인지질과 자유 지방산 형태의 DHA를 무수 헥산(Hexane, anhydrous)에 녹인 후, 유기 용매 하에서 반응을 시도하였다. 또한 장시간의 반응 실험 동안 지질의 산화를 막기 위하여 산화방지제를 첨가하였다.

PLA2 효소를 사용하는 기질의 경우, 인지질과 DHA를 일정 비율로 섞은 후, 헥산(Hexane)에 녹여 교반 후, 감압 농축하였다. 그 후, 반응에 필요한 글리세롤을 첨가하여 기질과 글리세롤이 잘 섞이도록 교반한 후 사용하였다.

고정화된 효소인 Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM은 인지질 대비 무게비로 정량하여 반응에 사용하였고, Lipozyme TL 100L, Lecitase Ultra(PLA1)은 액상 상태의 효소 역시 무게비로 정량하여 사용하였다. Lecitase 10L(PLA2) 효소는 이온 강도에 영향을 크게 받기 때문에 염화칼슘(CaCl₂)과 함께 증류수에 녹여 사용하였 다.

반응은 10mL 유리 바이알에서 수행하였으며 기질과 효소가 충분이 혼합될 수 있는 속도를 유지하며 자석 교반기 (magnetic stirrer) 를 이용하여 교반하였다. 모든 반응은 반응 시간 동안 질소(N₂ 99.99％) 폭기(sparging) 하에 이루어지도록 하여 인지질과 DHA의 산화를 최대한 방지하였다. 각 온도, 시간, 기질의 종류, 효소의 종류, 효소의 양등 여러 조건 인자를 비교 실험 하여 반응 조건의 최적화를 이루고자 하였다.

＃ 실시 예 4 고정화 PLA2 를 이용한 고도불포화지방산 강화 인지질의 효소적 합성

포스포리파아제를 이용하여 치환반응을 유도하고자 할 경우 상업화된 고정화 효소가 없으므로 해서 실험에 어려움을 겪는다. 특히 PLA2의 경우 반응에 CaCl₂ 와 같은 2가 금속이온이 존재하여야 한다는 특징들로 인해 고정화를 통한 치환반응이 성공적으로 보고된 바가 거의 없다.

또한 반응의 특성상 가수분해를 억제하기 위해 유기용매만을 사용하거나, 최소한의 수분함량을 유지해야 하기 때문에 리파아제 (lipase) 를 활용한 반응 시도가 주로 발명되고 있다.

본 발명에서는 PLA2 를 다양한 지지체 - 알긴산, 규산, 키토산 담체 등 - 에 공유결합, 가교화, 포괄법 등 다양한 방법을 사용하여 고정화 하거나, CLEAs 와 같은 carrier-free 형태의 고정화 방법 등도 시도하여 적절한 후보 방법을 선별 (screening) 하였다.

인지질로부터 지방산 1개를 분해한 라이소인지질을 생성하기 위한 반응은 pH 완충 용액 단일계, 또는 pH 완충 용액-에탄올 2상계 시스템 상에서 CaCl₂ 를 보조인자 (cofactor) 로 첨가하여 원활히 진행된다.

일반적으로 효소반응에서 고려될 수 있는 열전달 및 물질전달 등에 관련된 문제가 발생하지 않으며, 매우 안정적이고 신속하게 반응이 이루어지므로 대개 약 6시간 내에 90％ 이상의 반응이 종료된다.

그러나, 지방산 치환 반응의 경우 기질이 모두 유지(지방산, 인지질)로 구성되어 있으며 반응 시스템 중의 수분 함량이 1％ ∼ 10％ 범위 내에서 조절되어야 하므로 고정화 지지체의 표면에서 확산 효율이 극도로 감소할 수 있으며, 알긴산 담체의 경우 대표적인 수화 겔 (hydrogel) 이므로 부분적인 가수분해만 발생할 수 있다. 따라서 가장 바람직한 방법은 지지체의 표면에 효과적으로 효소를 고정화하는 것이라고 짐작할 수 있다. 이에 따라 실리카 겔, 또는 이온교환레진 등의 표면에 효소를 고정화 하는 방법이 모색될 수 있겠다.

본 발명에서는 실리카 겔 표면에 효소-효소 사이의 가교결합을 유도하고 동시에 실리카 겔 표면과의 공유결합을 유도하는 고정화 방법을 이용하여 기존의 공유결합 법, 또는 가교법에 비해 대폭 간소화되고, 효율적인 고정화 방법을 고안하여 PLA2의 아실기 치환반응을 수행하였다.

표 5 고정화 방법에 따른 PLA2의 고정화 결과 비교

표5 에 나타난 것처럼, 비-다공성 실리카 (non-porous silica) 에 가교 결합 (cross-linking) 과 공유 결합 (covalent binding) 을 혼합한 방법이 매우 높은 활성을 보여주고 있어 최종적으로 고정화 리파아제 (lipase) 와 비교할 수 있는 방법으로 제시되었다.

＃ 실시 예 5 효소의 종류에 따른 치환 반응 [도 10]

인지질의 지방산 치환 반응을 위하여 일차적으로 여러 종류의 효소를 탐색할 필요가 있었다.

반응에 사용한 기질의 양은 20mg PC와 자유 지방산 형태의 DHA 40mg을 사용하였다. 효소의 양은 기질인 인지질의 양 대비, 65％의 비율에 해당하는 양을 사용하였으며, 반응 시간은 24시간이며 반응 온도는 각 효소별 최적화 온도를 사용하였다.

리포자임 (Lipozyme) 계열의 효소는 기질을 무수 헥산(anhydrous n-hexane)에 녹여 유기 용매 하에서 이루어졌으며, 레시타제 (Lecitase) 계열의 효소는 전체 기질 양의 20배에 해당하는 글리세롤과 혼합하여 실험하였다.

표 6. 스크리닝 효소의 종류 및 특성

본 발명에서 다루어진 효소는 총 5가지로 크게 Lipozyme과 Lecitase로 나누어 질 수 있다. Lipozyme의 경우 sn-1위치와 sn-3위치의 기질 특이성을 가지며 일반적으로 중성 지질의 치환 반응에 많이 쓰인다. 그러나 일부는 인지질의 치환 반응에도 반응성을 보이며 더불어 반응 후, 인지질의 회수율이 Lecitase에 비하여 상대적으로 높기 때문에 본 발명에 도입하여 실험을 시행하였다. 사용된 효소는 고정화 상태의 효소와 액상 효소를 사용하였으며, 고정화 효소로는 Lipozyme TL IM, Lipozyme RM IM을 사용하였으며, 액상 효소로는 Lipozyme TL 100L을 사용하였다.

Lecitase는 인지질에 기질 특이성을 보이는 효소로써 phospholipase A1 효소인 Lecitase Ultra와 phospholipase A2 효소인 Lecitase 10L을 사용하였다. 반응 실험 후, 일련의 전처리 과정을 거쳐 인지질의 회수율과 지방산의 결합률을 분석하 였다.

그 결과 [도 10] 과 같이 Lipozyme TL IM이 가장 큰 반응성을 보였다. 그러나 인지질의 회수율이 상대적으로 매우 낮았는데, 이는 반응 도중 교반 속도와 소량의 수분에 의해서 Lipozyme TL IM의 고정체인 실리카겔이 깨지면서, 반응 후 효소와 인지질을 분리하는 과정 중 인지질의 일부가 실리카겔에 흡착되었기 때문이다.

반면 Lipozyme RM IM은 Lipozyme TL IM과 비슷한 반응성을 보였으며, 인지질의 회수율 또한 높았다. Lipozyme TL 100L은 Lipozyme TL IM의 고정화 전 액상 효소로써 이론상으로는 비슷한 반응성을 보여야 하나 액상 효소의 단점 상, 기질과 충분히 섞이지 못하여 반응이 거의 일어나지 않았다.

Lecitase Ultra의 경우, 매우 낮은 인지질 회수율과 지방산 결합률을 보였는데, 라이소 인지질의 생성이 컸던 것으로 보아 가수 분해가 활발히 일어난 것으로 보여 진다. 반면 치환 반응은 거의 일어나지 않았다. Lecitase 10L은 중간 정도의 반응성과 인지질 회수율을 보였기 때문에 반응 조건의 최적화를 통하여 반응율을 높이기로 하였다.

위의 실시 결과에 따라 효소의 탐색 결과 Lipozyme RM IM과 Lecitase 10L, 두 가지 효소를 최적화 실험에 사용하기로 결정하였다.

＃ 실시 예 6 수분 함량에 따른 치환 반응 [도 11]

치환 반응에서 가장 중요한 인자 부분이 수분의 함량이었다. 일반적으로 효소는 효소 반응 환경의 수분 함량에 따라 반응의 활성도가 달라지므로 반응에 활발 히 참여할 수 있는 일정량의 수분이 요구된다. 따라서 가장 먼저 수분의 양에 따른 최적화 실험이 요구되었는데 이를 위하여 수분의 함량별로 실험을 실시하였다.

실험에 사용한 기질의 종류는 표준물질 PC와 자유 지방산 형태의 DHA이며, 기질의 양은 PC 10mg과 DHA 20mg으로 몰 비율은 1대 5이다. 사용한 글리세롤의 양은 0.55g이며 이를 혼합한 혼탁액 상태의 기질에 효소 용액을 첨가하여 반응하였다. 효소 용액은 염화칼슘과 PLA2 효소인 레시타제 (Lecitase 10L) 과 증류수의 혼합액이다. 기질인 PC양의 100％에 해당하는 10mg의 Lecitase 10L과 0.3mg의 염화칼슘을 포함한 증류수 혼합 용액을 각각 20㎕, 40㎕, 60㎕, 80㎕씩 기질에 첨가하여 수분의 양에 따른 치환 반응 수율을 비교하였다. 반응 온도는 25℃이며 반응 시간은 24시간이다.

실시 결과 수분의 함량이 60㎕일 경우 가장 높은 PUFA 함량을 보였고, 인지질의 회수율 또한 가장 높았다. 또한 인지질의 회수율이 수분 함량이 증가할수록 감소하는 것으로 보아 가수 분해 반응이 활발하게 일어났음을 알 수 있었다. 일련의 실험 결과를 통하여 가수 분해 반응과 경쟁적인 반응 관계에 있는 치환 반응을 높이기 위한 조건으로 수분이 60㎕인 경우가 가장 반응에 적합함을 알 수 있었다.

＃ 실시 예 7 반응온도에 따른 치환 반응 [도 12],[도 13]

효소 반응의 반응 환경 중, 온도 조건은 각 효소의 종류별로 특성화되어있기 때문에 효소의 탐색 실험 과정에서 선정된 두 가지 효소인 Lipozyme RM IM과 Lecitase 10L를 각각 다른 온도 하에서 실험하였다.

각 효소의 최적화 반응 온도는 효소의 공급업체인 노보자임 사 (Novozymes) 에서 제공한 최적화 온도 조건을 따랐으며 그것을 기준으로 하여 10℃의 간격으로 최적화 실험을 수행하였다.

리포자임 (Lipozyme RM IM) 의 경우 최적화 온도가 50 ∼ 70 ℃이나, 고온에 의한 기질의 산화를 고려하여 70℃는 비교 대상에서 제외하고, 온도 비교 조건을 각각 40℃, 50℃, 60℃로 설정하여 실험하였다. 실험에 사용한 기질은 난황 인지질 GL-90E 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 80mg이며, 1 대 10의 몰 비율로 두 기질을 무수 헥산 1mL과 혼합하여 용해한 후, 인지질 대비 65％양의 효소를 넣어 반응하였다. 반응 시간은 24시간이다.

레시타제 (Leitase 10L) 의 경우, 온도 비교 조건은 각각 25℃, 35℃, 45℃로 정하였으며. 실험에 사용한 기질은 난황 PC와 자유 지방산 형태의 DHA다. 기질은 PC 20mg과 DHA 40mg을 헥산에 녹여 혼합한 후, 헥산을 감압 농축하여 두 기질을 혼합하였다. 그 후, 글리세롤 1.1 g 을 첨가하여 교반, 혼탁액을 만들었다. 이 혼탁액에 기질 대비 100％의 효소 양을 첨가한 후, 24시간 반응하였다. 효소는 0.6mg의 염화칼슘과 함께 120㎕의 증류수에 미리 녹여 준비한 후, 첨가하였고 수분의 함량은 선행된 수분 함량 최적화 실험의 결과를 적용한 비율에 따랐다.

실시 결과는 [도 12] 과 같이 반응 온도가 50℃ 일 때 가장 높은 치환 반응 수율을 보였으며, 60℃인 경우 오히려 반응 수율이 감소하였다. 인지질의 회수율에는 각 온도 모두 큰 차이를 보이지 않았다.

Lecitase 10L의 최적 온도 조건은 30∼40℃로 Lipozyme 효소에 비해 상대적으로 낮은 온도 하에서 최적화 온도 실험이 진행되었다. 실험의 결과는 [도 13] 과 같이 반응 온도가 35℃ 경우 인지질에 결합한 PUFA의 함량이 가장 높았으며 인지질의 회수율은 다소 감소하는 경향을 보였으나 다른 온도 조건과 큰 차이를 보이진 않았다.

＃ 실시 예 8 반응 시간에 따른 치환 반응 [도 14], [도 15]

효소의 반응 시간에 따른 치환 반응율과 인지질의 회수율과의 관계 및 반응을 최적화할 수 있는 적합한 반응 시간을 알아보기 위하여 각 시간별로 실험을 실시하였다.

반응 시간의 비교를 위하여 반응은 각각 24시간, 48시간, 72시간 84시간 동안 이루어졌다.

Lipozyme RM IM의 경우, 반응 온도는 50℃이며 사용한 기질의 양은 난황 인지질 GL-90E 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 80mg이다. 효소는 인지질 양의 65％에 해당하는 양을 사용하였다.

Lesitase 10L의 경우, 역시 같은 반응 시간 조건을 비교하였으며 반응 기질로 난황 PC와 자유 지방산 형태의 DHA를 사용하였다. 반응 온도는 35℃이며, 각 기질의 사용양은 PC 20mg과 DHA 40mg, 효소의 양은 PC의 양에 100％되는 양을 사용하였다.

Lipozyme RM IM을 사용한 반응의 결과는 [도 14] 과 같이 반응 시간이 84시간일 때 대략 30％의 가장 높은 치환 반응율을 보였다. 그러나 인지질의 회수율은 상대적으로 낮은 55％에 달하였다. 반응 시간이 점차 길어짐에 따라 인지질의 회수율이 감소하는 경향을 보였는데, 이는 반응 시간이 길어질수록 효소의 가수 분해로 인하여 인지질이 라이소 인지질로 전환되었기 때문이다.

Lecitase 10L을 사용한 경우, [도 15] 의 결과에서 알 수 있듯이 가장 높은 치환 반응율을 보인 것은 84시간이었으며 약 25％의 치환 반응율을 보였다. 이때의 인지질의 회수율은 약 5％ 정도로 대부분의 인지질이 라이소 인지질로 가수 분해된 것을 알 수 있었다. Lecitase 역시 Lipozyme과 마찬가지로 시간이 지남에 따라 가수 분해율이 증가하면서 인지질의 회수율이 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 반면 지방산의 치환율은 점차 증가하였다. 그러나 상대적으로 Lecitase의 경우 Lipozyme에 비하여 매우 낮은 인지질 회수율을 보였다.

＃ 실시 예 9 효소의 양에 따른 치환 반응

반응에 사용하는 효소의 양은 반응 공정이 상업화되었을 때, 제품의 생산 비용과 직결하는 문제임으로 반응을 충분히 일으킬 수 있는 동시에 경제성이 있어야 한다. 이론적으로 보았을 때, 효소의 양을 많이 사용할수록 반응율은 높아지며 전체 반응 시간은 짧아진다. 본 실험에서는 효소의 양에 따른 치환 반응율의 차이를 비교하였다.

효소의 양에 따른 치환 반응율의 차이를 비교하기 위하여 효소의 양을 각각 30％, 65％, 100％로 조절하여 실험하였다.

Lipozyme RM IM을 이용한 반응의 경우 [도 16], 반응 온도는 50℃이며 사용한 기질의 양은 난황 인지질 GL-90E 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 80mg이다. 실험은 48시간 동안 이루어졌다.

Lecitase 10L의 경우 [도 17], 역시 같은 조건 하에서 비교하였으며 반응 기 질로 난황 PC와 자유 지방산 형태의 DHA를 사용하였다. 사용양은 PC 20mg과 DHA 40mg으로 몰 비율 1대 5의 비율이며, 반응 온도는 35℃, 반응 시간은 48시간이다.

실시 결과, Lipozyme RM IM의 양이 증가할수록 치환 반응율이 높아졌으며 기질인 인지질 양 대비 100％의 효소를 사용하였을 경우, 약 30％의 치환 반응율을 보였다. 결론적으로 첨가된 Lipozyme RM IM의 양에 따라 치환 반응율의 변화가 컸으며, 이는 충분한 양의 효소가 반응에 필요하다는 것을 의미한다. 동시에 효소의 재사용 부분을 생각해야함을 의미한다.

Lecitase 10L의 경우, 실험의 결과 Lecitase 10L의 양이 증가할수록 치환 반응율은 높아졌으며, 반면에 인지질의 회수율은 감소하였다. 또한 Lipozyme RM IM과 비교하였을 때, 전반적으로 치환율이나 인지질 회수율이 낮은 경향을 보였다. ([도 16], [도 17])

＃ 실시 예 10 기질의 종류에 따른 치환 반응 - ① DHA의 형태에 따른 치환 반응 [도 18]

실시를 위하여 사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 기질로 사용하는 DHA를 각각 에틸 에스테르 형태(DHA 50％)와 자유 지방산 형태(DHA 80％)로 나누어 비교하였으며 반응 기질로 난황 PC를 사용하였다. 사용양은 PC 20mg과 각 형태의 DHA 40mg으로 몰 비율 1대 5의 비율이며, 반응 온도는 35℃이고 반응 시간은 24시간이다.

자유 지방산 형태의 DHA의 경우 DHA가 80％ 포함된 기질이었기 때문에 에틸 에스테르 형태의 DHA 기질과 순도를 맞추기 위하여 순도가 낮은 자유 지방산 형태 의 DHA 오일을 사용하여 희석을 한 후, 반응 기질로 사용하였다. 효소의 양은 PC의 양에 100％되는 양을 사용하였다.

실시 결과, 동일한 반응 조건 하에 자유 지방산 형태의 DHA를 사용한 경우, 약 8％의 치환 수율을 보인 반면, 에틸 에스테르 형태의 DHA의 경우, 약 2％ 정도의 치환 수율을 보였다. 이는 에틸 에스테르 형태의 DHA가 반응에 참여하였을 때, 효소가 안정적인 에틸 에스테르 형태의 연결을 끊은 후, 다시 치환 반응에 참여해야하기 때문에 상대적으로 두 개의 반응에 놓여있는 상태가 되는 것이다. 따라서 자유 지방산 형태의 DHA보다 반응 수율이 떨어졌다고 볼 수 있다. ([도 18])

＃ 실시 예 11. 기질의 종류에 따른 치환 반응 - ② 인지질의 종류에 따른 치환 반응 [도 19]

실시에 사용한 인지질의 종류는 크게 sn-2 위치의 지방산이 분리된 라이소 포스파티딜콜린 (lyso-PC) 와 포스파티딜콜린 (PC) 형태로 구분하였다. 그리고 GL-90E를 사용하여 포스파티딜콜린 (PC) 이 70％ 이상이고, 다른 형태의 인지질과 중성 지질이 소량 섞여있는 형태로 나누어 실험하였다.

실시를 위하여 사용한 효소는 레시타제 (Lecitase 10L) 이며, 사용양은 각 인지질 종류별로 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 40mg으로 몰 비율 1대 5의 비율이고 사용한 효소의 양은 인지질 양 대비 100％이며, 반응 온도는 35℃, 반응 시간은 48시간이다.

실시 결과, 라이소 PC 형태의 기질을 사용한 경우, 20％ 이상의 치환 반응율을 보였으나 인지질 회수율이 PC를 사용한 경우 보다 다소 낮았다. 이는 라이소 형 태의 PC가 상대적으로 반응에 참여하기는 쉬운 형태라는 것을 보여준다. GL-90E의 경우 어느 정도의 반응 수율을 보였으나 PC에 비하여 낮은 반응 수율을 보였다. 이는 GL-90E의 기질 내에 있는 소량의 중성 지질이 인지질과의 치환 반응을 저해하였기 때문이라 여겨진다.

([도 19])

＃ 실시 예 12. 기질의 양에 따른 치환 반응 [도 20]

기질로 사용하는 DHA의 양에 따른 치환 반응 수율을 알아보기 위하여 DHA의 비율을 다르게 하여 실험하였다.

실시에 사용한 효소는 리포자임 (Lipozyme RM IM) 이며 반응 온도는 50℃이며 사용한 기질의 양은 난황 인지질 (GL-90E) 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 각각 80mg과 120mg이다. 몰 비율은 전자는 약 1대 10, 후자는 약 1대 15로 반응은 무수 헥산에 녹여 이루어졌으며, 반응에 사용한 효소의 양은 인지질의 기질 대비 65％이다.

[도 20] 의 결과와 같이 반응에 참여하는 DHA의 양이 증가한 경우, 치환 반응율이 증가하였으며 또한 인지질의 회수율도 증가하였다.

＃ 실시 예 12. 물 유사물질 (water mimics) 사용에 따른 지방산 치환 반응

[도 21]

물 유사물질은 효소 반응 시, 물과 비슷한 성질로서 반응의 활성을 높여주는 역할을 한다. 일반적으로 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 또는 프로필렌글리콜(propylene glycol)이 물 유사물질로 사용되며, 반응의 활성을 도우나 많은 양을 사용할 경우, 가수 분해 반응을 높여 인지질의 회수율을 떨어뜨리는 단점을 가지고 있다.

실시에 사용한 효소는 리포자임 (Lipozyme RM IM) 이며 반응 온도는 50℃이며 사용한 기질의 양은 난황 인지질 (GL-90E) 20mg과 자유 지방산 형태의 DHA 80mg이다. 반응은 무수 헥산에 녹여 이루어졌으며, 반응에 사용한 효소의 양은 인지질의 기질 대비 65％이다.

프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 0.5㎕를 반응에 사용하였으며, 반응에 앞서 프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 과 기질의 혼합을 위하여 초음파 세척기에 10분간 처리하였다.

이 실시 결과에서는 프로필렌글리콜의 사용 유무에 따른 치환 반응 수율을 살펴보았다. 실험의 결과 인지질의 회수율에는 큰 차이를 보이지 않았으나 프로필렌글리콜을 사용한 경우, 치환 반응 수율이 높아짐을 볼 수 있었다. ([도 21])

＃ 실시 예 13 고정화 PLA2를 이용한 고도불포화지방산 강화 인지질의 효소에 의한 합성에서 수분과 DHA 함량에 따른 DHA 치환율의 변화

고정화 PLA2 를 이용한 실시를 통해 리파아제와 또 다른 형태의 반응 특성을 규명할 수 있었다.

Lipozyme RM IM 의 경우 매우 안정되고 강한 활성을 보여주는 대표적인 Lipase 로써의 이용 가능성이 엿보인다. 가장 비슷하다고 할 수 있는 Lipozyme TL IM 의 경우 Xuebing(2002) 등의 연구결과에서 Lipozyme RM IM 에 대별되는 가능성을 보여주었으나 지지체의 물리적 견고성이 부족하여 전체적인 활용가능성이 미흡 하다. 그러나, 상대적으로 저렴한 가격(Lipozyme RM IM 의 20％ 수준)은 장점으로 남아있다.

본 발명에서 사용된 Lipozyme RM IM 은 이온교환레진에 흡착방식으로 미생물 유례의 리파아제 (Lipase) 를 고정화 한 것으로 매우 안정된 활성을 보여준다.

반면 PLA2 의 경우 수분함량 등에 매우 민감하며, Ca 이온의 존재 여부가 활성에 영향을 줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

[표 7] 과 [표 8] 에서 보여지는 것처럼 DHA의 양은 크게 영향을 미치지 못했다. 반면 수분함량과 칼슘이온은 PLA2 고정화 효소의 활성에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.

표 7. 반응 후 인지질 내 DHA 함량 (CaCl ₂ 무첨가 군)

표 8. 반응 후 인지질 내 DHA 함량 (CaCl ₂ 첨가 군)

＃ 실시 예 14 고도 불포화 지방산 함유 인지질 생성 후의 정제

효소 반응 실험이 끝난 상태의 반응물인 인지질과 자유 지방산 DHA 혼합물 100mL을 에탄올 100mL을 사용하여 용해한 후, 여과하여 효소와 분리하였다. 분리한 혼합물 에탄올 용액 200mL을 추출기에 넣었다 [도 22]. 추출기의 뚜껑을 봉한 후, 추출기의 온도를 45℃, 압력을 16MPa로 가온 가압하였다. 한 개의 분리기를 사용하였으며 추출기에서 분리기로 나누어지는 부분에 압력조절장치를 사용하여 압력을 4MPa로 감압하였다. 분리기의 온도는 추출 시간동안 30℃를 유지하였으며, 추출기에 초임계 상태의 이산화탄소를 시간당 1.6L의 비율로 흐르게 하여 지방산을 추출하였다.

실시 결과 [도 23] 과 같이 총 추출에 소요된 시간은 90분이며, 추출을 시작한 지 약 30분, 이산화탄소의 유량이 약 900g이 되는 시점에서 전체 지방산의 50％ 이상에 해당하는 양이 추출되었음을 확인 할 수 있었다. 더불어 대부분의 추출물이 60분 이내에 추출되었다. 추출 후, 라이소 인지질을 포함한 전체 인지질의 회수율은 약 98％에 달하였다. 이와 같이 초임계 이산화탄소 추출 공정을 통하여 별도의 용매 추출 공정 없이 짧은 시간 내에 효과적으로 인지질과 지방산을 분리할 수 있었다.

＃ 실시 예 15 스케일 업 - 산업적 이용 가능성 확인

[표 9]

스케일 업 테스트를 통해 랩 스케일에서 확립된 최적화 조건의 산업적 이용 가능성을 검증해 보았다.

인지질 지방산 치환반응의 재현성을 확인하고, 생산 규모의 응용을 위한 주요변수 들을 도출하고 최적화하기 위해, 실험 규모를 확대하여 수 ml 스케일이던 것을 500 L 스케일로 확대 실시하였다.

재현성 및 조건 최적화를 위하여 총 10회 반복 실시하였으며, 50℃ 온도에서 48시간 동안 300rpm 교반속도를 유지하면서 반응을 수행하였다.

본 실시예에 사용된 모든 효소는 고정화 PLA2 로써, 실리카 겔(평균 입도 100마이크론, non-porous)에 고정화된 형태로 사용하였다. 스케일 업 실험의 과정은 다음과 같다.

1) 반응에 사용될 기질은 50％ 에탄올 용액 상태의 인지질과 지방산을 가온 상태에서 혼합한 다음, 혼화 상태가 균질화 되었을 때 감압 농축하여 용매를 제거한다. 이것이 기질 용액이다.

2) 반응기에 500 L의 반응 기질(인지질, DHA지방산 혼합물) 및 인지질 중량 기준 30％ 의 고정화 PLA2 를 첨가한다.

3) 수조 (water bath) 에서 가온하며 48시간 반응을 진행한다.

4) 반응이 종료된 반응 혼합물은 200 메쉬 체를 통해 여과하여 고정화 PLA2 를 거른다.

5) 분석을 위하여 10ml 의 샘플을 취한다음 여액은 초임계 이산화탄소 추출기 내에 200ml 씩 칭량하여 부은 다음 가압 하에서 3시간 동안 자유지방산을 추출하고, 인지질을 회수한다.

표 9. 고정화 PLA2를 이용한 PL-PUFA 합성 스케일업 테스트 결과

＃ 실시 예 16 포화 지방산의 선택적 치환

300g 고정화 PLA2 효소를 10L 반응기에 넣고, 시료 1,2,3,에 100mM 칼슘 용액을 각각 50, 100, 150 mL 를 첨가하였다. 4.5kg 인지질-지방산 혼합 반응액을 가하였다. 이를 질소 환경에서 50 ℃에서 20시간 동안 반응하였다.

반응 후의 액은 3L 석유 에테르로 3회 추출하였고, 이를 아세톤 침전하여 인지질을 회수하여 지방산의 치환 상태를 분석하였다.

실시 결과, 스테아르 산의 함량을 16％에서 44％로 높이고, 팔미트 산은 27％에서 34％까지 높일 수 있었다.

고정화 효소 표면의 수 활성 (water activity) 를 높아져서 포화 지방산의 치환을 선택적으로 증가시킨 것으로 추측되었다.

표 10 포화 지방산의 선택적 치환 실시 결과

＃ 실시 예 17 불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환

300g 고정화 PLA2 (Lecitase 10L)를 10L 반응기에 넣고, 4.5kg 인지질-지방산 (DHA) 혼합 반응액과 100 mM 칼슘 용액을 가하였다. 100 mM 칼슘 용액을 각각 시료1과 시료2에는 50 mL, 시료3과 시료4에는 100 mL 씩 첨가하였다. 또한 넣는 순서를 시료1과 시료3은 칼슘용액 먼저, 시료2와 시료4는 인지질-지방산을 먼저 넣었다. 이를 질소 환경에서 50 ℃에서 20시간 동안 반응하였다.

반응 후의 액은 3L 석유 에테르로 3회 추출하였고, 이를 아세톤 침전하여 인지질을 회수하여 지방산의 치환 상태를 분석하였다.

실시 결과, 시료2와 시료4에서는 DHA 가 뚜렷하게 증가하였다. 불포화 지방산이 고정화 효소 표면의 수 활성이 낮을 때 더 잘 치환되었다(표 11). 불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환 과정에서, 인지질 회수 정도도 TLC 를 보면 충분함이 확인되었다(도 24).

표 11 포화, 불포화 지방산의 선택적 치환 결과

＃ 실시 예 18 고정화 효소 칼럼 반응기에서 불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환

약 5 리터 (약 6 kg) 부피의 고정화 PLA2 (Lecitase 10L)를 칼럼 반응기에 충전하였다. 100 리터 부피의 인지질-지방산 (DHA) 혼합 기질에, 1 리터의 100 mM 칼슘 수용액을 혼합하였다. 이를 질소 환경에서 50 ℃에서 20시간 동안, 분당 3 리터로 순환시키며 반응시켰다.

반응 후의 액은 초임계 이산화탄소로 추출하여 반응하지 않은 지방산을 회수하였다. 이때 분말 상태로 인지질을 정제되므로 지방산의 치환 상태를 분석하였다.

실시 결과, 불포화 지방산이 치환이 재현되었다(표 12).

표 12 고정화 효소 칼럼 반응기에서 불포화 지방산의 선택적 치환 결과

＃ 실시 예 19 고정화 효소 칼럼 반응기에서 불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환의 시간적 변화

약 5 리터 (약 6 kg) 부피의 고정화 PLA2 (Lecitase 10L)를 칼럼 반응기에 충전하였다. 100 리터 부피의 인지질-지방산 (DHA) 혼합 기질에, 1 리터의 100 mM 칼슘 수용액을 혼합하였다. 이를 질소 환경에서 50 ℃에서 24시간 동안, 분당 3 리터로 순환시키며 반응시켰다.

반응 후의 액을 시간 별로 시료를 취하여, 아세톤 침전하여 인지질을 정제하여 지방산의 치환 상태를 분석하였다.

실시 결과, 불포화 지방산이 치환된 후 유지 되었다(표 13).

표 13 고정화 효소 칼럼 반응기에서 DHA의 치환 비율의 변화

＃ 실시 예 20 고정화 효소 칼럼 반응기(PFR) 에서 불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환의 연속 공정 운전

약 5 리터 (약 6 kg) 부피의 고정화 PLA2 (Lecitase 10L)를 칼럼 반응기에 충전하였다. 100 리터 부피의 인지질-지방산 (DHA) 혼합 기질에, 1 리터의 100 mM 칼슘 수용액을 혼합하였다. 이를 질소 환경에서 50 ℃에서 90분 동안, 분당 1 리터로 통과시키며 반응시켰다.

칼럼 통과 직후의 액을 시간 별로 시료를 취하여, 아세톤 침전하여 인지질을 정제하여 지방산의 치환 상태를 분석하여 sn-2 DHA 치환율을 60％ 정도로 측정되었다.

실시 결과, 불포화 지방산이 치환된 후 유지 되었다(표 14).

표 14 PFR 운전 방식의 고정화 효소 칼럼 반응기의 연속 공정에서 DHA의 치환 비율의 변화

본 발명은 산업적 이용가능성이 매우 높다. 기질과 효소를 모두 천연 소재를 이용하므로 식품 안전성이 높다. 그리고 두뇌 건강에 매우 유익하므로 건강 기능성 식품으로의 응용의 범위가 매우 넓다.

본 발명의 고도 불포화 지방산 함유 인지질 제조 기술은 무해한 용매를 이용하여 제조하며, 선택성과 생산성이 우수한 효소 반응을 진행할 조건을 제시함으로써 산업적 이용 가능성을 높였다.

도 1 은 인지질의 생합성 방법의 전체 순서도

인지질로부터 보통 지방산을 고도 불포화 지방산으로 치환하여 고도 불포화 지방산 - 인지질의 생합성 방법의 전체 순서도이다. 공정 (표기: 정사각형, 마름모) 별로 투입되는 재료 (표기: 6각형)와 부산물 (표기: 사다리꼴), 주산물 (표기: 타원형)을 표시한다.

도 2 는 고정화에 미치는 CaCl₂의 영향 그래프

반응조건 : Sodium Alginate solution 2％, enzyme solid 5mg/ml, Bead size 1.5mm

도 3 은 고정화에 미치는 Sodium Alginate 농도의 영향

반응조건 : CaCl₂ 200mM, enzyme solid 5mg/ml, Bead size 1.5mm

도 4 는 Alginate-silicate sol-gel matrix bead after hardening

도 5 는 Alginate-silicate sol-gel matrix 비드의 표면 SEM(scanning electron microscopy) 이미지

도 6 는 실란화 반응에서 3-APTES의 첨가량이 미치는 영향

용매로는 아세톤을 사용하였으며, 2시간 동안 50℃에서 반응하였다.

도 7 는 고정화 후 환원 처리 효과

sodium borohydride에 의한 reducing 처리가 미치는 영향이다. 반응 횟수 N=10; NaBH4 처리군의 평균 활성도 = 220 U/g gel beads, 비처리군=1.7 U/g gel beads

도 8 은 고정화 효소 PLA2 의 전자현미경 사진

도 9 는 효소 가교법의 개념도

효소를 가교제를 작용 시켜 담체 표면에 고정함과 동시에 효소 사이의 가교를 결합시켜 높은 농도의 효소를 고정화하는 기술의 개념도이다.

도 10 은 효소의 종류에 따른 치환 반응 결과

A:Lipozyme TL IM, B:Lipozyme RM IM, C:Lipozyme TL 100L, D:Lecitase Ultra, E:Lecitase 10L의 5가지 효소를 반응에 사용하였으며 사용양은 인지질 무게 대비 65％이다. 반응 온도는 Lipozyme 계열 효소는 50℃, Lecitase 계열 효소는 25℃이며 반응 시간은 24시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 11 은 수분 함량에 따른 치환 반응 결과

사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 사용양은 인지질 무게 대비 100％이다. 반응 온도는 25℃이며, 반응 시간은 24시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 12 는 반응 온도에 따른 치환 반응 결과 1

사용한 효소는 Lipozyme RM IM이며, 사용양은 인지질 무게 대비 65％이다. 반응 시간은 24시간, GL-90E / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/10 (mol/mol)이다.

도 13 은 반응 온도에 따른 치환 반응 결과 2

사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 사용양은 인지질 무게 대비 100％이다. 반 응 시간은 24시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 14 는 반응 시간에 따른 치환 반응 결과 1

사용한 효소는 Lipozyme RM IM이며, 사용양은 인지질 무게 대비 65％이다. 반응 온도는 50℃이며, GL-90E / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/10 (mol/mol)이다.

도 15 는 반응 시간에 따른 치환 반응 결과 2

사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 사용양은 인지질 무게 대비 100％이다. 반응 온도는 35℃이며, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 16 은 효소 양에 따른 치환 반응 결과 1

사용한 효소는 Lipozyme RM IM이다. 반응 온도는 50℃이며, 반응 시간은 48시간, GL-90E / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/10 (mol/mol)이다.

도 17 은 효소 양에 따른 치환 반응 결과 2

사용한 효소는 Lecitase 10L이다. 반응 온도는 35℃이며, 반응 시간은 24시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 18 은 DHA의 형태에 따른 치환 반응 결과

사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 사용양은 인지질 무게 대비 100％이다. 반응 온도는 35℃이며, 반응 시간은 24시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다. 사용한 기질은 ethyl ester 형태의 DHA와 자유 지방산 형태의 DHA이며 순도는 50％이다.

도 19 는 인지질의 종류에 따른 치환 반응 결과

사용한 효소는 Lecitase 10L이며, 사용양은 인지질 무게 대비 100％이다. 반응 온도는 35℃이며, 반응 시간은 48시간, Phosphatidylcholine / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/5 (mol/mol)이다.

도 20 은 기질의 양에 따른 치환 반응 결과

사용한 효소는 Lipozyme RM IM이며, 사용양은 인지질 무게 대비 65％이다. 반응 온도는 50℃이며, 반응 시간은 48시간이다.

도 21 은 water mimics 사용에 따른 치환 반응 결과

A: propylene glycol 0.5㎕ 사용, B: 사용 안함. 반응에 참여한 효소는 Lipozyme RM IM이며, 사용양은 인지질 무게 대비 65％이다. 반응 온도는 50℃이며, 반응 시간은 48시간, GL-90E / FF DHA의 기질 혼합 비율은 1/10 (mol/mol)이다.

도 22 는 인지질과 지방산의 분리 추출 공정에 사용된 500 mL 랩용 초임계 추출기 플랜트

도 23 은 초임계 CO2 추출 공정에 따른 추출물의 추출 곡선

추출기 압력은 16MPa이며 온도는 45℃, 분리기의 압력은 4MPa이며, 온도는 30℃이다. 초임계 이산화탄소의 유량은 시간당 1.6L이다.

도 24 는 반응 후 TLC 결과

불포화 지방산 (DHA) 의 선택적 치환 과정에서, 인지질 회수 정도를 TLC 로 확인한 결과이다.

Claims (15)

1. 인지질에 지방산을 선택적으로 치환하여서 설계된 구조의 기능성 인지질의 제조 방법으로서

   포스포리파아제 A2 (PLA2) 에 의해 인지질 (phospholipid) 을 기질로 지방산을 치환한 인지질을 생합성하는 과정에서 지방산의 치환 위치와 지방산 종류의 선택성 향상을 위한 효소를 선택하고, 고정화 효소의 제법과 보조인자(cofactor)의 첨가 순서, 기질의 용해 순서를 선택하여서, 효소와 기질 분자들의 상호작용을 조절하는 방법으로서,

   제 1 단계 : 포스포리파아제 A2 (PLA2)의 고정화;

   실리카 표면이 평탄면으로 노출된 담체에 sn-2에 선택적으로 작용하는 포스포리파아제 A2 (PLA2) 를 효소 분자 사이의 가교결합과 담체와 효소 사이의 공유결합을 동시에 수행시켜 효소를 고정화한 다음, 환원제로 환원한 후, 건조한다.

   제 2 단계 : 효소와 재료들의 순서적 혼합;

   최대한 건조된 고정화 효소에 인지질, 지방산, 보조인자(cofactor) 등을 선택적 순서로 혼합하되 보조인자인 Ca-수용액을 최후에 혼합하여 고정화 효소 표면의 수 활성 (water activity) 을 낮춘다.

   제 3 단계 : 인지질의 지방산 치환 반응;

   혼합액을 섭씨 20 ∼ 70 도 중에 특정온도에서 인지질의 지방산을 치환한다. 고정화 효소의 표면의 수 활성 (water activity) 을 낮게 유지하여 생성된 인지질 속의 고도 불포화 지방산의 함량이 높인다.

   제 4 단계 : 인지질의 정제;

   반응된 액체에서 고정화 효소와 반응되지 않은 지방산을 회수하고 지방산이 선택적 치환된 인지질을 정제한다.

   위 공정을 미세한 환경과 정확한 순서를 조절하여 수행함을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 인지질의 제조 방법
2. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 1단계 효소 고정화 공정 중에서, 입도가 50 ∼ 200 미크론(micrometer)인 실리카 표면이 평탄면으로 노출된 담체에 포스포리파아제 A2 (PLA2) 를 고정화하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조 방법
3. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 1단계 효소 고정화 공정 중에서, 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 같은 가교제를 작용시키되, 효소 분자 사이의 가교결합과 담체와 효소 사이의 공유결합을 동시에 수행시켜 효소를 고정화하는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조 방법
4. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 1단계 효소 고정화 공정 중에서, 효소를 고정화한 후, 붕소 수소화 나트륨 (sodium borohydride, NaBH₄) 와 같은 환원제로 환원시키는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조 방법
5. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 1단계 효소 고정화 공정 중에서, 효소를 고정화한 후, 동결건조와 같은 방법으로 건조하여 수분을 최소화 시키는 것을 특징으로 하는 고정화 효소의 제조 방법
6. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 가장 나중에 반응 고정화 효소에 혼합하여 수 활성 (water activity) 를 낮추어서 공정을 수행함을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함량을 높인 인지질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
7. 제 1 항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 가장 먼저 고정화 효소에 혼합하여 수 활성 (water activity) 를 높여서 공정을 수행함을 특징으로 하는 포화 지방산 함량을 높인 인지질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
8. 제 6 항과 제 7 항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 수용액 기준으로 10 ∼ 200 mM 농도로 조절하고 반응 기질의 부피 기준으로 0.3 ∼ 1.0 퍼센트로 첨가량을 조절하여 인지질을 생성 효소반응의 보조인자로 작용시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
9. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 가장 나중에 고정화 효소에 혼합하여 수 활성 (water activity) 를 낮추되, 3단계에서 건조한 아르곤, 질소, 헬륨 등을 가한 상태로 대기압보다 0.1 ∼ 0.5 기압 높게 공정을 수행함을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함량을 높인 인지질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
10. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 가장 나중에 고정화 효소에 혼합하여 수 활성 (water activity) 를 낮추되, 3단계에서 수활성을 낮게 유지하기 위하여 대기압보다 0.1 ∼ 0.5 기압 낮은 감압 진공 상태로 수분을 제거시키는 공정을 수행함을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함량을 높인 인지질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
11. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 2단계에서 Ca-수용액을 가장 나중에 고정화 효소에 혼합하여 수 활성 (water activity) 를 낮추되, 3단계에서 수활성을 낮게 유지하기 위하여, 무수 염화칼슘이나 무수 실리카와 같은 건조제를 첨가한 상태로 공정을 수행함을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함량을 높인 인지질을 생성시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
12. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 4단계에서 지방산을 회수할 때 초임계 이산화탄소로, 온도는 섭씨 40 ∼ 75 도로 하고, 압력은 15 ∼ 40 MPa 로, 추출하는 것 을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
13. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 4단계에서 지방산을 회수할 때, 영하 20 ∼ 영하 30 도의 초저온 아세톤으로 추출하는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
14. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 제3단계에서 고정화 효소 충진 칼럼에서 칼럼 부피의 1배 ∼ 40 배의 반응용 기질을 순환시키되, 1 분마다 칼럼 부피의 0.1 ∼ 2.0 배 부피의 기질 혼합 용액을 순환하며 10 ∼ 40 시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법
15. 제 1항에 있어서, 위 공정 중에 제3단계에서 고정화 효소 충진 칼럼을 플러그 플로우 반응기 (Plug Flow Reactor, PFR) 에서 칼럼 부피의 무제한으로 생산할 만큼의 반응용 기질을 준비하고, 1 분마다 칼럼 부피의 0.05 ∼ 0.3 배 부피의 기질 혼합 용액을 통과하며 연속 반응시키는 것을 특징으로 하는 인지질의 제조 방법

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