DE112005000098T5

DE112005000098T5 - Hochbeständiges Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie

Info

Publication number: DE112005000098T5
Application number: DE112005000098T
Authority: DE
Inventors: Osakazu Nakajima; Takeshi Narita Urano
Original assignee: Daiso Co Ltd
Current assignee: Osaka Soda Co Ltd
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2005-06-22
Publication date: 2007-06-28
Also published as: US7537703B2; WO2006001300A1; SE0600373L; JPWO2006001300A1; SE530132C2; US20080249326A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches das chemische Modifizieren von Silicagel mit einer bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist:

worin X¹ und X² dieselben oder unterschiedlich sind, ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und R¹ eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe, welche einen oder mehrere Substituenten aufweisen können, darstellen und
das Ausführen einer Endverkappungs-Reaktion des resultierenden chemisch modifizierten Silicagels unter Verwendung eines bifunktionellen cyclischen Silazans, dargestellt durch die allgemeine Formel [II]:

worin R² und R³ dieselben oder unterschiedlich sind, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und n einen Wert bedeutet, welcher die Anzahl der den Ring bildenden Einheiten angibt, der eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist, umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Pakkungsmaterials für die Flüssigchromatographie.

Die Flüssigchromatographie wurde in vielen Bereichen als wichtiges Mittel für Trennungsanalysen auf dem Gebiet der Arzneimittel, Nahrungsmittel, Naturstoffe und ähnliches eingesetzt. Im Allgemeinen wurde als Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie poröses Silicagel mit einer ausgezeichneten mechanischen Festigkeit, guten Trennungsleistung und ähnliches, welches auf seiner Oberfläche mit einer Silan-Verbindung chemisch modifiziert wurde, in vielen Fällen eingesetzt. Das gängigste oberflächenmodifizierte Silicagel weist an den Silanolgruppen auf der Oberfläche über eine chemische Bindung eingeführte Octadecylgruppen auf (ODS). Jedoch sind jene mit Octylgruppen, Butylgruppen, Methylgruppen oder ähnlichem als eingeführte Gruppen ebenso bekannt. In einigen Fällen weisen jene Alkylgruppen eine funktionelle Gruppe, wie eine Phenylgruppe, eine Aminogruppe, eine Cyanogruppe oder Nitrogruppe, an ihrem Ende auf.

In der Analyse und Fraktionierung einer Verbindung durch Flüssigchromatographie wird oftmals eine saure mobile Phase oder eine alkalische mobile Phase als Trennungsbedingung bzw. Trennungskondition verwendet. Insbesondere bei der Analyse und Fraktionierung einer biologischen Probe, welche Peptide, Proteine oder ähnliches enthält, treten Probleme der Abtrennung der modifizierenden Gruppe von dem Matrixsilicagel durch saure Hydrolyse, Auflösen des Matrixsilicagels durch Alkali und ähnliches auf. Dementsprechend bestand ein Bedarf an einem hochbeständigen Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie mit einer verlängerten Betriebslebensdauer.

Herkömmlich wurden als Verfahren zur Herstellung eines hochbeständigen Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie ein Verfahren, welches das Imprägnieren einer Silicagel-Oberfläche mit Polysilazan, wie Perhydroxypolysilazan, anschließendes Backen bzw. Brennen dieses Silicagels unter Bildung von keramischen Überzügen auf seiner Oberfläche zur Beschichtung mit Keramiken und chemisches Binden einer Silan-Verbindung daran als Modifikationsmittel (siehe JP-A-H10-206407) umfaßt, ein Verfahren, welches das Polymerisieren einer Silikon-Verbindung mit einer Hydrosilyl-Gruppe auf einer Silicagel-Oberfläche unter Bildung eines Silikon-Polymers umfasst (siehe JP-A-2003-149219), sowie ein Verfahren, in dem ein monofunktionelles Silan mit einer sterischen Schutzgruppe, wie Octadecyldi-t-butylchlorsilan oder Octyldiisopropylchlorsilan, in seiner Struktur als Silan-Verbindung in Funktion eines Modifikationsmittels verwendet wird (siehe JP-A-S63-137750) vorgeschlagen.

Jedoch können in jeder der Beschichtungen mit Keramiken in der JP-A-H10-206407 und den Beschichtungen mit einem Polymer in der JP-A-2003-149219 die Eigenschaften des Silicagels möglicherweise sich verschlechtern, während die sterische Schutzgruppe in der JP-A-S63-137750 die Selektivität des bzw. als Packungsmaterial(s) für die Flüssigchromatographie stark beeinflusst.

Im Hinblick auf die obengenannte Situation ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines hochbeständigen Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches ausgezeichnet ist in der Säurebeständigkeit und Alkalibeständigkeit.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben viele Untersuchungen angestellt, um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, und haben entsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines neuen hochbeständigen Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches ausgezeichnet in der Säurebeständigkeit und Alkalibeständigkeit ist, gefunden, wobei das Verfahren einen Schritt des chemischen Modifizierens der Silicagel-Oberfläche unter Verwendung einer Silan-Verbindung mit einer spezifischen Struktur sowie den anschließenden Endverkappungs-Reaktionsschritt, in dem eine bifunktionelle cyclische Silazan-Verbindung mit einer spezifischen Struktur verwendet wird, ohne Verlust der Eigenschaften des Silicagels sowie ohne Änderungen der Selektivität des Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie umfasst.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie dar, welches das chemische Modifizieren des Silicagels mit einer bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [I] repräsentiert ist:

worin X¹ und X² dieselben oder unterschiedlich sind, ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und R¹ eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe, welche einen oder mehrere Substituenten aufweisen können, darstellt, und die Durchführung einer Endverkappungs-Reaktion des resultierenden chemischen modifizierten Silicagels unter Verwendung eines bifunktionellen cyclischen Silazans, welches durch die allgemeine Formel [II] repräsentiert ist:

worin R² und R³ dieselben oder unterschiedlich sind, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und n einen Wert darstellt, welcher die Anzahl der den Ring bildenden Einheiten angibt und eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist, umfasst.

Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung eine Säule bzw. Kolonne für die Flüssigchromatographie zur Verfügung; in der das Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie, welches durch das genannte Verfahren erhalten wird, verwendet wird. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse oder ein Verfahren zur Fraktionierung zur Verfügung, in welchem die Säule verwendet wird, insbesondere ein Verfahren zur Analyse oder Fraktionierung von Peptiden oder Proteinen, welche in einer biologischen Probe enthalten sind.

Das Silicagel-Ausgangsmaterial, welches vorzugsweise in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, stellt poröses Silicagel mit einer mittleren Teilchengröße von gewöhnlich 1 bis 1.000 μm und besonders bevorzugt von 2 bis 200 μm dar; besitzt eine Feinporengröße von gewöhnlich 10 bis 10.000 Å und besonders bevorzugt von 50 bis 3.000 Å; und weist eine Oberfläche von gewöhnlich 1 bis 1.000 m²/g und besonders bevorzugt von 5 bis 600 m²/g auf. Zum Erreichen einer hohen Trennleistung ist ein solches mit einer hohen Reinheit und Kugelform als Silicagel-Ausgangsmaterial bevorzugt.

In der bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [I] dargestellt ist, kann die durch R¹ angegebene Alkylgruppe eine geradkettige Alkylgruppe, eine verzweigtkettige Alkylgruppe, eine cyclische Alkylgruppe oder ähnliches sein. Wenn R¹ eine Alkylgruppe darstellt, ist die Anzahl der Kohlenstoffatome nicht besonders begrenzt, kann allerdings vorzugsweise 1 bis 30 und besonders bevorzugt 2 bis 8 betragen. Die Arylgruppe, welche durch R¹ dargestellt ist, kann eine Phenylgruppe, eine Tolylgruppe, eine Mesitylgruppe, eine Naphthylgruppe oder ähnliches sein.

Die durch R¹ in der allgemeinen Formel [I] dargestellte Alkylgruppe kann eine Arylgruppe, Aminogruppe (-NH), eine Cyanogruppe (-CN) oder eine Nitrogruppe (-NO) an ihrem Ende aufweisen, oder sie kann eine Amidgruppe (-NH-C(O)-), eine Carbamatgruppe (-O-C(O)-NH-), eine Carbamidgruppe (-NH-C(O)-NH-), eine Estergruppe (-O-C(O)-) oder eine Carbonatgruppe (-O-C(O)-O-) an einer von ihrem Ende unterschiedlichen Stelle aufweisen.

Die bifunktionelle Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [I] dargestellt ist, ist ein Dialkylsilan oder Diarylsilan mit einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom oder einer Alkoxcylgruppe. Spezifische Beispiele umfassen Dimethyldichlorsilan, Dimethyldimethoxysilan, Dimethyldiethoxysilan, Diethyldichlorsilan, Diethyldimethoxysilan, Diethyldiethoxysilan, Di-n-propyldichlorsilan, Di-n-propyldimethoxysilan, Diisopropyldichlorsilan, Diisopropyldimethoxysilan, Di-n-butyldichlorsilan, Di-n-butyldimethoxysilan, Diisobutyldichlorsilan, Diisobutyldimethoxysilan, Di-t-butyldichlorsilan, Di-t-butyldimethoxysilan, Di-n-pentyldichlorsilan, Di-n-pentyldimethoxysilan, Dicyclopentyldichlorsilan, Dicyclopentyldimethoxysilan, Di-n-hexyldichlorsilan, Di-n-hexyldimethoxysilan, Dicyclohexyldichlorsilan, Dicyclohexyldimethoxysilan, Di-n-heptyldichlorsilan, Di-n-heptyldimethoxysilan, Di-n-octyldichlorsilan, Di-n-octyldimethoxysilan, Diphenyldichlorsilan, Diphenyldimethoxysilan, Dimesityldichlorsilan, Dimesityldimethoxysilan, Di-(p-tolyl) dichlorsilan, Bis(3-cyanopropyl)dichlorsilan, Bis(3-cyanopropyl)dimethoxcysilan und dergleichen.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eine Reihe von Studien durch und fanden entsprechend heraus, dass das unter Verwendung einer bifunktionellen Silan-Verbindung chemisch modifizierte Silicagel, welches durch die allgemeine Formel [I] dargestellt ist, als ein chemisches Modifizierungsmittel in der Verbesserung der Beständigkeit im Vergleich mit einem unter Verwendung einer herkömmlichen monofunktionellen Silan-Verbindung chemisch modifizierten Silicagel deutlich wirksamer ist.

Die chemische Modifizierungsreaktion kann durch ein gängiges Verfahren unter gängigen Bedingungen durchgeführt werden, in welchen das Silicagel und die bifunktionelle Silan-Verbindung [I] in einem Lösungsmittel erwärmt werden können, um die Reaktion zu erlauben. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise 60 bis 200°C und besonders bevorzugt 100 bis 160°C. Die Reaktion kann in einer flüssigen Phase durchgeführt werden. Obwohl das Lösungsmittel nicht besonders begrenzt ist, ist ein aromatischer Kohlenwasserstoff, wie Benzol, Toluol, Xylol oder Mesitylen, oder eine substituierte aromatische Verbindung, wie Dichlorbenzol, geeignet, welche nicht mit der bifunktionellen Silan-Verbindung [I] reagiert und bei der Reaktionstemperatur stabil ist. Der Druck bei der Reaktion kann gewöhnlich Umgebungsdruck sein. Jedoch kann die Reaktion ebenso unter Druckbedingungen von 0,15 bis 0,49 MPa durchgeführt werden. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise 0,5 bis 20 Stunden und besonders bevorzugt 3 bis 10 Stunden. Die Menge an bifunktioneller Silan-Verbindung [I] beträgt vorzugsweise 0,01 bis 10 und besonders bevorzugt 0,05 bis 1, dargestellt durch das Gewichtsverhältnis der bifunktionellen Silan-Verbindung [I]/Silicalgel. Es ist ebenso bevorzugt, dass eine basische Verbindung, wie Pyridin oder Imidazol, zu dem Reaktionssystem zugesetzt wird.

Die bifunktionelle Silan-Verbindung [I] ist vorteilhafterweise derartiger Gestalt, dass sie mehrere reaktive Stellen aufweist und eine höhere Reaktivität als monofunktionelle Silan-Verbindungen zeigt, während weniger Nebenreaktionen als bei trifunktionellen Silan-Verbindungen bedingt werden.

Insbesondere ist die Verwendung einer Silan-Verbindung, in welcher zwei R¹-Reste dieselben sind und eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen darstellen, als die bifunktionelle Silan-Verbindung [I] zur Verbesserung der Hydrophobizität und der Auflösungsfähigkeit bzw. des Resolutionsvermögens, einer noch besseren Beständigkeit aufgrund der Erhöhung der Dichte der Alkylgruppen oder der Arylgruppen pro Oberflächeneinheit des Silicagels im Gegensatz zu dem Fall, wo eine bifunktionelle Silan-Verbindung eingesetzt wird, in welcher zwei R¹-Gruppen unterschiedliche Alkylgruppen oder Arylgruppen darstellen (beispielsweise Octadecylmethyldichlorsilan, n-Octylmethyldichlorsilan oder ähnliches), von Vorteil.

Die Reaktionsmischung kann nach der chemischen Modifizierungsreaktion direkt in der folgenden Endverkappungs-Reaktion eingesetzt werden. Jedoch können die Feststoffe aus der Reaktionsmischung der chemischen Modifikation entnommen werden und nach dem Waschen und Trocknen der Endverkappungs-Reaktion unterzogen werden.

Nach der chemischen Modifikationsreaktion kann ein Endverkappungsmittel zu der Reaktionsmischung zugesetzt werden, um die Endverkappungsreaktion durchzuführen. Jedoch wird in einigen Fällen unumgesetzte bifunktionelle Silan-Verbindung [I] nach vollständiger chemischer Modifikationsreaktion hydrolysiert.

Das durch die allgemeine Formel [II] dargestellte Endverkappungsmittel ist ein bifunktionelles cyclisches Silazan. Bevorzugte Beispiele umfassen 1,1,3,3,5,5-Hexamethylcyclotrisilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7-Octamethylcyclotetrasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9-Decamethylcyclopentasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11-Dodecamethylcyclohexasilazan, 1,1,3,3,5,5-Hexaethylcyclotrisilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7-Octaethylcyclotetrasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9-Decaethylcyclopentasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11-Dodecaethylcyclohexasilazan und dergleichen.

Diese können entweder alleine oder in Mischung von zwei oder mehreren davon verwendet werden.

Das Endverkappungsmittel [II] kann in Kombination mit einer bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [III] dargestellt ist, verwendet werden. Das Verhältnis des Endverkappungsmittels [II] und der bifunktionellen Silan-Verbindung [III] kann vorzugsweise 0,5 oder mehr und besonders bevorzugt 1 oder mehr betragen, dargestellt durch das Gewichtsverhältnis des Endverkappungsmittels [II]/bifunktionelle Silan-Verbindung [III]:

worin X₃ und X₄ dieselben oder unterschiedlich sind, ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und R⁴ und R⁵ dieselben oder unterschiedlich sind und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen.

Bevorzugte Beispiele der bifunktionellen Silan-Verbindung [III] umfassen Dimethyldichlorsilan, Dimethyldimethoxysilan und ähnliches.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten eine Reihe von Studien durch und fanden entsprechend, dass die Verwendung des durch die allgemeine Formel [II] dargestellten bifunktionellen cyclischen Silazans bei der Endverkappung die Beständigkeit des resultierenden endverkappten modifizierten Silicagels deutlicher verbessert als in einem solchen Fall, in dem Trimethylchlorsilan oder Hexamethyldisilazan als ein herkömmliches monofunktionelles Endverkappungsmittel eingesetzt wird.

Die Endverkappungsreaktion kann durch gängige Verfahren unter gängigen Bedingungen durchgeführt werden, in dem das chemisch modifizierte Silicagel und das Endverkappungsmittel in einem Lösungsmittel erwärmt werden können, um die Reaktion zu erlauben. Die Reaktionstemperatur beträgt vorzugsweise 60 bis 200°C und besonders bevorzugt 100 bis 160°C. Die Reaktion kann in einer flüssigen Phase durchgeführt werden. Obwohl das Lösungsmittel nicht besonders begrenzt ist, ist ein aromatischer Kohlenwasserstoff, wie Benzol, Toluol, Xylol oder Mesitylen, oder eine substituierte aromatische Verbindung, wie Dichlorbenzol, geeignet, welche nicht mit dem Endverkappungsmittel [II] reagiert und bei der Reaktionstemperatur stabil ist. Der Reaktionsdruck kann vorzugsweise Umgebungsdruck darstellen. Jedoch kann die Reak tion ebenso unter Druckbedingungen von 0,15 bis 0,49 MPa durchgeführt werden. Die Reaktionszeit beträgt vorzugsweise 0,5 bis 20 Stunden und besonders bevorzugt 3 bis 10 Stunden. Die Menge des Endverkappungsmittels [II] ist vorzugsweise 0,01 bis 10 und besonders bevorzugt 0,05 bis 1, dargestellt durch das Gewichtsverhältnis des Endverkappungsmittels [II]/chemisch modifiziertes Silicagel. Es ist ebenso bevorzugt, dass eine basische Verbindung, wie Pyridin oder Imidazol, zu dem Reaktionssystem zugesetzt wird.

Nach vollständiger Reaktion kann eine Feststoff-Flüssigkeit-Trennung erfolgen, und die abgetrennten Feststoffe können mit einem Waschmittel, wie Methanol, ausreichend gewaschen werden, gefolgt vom Trocknen unter Erhalt eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie bei vergleichsweise moderaten Temperaturen, d.h. bei 200°C oder weniger, hergestellt werden, wodurch in einem einfachen Reaktionsapparat und einem Produktionsschritt, welcher eine kurze Zeitdauer erfordert, und dementsprechend bei niedrigen Kosten hergestellt werden.

Das Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung vermeidet den Verlust an für Silicagel charakteristischen Eigenschaften und zeigt eine hohe Säurebeständigkeit und Alkalibeständigkeit. Ferner besitzt es eine lange Betriebslebensdauer ohne Änderung der Selektivität als Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie. Daher ist dieses Packungsmaterial besonders geeignet für die Analyse und Fraktionierung einer biologischen Probe, welche Peptide, Proteine oder ähnliches enthält.

Nachstehend werden einige Beispiele der vorliegenden Erfindung zur detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben. Jedoch ist die vorliegende Erfindung auf diese Beispiele nicht begrenzt. Als ein Vergleich werden Beispiele, in denen eine konventionelle monofunktionelle Silan-Verbindung und ein konventionelles monofunktionelles Endverkappungsmittel verwendet werden, angeführt. Es wurden ein Säurebeständigkeitsvergleichstest, ein Alkalibeständigkeitsvergleichstest und ein Proteintrennungsvergleichstest dieser Beispiele durchgeführt.
Beispiel 1
Nach dem Durchführen einer azeotropen Dehydratisierung bzw. Entwässerung von 20 g kugelförmigem bzw. sphärischem hochreinem Silicagel (hergestellt von der Daiso Co., Ltd. "Daiso Gel SP-300-10P", mittlere Teilchengröße: 10 μm, Feinporengröße: 300 Å, Oberfläche: 100 m²/g) in 150 ml Toluol wurden 3,3 g Di-n-butyldichlorsilan und 2,4 g Pyridin zugesetzt. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurden zu dieser Reaktionsmischung 0,8 g 1,1,3,3,5,5-Hexamethylcyclotrisilazan als Endverkappungsmittel zugegeben. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang zur Vervollständigung der Endverkappungsreaktion refluxiert und auf Raumtemperatur abgekühlt, gefolgt von Filtration, Waschen mit Methanol und Trocknen, wobei 20 g eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie erhalten wurden.
Vergleichsbeispiel 1
Nach dem Durchführen einer azeotropen Entwässerung von 20 g des selben kugelförmigen hochreinen Silicagels, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde ("Daiso Gel SP-300-10P") in 150 ml Toluol wurden 2,3 g n-Butyldimethylchlorsilan und 1,2 g Pyridin zugesetzt. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurden zu dieser Reaktionsmischung 2,0 g Trimethylchlorsilan als Endverkappungsmittel und 1,8 g Pyridin zugegeben. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang zur Vervollständigung der Endverkappungsreaktion refluxiert und auf Raumtemperatur abgekühlt, gefolgt von Filtration, Waschen mit Methanol und Trocknen, wobei 20 g eines Pakkungsmaterials für die Flüssigchromatographie erhalten wurden.
Vergleichsbeispiel 2
Nach der Durchführung einer azeotropen Entwässerung von 20 g des selben kugelförmigen hochreinen Silicagels, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde ("Daiso Gel SP-300-10P"), in 150 ml Toluol wurden 2,3 g n-Butyldimethylchlorsilan und 1,2 g Pyridin zugesetzt. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurden zu dieser Reaktionsmischung 2,0 g 1,1,3,3,5,5-Hexamethylcyclotrisilazan als ein Endverkappungsmittel zugegeben. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang zur Vervollständigung der Endverkappungsreaktion refluxiert und auf Raumtemperatur abgekühlt, gefolgt von Filtration, Waschen mit Methanol und Trocknen, wobei 20 g eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie erhalten wurden.
Vergleichsbeispiel 3
Nach der Durchführung einer azeotropen Entwässerung von 20 g des selben kugelförmigen hochreinen Silicagels, wie es in Beispiel 1 verwendet wurde ("Daiso Gel SP-300-10P"), in 150 ml Toluol wurden 3,3 g Di-n-butyldichlorsilan und 2,4 g Pyridin zugegeben. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurden zu dieser Reaktionsmischung 2,0 g Trimethylchlorsilan als Endverkappungsmittel und 1,8 g Pyridin zugesetzt. Diese Mischung wurde 5 Stunden lang zur Vervollständigung der Endverkappungsreaktion refluxiert und auf Raumtemperatur abgekühlt, gefolgt von Filtration, Waschen mit Methanol und Trocknen, wobei 20 g eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie erhalten wurden.
Evaluierungstests
1) Säurebeständigkeitstest
Die in Beispiel 1 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 erhaltenen Packungsmaterialien für die Flüssigchromatographie wurden jeweils in eine Edelstahlsäule bzw. Edelstahlkolonne mit einem Innendurchmesser von 6,0 mm und einer Länge von 250 mm mittels eines Aufschlämmungsverfahrens gepackt. Die Retentionszeit bezüglich der sauren mobilen Phase wurde vor und nach dem Passieren der Flüssigkeit jeweils durch einen Flüssigchromatographie-Evalu-ierungstest unter Verwendung von Uracil und Naphthalin als Standardprobe gemessen, und der Retentionskoeffizient (k) wurde aus diesen Messwerten bestimmt.
Um den Kohlenstoffgehalt in dem durch Endverkappung modifizierten Silicagel als ein Packungsmaterial zu bestimmen, wurden darüber hinaus Messungen hinsichtlich der Elementaranalyse durchgeführt. Aus diesen Ergebnissen konnte die Erhaltungsrate des Retentionskoeffizienten und die Erhaltungsrate des Kohlenstoffgehalts (Gewicht von Kohlenstoff pro 1 g des durch Endverkappung modifizierten Silicagels) nach dem Passieren der Säureflüssigkeit in Bezug auf jene vor dem Passieren der Säureflüssigkeit berechnet werden. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Durch Passieren der Flüssigkeit der sauren mobilen Phase durch die Säule bzw. Kolonne wurde das durch Endverkappung modifizierte Silicagel durch die Säure hydrolysiert, wobei ein Abtrennen der Modifikationsgruppe von dem Matrixsilicagel hervorgerufen wurde. Dementsprechend nahm der Retentionskoeffizient der Zielverbindung ab. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist zeigten sich die höchsten Erhaltungsraten des Retentionskoeffizienten sowie die höchsten Erhaltungsraten des Kohlenstoffgehalts nach dem Durchleiten der Säureflüssigkeit bei Verwendung der bifunktionellen Silan-Verbindung [I] als chemisches Modifizierungsmittel und des bifunktionellen cyclischen Silazans [II] als Endverkappungsmittel, wie es in Beispiel 1 der Fall ist. Im Gegensatz dazu wurde bei Verwendung einer konventionellen monofunktionellen Silan-Verbindung als chemisches Modifizierungsmittel und/oder als Endverkappungsmittel wie in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 nur ein unzureichender Säurebeständigkeitseffekt erzielt. Ferner waren die Erhaltungsrate des Retentionskoeffizienten und die Erhaltungsrate des Kohlenstoffgehalts geringer als die in Beispiel 1.
Tabelle 1 Vergleich der Ergebnisse des Säurebeständigkeitstests
Flüssigchromatographie-Evaluierungstest

Mobile Phase: Methanol/Wasser = 50/50 (Volumenverhältnis)
Fließrate: 1,7 ml/Min.
Temperatur: 40°C
Detektor: UV 254 nm
Standardprobe: 1) Uracil (0,3 mg/ml) 2) Naphthalin (1,8 mg/ml)
Injektion: 1, 5 μl

Berechnung des Retentionskoeffizienten
Wenn die Retentionszeit von Uracil durch t1 dargestellt ist, die Retentionszeit von Naphthalin durch t2 dargestellt ist und der Retentionskoeffizient von Naphthalin durch k angegeben ist, wird der Retentionskoeffizient (k) gemäß der folgenden Formel berechnet: k = (t2 – t1)/t1
Bedingungen für das Durchleiten der Flüssigkeit durch die saure mobile Phase

Saure mobile Phase: Acetonitril/1% wässrige Trifluoressigsäure-Lösung (pH = 1) = 10/90 (Volumenverhältnis)
Fließrate: 0,9 ml/Min.
Temperatur: 70°C
Zeit des Flüssigkeitsdurchtritts: 15 Stunden

Berechnung der Erhaltungsraten des Retentionskoeffizienten und des Kohlenstoffgehalts von Naphthalin nach dem Passieren der Flüssigkeit der Säure zu jenen vor dem Durchleiten der Flüssigkeit der Säure
Erhaltungsrate (%) = Wert nach dem Passieren der Flüssigkeit der Säure/Wert vor dem Passieren der Flüssigkeit der Säure X 100
2) Alkalibeständigkeitstest
Die in Beispiel 1 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 erhaltenen Packungsmaterialien für die Flüssigchromatographie wurden jeweils in eine Edelstahlsäule bzw. Edelstahlkolonne mit einem Innendurchmesser von 6 mm und einer Länge von 250 mm mittels eines Aufschlämmungsverfahrens gepackt. Es wurde durch die Säule eine Flüssigkeit einer alkalischen mobilen Phase geleitet, und der Gesamtanteil des Eluats wurde von der Säule entnommen. Anschließend wurde die Konzentration an eluiertem Si durch Elementaranalyse der gewonnenen Flüssigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Die Lösung des Matrixsilicagels in der Säule geschieht durch Passieren der Flüssigkeit der alkalischen mobilen Phase durch die Säule. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist wird bei Verwendung der bifunktionellen Silan-Verbindung [I] als das chemische Modifizierungsmittel und des bifunktionellen cyclischen Silazans [II] als das Endverkappungsmittel, wie es in Beispiel 1 der Fall ist, die niedrigste Konzentration an Si durch Passieren der alkalischen Flüssigkeit eluiert. Mit anderen Worten wird die höchste Alkalibeständigkeit erreicht. Im Gegensatz dazu wird bei Verwendung der konventionellen monofunktionellen Silan-Verbindung als chemisches Modifizierungsmittel und/oder Endverkappungsmittel, wie es in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 der Fall ist, ein unzureichender Effekt hinsichtlich der Alkalibeständigkeit erreicht, was eine höhere Konzentration an eluiertem Si im Vergleich zu Beispiel 1 zeigt.
Tabelle 2 Vergleich der Ergebnisse des Alkalibeständigkeitstests
Bedingungen für das Durchleiten der Flüssigkeit der alkalischen mobilen Phase

Mobile Phase: Acetonitril/0,01 N wässrige Natriumhydroxid-Lösung (pH: 12) = 10/90 (Volumenverhältnis)
Fließrate: 1,7 ml/Min.
Temperatur: 40°C
Zeit des Durchleitens der Flüssigkeit: 5 Stunden

Messung der Konzentration an eluiertem Si
Die Messung wurde unter Verwendung der induktiv gekoppelten Plasmaemissionsspektrometrie (ICP) durchgeführt.
3) Test zur Trennung von Proteinen
Die in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Packungsmaterialien für die Flüssigchromatographie wurden jeweils in eine Edelstahlsäule bzw. Edelstahlkolonne mit einem Innendurchmesser von 6 mm und einer Länge von 250 mm mittels eines Aufschlämmungsverfahrens gepackt. Unter Verwendung einer Mischung von typischen Proteinen als Standardprobe wurde ein Flüssigchromatographie-Evaluierungstest durchgeführt. Die Charts der Flüssigchromatographie, welche in dem Trennungstest der Proteine erhalten wurden, in welchem ein jedes der Packungsmaterialien des Beispiels 1 und des Vergleichsbeispiels 1 verwendet wurde, sind in den 1 und 2 jeweils angegeben.
Das Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie des Beispiels 1, welches unter Verwendung der bifunktionellen Silan-Verbindung [I] als chemisches Modifizierungsmittel und des bifunktionellen cyclischen Silazans [II] als Endverkappungsmittel hergestellt wurden, zeigten nicht nur eine unveränderte Selektivität hinsichtlich der Proteine und Reihenfolge ihrer Eluierung, sondern ermöglichten ebenso die Abtrennung von geringfügigen Verunreinigungen, welche herkömmlich nicht abgetrennt werden konnten (siehe 1). Dadurch wird eine höhere Trennungsleistung nahegelegt im Vergleich zu den Packungsmaterialien für die Flüssigchromatographie des Vergleichsbeispiels 1, welches unter Verwendung der herkömmlichen monofunktionellen Silan-Verbindung als chemisches Modifizierungsmittel und Endverkappungsmittel hergestellt wurde.
Betriebsbedingungen für die Flüssigchromatographie
Mobile Phase

Flüssigkeit A) Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure = 20/80/0,1 (Volumenverhältnis)
Flüssigkeit B) Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure = 60/40/0,1 (Volumenverhältnis) 0 bis 25 Minuten, linearer Gradient von Flüssigkeit A zu Flüssigkeit B 25 bis 35 Minuten, Flüssigkeit B 100% Fließrate: 1,7 ml/Min. Säulentemperatur: 35°C Detektor: UV 220 nm Standardprobe: Mischung von 1) bis 6) 1) Ribonuclease A (2,0 mg/ml) 2) Cytochrom C (1, 5 mg/ml) 3) Lysozym (1,5 mg/ml) 4) Bovines Serumalbumin (4,0 mg/ml) 5) Myoglobin (2,0 mg/ml) 6) Ovalbumin (5,0 mg/ml) Injektion: 10 μl

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 gibt einen Chart der Flüssigchromatographie an, welcher in dem Trennungstest der Proteine unter Verwendung des Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches in Beispiel 1 hergestellt wurde, erhalten wurde.
2 gibt einen Chart der Flüssigchromatographie an, welcher in dem Trennungstest der Proteine unter Verwendung des Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches in Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurde, erhalten wurde.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein hochbeständiges Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie zur Verfügung, welches hinsichtlich der Säurebeständigkeit und Alkalibeständigkeit ausgezeichnet ist. Solch ein Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie kann durch chemisches Modifizieren von Silicagel mit einer bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [I] dargestellt ist, und mittels Durchführung einer Endverkappungs-Reaktion des resultierenden chemisch modifizierten Silicagels unter Verwendung eines bifunktionellen cyclischen Silazans, welches durch die allgemeine Formel [II] dargestellt ist, erhalten werden. In der Formel [I] sind X¹ und X² dieselben oder unterschiedlich, stellen ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar; und R¹ bedeutet eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe, welche ein oder mehrere Substituenten aufweisen können. In der Formel [II] sind R² und R³ dieselben oder unterschiedlich, stellen eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen dar; und n repräsentiert einen Wert, welcher die Anzahl der den Ring bildenden Einheiten angibt, welcher eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie, welches das chemische Modifizieren von Silicagel mit einer bifunktionellen Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel (I) dargestellt ist:
worin X¹ und X² dieselben oder unterschiedlich sind, ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und R¹ eine Alkylgruppe oder eine Arylgruppe, welche einen oder mehrere Substituenten aufweisen können, darstellen und das Ausführen einer Endverkappungs-Reaktion des resultierenden chemisch modifizierten Silicagels unter Verwendung eines bifunktionellen cyclischen Silazans, dargestellt durch die allgemeine Formel [II]:
worin R² und R³ dieselben oder unterschiedlich sind, eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und n einen Wert bedeutet, welcher die Anzahl der den Ring bildenden Einheiten angibt, der eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie nach Anspruch 1, worin die durch R¹ in der allgemeinen Formel [I] dargestellte Alkylgruppe eine Arylgruppe, eine Aminogruppe, eine Cyanogruppe oder eine Nitrogruppe an ihrem Ende aufweist oder eine Amidgruppe, eine Carbamatgruppe, eine Carbamidgruppe, eine Estergruppe oder eine Carbonatgruppe an einer von dem Ende unterschiedlichen Stelle aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Packungsmaterials für die Flüssigchromatographie nach Anspruch 1 oder 2, worin das durch die allgemeine Formel [II] dargestellte bifunktionelle cyclische Silazan und eine bifunktionelle Silan-Verbindung, welche durch die allgemeine Formel [III] dargestellt ist:
worin X³ und X⁴ dieselben oder unterschiedlich sind, ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom oder eine Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen; und R⁴ und R⁵ dieselben oder unterschiedlich sind und eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen darstellen, in Kombination verwendet werden.
Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie, welches durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt ist.
Säule für die Flüssigchromatographie, gepackt mit einem Packungsmaterial für die Flüssigchromatographie nach Anspruch 4.
Verfahren zur Analyse oder Verfahren zur Fraktionierung einer Verbindung, worin die Säule für die Flüssigchromatographie nach Anspruch 5 verwendet wird.
Verfahren zur Analyse oder Verfahren zur Fraktionierung einer Verbindung nach Anspruch 6, worin die Verbindung nach Anspruch 6 ein Peptid oder ein Protein, welches in einer biologischen Probe enthalten ist, darstellt.