WO2006001300A1 - 高耐久性液体クロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents

高耐久性液体クロマトグラフィー用充填剤 Download PDF

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WO2006001300A1
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liquid chromatography
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packing material
general formula
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Osakazu Nakajima
Takeshi Urano
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Daiso Co., Ltd.
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    • G01N2030/042—Standards

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a packing material for liquid chromatography.
  • Liquid chromatography is used in a wide range of fields as an important separation analysis method in the fields of pharmaceuticals, foods, natural compounds, and the like.
  • many liquid chromatography fillers are obtained by chemically modifying the surface of porous silica gel having excellent mechanical strength, good quality, separation performance, etc. with a silanic compound.
  • surface-modified silica gel those in which octadecyl groups are introduced into the surface silanol groups by chemical bonds (ODS) are the most common.
  • Force introduction groups are octyl groups, butyl groups, methyl groups, etc. ing.
  • the alkyl group may have a functional group such as a full group, a amino group, a cyano group, or a nitro group at the terminal.
  • a silica gel surface is impregnated with a polysilazane such as perhydroxypolysilazane, and then the silica gel is fired at a ceramic surface.
  • a method of chemically bonding a modifier silane compound to the coating see Patent Document 1
  • a method of polymerizing a silicone compound having a hydrosilyl group on the surface of a silica gel to form a silicone polymer see Patent Document 2
  • Patent Document 3 As a modifier silane compound, there has been proposed a method (Patent Document 3) using octadecyl di-tert-butyl silane in its structure.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-206407.
  • Patent Document 2 JP 2003-149219 A.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 63-137750.
  • An object of the present invention is to provide a highly durable packing material for liquid chromatography having excellent acid resistance and alkali resistance, as described above. Means for solving the problem
  • the present inventor has carried out a chemical modification of the silica gel surface with a silane compound having a specific structure, and the following specific structure:
  • a silane compound having a specific structure In combination with an end-cap reaction step using a bifunctional cyclic silazane compound having a viscosity, the characteristics of silica gel are not lost and the selectivity as a packing material for liquid chromatography is greatly changed.
  • the present invention is a method in which the silica gel is chemically modified with a bifunctional silane compound represented by the general formula [I], and the resulting chemically modified silica gel is represented by the general formula [ ⁇ ].
  • a method for producing a packing material for liquid chromatography which comprises performing an end cap reaction using a bifunctional cyclic silazane represented by the formula:
  • x 1 and x 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a halogen atom or an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, R 1 may have a substituent, may be an alkyl group or a aryl group] Group. ]
  • the halogen atom may be the same or different in X 1 and X 2 .
  • R 2 and R 3 are the same or different and are alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms, and n is a value indicating the number of units forming a ring and is an integer of 2 to 10. ]
  • the present invention provides a liquid chromatography column using the liquid chromatography packing material obtained by the above method, an analysis method or a fractionation method using the column, particularly analysis of peptides or proteins contained in biological samples, or Provide sorting methods.
  • the preferred raw silica gel used in the method of the present invention has an average particle diameter of usually 1 to: L000 ⁇ m, preferably 2 to 200 ⁇ m, and a pore diameter of usually 10 to: L0000 angstrom, preferably 50. It is a porous silica gel having a surface area of ⁇ 3000 angstrom and a surface area of usually 1 ⁇ : L000 m 2 / g, preferably 5 to 600 m 2 / g. To obtain high separation performance
  • the raw silica gel is preferably a high purity and spherical one.
  • the alkyl group as R 1 may be a linear alkyl group, a branched alkyl group, a cyclic alkyl group, or the like.
  • R 1 is an alkyl group
  • the carbon number is not particularly limited, but is preferably 1-30, more preferably 2-8.
  • the aryl group as R 1 may be a phenol group, a tolyl group, a mesityl group, a naphthyl group or the like.
  • the alkyl group as R 1 in the general formula [I] has an aryl group, an amino group (—NH 2), a cyan group (one CN) or a -toro group (one NO) at the terminal, or non- Amide group at the end (one NH — C (O)), carbamate group (OC (O) NH), carbamide group (NH— C (O) NH), ester group (—OC (O) —) or carbonate group (—OC (O)-o -) May be included.
  • the bifunctional silane compound represented by the general formula [I] is a dialkylsilane or a diarylsilane having a hydrogen atom, a halogen atom or an alkoxyl group.
  • silica gel chemically modified using a bifunctional silane compound general formula [I] as a chemical modifier is a conventional monofunctional silane compound. As a result, it has been found to be much more effective in improving durability compared to those chemically modified.
  • the chemical modification reaction can be carried out under known methods and conditions, and the silica gel and the bifunctional silane compound [I] are heated and reacted in a solvent.
  • the reaction temperature is preferably 60 200 ° C, more preferably 100 160 ° C, and the reaction may be carried out in the liquid phase.
  • the solvent is not particularly limited, but aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene and mesitylene, which do not react with the bifunctional silane compound [I] and are stable at the reaction temperature, dichlorobenzene Substituted aromatic compounds such as are preferred.
  • the reaction pressure is usually atmospheric pressure, but the reaction may be carried out under a pressure of 0.15 to 0.49 MPa.
  • the reaction time is preferably 0.5 to 20 hours, more preferably 3 to 10 hours.
  • the amount of the bifunctional silane compound [I] used is preferably 0.01 to 10, more preferably 0.05 to 1, in terms of the weight ratio of the difunctional silane compound [I] Z silica gel. It is also preferable to add a basic compound such as pyridine or imidazole to the reaction system.
  • the bifunctional silane compound [I] has more reactive sites than the monofunctional one, and is more reactive and has side reactions than the trifunctional one. There is an advantage that it is less likely to occur.
  • bifunctional silanic compound [I] particularly when two R 1 are the same and an alkyl group or aryl group having 4 to 30 carbon atoms is used, two R 1 Unlike when bifunctional silane compounds in which 1 is a different alkyl group or aryl group (for example, octadecylmethyldichlorosilane, n-octylmethyldichlorosilane, etc.) are used, the density of the alkyl group or aryl group is increased, which is advantageous for improving the hydrophobic force and separation ability, and further improving the durability.
  • reaction solution after the chemical modification reaction may be used as it is for the next end-cubbing reaction, but the solid content may be taken out from the chemical modification reaction solution and washed and dried to be used for the force end-capping reaction. Good.
  • reaction solution after the chemical modification reaction may be subsequently charged with an end-cabbing agent and reacted. However, after the chemical modification reaction, the unreacted bifunctional silane compound [I] is hydrolyzed. There is also.
  • the end-cavating agent represented by the general formula [II] is a bifunctional cyclic silazane, preferably 1, 1, 3, 3, 5, 5-hexamethylcyclosilazane, 1 , 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7-octamethylcyclotetrasilazane, 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-decamethylcyclopentasilazane, 1 , 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9,
  • the end-cabinet agent [II] may be used in combination with the bifunctional silane compound represented by the general formula [III]!
  • the ratio of the end-cabinet agent [II] and the bifunctional silane compound [III] is preferably 0. 0 by weight ratio of the end-cave agent [II] Z difunctional silane compound [III]. 5 or more, more preferably 1 or more.
  • X 3 and X 4 are the same or different and are a hydrogen atom, a halogen atom or an alkoxyl group having 1 to 4 carbon atoms, and R 4 and R 5 are the same or different and represent an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. Kill group. ]
  • bifunctional silane compound [ ⁇ ] examples include dimethyldichlorosilane and dimethyldimethoxysilane.
  • the end-cabbing reaction can be carried out under a known method and conditions, and the reaction is carried out by heating the chemically modified silica gel and the end-cubbing agent in a solvent.
  • the reaction temperature is preferably 60 to 200 ° C, more preferably 100 to 160 ° C, and the reaction may be carried out in the liquid phase.
  • Solvents are not particularly limited, but aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene, xylene, mesitylene, etc., substituted aromatic compounds such as dichlorobenzene, which do not react with the end-cabinet agent [II] and are stable at the reaction temperature. Is preferred.
  • the reaction pressure is preferably atmospheric pressure, but the reaction may be carried out under a pressure of 0.15 to 0.49 MPa.
  • Reaction time I is preferably 0.5 to 20 hours, more preferably 3 to 10 hours.
  • the amount of the end-cabining agent [II] used is preferably 0.01 to 10, more preferably 0.05 to 1, in terms of the weight ratio of the end-cabining agent [II] Z chemically modified silica gel. It is also preferable to add a basic compound such as pyridine or imidazole to the reaction system. After the reaction, solid-liquid separation is performed, and the separated solid is sufficiently washed with a cleaning agent such as methanol and dried to obtain a packing material for liquid chromatography.
  • the packing material for liquid chromatography according to the present invention has a long lifetime with high acid resistance and alkali resistance without changing the selectivity as a packing material for liquid chromatography without losing the properties of silica gel. This is therefore particularly suitable for the analysis and fractionation of biological samples containing peptides, proteins, etc.! / Speak.
  • Spherical high-purity silica gel (Daiso 1 Gel SP-300 10P, average particle size 10 ⁇ m, pore size 300 angstrom, surface area 100 m 2 / g) azeotropically dehydrated in 150 ml toluene, n-Butyldichlorosilane (3.3 g) and pyridine (2.4 g) were added, and the mixture was heated to reflux for 5 hours. Subsequently, 0.8 g of 1,1,3,3,5,5 hexamethylcyclotrisilazane was added to this reaction solution as an end-cabining agent, and this mixture was refluxed for 5 hours to complete the end-cap reaction. The mixture was cooled to room temperature, filtered, washed with methanol, and dried to obtain 20 g of a filler for liquid chromatography.
  • Comparative Example 1 20 g of the same spherical high-purity silica gel used in Example 1 (“Diiso-gel SP-300-10P”) was azeotropically dehydrated in 150 ml of toluene, and then 2.3 g of n-butyldimethylchlorosilane and 1.2 g of pyridine. And the mixture was heated to reflux for 5 hours. Subsequently, trimethylchlorosilane (2.Og) and pyridine (1.8g) were added to the reaction solution as an end-caving agent, and the mixture was refluxed for 5 hours to complete the end-cap reaction. After cooling to room temperature, filtration, methanol 20g of packing material for liquid chromatography was obtained through washing and drying with
  • Example 2 20 g of the same spherical high-purity silica gel used in Example 1 (“Diiso-gel SP-300-10P”) was azeotropically dehydrated in 150 ml of toluene, and then 2.3 g of n-butyldimethylchlorosilane and 1.2 g of pyridine. And the mixture was heated to reflux for 5 hours. Subsequently, 1,1,3,3,5,5-hexamethylcyclotrisilazane 2. Og was added to the reaction solution as an end-cubbing agent, and the mixture was refluxed for 5 hours to carry out an end-capping reaction. After completion and cooling to room temperature, 20g of packing material for liquid chromatography was obtained through filtration, washing with methanol, and drying.
  • Example 2 20 g of the same spherical high-purity silica gel used in Example 1 (“Daiso-gel SP-300-10P”) was azeotropically dehydrated in 150 ml toluene, and then 3.3 g of di-n-butyldichlorosilane and pyridine 2 4 g was added and the mixture was heated to reflux for 5 hours. Subsequently, 2.0 g of trimethylchlorosilane and 1.8 g of pyridine were added to the reaction solution as an end-cubbing agent, and the mixture was refluxed for 5 hours to complete the end-cap reaction. After cooling to room temperature, filtration, methanol 20g of packing material for liquid chromatography was obtained through washing and drying with
  • Example 1 Each of the packing materials for liquid chromatography obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 6. Omm and a length of 250 mm by a slurry method. Acid before and after passing through the mobile phase by liquid chromatography evaluation test. The retention time was measured using uracil and naphthalene as samples, and the retention coefficient (k) was calculated from the measured values.
  • the end-cap modified silica gel is hydrolyzed by the acid, and the modifying group is eliminated from the base silica gel, thereby reducing the retention coefficient of the target compound.
  • Table 1 when the bifunctional silane compound [I] is used as the chemical modifier and the bifunctional cyclic silazane [II] is used as the end-capping agent as in Example 1. The highest retention coefficient retention rate and carbon content retention rate were obtained after acid flow.
  • Comparative Examples 1 to 3 the conventional monofunctionality is used for the chemical modifier and the Z or end-cabining agent.
  • the retention time of naphthalene is t2.
  • Example 2 Each of the packing materials for liquid chromatography obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 250 mm by a slurry method.
  • the alkaline mobile phase was passed through the column to collect the entire amount of the eluent from the column, and the Si elution concentration was measured by elemental analysis of the recovered liquid. The results are shown in Table 2.
  • ICP inductively coupled plasma optical emission spectrometry
  • Example 1 and Comparative Example 1 Each of the liquid chromatography packing materials obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 6 mm and a length of 250 mm by a slurry method. A liquid chromatographic evaluation test was performed using a mixture of representative proteins as a standard sample. The liquid chromatography charts obtained in the protein separation test using the fillers of Example 1 and Comparative Example 1 are shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • the packing material for liquid chromatography of Example 1 prepared by using the bifunctional silane compound [I] as the chemical modifier and the difunctional cyclic silazane [II] as the end-cubbing agent
  • the selectivity of the protein and its elution are as follows. Not only did the order not change, but it also became possible to separate trace impurities (see Fig. 1), which could not be separated in the past, and showed higher separation performance.
  • FIG. 1 is a liquid chromatography chart of a protein separation test using the packing material for liquid chromatography obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is a liquid chromatography chart of a protein separation test using the liquid chromatography filler obtained in Comparative Example 1.

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Abstract

　本発明は耐酸性および耐アルカリ性に優れる高耐久性液体クロマトグラフィー用充填剤を提供する。シリカゲルに、一般式［I］で表される二官能性シラン化合物による化学修飾を施し、得られた化学修飾シリカゲルに、一般式［II］で表される二官能性環状シラザンを用いてエンドキャップ反応を行うことで、上記のような液体クロマトグラフィー用充填剤が得られる。式［I］中、Ｘ１およびＸ２は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子もしくは炭素数１～４のアルコキシ基であり、Ｒ１は置換基を有していてもよいアルキル基またはアリール基である。式［II］中、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なり、炭素数１～４のアルキル基であり、ｎは環を形成するユニットの数を示す値で、２～１０の整数である。 【化１】 【化２】

Description

明 細 書
高耐久性液体クロマトグラフィー用充填剤
技術分野
[0001] 本発明は、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法に関するものである。
[0002] 液体クロマトグラフィーは医薬品や食品、天然ィ匕合物等の分野で重要な分離分析 手段として幅広い分野で使用されている。通常、液体クロマトグラフィー用充填剤に は優れた機械強度、良 、分離性能等を備えた多孔性シリカゲルの表面をシランィ匕合 物で化学修飾したものが多く用いられる。表面修飾シリカゲルとしては、表面のシラノ ール基に化学結合によりォクタデシル基を導入したもの（ODS)が最も一般的である 力 導入基がォクチル基、ブチル基、メチル基等であるものも知られている。また、ァ ルキル基は末端にフ -ル基ゃァミノ基、シァノ基、ニトロ基等の官能基を有する場 合もある。
[0003] 液体クロマトグラフィーによる化合物の分析および分取においてはその分離条件と して酸性の移動相やアルカリ性の移動相を用いることが多い。特に、ペプチド、タン パク質等を含む生体試料を分析および分取の対象とする場合には、酸による加水分 解で修飾基が母体シリカゲル力 脱離したりアルカリにより母体シリカゲルが溶解す る等の問題がある。そのため長寿命かつ高耐久性の液体クロマトグラフィー用充填剤 が要求される。
背景技術
[0004] 従来、高耐久性の液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法としては、シリカゲル表 面にペルヒドロキシポリシラザンのようなポリシラザンを含浸させ、次 、でこのシリカゲ ルを焼成することにより表面にセラミックスのコーティングを施し、これに修飾剤シラン 化合物を化学結合させる方法 (特許文献 1参照）、ヒドロシリル基を有するシリコーン 化合物をシリカゲル表面で重合させてシリコーンポリマーを形成させる方法 (特許文 献 2参照）、修飾剤シランィ匕合物として、その構造内にォクタデシルジ一 t—プチルク 性シランを用 、る方法 (特許文献 3)が提案されて 、る。 [0005] しかし、特許文献 1のセラミックスによるコーティングおよび特許文献 2のポリマーに よるコーティングは 、ずれもシリカゲルの特性を失う恐れがあり、特許文献 3の立体保 護基は液体クロマトグラフィー用充填剤としての選択性を大きく変えることになる。 特許文献 1：特開平 10— 206407号公報。
特許文献 2 :特開 2003— 149219号公報。
特許文献 3：特開昭 63— 137750号公報。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は上記のような実情カゝら耐酸性および耐アルカリ性に優れた高耐久性液体 クロマトグラフィー用充填剤を提供することを課題とするものである。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を 有するシラン化合物を用いてシリカゲル表面をィ匕学修飾する工程と、次 、で特定の 構造を有する二官能性環状シラザンィ匕合物を用いるエンドキャップ反応工程とを組 み合わせることにより、シリカゲルの特性を失うことなぐかつ液体クロマトグラフィー用 充填剤としての選択性を大きく変えることなぐしカゝも耐酸性、耐アルカリ性に極めて 優れた新規高耐久性液体クロマトグラフィー用充填剤の製造法を確立するに至った
[0008] すなわち、本発明は、シリカゲルに、一般式 [I]で表される二官能性シランィ匕合物に よる化学修飾を施し、得られたィ匕学修飾シリカゲルに、一般式 [Π]で表される二官能 性環状シラザンを用いてエンドキャップ反応を行うことを特徴とする液体クロマトグラフ ィー用充填剤の製造法である。
[化 1]
Figure imgf000003_0001
[式中、 x1および x2は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子もしくは炭素数 1 〜4のアルコキシ基であり、 R1は置換基を有して 、てもよ 、アルキル基またはァリー ル基である。 ]
ハロゲン原子は X1と X2で同じでも異なってもよい。
[化 2]
Figure imgf000004_0001
[式中、 R2および R3は、同一または異なり、炭素数 1〜4のアルキル基であり、 nは環 を形成するユニットの数を示す値で、 2〜 10の整数である。 ]
更に、本発明は上記方法により得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いた 液体クロマトグラフィー用カラム、そのカラムを用いた分析方法または分取方法、特に 生体試料に含まれるペプチドまたはタンパク質の分析または分取方法を提供する。
[0009] 本発明方法に用いる好ましい原料シリカゲルは、平均粒子径が通常 1〜： L000 μ m 、好ましくは 2〜200 μ mであり、細孔径が通常 10〜： L0000オングストローム、好まし くは 50〜3000オングストロームであり、表面積が通常 1〜： L000m2/g、好ましくは 5 〜600m2/gである多孔性シリカゲルである。高い分離性能を得るため
には原料シリカゲルとしては高純度かつ球形のものが好ましい。
[0010] 一般式 [I]で表される二官能性シランィ匕合物において、 R1としてのアルキル基は、 直鎖状アルキル基、分枝状アルキル基、環状アルキル基等であってもよい。 R1がァ ルキル基の場合、炭素数は特に限定しないが、好ましくは 1〜30、より好ましくは 2〜 8である。 R1としてのァリール基はフエ-ル基、トリル基、メシチル基、ナフチル基等で あってもよい。
[0011] 一般式 [I]中の R1としてのアルキル基は末端にァリール基、アミノ基（― NH )、シァ ノ基（一 CN)もしくは-トロ基（一 NO )を有するか、または非末端にアミド基（一 NH — C (O) )、カーバメート基（ O C (O) NH ）、カーバマイド基（ NH— C ( O) NH )、エステル基（― O C (O)―)もしくはカーボネート基（― O C (O) - o—）を有していてもよい。
[0012] 一般式 [I]で表される二官能性シランィ匕合物は、水素原子、ハロゲン原子またはァ ルコキシル基を有するジアルキルシランまたはジァリールシランである。具体的には、 ジメチルジクロロシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジェトキシシラン、ジェチ ノレジクロロシラン、ジェチノレジメトキシシラン、ジェチノレジェトキシシラン、ジー n—プロ ピルジクロロシラン、ジー n—プロピルジメトキシシラン、ジイソプロピルジクロロシラン、 ジイソプロピルジメトキシシラン、ジー n—ブチルジクロロシラン、ジー n ブチルジメト ルジクロロシラン、ジ tーブチルジメトキシシラン、ジ n—ペンチルジクロロシラン、 ジー n ペンチルジメトキシシラン、ジシクロペンチルジクロロシラン、ジシクロペンチ ノレジメトキシシラン、ジー n キシノレジクロロシラン、ジー n キシノレジメトキシシラ ン、ジシクロへキシノレジクロロシラン、ジシクロへキシノレジメトキシシラン、ジー n ヘプ チルジクロロシラン、ジー n プチルジメトキシシラン、ジ n—ォクチルジクロロシラ ン、ジ一 n—ォクチルジメトキシシラン、ジフエニルジクロロシラン、ジフエ二ルジメトキ シシラン、ジメシチルジクロロシラン、ジメシチルジメトキシシラン、ジー（p—トリル） ジクロロシラン、ビス（3—シァノプロピル）ジクロロシラン、ビス（3—シァノプロピル）ジ メトキシシラン等が例示できる。
[0013] 本発明者らは、種々の検討を行った結果、化学修飾剤として二官能性シランィ匕合 物一般式 [I]を用いて化学修飾したシリカゲルが、従来の一官能性シラン化合物を 用 、て化学修飾したものと比較して、耐久性の向上にお!、て格段に効果的であるこ とを見い出した。
[0014] 化学修飾反応は公知の方法および条件下で行うことができ、シリカゲルと二官能性 シランィ匕合物 [I]を溶媒中で加温して反応させてょ 、。反応温度は好ましくは 60 2 00°C、より好ましくは 100 160°Cであり、反応は液相中で行ってよい。溶媒は特に 限定しな 、が、二官能性シランィ匕合物 [I]とは反応せずかつ反応温度下で安定であ るベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族炭化水素、ジクロロベンゼン 等の置換芳香族化合物が好適である。反応圧は通常大気圧であるが、 0. 15〜0. 4 9MPaの加圧条件下で反応を行ってもよい。反応時間は好ましくは 0. 5〜20時間、 より好ましくは 3〜10時間である。二官能性シランィ匕合物 [I]の使用量は、二官能性 シランィ匕合物 [I]Zシリカゲルの重量比で好ましくは 0. 01〜10、より好ましくは 0. 05 〜1である。反応系にピリジン、イミダゾールのような塩基性ィ匕合物を添加することも 好ましい。
[0015] 二官能性シランィ匕合物 [I]は、一官能性のものに比べると、反応可能なサイトが多く 、より反応性が高ぐまた三官能性のものに比べると、副反応を起こすことが少ないと いった利点がある。
[0016] 二官能性シランィ匕合物 [I]として、特に、 2つの R1が同じで炭素数 4〜30のアルキ ル基またはァリール基のシランィ匕合物を用いた場合は、 2つの R1が異なるアルキル 基またはァリール基である二官能性シランィ匕合物（例えば、ォクタデシルメチルジクロ ロシラン、 n—ォクチルメチルジクロロシラン等）を用いた場合とは異なり、シリカゲルの 単位面積あたりのアルキル基またはァリール基の密度が増大し、疎水力や分離能の 向上、さらには耐久性の向上に有利である。
[0017] 化学修飾反応後の反応液をそのまま次のエンドキヤッビング反応に用いてもよいが 、化学修飾反応液から固形分を取り出してこれを洗浄乾燥して力 エンドキヤッピン グ反応に供してもよい。
[0018] 化学修飾反応後の反応液に引き続きエンドキヤッビング剤を仕込んで反応させても よいが、化学修飾反応終了後に、未反応の二官能性シラン化合物 [I]を加水分解さ せる場合もある。
[0019] 一般式 [II]で表されるエンドキヤッビング剤は二官能性環状シラザンであり、好まし くは 1, 1, 3, 3, 5, 5—へキサメチルシクロ卜リシラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7—ォ クタメチルシクロテ卜ラシラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9—デカメチルシクロべ ンタシラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9,
11, 11—ドデカメチルシクロへキサシラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5—へキサェチ ルシクロ卜!;シラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7—オタタエチルシクロテ卜ラシラザン、 1,
1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9—デカェチルシクロペンタシラザン、 1, 1, 3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11, 11ードデカェチルシクロへキサシラザン等が例示される。これらは単独 で用いても 2種以上の混合物で用いてもよい。
エンドキヤッビング剤 [II]は一般式 [III]で表される二官能性シランィ匕合物と組み合 わせて用いてもよ!、。エンドキヤッビング剤 [II]と二官能性シランィ匕合物 [III]の割合 は、エンドキヤッビング剤 [II] Z二官能性シランィ匕合物 [III]の重量比で好ましくは 0. 5以上、より好ましくは 1以上である。
[0020] [化 3]
Figure imgf000007_0001
[式中、 X3および X4は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子または炭素数 1 〜4のアルコキシル基であり、 R4および R5は、同一または異なり、炭素数 1〜4のアル キル基である。 ]
二官能性シランィ匕合物 [ΠΙ]としてはジメチルジクロロシラン、ジメチルジメトキシシラ ン等が例示される。
[0021] 本発明者らは、種々の検討を行った結果、エンドキヤッビングには、一般式 [II]で表 される二官能性環状シラザンを用いることで、従来の一官能性エンドキヤッビング剤と してのトリメチルクロロシランやへキサメチルジシラザンを用いた場合よりも、得られる エンドキャップ修飾シリカゲルの耐久性が格段に向上することを見い出した。
[0022] エンドキヤッビング反応は公知の方法および条件下で行うことができ、化学修飾した シリカゲルとエンドキヤッビング剤を溶媒中で加温して反応を行ってょ 、。反応温度 は好ましくは 60〜200°C、より好ましくは 100〜160°Cであり、反応は液相中で行つ てよい。溶媒は特に限定しないが、エンドキヤッビング剤 [II]とは反応せずかつ反応 温度下で安定であるベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族炭化水素、 ジクロロベンゼン等の置換芳香族化合物が好適である。反応圧は好ましくは通常大 気圧であるが、 0. 15〜0. 49MPaの加圧条件下で反応を行ってもよい。反応時間 は好ましくは 0. 5〜20時間、より好ましくは 3〜10時間である。エンドキヤッビング剤 [ II]の使用量は、エンドキヤッビング剤 [II] Z化学修飾シリカゲルの重量比で好ましく は 0. 01〜10、より好ましくは 0. 05〜1である。反応系にピリジン、イミダゾールのよう な塩基性化合物を添加することも好ましい。反応後、固液分離を行い、分離した固形 分を十分にメタノールのような洗浄剤で洗浄し、乾燥して液体クロマトグラフィー用充 填剤を得る。
発明の効果
[0023] 本発明によれば、 200°C以下と!/、う比較的温和な温度で、したがって簡易な反応 設備で短い製造工程でしたがって低コストで液体クロマトグラフィー用充填剤を製造 することができる。
[0024] 本発明による液体クロマトグラフィー用充填剤は、シリカゲルの特性を失うことなぐ 液体クロマトグラフィー用充填剤としての選択性を変えることなぐ耐酸性および耐ァ ルカリ性が高ぐ長寿命である。したがって、これは特にペプチド、タンパク質等を含 む生体試料の分析および分取に適して！/ヽる。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、本発明の実施例を幾つか挙げ、本発明を具体的に説明する。ただし、これら 実施例は本発明を限定するものではな 、。比較として従来の一官能性シランィ匕合物 および従来の一官能性エンドキヤッビング剤を用いた例を挙げる。その耐酸性比較 試験と耐アルカリ性比較試験、タンパク質の分離比較試験を行った。
[0026] 実施例 1
球形高純度シリカゲル (ダイソ一社製「ダイソ一ゲル SP— 300 10P」、平均粒子 径 10 μ m、細孔径 300オングストローム、表面積 100m2/g) 20gを 150mlトルエン 中で共沸脱水した後、ジ n—ブチルジクロロシラン 3. 3gとピリジン 2. 4gを加え、こ の混合物を加熱して 5時間還流させた。引き続きこの反応液にエンドキヤッビング剤と して、 1, 1, 3, 3, 5, 5 へキサメチルシクロトリシラザン 0. 8gを加え、この混合物を 5時間還流させてエンドキャップ反応を完了させ、室温まで冷却した後、ろ過、メタノ ールによる洗浄、乾燥を経て液体クロマトグラフィー用充填剤 20gを得た。
[0027] 比較例 1 実施例 1で用いたのと同じ球形高純度シリカゲル (「ダイソ一ゲル SP— 300— 10P」 ) 20gを 150mlトルエン中で共沸脱水した後、 n—ブチルジメチルクロロシラン 2. 3gと ピリジン 1. 2gを加え、この混合物を加熱して 5時間還流させた。引き続きこの反応液 にエンドキヤッビング剤として、トリメチルクロロシラン 2. Og、ピリジン 1. 8gを加え、こ の混合物を 5時間還流させてエンドキャップ反応を完了させ、室温まで冷却した後、 ろ過、メタノールによる洗浄、乾燥を経て液体クロマトグラフィー用充填剤 20gを得た
[0028] 比較例 2
実施例 1で用いたのと同じ球形高純度シリカゲル (「ダイソ一ゲル SP— 300— 10P」 ) 20gを 150mlトルエン中で共沸脱水した後、 n—ブチルジメチルクロロシラン 2. 3gと ピリジン 1. 2gを加え、この混合物を加熱して 5時間還流させた。引き続きこの反応液 にエンドキヤッビング剤として、 1, 1, 3, 3, 5, 5—へキサメチルシクロトリシラザン 2. Ogをカ卩え、この混合物を 5時間還流させてエンドキャップ反応を完了させ、室温まで 冷却した後、ろ過、メタノールによる洗浄、乾燥を経て液体クロマトグラフィー用充填 剤 20gを得た。
[0029] 比較例 3
実施例 1で用いたのと同じ球形高純度シリカゲル (「ダイソ一ゲル SP— 300— 10P」 ) 20gを 150mlトルエン中で共沸脱水した後、ジ—n—ブチルジクロロシラン 3. 3gと ピリジン 2. 4gを加え、この混合物を加熱して 5時間還流させた。引き続きこの反応液 にエンドキヤッビング剤として、トリメチルクロロシラン 2. 0g、ピリジン 1. 8gを加え、こ の混合物を 5時間還流させてエンドキャップ反応を完了させ、室温まで冷却した後、 ろ過、メタノールによる洗浄、乾燥を経て液体クロマトグラフィー用充填剤 20gを得た
[0030] 評価試験
1)耐酸性試験
実施例 1および比較例 1〜3で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤をそれぞれ 、内径 6. Omm,長さ 250mmのステンレス製カラムにスラリー法により充填した。酸性 移動相の通液前後についてそれぞれ液体クロマトグラフィー評価試験により標準サ ンプルとしてゥラシルおよびナフタレンを用いて保持時間を測定し、この測定値から 保持係数 (k)を求めた。
また、充填剤としてのエンドキャップ修飾シリカゲル中の炭素含有量を求めるために 元素分析測定を行った。これらの結果から、酸通液前に対する酸通液後の保持係数 の維持率および炭素含有率 (エンドキャップ修飾シリカゲル 1グラム当たりの炭素重 量)の維持率を算出した。これらの結果を表 1に示す。
カラムに酸性の移動相を通液することにより、エンドキャップ修飾シリカゲルが酸に より加水分解されて母体シリカゲルからの修飾基の脱離が起こり、対象化合物の保持 係数が低下する。表 1からわ力るように、実施例 1のように化学修飾剤に二官能性シ ラン化合物 [I]を用い、かつエンドキヤッビング剤に二官能性環状シラザン [II]を用い ると、酸通液後に最も高い保持係数の維持率および炭素含有率の維持率が得られ た。これに対し、比較例 1〜3のように、化学修飾剤および Zまたはエンドキヤッビング 剤に従来の一官能
性シランィ匕合物を用いると、耐酸性効果が十分でなぐ実施例 1に比べて低い保持 係数の維持率および炭素含有率の維持率を示した。
[表 1]
表 1 . 耐酸性試験結果の比較
Figure imgf000011_0001
[0031] 液体クロマトグラフィー評価試験
移動相：メタノール Z水 = 50/50 (体積比） ： 1. 7ml/ mm
温度： 40°C
検出器： UV 254nm
標準サンプル：
1)ゥラシル（0. 3mg/ml)
2)ナフタレン（1. 8mg/ml)
インジェクション： 1. 5 ^ 1
[0032] 保持係数の算出
ゥラシルの保持時間を tlとする。
ナフタレンの保持時間を t2とする。
ナフタレンの保持係数を kとする。
保持計数 (k)は以下の計算式により算出される。 k= (t2-tl) /tl
[0033] 酸性移動相の通液条件
酸性移動相：ァセトニトリル Zl%トリフルォロ酢酸水溶液 (PH= 1) = 10Z90 (体 積比）
流速： 0. 9mレ min
温度： 70°C
通液時間： 15時間
[0034] ナフタレンの保持係数および炭素含有率の、酸通液前に対する酸通液後の維持率 の算出
維持率（％) =酸通液後の値 Z酸通液前の値 X 100
[0035] 2)耐アルカリ性試験
実施例 1および比較例 1〜3で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤をそれぞれ 、内径 6mm、長さ 250mmのステンレス製カラムにスラリー法により充填した。カラム にアルカリ性移動相を通液して、カラムからの溶離液を全量回収し、回収液の元素分 析により Si溶出濃度を測定した。その結果を表 2に示す。
カラムにアルカリ性の移動相を通液することにより、カラム内の母体シリカゲルの溶 解が起こる。表 2からわ力るように、実施例 1のように化学修飾剤に二官能性シラン化 合物 [I]を用い、 かつエンドキヤッビング剤に二官能性環状シラザン [II]を用いると、 アルカリ通液による Si溶出濃度は最も低ぐすなわち耐アルカリ性が最も高い。これ に対し、比較例 1〜3のように、化学修飾剤および Zまたはエンドキヤッビング剤に従 来の一官能性シランィ匕合物を用いると、耐アルカリ性に及ぼす効果が十分でなぐ実 施例 1に比べてより高 、Si溶出濃度を示した。
[表 2] 表 2. 耐ァルカ リ性試験結果の!:匕較
実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3 ジ ー n —プチ n 一プチルジ n 一プチルジ ジ — n —プチ 化学修飾剤 ルジ ク ロ ロ シ メ チルク ロ 口 メチルク ロ 口 ゾレジ ク ロ ロ シ ラン シラン シラン ラン
エ ン ド キ ヤ ッ 1 , 1 , 3 , 3 , 卜 リ メ チルク 1 , 1 , 3 , 3 , 卜 リ メ チルク ビング剤 5 , 5一へキサ ロロシラン 5， 5—へキサ ロロシラン メ チルシ ク ロ メチルシ ク ロ
ト リ シラザン トリシラザン
アル力 リ 通液 1 2 2 2 3 1 3 4 2 3 によ り 溶出す
-6 S I 兀 3^
度 （ p p m )
[0036] アルカリ性移動相の通液条件
移動相：ァセトニトリル Ζθ.01N 水酸ィ匕ナトリゥム水溶液 11=12)=10790( 体積比）
： 1.7ml/ mm
温度： 40°C
通液時間： 5時間
[0037] Si溶出濃度測定
誘導結合プラズマ発光分析法 (ICP)を用いて測定を行った。
[0038] 3)タンパク質分離試験
実施例 1および比較例 1で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤をそれぞれ、内 径 6mm、長さ 250mmのステンレス製カラムにスラリー法により充填した。代表的なタ ンパク質の混合物を標準サンプルに用いて液体クロマトグラフィー評価試験を行った 。実施例 1および比較例 1の各充填剤を用いたタンパク質分離試験で得られた液体 クロマトグラフィーチャートを図 1および図 2にそれぞれ示す。
化学修飾剤に二官能性シラン化合物 [I]を用い、 かつエンドキヤッビング剤にニ官 能性環状シラザン [II]を用いて調製した実施例 1の液体クロマトグラフィー用充填剤 は、化学修飾剤とエンドキヤッビング剤に従来の一官能性シランィ匕合物を用いて調 製した比較例 1の液体クロマトグラフィー用充填剤と比較して、タンパク質の選択性お よびその溶出順が変化することはないばかりか、従来は分離できなかった微量不純 物（図 1参照)の分離も可能になり、より高い分離性能を示した。
[0039] 液体クロマトグラフィーの操作条件
移動相
A液)ァセトニトリル Z水 Zトリフルォロ酢酸 =20Z80Z0. 1 (体積比）
Β液)ァセトニトリル Ζ水 Ζトリフルォロ酢酸 =60Ζ40Ζ0. 1 (体積比） 0〜 25分 Α液力 Β液への直線グラジェント
25〜35分 B液 100%
流速： 1. 7ml/ min
カラム温度： 35°C
検出器： UV220nm
標準サンプル： 1)〜6)の混合物
1)リボヌクレアーゼ A(2. Omg/ml)
2)チトクロム C (l. 5mg/ml)
3)リゾチーム（1. 5mg/ml)
4)ゥシ血清アルブミン（4. Omg/ml)
5)ミ才グロビン（2. Omg/ml)
6)ォバノレブミン（5. Omg/ml)
インジェクション： 10 1
図面の簡単な説明
[0040] [図 1]実施例 1で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用レ、たタンパク質分離試 験の液体クロマトグラフィーチャートである。
[図 2]比較例 1で得られた液体クロマトグラフィー用充填剤を用いたタンパク質分離試 験の液体クロマトグラフィーチャートである。

Claims

請求の範囲 シリカゲルに、一般式 [I]で表される二官能性シランィ匕合物による化学修飾を施し、 得られたィ匕学修飾シリカゲルに、一般式 [II]で表される二官能性環状シラザンを用い てエンドキャップ反応を行うことを特徴とする液体クロマトグラフィー用充填剤の製造 法。
[化 1]
Figure imgf000015_0001
[式中、 X1および X2は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子もしくは炭素数 1 〜4のアルコキシ基であり、 R1は置換基を有して 、てもよ 、アルキル基またはァリー ル基である。 ]
[化 2]
Figure imgf000015_0002
[式中、 R2および R3は、同一または異なり、炭素数 1〜4のアルキル基であり、 nは環 を形成するユニットの数を示す値で、 2〜 10の整数である。 ]
[2] 一般式 [I]中の R1としてのアルキル基が末端にァリール基、アミノ基、シァノ基もしくは ニトロ基を有するか、または非末端にアミド基、カーノメート基、カーバマイド基、エス テル基もしくはカーボネート基を有する、請求項 1に記載の液体クロマトグラフィー用 充填剤の製造法。
[3] 一般式 [II]で表される二官能性環状シラザンを一般式 [III]で表される二官能性シ ランィ匕合物と組み合わせて用いる請求項 1または 2に記載の液体クロマトグラフィー 用充填剤の製造法。
[化 3]
Figure imgf000016_0001
[式中、 X3および X4は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子または炭素数 1
〜4のアルコキシル基であり、 R4および R5は、同一または異なり、炭素数 1〜4のアル キル基である。 ]
[4] 請求項 1〜3のいずれかに記載の方法により製造された液体クロマトグラフィー用充 填剤。
[5] 請求項 4に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤が充填された液体クロマトグラフィ 一用カラム。
[6] 請求項 5に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いる化合物の分析方法または 分取方法。
[7] 請求項 6に記載の化合物が生体試料に含まれるペプチドまたはタンパク質である、 請求項 5に記載の化合物の分析方法または分取方法。
ラン化合物と組み合わせて用いる請求項 1または 2に記載の液体クロマトグラフィー 用充填剤の製造法。
[化 3]
Figure imgf000017_0001
[式中、 X3および X4は、同一または異なり、水素原子、ハロゲン原子または炭素数 1
〜4のアルコキシル基であり、 R4および R5は、同一または異なり、炭素数 1〜4のアル キル基である。 ]
[4] 請求項 1〜3のいずれカゝに記載の方法により製造された液体クロマトグラフィー用充 填剤。
[5] 請求項 4に記載の液体クロマトグラフィー用充填剤が充填された液体クロマトグラフィ 一用カラム。
[6] 請求項 5に記載の液体クロマトグラフィー用カラムを用いる化合物の分析方法または 分取方法。
[7] 請求項 6に記載の化合物が生体試料に含まれるペプチドまたはタンパク質である、 請求項 6に記載の化合物の分析方法または分取方法。
訂正された用紙 （規則 91)
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