RU2813512C1 - Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме - Google Patents
Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813512C1 RU2813512C1 RU2023119830A RU2023119830A RU2813512C1 RU 2813512 C1 RU2813512 C1 RU 2813512C1 RU 2023119830 A RU2023119830 A RU 2023119830A RU 2023119830 A RU2023119830 A RU 2023119830A RU 2813512 C1 RU2813512 C1 RU 2813512C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- buffer
- lipase
- immobilized
- solution
- cation exchanger
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims abstract description 83
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims abstract description 83
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims abstract description 83
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 30
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 abstract description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 57
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 19
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 102100021851 Calbindin Human genes 0.000 description 6
- 101000898082 Homo sapiens Calbindin Proteins 0.000 description 6
- 101001021643 Pseudozyma antarctica Lipase B Proteins 0.000 description 6
- UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N Tributyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(OC(=O)CCC)COC(=O)CCC UYXTWWCETRIEDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical class O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N toluene Substances CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 125000003010 ionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920000371 poly(diallyldimethylammonium chloride) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 229940122930 Alkalising agent Drugs 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000146387 Chromobacterium viscosum Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031375 Endothelial lipase Human genes 0.000 description 1
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 1
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 229940127470 Lipase Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 108010048733 Lipozyme Proteins 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 1
- XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CN=CN1 XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical class [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N batilol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCC(O)CO OGBUMNBNEWYMNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000007210 heterogeneous catalysis Methods 0.000 description 1
- 239000002638 heterogeneous catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000009854 hydrometallurgy Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010090785 inulinase Proteins 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N lipoamide Chemical compound NC(=O)CCCCC1CCSS1 FCCDDURTIIUXBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000005555 metalworking Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 238000001050 pharmacotherapy Methods 0.000 description 1
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010079522 solysime Proteins 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; при этом перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии катионообменной смолы КУ-2-8 в буфере 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Изобретение позволяет получать нерастворимый в воде биокатализатор на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменной смоле КУ-2-8 в Н-форме, включающего только иммобилизованную липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями. 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для гидролиза молочного жира, для производства и улучшения качества сыров.
В настоящее время изучение липолитических ферментов является перспективным направлением благодаря их уникальным свойствам. Одним из преимуществ липаз является контролируемый и избирательный липолиз, который успешно применяется в различных сферах практической деятельности человека: в медицине, в пищевой, легкой и химической промышленности [Гамаюрова B.C., Зиновьева М.Е., Елизарова Е.В. и др. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / Вестник Казанского технологического университета. - 2007. №2 - С. 103-108].
Липаза (КФ 3.1.1.3) - сериновая гидролаза, катализирующая гидролиз триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот. Липазы широко доступны и повсеместно присутствуют в тканях животных и растений, а также в различных микроорганизмах. Активный центр липазы состоит из каталитической триады, которая включает Ser-His-Asp/Glu и оксианионное отверстие, покрытое lid-доменом. Домен lid претерпевает конформационное изменение в присутствии ингибитора [Е.D. Yushkova, Е.A. Nazarova, А.V. Matyuhina et al. Application of Immobilized Enzymes in Food Industry // Journal of agricultural and food chemistry Microb Cell Fact. - 2019. V. 67, №42 - P. 11553-11567].
Оптимальным pH для функционирования липазы являются значения от 4.0 до 8.0. Липазы, продуцируемые Chromobacterium viscosum, A. niger и Rhizophus sp., активны при кислом pH, а P. nitroaeducens продуцируют липазу, активную при сильнощелочном рН. Оптимальная температура для большинства липаз составляет от 30 до 50°С. Фермент обладает субстратной специфичностью [Tian-Tian Liu, Xiao-Tian Liu, Qing-Xi Chen, Yan Shi. Lipase Inhibitors for Obesity: A Review // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2020. V. 128. - P. 110314-110323].
В настоящее время липазы используются в различных отраслях промышленности. В молочной промышленности фермент применяется для гидролиза молочного жира, в производстве сырных продуктов и в переработке кислых масел. Также липаза используется как лекарственное средство при заместительной терапии, и в качестве агента, специфически разрушающего нежелательные продукты обмена веществ в организме больного [Стурова Ю.Г., Гришкова А.В. Исследование активности прегастральных липаз // Ползуновский вестник. - 2019. Т. 4. - С. 29-33].
В современной биотехнологии широко применяются ферменты, иммобилизованные на синтетических полимерных носителях. Одним из условий успешной иммобилизации фермента является правильный выбор носителя, при котором удается существенно повысить время активного функционирования ферментов, модулировать их каталитическую активность и специфичность действия, а также многократно использовать энзимные препараты. К одним из перспективных носителей для иммобилизации гидролитических ферментов относят ионообменные смолы [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5 - С. 704-711].
Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, представляющие собой высокомолекулярные синтетические соединения с трехмерной гелевой или макропористой структурой, которые содержат различные функциональные группы, способные осуществлять ионный обмен [K. Biswas, S. Ghosh, В. Basu. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52]. Ионообменные смолы делятся на анионообменные и катионообменные. Катионообменные смолы содержат функциональные группы, способные к обмену положительных ионов, анионообменные - к обмену отрицательных.
Катионнообменные смолы представляют собой гетерополикислоты, состоят из высокомолекулярной матрицы, к которой присоединены катионогенные группы. Катиониты могут быть получены посредством реакции полимеризации или поликонденсации из мономерных соединений, уже содержащих ионогенные группы, или на основе готовых нерастворимых продуктов с последующим введением в них ионогенных групп [Приходько А.Е., Валевко С.А. Методы предварительной подготовки и получения воды для фармацевтических целей / Химико-фармацевтический журнал. - 2002. Т. 36, №10. - С. 31-711].
Катионнообменные смолы подразделяют на смолы с катионами сильных кислот, изготовляемые из полистирола с сульфонатной функциональной группой (SO3-), которая заряжена либо ионами водорода (Н+), либо ионами натрия (Na+) и на смолы на катионах слабых кислот, которые состоят из акрилового полимера с группами карбоновых кислот в качестве функциональных групп и обладают высоким сродством к ионам водорода.
Благодаря своим универсальным свойствам катионообменные смолы используются в области ионного обмена и гетерогенного катализа. Эти смолы обладают высокой обменной способностью и устойчивостью к осмотическому удару. Катионнобменные смолы, произведенные с высокой степенью чистоты, могут быть перспективными катализаторами в различных пищевых технологиях. Во многих случаях их применение ограничено относительно низкой термостойкостью [Pravin U. Singare, Ram S. Lokhande, Rupa S. Madyal. Thermal degradation studies of some strongly acidic cation exchange resins // Open journal of physical chemistry. - 2011. V. 1, №2 - P. 45-54].
Устойчивым к термическому и химическому воздействию оказались сульфокатионит КУ-2 с активными группами -SO3H, синтезируемый на основе сополимера стирола с дивинилбензолом, и катионит КУ-2-8 с активными сульфогруппами, полученный сульфированием гранульного сополимера стирола с 8% дивинилбензолом [Полянский Н.Г., Тулупов П.Е. Термическая устойчивость катионообменных смол / Успехи химии. - 1971. Т. 40, №12 - С. 2250-2279].
Смолы КУ-2 и КУ-2-8 нерастворимы в воде, в большинстве органических растворителей, растворах кислот и щелочей. Рабочий диапазон рН от 0 до 14, максимальная рабочая температура для КУ-2 составляет 120-130°С, а для КУ-2-8 - 110-120°С [Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / Холявка М.Г., Наквасина М.А., Артюхов В.Г. - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с.].
Ионообменная смола обладает двумя основными характеристиками -ионообменной емкостью и селективностью. Ионообменная емкость определяется способностью нерастворимой функциональной группы внутри мембраны подвергаться вытеснению ионов, которые включаются и свободно присоединяются к ее структуре противоположно заряженными ионами, доступными в окружающем растворе [Олыпанникова С.С., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. Т. 21, №3 - С. 408-416].
Ионообменные смолы применяются в различных сферах производства: в теплоэнергетике для умягчения и обессоливания воды, в гидрометаллургии для разделения цветных металлов, для регенерации отходов гальванотехники и металлообработки, в органическом синтезе в качестве катализатора, при очистке сточных вод, в пищевой промышленности. Ионообменные смолы могут выступать в качестве носителя при иммобилизации ферментов [Олыпанникова С.С., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. Т. 21, №3 - С. 408-416].
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.
В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.
Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные смолы не растворимы в воде.
Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.
Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.
Анионообменная смола АВ-17-2П уже рассматривалась в литературе в качестве носителя для иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus 1403 [Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова А.С.Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т. 8. Вып. 6. - С. 1035-1041; Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Трофимова О.Д., Беленова А.С, Воропаева Е.Н. Исследование термодинамических аспектов реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005 - Т. 5. Вып. 3. - С. 353-360]. Авторы показали, что оптимальным методом иммобилизации является модифицированный глутаральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связывающего звена между липазой и анионитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизация липазы адсорбционным методом на товарных анионообменных смолах АВ-26 и АВ-17-2П не дала положительных результатов [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М., Селеменев В.Ф., Трофимова О.Д., Холявка М.Г., Китаева Т.А. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. - Т. 5. Вып. 5. - С. 704-711].
Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине.
Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.
В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковалентной модификации.
Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler М., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гидролазной (липазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.
Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN 108148827 A, CN 101712951 A, CN 106867989 A, JPH 01273588 A, JPH 03160992 A, US 5273898 A, WO 2015081879 A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO 2008084470 A2, CN 102839166 А], Lewatit, Dowex [US 5292649 A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN 114657169 А], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO 2008139455 A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO 2009069116 A2] Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.
Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 А1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.
В качестве прототипа служил способ, описанный в патенте [US 5292649 A], согласно которому 1 г макропористой слабокислотной катионообменной смолы Lewatit CNP 80 производства Bayer AG смешивали с 50 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-n-толуолметосульфоната и 10 мл воды. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре, при этом значение рН доводили до 4-5 добавлением 6 М HCl. После стабилизации значения рН полученную реакционную смесь тщательно промывали для удаления избытка 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-n-толуолметосульфоната. Затем к смеси добавляли 2 мл 1/15 М буфера McIlvaine с рН 4 и 50 мкл раствора липазы (1450 единиц) и полученную смесь оставляли на ночь в прохладной комнате для проведения реакции. В результате была получена липаза, иммобилизованная на Lewatit CNP 80.
В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.
Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменной смоле КУ-2-8 в Н-форме, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, равной 2656 мкмоль/мг для липазы, иммобилизованной на КУ-2-8, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора; согласно изобретению в качестве носителя используют катионообменник КУ-2-8, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменной смолы КУ-2-8 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионобменнике, проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.
Фиг.2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные смолы КУ-2 и КУ-2-8 (ГОСТ 20298-74) фирмы ООО «АКВАХИМ».
Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации 0,5-3,0 М до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0,1-0,25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в Н-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали до постоянной массы при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - №6 - С. 31-42].
Иммобилизацию липазы на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. 1 г предварительно кондиционированной катионообменной смолы в Н-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М фосфатного буфера с рН 5,8. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8 в концентрации 1 мг/мл добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм
Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].
Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис. к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С.- Воронеж, 2011. - 162 с.]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.
Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:
А=а/В⋅t,
где а - количество жирных кислот, мкмоль;
В - содержание белка в препарате, мг;
t - время гидролиза, мин.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты отражены на фиг. 1-3.
Высокие значения содержания белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации липазы адсорбционным методом на катионообменных смолах КУ-2 и КУ-2-8 (фиг. 1). Однако более высокие значения общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот), а также ее удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) были зарегистрированы при сорбции фермента на КУ-2-8 (фиг. 2, 3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на катионите КУ-2-8.
Claims (1)
- Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора; отличающийся тем, что в качестве носителя используют катионообменник КУ-2-8, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменной смолы КУ-2-8 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и предшествующего ей выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют помощью диализа с использованием целлофанового мешочка, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813512C1 true RU2813512C1 (ru) | 2024-02-12 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5292649A (en) * | 1983-03-29 | 1994-03-08 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry | Method for reaction of lipase upon fatty acid |
| RU2301831C1 (ru) * | 2006-04-10 | 2007-06-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина | Способ получения иммобилизованной липазы |
| RU2389792C2 (ru) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Способ получения иммобилизованной липазы |
| WO2015081879A1 (zh) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 催化酯化和酯交换的Sn-1,3选择性固定化脂肪酶及其制备方法 |
| CN108148827A (zh) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 固定化酶及其制备方法和用途 |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5292649A (en) * | 1983-03-29 | 1994-03-08 | Agency Of Industrial Science & Technology, Ministy Of International Trade & Industry | Method for reaction of lipase upon fatty acid |
| RU2301831C1 (ru) * | 2006-04-10 | 2007-06-27 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина | Способ получения иммобилизованной липазы |
| RU2389792C2 (ru) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Способ получения иммобилизованной липазы |
| WO2015081879A1 (zh) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 催化酯化和酯交换的Sn-1,3选择性固定化脂肪酶及其制备方法 |
| CN108148827A (zh) * | 2016-12-02 | 2018-06-12 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 固定化酶及其制备方法和用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zahirinejad et al. | Nano-organic supports for enzyme immobilization: scopes and perspectives | |
| Brena et al. | Immobilization of enzymes: a literature survey | |
| Zaak et al. | Improved stability of immobilized lipases via modification with polyethylenimine and glutaraldehyde | |
| Jesionowski et al. | Enzyme immobilization by adsorption: a review | |
| Kharrat et al. | Immobilization of Rhizopus oryzae lipase on silica aerogels by adsorption: Comparison with the free enzyme | |
| Bagi et al. | Immobilization and characterization of porcine pancreas lipase | |
| Mohammadi et al. | Improvement of lipase biochemical properties via a two-step immobilization method: Adsorption onto silicon dioxide nanoparticles and entrapment in a polyvinyl alcohol/alginate hydrogel | |
| Bhushan et al. | Immobilization of lipase by entrapment in Ca-alginate beads | |
| Liang et al. | Immobilized enzymes in inorganic hybrid nanoflowers for biocatalytic and biosensing applications | |
| Qi et al. | Poly (carboxybetaine methacrylate)-functionalized magnetic composite particles: A biofriendly support for lipase immobilization | |
| Wang et al. | Comparison of covalent and physical immobilization of lipase in gigaporous polymeric microspheres | |
| Sugahara et al. | Immobilization of Beauveria bassiana lipase on silica gel by physical adsorption | |
| Ondul et al. | Immobilization of Candida antarctica A and Thermomyces lanuginosus lipases on cotton terry cloth fibrils using polyethyleneimine | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| CN106434622B (zh) | 一种共固定化酶的制备方法 | |
| Spasojević et al. | The enzyme immobilization: carriers and immobilization methods | |
| Amani et al. | Immobilization of urease enzyme on chitosan/polyvinyl alcohol electrospun nanofibers | |
| Çakmakçi et al. | Physical and covalent immobilization of lipase onto amine groups bearing thiol-ene photocured coatings | |
| Guimarães et al. | Stabilization of immobilized lipases by treatment with metallic phosphate salts | |
| RU2813512C1 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме | |
| Suckling | Immobilized enzymes | |
| L'. Kurillova, P. Gemeiner, A. Vikartovska, H. Mikova, M. Rosenberg, M. Ilavsky | Calcium pectate gel beads for cell entrapment. 6. Morphology of stabilized and hardened calcium pectate gel beads with cells for immobilized biotechnology | |
| Cantarella et al. | Entrapping of acid phosphatase in poly (2‐hydroxyethyl methacrylate) matrices: Preparation and kinetic properties | |
| Milašinović et al. | Catalyzed ester synthesis using candida rugosa lipase entrapped by poly (N‐isopropylacrylamide‐co‐itaconic acid) hydrogel | |
| RU2823329C1 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на анионообменных смолах ав-16-гс и ан-12п в oh-форме |