KR20230015546A - 인지질 분해능이 개선된 바실러스 메가테리움 유래 신규 포스포리파아제 a2 - Google Patents

인지질 분해능이 개선된 바실러스 메가테리움 유래 신규 포스포리파아제 a2 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인지질 분해능이 개선된 Bacillus megaterium 유래 신규 포스포리파아제 A2(phopholipase A2) 효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 등에 관한 것으로서, 실수유발 중합효소 연쇄 반응(Error-prone PCR)을 통해 형질전환함으로써 상기 포스포리파아제 A2를 수득할 수 있으며, 상기 포스포리파아제 A2는 레시틴의 가수분해 활성이 우수하여 이를 사용한 산업에서 유용하게 활용될 수 있고 박테리아 발현 벡터를 이용하여 대량생산이 가능하기 때문에 생산 비용 측면에서 경쟁력을 가질 수 있다.

Description

인지질 분해능이 개선된 바실러스 메가테리움 유래 신규 포스포리파아제 A2{Novel phospholipase A2 derived from Bacillus megaterium with enhanced phospholipid hydrolyzation activity}
본 발명은 인지질 분해능이 개선된 Bacillus megaterium 유래 신규 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 등에 관한 것이다.
효소는 현재 다양한 산업에서 많이 사용되고 있다. 효소는 화학적 방법을 통한 생산 방식보다 저렴하고 특이적 반응을 통해 생산물들의 품질이 좋다는 장점이 있다. 또한 단순 발효를 통한 생산보다 효소 정제를 통한 생산의 경우 특정 물질을 생산하기에 용이하다. 연평균 세계 효소 시장 규모는 지속적인 성장을 이루고 있으며 한국이 포함된 아시아 시장의 성장률이 가장 크다.
현재 실생활과 필수인 식품, 환경, 제지, 정유, 세제, 축산 등에서 효소에 대한 큰 수요를 보이고 있다. 초기에는 화학적인 방법으로 필요 물질을 합성하여 준비과정, 기기설비, 정제등에서 높은 비용이 요구되었다. 이후 단순 화학적인 방법을 통한 물질합성이 아닌 효소사용 생산공정을 통해 필요 비용이 크게 줄어들었으며, 각 기업들은 생산비용을 절감하여 큰 경쟁력을 갖게되었다. 각 산업분야에서 효소이용 물질 생산과정시 요구되는 효소의 반응 조건은 차이가 클 수 있다. 온도, pH등과 같은 반응 조건이나 기질들의 특성이 모두 달라 효소가 최대 효율을 갖는 조건에서 물질을 생산하는 것이 큰 관건이다. 이렇기 때문에 각 산업분야에서 요구되는 생산조건에서 최대의 효율을 갖는 효소의 수요가 증가하고 있다.
포스포리파아제 A2의 경우 다른 포스포리파아제보다 굉장히 넓은 분야에서 사용되고 있다. 식품 산업에서는 치즈, 아이스크림과 같은 유제품의 공정, 계란 노른자를 유화시키는 마요네즈 공정과정에서 사용되고, 기름 정제 공정의 탈검과정, 미생물에 대해 항균활성 증대를 위해서도 사용이 되고 있다.
현재 기존 산업에서 이용되는 효소 시장은 굉장히 크지만, 보다 개선된 효소의 제시를 통해 해당 산업에 종사하는 기업들의 부흥과 동일 산업내의 기업들보다 높은 경쟁력을 확보할 수 있다. 또한 포스포리파아제 A2의 대량 생산과 정제를 통해 효소의 가격 인하와 동시에 생산가 인하를 기대할 수 있다. 때문에 여러 조건에서 최적화되고 안정적인 효소의 확보에 대한 수요를 충족시킬 수 있는 신규 포스포리파아제 A2의 개발이 시급한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 실수유발 중합효소 연쇄 반응(error-prone PCR)을 통해 인지질 분해능이 개선된 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래 신규 포스포리파아제 A2를 발굴하여, 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2160484
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 효소, 이를 암호화하는 뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 이를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2(phospholipase A2); 또는 이를 암호화하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하는, 인지질 분해용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2에 레시틴을 처리하는 단계를 포함하는, 리소레시틴의 생산 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 효소를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2는 서열번호 3의 10번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 47번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 글리신으로 치환된 것일 수 있으며, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2는 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2보다 인지질 분해능이 더 우수할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 레시틴(lecithin)을 가수분해하여 리소레시틴(lysolecithin)을 생산하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 포스포리파아제 A2 효소는 32.5℃pH 8.0에서 최적의 인지질 분해활성을 가지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 포스포리파아제 A2를 암호화하는, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2(phospholipase A2); 또는 이를 암호화하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하는, 인지질 분해용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2에 기질을 처리하는 단계를 포함하는, 리소레시틴의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 포스포리파아제 A2는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 수득한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 단계는 20 내지 37.5℃에서 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 32.5℃에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 25 내지 35℃에서 기질 없이 상기 포스포리파아제 A2를 첨가하고 30분 내지 2시간 후에, 상기 단계를 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 단계는 pH 7.5 내지 8.5에서 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 pH 8.0에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, pH 7.5 내지 8.5에서 기질 없이 상기 포스포리파아제 A2를 첨가하고 30분 내지 2시간 후에, 상기 단계를 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 기질의 최소 농도는 실험 100 μL버퍼당 0.1 μg, 즉, 1 μg/mL인 것일 수 있다.
본 발명은 인지질 분해능이 개선된 Bacillus megaterium 유래 신규 포스포리파아제 A2(phopholipase A2) 효소, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 등에 관한 것으로서, 실수유발 중합효소 연쇄 반응(Error-prone PCR)을 통해 형질전환함으로써 상기 포스포리파아제 A2를 수득할 수 있으며, 상기 포스포리파아제 A2는 레시틴의 가수분해 활성이 우수하여 이를 사용한 산업에서 유용하게 활용될 수 있고 박테리아 발현 벡터를 이용하여 대량생산이 가능하기 때문에 생산 비용 측면에서 경쟁력을 가질 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 3에서 형질전환된 각 효소들의 EEPC 분해 활성을 비교한 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예 4에서 수행한 발현 조건에서 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 발현량을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에서 수득한 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2, 실시예 2에서 수득한 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2, 상업적으로 사용되고 있는 Novozymes사의 LowP의 효소 활성을 비교한 결과이다.
도 4는 본 발명의 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 기질량에 따른 활성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 온도에 따른 활성을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2을 각각 다른 온도에서 전보온 후 잔효성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 pH에 따른 활성을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2을 각각 다른 pH에서 전보온 후 잔효성을 확인한 결과이다.
본 발명자들은 레시틴을 기질로 하여 포스포리파아제 A2을 이용하여 지방산과 리소레시틴을 생합성하는 방법에 대해 연구한 결과, 실수유발 중합효소 연쇄 반응(Error-prone PCR)을 통해 형질전환함으로써 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 개발하였다.
보다 구체적으로, 우수한 포스포리파아제 A2를 가지는 미생물을 선별하기 위해 고농도의 인지질 배지에서 높은 인지질 분해 활성을 보이는 미생물을 확인한 후, 확보한 미생물로부터 후보 포스포리파아제 A2의 유전자를 확보한 다음, 이를 미생물에서 발현시켜 인지질 분해 활성을 비교하였다. 실수유발 중합효소 연쇄 반응 돌연변이화법을 통해 선별된 포스포리파아제 A2의 돌연변이 포스포리파아제 A2 유전자를 확보하였다. 이를 잘 알려진 미생물을 통해 대량 발현조건에서 활성이 개선된 포스포리파아제 A2를 발현한 후 정제하여 활성이 증가한 것을 확인하였다.
또한, 상기 형질전환으로 확보한 활성이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 특성을 밝히기 위해 기질의 농도, 온도, pH에서의 활성을 확인하였고 온도와 pH에 대해 안정성을 확인하였으며 기존의 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2와 시중에 판매되고 있는 포스포리파아제 A2의 비교를 통해 본 발명의 포스포리파아제 A2의 우수한 활성과 사용 조건을 확인하였다.
이에, 본 발명은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2(phospholipase A2); 또는 이를 암호화하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서, 용어 “포스포리파아제(Phospholipase)”는 포스포리파아제는 인지질을 가수분해하는 효소로서 레시티나아제라고도 한다. 포스포리파아제는 인지질을 분해하는 위치에 따라 A1, A2, B, C, D 로 분류되며, 상기 포스포리파아제 중 본 발명의 “포스포리파아제 A2(PLA2)”는 세포막 구성 지질인 포스포리피드의 글리세린의 BDP 결합하는 지방산을 유리시켜 리조포스파티드로 만들기 때문에 세포조직의 파괴, 용혈작용 및 촉매 작용 등을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 상기 염기서열 및 아미노산 서열의 상동체를 포함하며, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오티드 및 아미노산은 각각 서열번호 1 또는 2, 서열번호 3 또는 4의 각각의 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)를 암호화하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 등을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 상기 포스포리파아제 A2를 암호화하는 유전자의 효율적인 발현을 위해 발현 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현 벡터는 적합한 발현 벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시 코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성 일 수 있다.
또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.
발현 벡터는 통상의 모든 발현 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λλ및 λ가 있다. 또한, 리트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 되며 상기 예시에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주의 종류로는 에셰리키아(Escherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스 (Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다. 본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
실시예 1 : 우수한 인지질 분해효소를 가지는 박테리아 선별
우수한 인지질 분해효소를 가지는 박테리아를 선별하기 위해 로다민 6G(rhodamine 6G)를 이용하여 효소 활성을 비교하였다. 로다민 6G는 자외선의 350 nm 파장에서 인지질 분해효소의 활성에 따라 빈공간을 만드므로, agar-plate에서 박테리아를 선별하는데 유용하게 활용 가능하다.
인지질 분해효소의 활성을 세포 외에서 agar-plate 방법을 통해 확인하기 위해, Kouker & Jaeger (1987)의 방법을 변형시켜 하기 표 1과 같이 배지를 제작하였다.
Soluble starch 1g/l
Casein 0.3g/l
KNO3 2g/l
NaCl 2g/l
K2HPO4 2g/l
MgSO4.7H2O 0.05g/l
CaCO3 0.02g/l
FeSO4.7H2O 0.01g/l
CaCl2 0.5g/l
Bacteriological agar 18g/l
pH 7.0
Autoclave
Lecithin 5% (w/v) (in 1l); DW
Rhodamine 6G 1mg/ml (in 1l); DW
각각의 박테리아에 적합한 액체 배지와 배양 조건에서 키운 후, 600 nm 파장에서 0.1의 흡광도를 나타내는만큼 세포들을 배분하였다. 이후 PBS로 배지를 제거하였으며, 100 μL의 PBS로 풀어주었다. 상기 표 1로 제작한 배지에 적당한 간격으로 깊이 5 mm의 구멍을 내어 준비된 상기 박테리아를 첨가하였다. 사용한 박테리아의 배양 조건에 따라 24시간 동안 배양한 후, 자외선 하에서 인지질의 분해로 색이 변화하여 발생하는 공간의 지름의 길이를 측정하였다(표 2).
미생물 생성된 구역의 지름
실시예 (Bacillus megaterium) 17mm
비교예1 (Bacillus licheniformis) 17mm
비교예2 (Enterococcus faecium) 12mm
비교예3 (Enterococcus lactis) 10mm
비교예4 (Pediococcus　pentosaceus) 9mm
비교예5 (Streptococcus mutans) 12mm
비교예6 (Porphyromonas gingivalis) 14mm
비교예7 (Paenibacillus kribbensis) 13mm
비교예9 (Pseudomonas graminis) 12mm
그 결과, B. megaterium과 B. licheniformis가 자외선 하에서 발생하는 공간의 지름의 길이가 가장 긴 바, 가장 높은 인지질 분해 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2 : 신규 포스포리파아제 유전자 확보와 형질전환
상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 하기 표 3과 같이 B. megaterium과 B. licheniformis의 유전자 중 포스포리파아제 A2 활성이 있을 것으로 보이는 유전자 후보군을 선별하였고, 추가로 인지질 분해활성이 뛰어나다고 알려진 Mucilaginibacter gossypiicola, Catenulispora acidiphila로부터 유전자를 선별하였다.
효소 1 B. megaterium -PLA2
효소 2 C. acidiphila -PLA2
효소 3 B. licheniformis -PLA2-1
효소 4 B. licheniformis -PLA2-2
효소 5 M. gossypiicola -PLA2
상기 유전자들을 His-tag가 포함된 박테리아 발현 벡터에 형질전환하였고, DNA 염기서열 분석을 통해 해당 유전자가 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 3 : EPPC 분해 정도로 포스포리파아제 A2 활성 확인
실시예 2에서 형질전환된 포스포리파아제 A2 후보군의 효소 활성을 측정하기 위해, 1,2-α-eleostearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (EEPC)의 분해 정도를 확인하였다.
0.5 mg/mL의 EPPC와 0.01% butylhydroxytoluene(BTH)를 100% 에탄올에 녹인 후 100 μL씩 96 well microtiter 플레이트에 분주하였다. 이 플레이트는 통기가 유용한 클린벤치에서 1차적으로 증발을 시켰고, 이 후 진공 건조기를 이용하여 용매를 완전 증발시켜 EEPC를 플레이트에 코팅하였다. 실험 버퍼로는 150 mM NaCl, 6 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 3 mg/mL β을 포함하는 pH 8.0의 10 mM Tris buffer를 이용하였다.
실시예 2의 형질전환 박테리아는 IPTG를 이용해 2시간 동안 효소를 발현하도록 하였다. 박테리아를 파쇄 후 원심분리를 통해 상층액을 수득하였다. 이 때, 상층액의 단백질 농도를 측정하고, 단백질 농도가 모두 같도록 설정하여 실험 버퍼와 교반하였다. 실험을 진행하기 전, 준비한 플레이트를 실험 버퍼를 이용하여 불순물들을 씻어주었고, 기질이 시작 전 평형상태가 되도록 195 μL의 실험 버퍼로 채우고 10분 후 샘플을 5 μL씩 분주하였다. 2시간 동안 30℃에서 반응시킨 후 272 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 실험 버퍼의 흡광도를 0으로 맞추고 각각의 샘플에 대해 코팅이 되지 않은 플레이트에 단백질을 분주한 흡광도를 보정하여 측정하였다.
그 결과 도 1과 같이 B. megaterium의 EPPC 분해 정도, 즉 포스포리파아제 A2 활성이 가장 높게 나타났으며, 이를 추후 실험에 사용하였다.
실시예 4 : 쿠마시 염색법을 통한 B. megaterium 의 포스포리파아제 A2 발현량 확인
실시예 3에서 가장 우수한 활성을 나타낸 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 발현량을 확인하기 위해, 실시예 3과 같은 발현조건에서 실시예 2에서 사용된 박테리아 발현 벡터에 상기 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 형질전환한 두 박테리아를 IPTG를 사용하여 발현하였다. B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 하기 표 4에 나타내었다.
B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2 유전자 ATGTCTGTTCCGAACAAACGGAAAGCCACGCCCTGCCTCTTCCCCGGCTATAAATGGTGTGGTCCCGGCTGCAGTGGGCCCGGCTGTCCTGTAAATGATGTAGACTGCTGCTGTAAATACCATGATTTATGCTATGAAGATTACGGATCATGCCGCTCATGTGATGAGCAATTCCTTGACTGTCTTTGCTCCAAAGCAAATCCGTACAGTTTAAAAGGAAGACAGGCATACGCTATGTATACCTATATGCGGCTGAAGTTAGCTTTAAAACAATATGACTAA 서열번호 1
단백질 MSVPNKRKATPCLFPGYKWCGPGCSGPGCPVNDVDCCCKYHDLCYEDYGSCRSCDEQFLDCLCSKANPYSLKGRQAYAMYTYMRLKLALKQYD 서열번호 3
IPTG 발현 조건 외에서 발현되는 단백질과 비교함으로써 원하는 단백질의 발현이 증가하였는지 확인하기 위해, 대조군으로 IPTG를 처리하지 않은 박테리아를 준비하였다.
각 박테리아를 파쇄한 후 원심분리기를 이용하여 상층액만을 수득하였다. 각 상층액에 있는 단백질들을 SDS-PAGE를 통해 분리하였으며 분리된 단백질은 쿠마시 염색법을 통해 확인하였다.
그 결과, B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 형질전환한 샘플에 IPTG를 처리하여 발현시킨 경우, 대조군에서는 발견되지 않은 단백질을 확인하였다(도 2).
실시예 5 : 실수유발 중합효소 연쇄 반응 돌연변이화법을 이용해 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2 확보
실시예 3에서 가장 우수한 활성을 나타낸 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 주형 DNA로 사용하여 실수유발 중합효소 연쇄 반응 돌연변이화법을 수행하였다. 상기 실시예 2와 동일한 조건에서 dNTP 중 dATP, dTTP, dGTP, dCTP의 농도를 다르게 해 총 4가지의 중합효소 연쇄 반응의 결과물을 얻었고, 이들을 실시예 2에서 사용된 박테리아 발현 벡터에 형질전환하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타난 염기서열 및 아미노산 서열을 가진 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 포함하는 박테리아가 상대적으로 높은 효소 활성을 나타내었다.
인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래
포스포리파아제 A2		 유전자 ATGTCTGTTCCGAACAAACGGAAAGCCGCGCCCTGCCTCTTCCCCGGCTATAAATGGTGTGGTCCCGGATGCAGTGGTCCCGGATGTCCGGTAAACGATGTAGACTGCTGCTGCAAATACCATGATTTATGCTATGAAGGTTACGGATCATGCCGCTCATGTGATGAGCAATTTCTTGACTGTCTTTGCTCCAAAGCAAATCCGTACAGTTTAAAAGGAAGACAGGCATACGCCATGTATACCTATATGCGACTGAAGTTAGCTTTAAAACAATATGACTAA 서열번호 2
단백질 MSVPNKRKAAPCLFPGYKWCGPGCSGPGCPVNDVDCCCKYHDLCYEGYGSCRSCDEQFLDCLCSKANPYSLKGRQAYAMYTYMRLKLALKQYD 서열번호 4
실시예 6 : 실수유발 중합효소 연쇄 반응 돌연변이화법을 이용해 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 활성 확인
실시예 5에서 확보한 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium의 포스포리파아제 A2의 활성을 확인하기 위해, 실시예 3에서 가장 우수한 활성을 나타낸 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2와 상업적으로 사용되고 있는 Novozymes사의 LowP와 비교하여 EPPC 분해 정도를 확인하였다.
실시예 3과 같이 상기 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 실시예 2의 형질전환 박테리아를 이용하여 발현시키고, 박테리아를 파쇄한 후 원심분리를 통해 상층액을 수득하였다. 상층액에 있는 포스포리파아제 A2를 정제하기 위해 4℃에서 Ni-NTA resin와 1시간동안 반응시켰다. 충분히 resin을 씻어준 후 Imidazole이 포함된 버퍼를 이용하여 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하였다.
상기 실시예 3과 같이 활성을 확인하고 그 결과를 효소량에 따른 분당 기질 반응량인 Unit/g로 나타내었다. 그 결과, 실시예 5에서 수득한 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2는 실시예 2에서 수득한 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2보다 높은 활성을 보였으며, 상업적으로 사용되고 있는 Novozymes사의 LowP보다도 활성이 높은 것을 확인하였다(도 3).
실시예 7 : 기질량에 따른 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 활성 확인
실시예 6에 기술한 바와 같이, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하고, 실시예 3에서 기질량만을 바꾸어 각각 0.025 μg, 0.05 μg, 0.1 μg, 0.2 μg, 0.4 μg이 포함된 플레이트를 제작하였다. 상기 플레이트를 사용하여 실시예 3에 기술한 바와 같이 EEPC 분해 정도를 측정하였다.
그 결과, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2는 EEPC가 0.01 μg인 조건에서도 충분한 반응이 일어남을 확인하였다(도 4).
실시예 8 : 온도에 따른 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 활성 확인
실시예 6에 기술한 바와 같이, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하고, 최적 반응 온도를 찾기 위해 실시예 3에서 20 내지 40℃로 반응온도를 다르게 하여 효소의 활성을 확인하였다. 플레이트의 온도가 충분히 맞춰질 수 있도록 세척하여 불순물을 제거하거나 화학적 평형을 맞출 때도 반응온도와 동일한 온도의 실험버퍼를 사용하였다. 이후 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 활성을 측정하였다.
그 결과, 37.5℃ 이하에서는 높은 활성을 유지하고, 특히 32.5℃가 최적 온도로서 가장 높은 활성을 나타내었다. 저온에서도 절반 이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 9 : 온도에 따른 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 잔효성 확인
실시예 6에 기술한 바와 같이, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하고, 실시예 3에서 반응 전 기질 없이 20 내지 40℃의 온도에서 전보온하는 단계를 추가하였으며, 가장 높은 상대적 활성을 갖는 약 32℃에서 기질과 반응시켰다.
이후 분해된 기질의 양을 272 nm에서 측정한 결과, 25 내지 35℃에서 전보온한 경우 비교적 활성을 잘 유지하는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 10 : pH에 따른 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 활성 확인
실시예 6에 기술한 바와 같이, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하고, 실시예 3에서 사용한 실험 버퍼의 pH만을 바꾸어 각각 Phosphate buffer (pH 6.0), Tris buffer (pH 7.0, pH 8.0), Carbonate buffer (pH 9.0)에서 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2의 활성을 측정하였다.
그 결과 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2는 pH 8.0에서 가장 높은 활성을 갖는 것이 확인이 되었다(도 7).
실시예 11 : pH에 따른 인지질 분해능이 개선된 포스포리파아제 A2의 잔효성 확인
실시예 6에 기술한 바와 같이, 인지질 분해능이 개선된 B. megaterium 유래 포스포리파아제 A2를 정제하고, 실시예 10과 같이, 실시예 3에서 사용한 실험 버퍼의 pH를 바꾸되, 기질 없이 전보온 조건만 추가하여 진행하였다. 구체적으로, 같은 양의 포스포리파아제 A2를 Phosphate buffer (pH 6.0), Tris buffer (pH 7.0, pH 8.0), Carbonate buffer (pH 9.0)에서 기질 없이 30분 내지 2시간동안 전보온하였으며, 이후 가장 높은 상대적 활성을 갖는 pH 8.0에서 기질과 반응시켰다.
이후 분해된 기질의 양을 272 nm에서 측정한 결과, pH 8.0에서 전보온한 경우 가장 안정적인 상태를 유지하는 것을 확인하였다(도 8).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KyungHee University Research and Business Foundation <120> Novel phospholipase A2 derived from Bacillus megaterium with enhanced phospholipid hydrolyzation activity <130> GKH21P-0068-KR, DHP21-K216 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 282 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <400> 1 atgtctgttc cgaacaaacg gaaagccacg ccctgcctct tccccggcta taaatggtgt 60 ggtcccggct gcagtgggcc cggctgtcct gtaaatgatg tagactgctg ctgtaaatac 120 catgatttat gctatgaaga ttacggatca tgccgctcat gtgatgagca attccttgac 180 tgtctttgct ccaaagcaaa tccgtacagt ttaaaaggaa gacaggcata cgctatgtat 240 acctatatgc ggctgaagtt agctttaaaa caatatgact aa 282 <210> 2 <211> 282 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <400> 2 atgtctgttc cgaacaaacg gaaagccgcg ccctgcctct tccccggcta taaatggtgt 60 ggtcccggat gcagtggtcc cggatgtccg gtaaacgatg tagactgctg ctgcaaatac 120 catgatttat gctatgaagg ttacggatca tgccgctcat gtgatgagca atttcttgac 180 tgtctttgct ccaaagcaaa tccgtacagt ttaaaaggaa gacaggcata cgccatgtat 240 acctatatgc gactgaagtt agctttaaaa caatatgact aa 282 <210> 3 <211> 93 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 3 Met Ser Val Pro Asn Lys Arg Lys Ala Thr Pro Cys Leu Phe Pro Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Trp Cys Gly Pro Gly Cys Ser Gly Pro Gly Cys Pro Val Asn 20 25 30 Asp Val Asp Cys Cys Cys Lys Tyr His Asp Leu Cys Tyr Glu Asp Tyr 35 40 45 Gly Ser Cys Arg Ser Cys Asp Glu Gln Phe Leu Asp Cys Leu Cys Ser 50 55 60 Lys Ala Asn Pro Tyr Ser Leu Lys Gly Arg Gln Ala Tyr Ala Met Tyr 65 70 75 80 Thr Tyr Met Arg Leu Lys Leu Ala Leu Lys Gln Tyr Asp 85 90 <210> 4 <211> 93 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 4 Met Ser Val Pro Asn Lys Arg Lys Ala Ala Pro Cys Leu Phe Pro Gly 1 5 10 15 Tyr Lys Trp Cys Gly Pro Gly Cys Ser Gly Pro Gly Cys Pro Val Asn 20 25 30 Asp Val Asp Cys Cys Cys Lys Tyr His Asp Leu Cys Tyr Glu Gly Tyr 35 40 45 Gly Ser Cys Arg Ser Cys Asp Glu Gln Phe Leu Asp Cys Leu Cys Ser 50 55 60 Lys Ala Asn Pro Tyr Ser Leu Lys Gly Arg Gln Ala Tyr Ala Met Tyr 65 70 75 80 Thr Tyr Met Arg Leu Lys Leu Ala Leu Lys Gln Tyr Asp 85 90

Claims (15)

  1. 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2(phospholipase A2) 효소.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2 효소는 서열번호 3의 10번째 위치에 상응하는 아미노산인 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 47번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 글리신으로 치환된 것을 특징으로 하는, 효소.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포스포리파아제 A2 효소는 레시틴(lecithin)을 가수분해하여 리소레시틴(lysolecithin)을 생산하는 것을 특징으로 하는, 효소.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 포스포리파아제 A2 효소는 32.5℃, pH 8.0에서 최적의 인지질 분해활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 포스포리파아제 A2를 암호화하는, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
  7. 제6항의 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체.
  8. 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 포스포리파아제 A2(phospholipase A2); 또는 이를 암호화하는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 유효성분으로 포함하는, 인지질 분해용 조성물.
  9. 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진, 인지질 분해활성을 가지는 포스포리파아제 A2에 기질을 처리하는 단계를 포함하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 포스포리파아제 A2는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 단계는 20 내지 37.5℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    25 내지 35℃에서 기질 없이 상기 포스포리파아제 A2를 첨가하고 30분 내지 2시간 후에, 상기 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 단계는 pH 7.5 내지 8.5에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    pH 7.5 내지 8.5에서 기질 없이 상기 포스포리파아제 A2를 첨가하고 30분 내지 2시간 후에, 상기 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
  15. 제9항에 있어서,
    상기 기질의 최소 농도는 1 μg/mL인 것을 특징으로 하는, 리소레시틴의 생산 방법.
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