DE2638467A1 - Mit silanen gepfropfte anorganische traegermaterialien - Google Patents

Mit silanen gepfropfte anorganische traegermaterialien

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Francois Meiller
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Rhone Poulenc Industries SA
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Description

Mit Silanen gepfropfte anorganische Trägermaterialien
Die Erfindung betrifft anorganische Trägermaterialien, die mit siliciumhaltigen Verbindungen gepfropft sind sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger gepfropfter Träger und ihre Verwendung, insbesondere zum^ixieren von Enzymen·
Enzyme werden allgemein auf Trägerstoffen auf der Basis von modifizierter Cellulose oder modifiziertem Dextran fixiert. Derartige Träger besitzen aber keinerlei mechanische Eigenschaften; sie quellen in Wasser und organischen Lösungsmitteln auf und sind weder druck- noch temperaturbeständig.
^geeignete
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Anorganische Trägerstoffe sLnd bekannte Produkte, die jedoch für bestimmte Verwendungszwecke, beispielsweise zum Fixieren von Enzymen hinsichtlich ihrer chemischen Beschaffenheit modifiziert werden müssen durch Aufpfropfen von Gruppen, die die Fixierung oder Bindung zwischen Träger und Enzym verbessern. Man hat bereits Silane mit unterschiedlichen Substituenten auf anorganische Träger gepfropft und hierdurch eine gewisse Anzahl von unmittelbaren Bindungsreaktionen bzw. Fixierungen zwischen Trägermaterial und bestimmten Enzymen ermöglicht.
In anderen Fällen, bei denen ein Kupplungsvorgang zwischen gepfropftem Träger und Enzym stattfindet, muß häufig ein Kupplungsvermittler wie Dicyclohexylcarbodiimid, Thiophosgen oder Glutaraldehyd eingesetzt werden, wenn eine dauerhafte Fixierung zwischen dem gepfropften Trägermaterial und dem Enzym erreicht werden soll.
Die erfindungsgemäß vorgesehenen modifizierten Träger lassen sich auf zahlreichen Gebieten einsetzen; sie sind unempfindlich gegenüber Lösungsmitteln, Temperaturen und Drucken. Sie ermöglichen im Falle der Fixierung von Enzymen nicht nur die Durchführung neuer Reaktionen; es braucht auch kein Kupplungsvermittler verwendet zu werden und es wird mit ausgezeichneter Ausbeute die dauerhafte und gegenüber Faktoren der Denaturierung beständige Fixierung von Enzymen bewirkt.
Die erfindungsgemäßen gepfropften Träger bestehen aus unlöslichen porösen Oxiden, Hydroxiden oder anderen anorganischen Verbindungen und sind dadurch gekennzeichnet, daß sie aufgepfropfte siliciumhaltige Gruppen tragen, deren einer Substituent eine Acetalgruppe oder entsprechende Aldehydgruppe ist.
Die Träger, die mit einer eine Acetalgruppe enthaltenden Siliciumverbindung gepfropft sind, werden dadurch erhalten,
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daß man ein anorganisches, OH-Gruppen haltiges Trägermaterial mit einem Silan zur Umsetzung bringt, welches einen Acetalsubstituenten aufweist sowie 1 bis 3 Gruppen, die mit den OH-Gruppen des Trägermaterials reagieren können.
Das eingesetzte anorganische Trägermaterial soll OH-Gruppen enthalten, eine Korngrößenverteilung von 40 /um bis 5 mm
2 sowie eine spezifische Oberfläche, von 2 bis 600 m /g, vorzugsweise von 2 bis 100 m /g im Falle der Fixierung von Enzymen aufweisen, sowie einen Porendurchmesser von 60 bis 1 000 nm (600 bis 10 000 %) und ein Porenvolumen von 0,5 bis 1,8 ml/g.
Trägerstoffe, die diesen Eigenschaften entsprechen, sind beispielsweise Ziegel (Stein), Glas, anorganische Silicate, Metalloxide wie Tonerden und vor allem Kieselsäuren.
Die Verbindung, die aufgepfropft wird, ist ein ■. Silan. der allgemeinen Formel
^ A
Y - (CH2)n - Si B
in der A, B und C gleich oder verschieden sein können und jeweils für eine Methoxy-, Äthoxy-, Methyl- oder Äthylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß zumindest einer der Substituenten A, B oder C mit einer OH-Gruppe des Trägermaterials reagieren kann, η eine ganze Zahl mit dem Wert 2 oder 3 ist und Y für eine Gruppe -CH-(OR)2 oder für eine Gruppe
CH-(OR) steht, in denen R Jeweils eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet.
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ORlGJNAL !MSPECTED
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Zu den besonders zum Aufpfropfen geeigneten Verbindungen gehören die folgenden Formeln entsprechenden Verbindungen:
(CH3O)3-Si-CH2-CH2-CH-(OCH3)2 ,
(C2H5O)3-Si-CH2-CH2-CH-(OC2H5)2 ,
(C2H5O)3-Si-CH2-CH2-CH2-CH-(OC2H5)2 , (CH3O)2-Si-CH2-CH2-CH-(OC2H5)2 ,
CH,
5 CH-(OC2H5)
(C2H5O)3-Si-CH2-CH2-CH2-O-Zj
(CH3O)3-Si-CH2-CH2-CH2-O-/
Das Aufpfropfen wird auf beliebig bekannte Weise in einem organischen Lösungsmittel oder in Wasser durchgeführt sowie bei Atmosphärendruck oder unter höherem Druck und allgemein in der Wärme.
Die Hydrolyse von gepfropften Trägern, deren siliciumhaltiges Pfropfreis einen Acetalsubstituenten enthält, in salzsaurem Medium, führt zu Trägern, deren siliciumhältiges Pfropfreis den entsprechenden Aldehydsubstituenten aufweist·
Diese Hydrolyse kann beispielsweise so vorgenommen werden, daß der Träger mit Acetalsubstituenten enthaltendem Pfropfreis in konzentrierter wäßriger Salzsäure dispergiert und die Dispersion 15 bis 20 Stunden zum Sieden oder Kochen erhitzt wird. Der Träger wird dann isoliert und mit Wasser gewaschen.
Die erfindungsgemäß gepfropften Träger eignen sich für chromatographische Zwecke, für Affinitätschromatographie und insbesondere zum Fixieren von Enzymen.
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Im letzteren Falle lassen sich zahlreiche unterschiedliche Enzyme fixieren, beispielsweise Trypsin, Glucoamylase, Invertase, Papain, Urease und ß-Galactosidase.
Die Fixierung des Enzyms erfolgt unter Anwendung beliebiger bekannter Verfahren entweder in der Kälte in einer wäßrigen Lösung, deren pH-Wert auf einen mit dem Enzym am besten verträglichen Wert gepuffert ist, oder in der Wärme in Kohlenwasserstoff- oder Chlorkohlenwasserstoff-Lösungsmitteln, entsprechend der DT-OS 24 39 923.
Die Wahl des Verfahrens hängt von der Beschaffenheit des jeweiligen Enzyms ab. Ebenso richten sich die Auswahl des Trä-•germaterials und der aufzupfropfenden Siliciumverbindung nach der Eigentümlichkeit und den Reaktionseigenschaften des Enzyms . ί
Im Falle von Enzymen, die schwer reagieren, wird vorteilhafterweise ein modifizierter Träger eingesetzt, dessen Pfropfreis einen Aldehydsubstituenten trägt, der reaktionsfreudiger ist als der Acetalsubstituent. Dies trifft u.a. für Glucoamylase zu, die sich leichter an einen Aldehydsubstituenten fixiert als an einen Acetalsubstituenten.
Die auf diese Weise fixierten Enzyme sind besonders beständig und widerstandsfähig gegenüber Denaturierungs-Einflüssen, pH-Wert und Temperature
Die Beständigkeit oder- Stabilität der Träger-Enzym Komplexe kann noch durch Hydrieren des Komplexes verstärkt werden, vor allem dann, wenn das Pfropfreis aliphatisch iste
Diese Hydrierung wird auf beliebig bekannte Weise in wäßriger Lösung durchgeführt mit Hilfe von Verbindungen, die Wasserstoff in statu nascendi freisetzen wie Natriumbor-
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hydrid bei alkalischem pH-Wert oder Lithiumaluminiumhydrid, in ausreichender Menge, um vollständige Hydrierung zu bewirken.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1
100 g Kieselsäure-Mikrokügelchen mit Korngrößenverteilung 100 bis 200 /um, spezifischer Oberfläche 44 m2/g, Porendurchmesser 60 nm und Porenvolumen 0,97 ml/g wurden 4 h im Vakuum bei 1500C getrocknet. Das trockene Pulver wurde in 200 ml Xylol gegeben, das 20 g Silan der Formel (C2H5O)3-Si-(CH2)2-CH-(0C2H5)2 enthielt; die erhaltene Dispersion wurde 4 h unter Rühren zum Sieden erhitzt.
Nach dem Abkühlen wurde die gepfropfte Kieselsäure abfiltriert, mit Aceton gewaschen und schließlich getrocknet. Das Produkt enthielt 1 Gewe-# Kohlenstoff, bestimmt durch Mikroanalyse.
Beispiel 2
50 g der gepfropften Kieselsäure aus Beispiel 1 wurden mit 100 ml wäßriger 6n Salzsäure 20 h gekocht. Nach dem Abkühlen wurde der Träger abgetrennt und mit Wasser neutral gewaschen. Man erhielt eine gleichartige gepfropfte Kieselsäure wie in Beispiel 1, die jedoch eine Aldehydgruppe enthielt. Der Kohlenstoffgehalt machte 0,8 Gew.-% aus.
Beispiel 5
Beispiel 1 wurde wiederholt mit 15 g Silan der Formel
(C2H5O)3-Si-(CH2)3-O-
CH-(OC2H5) 70981 4/0909
Das Produkt enthielt 1 Gew.-% Kohlenstoff.
Beispiel 4
20 g gepfropfte Kieselsäure aus Beispiel 3 wurden mit 40 ml wäßriger 6n Salzsäure 18 h bei Raumtemperatur behandelt. Darauf wurde der Träger isoliert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Man erhielt eine mit einem Silan, das eine Aldehydgruppe enthielt, gepfropfte Kieselsäure. Der Kohlenstoffgehalt betrug 0,9 Gew.-%.
Beispiel 5
Fixierung von Trypsin
Zu 5 ml einer Lösung aus 2 g/l Trypsin in einem 0,05m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7, wurden bei 40C 100 mg gepfropfte · Kieselsäure gemäß Beispiel 1 gegeben und die erhaltene Dispersion 15h bei 40C in Bewegung gehalten.
Nach dem Abdekantieren wurde der Träger sechsmal durch erneutes Aufschlämmen in destilliertem Wasser gewaschen und die Aktivität gemessen: ein Gemisch aus 100 mg Träger-Enzym Komplex und ^O ml einer 0,6m Lösung von Methyl-DL-lysinat in destilliertem Wasser wurde bei 300C und pH-Wert 5,5 gehalten. Mit Hilfe eines pH-Reglers wurde die Geschwindigkeit der Freisetzung von L-Lysin verfolgt, indem in Abhängigkeit von der Zeit das Volumen an 0,1η Natronlauge bestimmt wurde, das notwendig war, um den pH-Wert bei 5,5 zu halten. Ergebnis: 244//UMol L-Lysin, die je Minute und Gramm Komplex freigesetzt wurden.
Beispiel 6
Fixierung von Trypsin
1 000 mg gepfropfte Kieselsäure gemäß Beispiel 1 und 40 ml einer 0,1m Phosphatpufferlösung von pH-Wert 7 enthaltend
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2 g/1 Trypsin wurden 18 h bei 4°C in Berührung miteinander gehalten. Der Komplex aus Träger und Enzym wurde absitzengelassen, abgetrennt und dreimal durch erneutes Suspendieren in 20 ml der gleichen Pyrophosphatpufferlösung gewaschen, um das nicht fixierte Enzym zu entfernen.
Die Hälfte des erhaltenen Komplexes wurde zu einem Gemisch aus 2 ml einer 0,005m Lösung aus Natriumborhydrid in destilliertem Wasser und 18 ml 0,005m Pyrophosphatpuffer vom pH-Wert 8,6 gegeben und bei Raumtemperatur 4 h in Berührung damit gehalten.
Darauf wurde der Komplex abgetrennt, zweimal mit 20 ml der gleichen Pyrophosphatpufferlösung und sechsmal mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen.
Die Enzymaktivität wurde dann wie in Beispiel 5 an behandeltem und nicht behandeltem Träger-Enzym Komplexen bestimmt. Bei den bei 4°C aufbewahrten Komplexen wurde die Enzymaktivität nach 5 Tagen und nach 8 Tagen bestimmt.
Enzymaktivität /uMol/g Komplex
nach 5 Tagen nach 8 Tagen Komplex 263 125 93
Komplex hydriert 230 218 190
Die Ergebnisse zeigen die verbesserte Beständigkeit des hydrierten Komplexes gegenüber dem nicht hydrierten Komplex.
Beispiel 7
Fixierung von Glucoamylase
Die Fixierung wurde analog Beispiel 6 durchgeführt und
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die Aktivität wie folgt gemessen:
Ein Gemisch aus 10 ml 3 gew.-#iger Stärkelösung in 0,01m Acetatpuffer von pH-Wert 4,5 und 500 mg Kieselsäure-Glucoamylase Komplex in 2 ml destilliertem Wasser wurde 10 min bei 400C gehalten. Die Menge der freigesetzten Glucose wurde in der flüssigen Phase mit Hilfe der Dinitrosalicylat-Methode bestimmt. Die Aktivität wird angegeben in g/l freigesetzte Glucose·
Enzymaktivität g/l
nach 5 Tagen nach 8 Tagen
Komplex 0,150 0,070 0,050
Komplex hydriert 0,230 0,100 0,100
Man stellt fest, daß nach einem gewissen Aktivitätsverlust die Aktivität konstant oder beständig bleibt, wenn der Komplex hydriert worden ist.
Beispiel 8
Fixierung von Invertase
Es wurde analog Beispiel 6 gearbeitet und die Enzymaktivität wie folgt gemessen:
500 mg Träger-Invertase Komplex in 5 ml destilliertem Wasser wurden bei 400C 30 min mit 10 ml einer Rohrzuckerlösung (0,0585m) in destilliertem Wasser und 5 ml 0,2m Acetatpuffer, pH-Wert 5,2 in Berührung gehalten.
Die Reaktion wurde durch Filtrieren unterbrochen und das Filtrat 5 min zum Kochen erhitzt.
Die freigesetzten reduzierenden Zucker wurden gemäß der Dinitrosalicylat-Methode titriert und die Aktivität in g/l freigesetzte reduzierende Zucker angegeben. Die Ergebnisse lauten wie folgt:
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- 10 -
hydriert 1A-48 274 2638467 :/l
9 5 Tagen
Enzvmaktivität g 130
nach 110
Komplex 0,250 0,
Komplex 0,140 0,
Beispiel
Fixierung von Papain
Eine Lösung aus 1 g/l Papain in 0,05m Phosphat-Citratpufferlösung von pH-Wert 4,enthaltend 5 x 10~^m Cystein und Äthylendiaminotetraessigsäure, die bei 4°C gehalten wurde, wurde 2 h mit 500 mg gepfropfter Kieselsäure gemäß Beispiel 3 in Berührung gehalten. Darauf wurde der Träger abgetrennt und mit reichlich gleicher Pufferlösung gewaschen, vk das nicht fixierte Papain zu entfernen.
Die Aktivität des Träger-Papain Komplexes wurde wie folgt gemessen:
Ein Gemisch aus 9 ml einer 3 g/l Caseinlösung in 0,05m Phosphat-Citratpuffer von pH-Wert 7 sowie 500 mg Komplex in 1 ml 10 m wäßriger Salzsäure enthaltend 2 χ 10 m Äthylendiaminotetraessigsäure wurde 10 min bei 37°C gehalten.
Nach Abkühlenlassen und Abtrennen wurden 4 ml Lösung zur Fällung mit 4 ml einer wäßrigen 10 ^igen Trichloressigsäurelösung versetzt; darauf wurde filtriert. Die freigesetzten Peptide wurden im Filtrat gemäß der Methode von Lowry bestimmt; Ergebnis: 600 /Ug freigesetzte Peptide.
Der bei 4°C in einer wäßrigen, 10""^n Salzsäurelösung, enthaltend 5 x 10"^m Cystein und 2 χ 10"^m Äthylendiaminotetr? essigsaure, besaß nach 1 Monat die gleiche Aktivität. Dies
^aufbewahrte Komplex
- 11 7098U/0909
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zeigte die außerordentliche Beständigkeit des Komplexes.
Beispiel 10
Fixierung von Glucoamylase
Die Fixierung wurde im Versuch A mit der gepfropften Kieselsäure gemäß Beispiel 3 und im Versuch B mit der gepfropften Kieselsäure gemäß Beispiel 4 vorgenommen.
Die gepfropften Kieselsäuren wurden jeweils in Acetonitril suspendiert, abgetrennt, mit Wasser gewaschen, wodurch ihre Benetzbarkeit verbessert wurde.
500 mg Träger wurden zu 100 ml 0,1m Acetatpufferlösung, pH 6, enthaltend 250 mg/l Glucoamylase gegeben und die Dispersion 18 h bei 4°C in Bewegung gehalten (geschüttelt bzw. gerührt). Nach dem Absitzenlassen und Abtrennen wurden die Träger mit 0,1m Acetatpuffer, pH 6, gewaschen; die Enzymaktivität wurde wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt.
Die Aktivität betrug 0,200 g/l freigesetzte Glucose im Versuch A und 0,500 g/l freigesetzte Glucose im Versuch B.
Dies zeigt, daß im Falle der Glucoamylase ein stärker aktiver Komplex erhalten wird, wenn die Fixierung an ein Trägermaterial erfolgt, das mit einer eine Aldehydgruppe enthaltende Silanverbindung gepfropft worden ist.
Die beiden Komplexe zeigten nach Aufbewahren während 1 Monat bei 40C (
digkeit.
bei 40C die gleiche Aktivität; dies zeigt ihre große Bestän-
Patentansprüche;
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Claims (8)

  1. Patentansprüche
    \yi Mit Silanen gepfropfte anorganische Trägermaterialien bestehend aus unlöslichen und porösen Oxiden, Hydroxiden oder anderen anorganischen Stoffen, dadurch gekennzeichnet, daß die siliciumhaltigen Pfropfreiser einen Substituenten mit Acetal- oder Aldehydgruppe enthalten.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der gepfropften anorganischen Trägermaterialien mit Acetalgruppen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein anorganisches, OH-Gruppen aufweisendes Trägermaterial mit einem Silan umsetzt, das einen Acetalgruppen haltigen Substituenten sowie 1 bis 3 Gruppen, die mit den OH-Gruppen des Trägermaterials reagieren können, enthält.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein anorganisches Trägermaterial einsetzt, das OH-Gruppen aufweist sowie eine Korngrößenverteilung von 40 /um bis 5 mm, eine spezifische Oberfläche von 2 bis 600 m /g, einen Porendurchmesser von 60 bis 1 000 nm und ein Porenvolumen von 0,5 bis 1,8 ml/g.
  4. 4· Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als anorganisches Trägermaterial Ziegel (Stein), Glas, anorganische Silicate oder Metalloxide wie Tonerden und Kieselsäuren verwendet.
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    2 1A-48 274
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Silan der allgemeinen Formel
    ^ A
    Y - (CH2)n - Si — B
    ^* C
    aufpfropft, in der A, B und C gleich oder verschieden sind und jeweils für eine Methoxy-, Äthoxy-, Methyl- oder Äthylgruppe stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens einer der Substituenten A, B oder C mit einer OH-Gruppe des Trägermaterials reagiert, η eine ganze Zahl mit dem Wert 2 oder 3 ist und Y für eine Gruppe der Formel
    -CH-(OR)2 oder -
    " CH-(OR)2
    steht, in der R eine Methyl- oder Äthylgruppe bedeutet.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung der gepfropften Träger mit Aldehydgruppe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man den Träger mit Acetalgruppe in salzsaurem Medium hydrolisiert.
  7. 7. Verwendung der gepfropften Trägermaterialien nach Anspruch 1 zum Fixieren von Enzymen.
  8. 8. Verwendung nach Anspruch 7 in hydrierter Form.
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