SE530132C2 - Mycket hållbart packningsmaterial för vätskekromatografi - Google Patents

Description

25 30 530 'l32 2 förfarande som innefattar polymerisation av en silikonförening som har en hydrosilylgrupp på en silikagelyta för att bilda en silikonpolymer (se patent- dokument 2)-, och ett förfarande i vilket monofunktionellt silan som har en sterisk skyddsgrupp, såsom oktadekyldi-t-butylklorsilan eller oktyldiisopropyl- klorsilan, i dess struktur används som en silanförening för att vara ett modi- fieringsmedel (patentdokument 3).

Emellertid kan vilken som helst av beläggningarna med kerameri patentdokument 1 och beläggningen med en polymer i patentdokument 2 möjligen försämra egenskaperna hos silikagelen, medan den steriska skydds- gruppen i patentdokument 3 kan ändra selektiviteten mycket av det som ett packningsmaterial för vätskekromatografi.

Patentdokument 1: JP-A-H10-206407.

Patentdokument 2: JP-A-2003-149219.

Patentdokument 3: JP-A-S63-137750.

Beskrivning av uppfinninqen PROBLEM SOM SKA LÖSAS MED UPPFlNNlNGEN Med tanke på den ovannämnda situationen är ett syfte med föreliggan- de uppfinning att tillhandahålla ett mycket hållbart packningsmaterial för vätskekromatografi som är utmärkt i syraresistens och alkaliresistens.

MEDEL FÖR LÖSNING AV PROBLEMEN Föreliggande uppfinnare undersökte detaljerat för att lösa problemen som beskrivs ovan, och åstadkom följaktligen ett förfarande för framställning av ett nytt mycket hållbart packningsmaterial för vätskekromatografi som är extremt utmärkt i syraresistens och alkaliresistens, varvid förfarandet inne- fattar ett steg av kemisk modifiering av silikagelytan genom användning av en silanförening som har en särskild struktur, och det följande ändkapslingsreak- tionssteget i vilket en bifunktionell cyklisk silazanförening som har en särskild struktur används, utan förlust av egenskaperna hos silikagelen, och utan änd- ring av selektivitet för ett packningsmaterial för vätskekromatografi. l enlighet därmed avser föreliggande uppfinning ett förfarande för fram- ställning av ett packningsmaterial för vätskekromatografi, vilket innefattar ke- misk modifiering av silikagel med en bifunktionell silanförening som är repre- senterad av den generella formeln [l]: 10 15 20 530 132 [varvid X1 och X2, desamma eller olika, representerar en väteatom, en halogenatom eller en alkoxigrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och Rl rep- resenterar en alkylgrupp eller en arylgrupp som kan ha substituent(er)], och utförande av en ändkapslingsreaktion av den resulterande kemiskt modifiera- de silikagelen genom användning av bifunktionellt cykllskt silazan som är rep- resenterat av den generella formeln [ll]: [varvid Rz och Ra, desamma eller olika, representerar en alkylgrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och n representerar ett värde som indikerar antalet enheter som bildar ringen, vilket är ett heltal av från 2 till 101.

Vidare tillhandahålls med uppfinningen en kolonn för vätskekromato- grafi i vilken packningsmaterialet för vätskekromatografi som erhålls genom det tidigare nämnda förfarandet används, och ett förfarande för analysen eller ett förfarande för fraktioneringen ivilken kolonnen används, särskilt ett för- farande för analysen eller fraktioneringen av peptider eller proteiner som är inkluderade i ett biologiskt prov. i Råmaterialsilikagel som företrädesvis används i förfarandet enligt upp- finningen är porös silikagel som har en medelpartikelstorlek av vanligtvis från 1 till 1000 um, och företrädesvis från 2 till 200 pm; som har en fin porstorlek av vanligtvis från 10 till 10000 Ångström, och företrädesvis från 50 till 3000 Ångström; och som har en ytarea av vanligtvis från 1 till 1000 mz/g, och före- trädesvis från 5 till 600 mz/g. För att uppnå hög separationsprestanda före- dras ett material som har hög renhet och sfärisk form som råmaterialsilika- gelen. 10 15 20 25 30 35 530 132 4 l den bifunktionella silanföreningen som är representerad av den gene- rella formeln [l] kan alkylgruppen som är representerad av R" vara en rak alkylgrupp, en förgrenad alkylgrupp, en cyklisk alkylgrupp eller liknande. Då R1 representerar en alkylgrupp är antalet kolatomer inte särskilt begränsat, men kan företrädesvis vara från 1 till 30, och mer föredraget från 2 till 8. Aryl- gruppen som är representerad av R' kan vara en fenylgrupp, en tolylgrupp. en mesitylgrupp, en naftylgrupp eller liknande.

Alkylgruppen som är representerad av R' iden generella formeln [l] kan ha en arylgrupp, en aminogrupp (-NH), en cyanogrupp (-CN) eller en nitrogrupp (-NO) vid änden därav, eller kan ha en amidgrupp (-NH-C(O)-), en karbamatgrupp (-O-C(O)-NH-), en karbamidgrupp (-NH-C(O)-NH-), en ester- grupp (-O-C(O)-) eller en karbonatgrupp (-O-C(O)-O-) vid ett annat ställe än änden därav.

Den bifunktionella silanföreningen som är representerad av den gene- rella formeln [I] är dialkylsilan eller diarylsilan som har en väteatom, en halo- genatom eller en alkoxylgrupp. Specifika exempel inkluderar dimetyldiklor- silan, dimetyldimetoxisilan, dimetyldietoxisilan, dietyldiklorsilan, dietyldi- metoxisilan, dietyldietoxisilan, di-n-propyldiklorsilan, di-n-propyldimetoxisilan, diisopropyldiklorsilan, diisopropyldimetoxisilan, di-n-butyldiklorsilan, di-n-butyl- dimetoxisilan, diisobutyldiklorsilan, diisobutyldimetoxisilan, di-t-butyldiklor- silan, di-t-butyldimetoxisilan, di-n-pentyldiklorsilan, di-n-pentyldimetoxisilan, dicyklopentyldiklorsilan, dicyklopentyldimetoxisilan, di-n-hexyldiklorsilan, di-n- hexyldimetoxisilan, dicyklohexyldiklorsilan, dicyklohexyldimetoxisilan, di-n- heptyldiklorsilan, di-n-heptyldimetoxisllan, di-n-oktyldiklorsilan, di-n-oktyldi- metoxisilan, difenyldiklorsilan, difenyldimetoxisilan, dimesityldiklorsilan, di- mesityldimetoxisilan, di-(p-tolyD-diklorsilan, bis(3-cyanopropy|)diklorsilan, bis(3-cyanopropybdimetoxisilan och liknande.

Föreliggande uppfinnare utförde en mångfald studier, och fann som en följd därav att silikagelen kemiskt modifierad genom användning av en bifunk- tionell silanförening som är representerad av den generella formeln [l], som ett kemiskt modifieringsmedel, är påfallande effektiv i förbättring av hållbar- het, i jämförelse med silikagelen som är kemiskt modifierad genom använd- ning av en konventionell monofunktionell silanförening.

Den kemiska modifieringsreaktionen kan utföras genom ett känt för- farande och under kända betingelser, ivilket silikagelen och den bifunktionel- la silanföreningen [l] kan värmas i ett lösningsmedel för att möjliggöra reak- tionen. Reaktionstemperaturen är företrädesvis från 60 till 200°C, och mer 10 15 20 25 30 35 530 132 5 föredraget från 100 till 160°C. Reaktionen kan utföras i en vätskeformig fas.

Fastän valet av lösningsmedlet inte är särskilt begränsat, är aromatiska kol- väten, såsom bensen, toluen, xylen eller mesitylen, eller en substituerad aro- matisk förening, såsom diklorbensen, lämpliga, vilka inte reagerar med den bifunktionella silanföreningen [l] och är stabila vid reaktionstemperaturen.

Trycket vid reaktionen kan vanligtvis vara ett omgivningstryck, men reaktio- nen kan även utföras under ett trycksatt tillstånd av från 0,15 till 0,49 MPa.

Reaktionstiden är företrädesvis från 0,5 till 20 timmar, och mer föredraget från 3 till 10 timmar. Mängden av den bifunktionella silanföreningen [I] är före- trädesvis från 0,01 till 10, och merföredraget från 0,05 till 1, då representerad av viktförhållande av den bifunktionella silanföreningen [ll/silikagelen. Det är även föredraget att en basisk förening, såsom pyridin eller imidazol, sätts till reaktionssystemet.

Den bifunktionella silanföreningen [l] är fördelaktig i det att den har fler reaktiva säten och uppvisar högre reaktivitet än monofunktionella silan- föreningar, medan den orsakar färre sidoreaktioner än trifunktionella silan- föreningar.

Särskilt är användning av en silanförening i vilken två Rls är desamma, och representerar en alkylgrupp eller en arylgrupp som har från 4 till 30 kol- atomer, som den bifunktionella silanföreningen [I] fördelaktig för förbättring av hydrofobicitet och upplösningsförmåga, och även ytterligare hållbarhet på grund av ökning i densitet av alkylgruppen eller arylgruppen per areaenhet av silikagelen, till skillnad från fallet där en bifunktionell silanförening i vilken två R's representerar olika alkylgrupper eller arylgrupper (t ex oktadekylmetyldi- klorsilan, n-oktylmetyldiklorsilan eller liknande) används.

Reaktionsblandningen efter den kemiska modifieringsreaktionen kan användas direkt i den följande ändkapslingsreaktionen, men det fasta mate- rialet kan emellertid tas ut ur den kemiska modifieringsreaktionsblandningen, och utsättas för ändkapslingsreaktionen efter tvättning och torkning.

Efter den kemiska modifieringsreaktionen kan ett ändkapslingsmedel sättas till reaktionsblandningen för att utföra ändkapslingsreaktionen. I vissa fall hydrolyseras emellertid oreagerad bifunktionell silanförening [I] efter full- ständigande av den kemiska modifieringsreaktionen. Ändkapslingsmedlet som är representerat av den generella formeln [ll] är bifunktionellt cykliskt silazan, och föredragna exempel inkluderar 1,1 ,3,3,5,5-hexametylcyklotrisilazan, 1 ,1,3,3,5,5,7,7-oktametylcyklotetrasila- zan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9-dekametylcyklopentasilazan, 10 15 20 25 30 530 132 6 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11V-dodekametylcyklohexasilazan, 1,1.3,3,5,5- hexaetylcyklotrisilazan, 1,1 ,3,3,5,5,7,7-oktaetylcyklotetrasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9-dekaetylcyklopentasilazan, 1,1,3,3,5,5,7,7,9,9,11,11- dodekaetylcvklohexasllazan och liknande. Dessa kan användas ensamma eller så kan två eller flera därav användas som en blandning. Ändkapslingsmedlet [ll] kan användas i kombination med en bifunktio- nell silanförening som är representerad av den generella formeln [lll]. För- hållandet av ändkapslingsmedlet [ll] och den bifunktionella silanföreningen [lll] kan företrädesvis vara 0,5 eller större, och mer föredraget 1 eller större, då representerat av viktförhållandet av ändkapslingsmedlet [ll]/den bifunktio- nella silanföreningen [lll]: III-i RS-ss-Xß X4 [ut] [varvid X3 och X4, desamma eller olika, representerar en väteatom, en halo- genatom eller en alkoxylgrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och R4 och Rs, desamma eller olika, representerar en alkylgrupp som har från 1 till 4 kol- atomer].

Föredragna exempel på den bifunktionella silanföreningen [lll] inklude- rar dimetyldiklorsilan, dimetyldimetoxisilan och liknande.

Föreliggande uppfinnare utförde en mångfald studier, och fann följakt- ligen att användning av det bifunktionella cykliska sllazanet som är represen- terat av den generella formeln [ll] i ändkapsling förbättrar hållbarhet av den resulterande ändkapslingsmodifierade silikagelen markant mer än i fallet där trimetylklorsilan eller hexametyldisilazan används som ett konventionellt monofunktionellt ändkapslingsmedel. Ändkapslingsreaktionen kan utföras genom ett känt förfarande och under kända betingelser, i vilket den kemiskt modifierade silikagelen och änd- kapslingsmedlet kan värmas i ett lösningsmedel för att möjliggöra reaktionen.

Reaktionstemperaturen är företrädesvis från 60 till 200°C, och mer föredraget från 100 till 160°C. Reaktionen kan utföras i en vätskeformig fas. Fastän valet av lösningsmedlet inte är särskilt begränsat är aromatiska kolväten, såsom bensen, toluen, xylen eller mesitylen, eller en substituerad aromatisk förening, 10 15 20 25 30 35 530 132 7 såsom diklorbensen, lämpliga, vilka inte reagerar med ett ändkapslingsmedel [ll] och är stabila vid reaktionstemperaturen. Trycket vid reaktionen kan före- trädesvis vara ett omgivningstryck, men reaktionen kan emellertid även ut- föras under ett trycksatt tillstånd av från 0,15 till 0,49 MPa. Reaktionstiden är företrädesvis från 0,5 till 20 timmar, och mer föredraget från 3 till 10 timmar.

Mängden aviändkapslingsmedlet [ll] ärföreträdesvis från 0,01 till 10, och mer föredraget från 0,05 till 1, då representerad av viktförhållande av ändkaps- lingsmedlet [ll]/den kemiskt modifierade silikagelen. Det är även föredraget att en basisk förening, såsom pyridin eller imidazol, sätts till reaktionssystemet.

Efter fullständig reaktion kan fastfas/väskefas-separation utföras, och det separerade fasta materialet kan tvättas tillräckligt med ett medel, såsom metanol, följt av torkning för att erhålla ett packningsmaterial för vätskekroma- tografi.

Fördelar med uppfinningen I enlighet med föreliggande uppfinning kan ett packningsmaterial för vätskekromatografi framställas vid en jämförelsevis måttlig temperatur, vid 200°C eller lägre, det vill säga således len enkel reaktlonsutrustning och med framställningssteg som erfordrar en kortare tidsperiod, det vill säga i enlighet därmed vid låga kostnader.

Packningsmaterialet för vätskekromatografi i enlighet med uppfin- ningen undviker förluster av egenskaper hos silikagel, och uppvisar hög syra- resistens och alkaliresistens och har längre driftlivslängd utan förändring av selektivitet som ett packningsmaterial för vätskekromatografi. Därför är detta packningsmaterial särskilt lämpligt för analys och fraktionering av ett biolo- giskt prov innehållande peptider, proteiner eller liknande.

Bästa sätt för utförande av uggfinningen Härefter kommer några exempel på föreliggande uppfinning att demon- streras för att beskriva uppfinningen i detalj. Emellertid är uppfinningen inte begränsad av dessa exempel. Som en jämförelse kommer exempel i vilka en konventionell monofunktionell silanförening och ett konventionellt monofunk- tionellt ändkapslingsmedel användes att illustreras. Jämförelsetest av syra- resistens, jämförelsetest av alkaliresistens och jämförelsetest av protein- separation utfördes på dessa exempel.

Exempel 1 Efter utförande av azeotropisk dehydrering av 20 g sfärisk, mycket ren, silikagel (tillverkad av Daiso Co., Ltd. "Daiso gel SP-300-10P", medelpartikel- storlek: 10 pm, finporstorlek: 300 Ångström, ytarea: 100 mz/g) i 150 ml toluen, 10 15 20 25 30 35 530 132 8 sattes 3,3 g di-n-butyldiklorsilan och 2,4 g pyridin därtill. Denna blandning värmdes till återflöde i 5 timmar. Därefter sattes 0,8 g 1,1,3,3,5,5-hexametyl- cyklotrisilazan som ett ändkapslingsmedel till denna reaktionsblandning.

Denna blandning återflödades i 5 timmar för att göra ändkapslingsreaktionen fullständig, och kyldes till rumstemperatur, följt av filtrering, tvättning med metanol och torkning för att ge 20 g av ett packningsmaterial för vätske- kromatografi.

Jamförande exempel 1 Efter utförande av azeotropisk dehydrering av 20 g av densamma sfä- riska, mycket rena, silikagelen som användes i exempel 1 ("Daiso gel SP- 300-10P") i 150 ml toluen, sattes 2,3 g n-butyldimetylklorsilan och 1,2 g pyri- din därtill. Denna blandning värmdes till återflöde i 5 timmar. Därefter sattes 2,0 g trimetylklorsilan som ett ändkapslingsmedel och 1,8 g pyridin till denna reaktionsblandning. Denna blandning återflödades i 5 timmar för att göra änd- kapslingsreaktionen fullständig, och kyldes till rumstemperatur, följt av filtre- ring, tvättning med metanol och torkning för att ge 20 g av ett packnings- material för vätskekromatografi.

Jamförande exemgel 2 Efter utförande av azeotropisk dehydrering av 20 g av densamma sfä- riska, mycket rena, silikagelen som användes i exempel 1 ("Daiso gel SP- 300-10P") i 150 ml toluen, sattes 2,3 g n-butyldimetylklorsilan och 1,2 g pyri- din därtill. Denna blandning värmdes till återflöde i 5 timmar. Därefter sattes 2,0 g 1,1,3,3,5,5-hexametylcyklotrisilazan som ett ändkapslingsmedel till den- na reaktionsblandning. Denna blandning återflödades i 5 timmar för att göra ändkapslingsreaktionen fullständig, och kyldes till rumstemperatur, följt av filt- rering, tvättning med metanol och torkning för att ge 20 g av ett packnings- material för vätskekromatografi.

Jamförande exempel 3 Efter utförande av azeotropisk dehydrering av 20 g av densamma sfä- riska, mycket rena, silikagelen som användes i exempel 1 ("Daiso gel SP- 300-10P") i 150 ml toluen, sattes 3,3 g di-n-butyldiklorsilan och 2,4 g pyridin därtill. Denna blandning värmdes till återflöde i 5 timmar. Därefter sattes 2,0 g trimetylklorsilan som ett ändkapslingsmedel och 1,8 g pyridin till denna reak- tionsblandning. Denna blandning återflödades i 5 timmar för att göra änd- kapslingsreaktionen fullständig, och kyldes till rumstemperatur, följt av filtre- ring, tvättning med metanol och torkning för att ge 20 g av ett packnings- material för vätskekromatografi; 10 15 20 25 30 fisnptsz Utvärderingstester 1) Syraresistenstest Packningsmaterialen för vätskekromatografi som erhölls i exempel 1 och jämförande exempel 1 till 3 packades respektive i en rostfri kolonn med en inre diameter av 6,0 mm och en längd av 250 mm genom ett uppslam- ningsförfarande. Retentionstid mättes på den sura mobila fasen före respekti- ve efter passage av vätskan genom ett vätskekromatografiutvärderingstest genom användning av uracil och naftalen som ett standardprov, och reten- tionskoefficient (k) bestämdes från detta mätvärde.

Vidare' utfördes, för att bestämma kolinnehållet i den ändkapslings- modifierade silikagelen som ett packningsmaterial, mätning för en elementar- analys. Från dessa resultat beräknades upprätthållande värde pä retentions- koefficienten och upprätthållande värde på kolinnehållet (vikt av kol per 1 g av den ändkapslingsmodifierade silikagelen) efter passage av syravätskan iför- hållande till före passage av syravätskan. Dessa resultat visas i tabell 1.

Genom passage av vätskan av den sura mobila fasen genom kolonnen hydrolyserades den ändkapslingsmodifierade silikagelen av syran för att orsa- ka avskiljande av modifieringsgruppen från silikagelmatrisen. I enlighet där- med sjunker retentionskoefficienten av föreningen enligt uppfinningen. Såsom ses från Tabell 1 uppvisades det högsta upprätthållande värdet på retentions- koefficienten och det högsta upprätthållande värdet på kolinnehållet efter pas- sage av syravätskan då den bifunktionella silanföreningen [l] användes som det kemiska modifieringsmedlet och det bifunktionella cykliska silazanet [ll] användes som ändkapslingsmedlet såsom i exempel 1. I motsats uppnåddes otillräcklig syraresistenseffekt då en konventionell monofunktionell silanföre- ning användes som det kemiska modifieringsmedlet och/eller ändkapslings- medlet såsom ijämförande exempel 1 till 3, och upprätthållande värde på re- tentionskoefficienten och upprätthållande värde på kolinnehållet uppvisades som är lägre än de i exempel 1. 10 15 20 25 530 132 10 Tabell 1 Jämförelse av resultat av svraresistenstest Jämförande Jämförande Jämförande Exempel 1 exempel 1 exempel 2 eXemPel . .. . :f- -b id- -b ldi- n-butyidi- di-n-butyidi- Kemiskt modifiermgsmedel lkTorågn' mgtyägrsnan wleåyïïfšiån k|0f5i|an 1I113I3sS15' ' _ ' ' , , ' - Ändkapslingsmedel hexametyl- mmšty' °r heXamefYl' snar, . . silan - - cyklotrisilazan Cykbfflsflala" Upprätthållande värde pà retentionskoefficient för 96 7 56 39 assage av syravätska (%) Upprätthållande värde på kolinnehåll för passage av 96 26 59 95 syravätska (°/.-») Vätskekromatografiutvärderingstest Mobil fas: metanol/vatten = 50/50 (volymförhållande) Flödeshastighet: 1,7 ml/min Temperatur: 40°C Detektor: UV 254 nm Standardprov: 1) uracil (0,3 mg/ml) 2) naftalen (1,8 mg/ml) injektion: 1,5 pl Beräkninq av retentionskoefficient Då retentionstid av uracil representeras av t1 representeras retentions- tid av naftalen av t2 och retentionskoefficient av naftalen representeras av k, varvid retentionskoefficient (k) beräknas enligt följande formel: k = (tz - mm Betingelser för passage av vätska av den sura mobila fasen Sur mobil fas: acetonitril/1% vattenhaltig trifluorättiksyralösning (pH- värde = 1) = 10/90 (volymförhållande) Flödeshastighet: 0,9 ml/min Temperatur: 70°C Vätskepassagetid: 15 timmar Beräkning av upprätthållande värden på retentionskoefficient och kolinnehåll av naftalen efter passage av syravätskan i förhållande till före passage av syravätskan Upprätthållande värde (%) = Värde efter passage av syravätskan I värde före passage av syravätskan X 100 10 15 20 25 30 530 132 11 2) Alkaliresistenstest Packningsmaterialen för vätskekromatografi som erhölls i exempel 1 och jämförande exempel 1 till 3 packades respektive i en rostfri kolonn med en inre diameter av 6 mm och en längd av 250 mm genom ett uppslamnings- förfarande. Genom kolonnen passerades en vätska av en alkalisk mobil fas och total mängd av eluatet återvanns från kolonnen. Sedan mättes koncentra- tionen av eluerat Si genom en elementaranalys av den återvunna vätskan.

Resultaten visas i Tabell 2.

Upplösning av silikagelmatrisen i kolonnen sker genom passage av vätskan av den alkaliska mobila fasen genom kolonnen. Såsom ses från Tabell 2 uppvisades den lägsta koncentrationen av Si som eluerats genom passage av den alkaliska vätskan, varvid med andra ord den högsta alkali- resistensen uppnåddes, då den bifunktionella silanföreningen [l] användes som det kemiska modifieringsmedlet och det bifunktionella cykliska silazanet [ll] användes som ändkapslingsmedlet såsom i exempel 1. I motsats upp- nåddes otillräcklig effekt på alkaliresistensen, varvid högre koncentration av eluerat Si uppvisades ijämförelse med exempel 1, då den konventionella monofunktionella silanföreningen användes som det kemiska modifierings- medlet och/eller ändkapslingsmedlet såsom ijämförande exempel 1 till 3.

Tabell 2 Jämförelse av resu_ltat av alkaliresistenstest h Jämförande Jämförande Jämförande . Exempel 1 exempel 1 exempel 2 exempel . . . di-n-butyldi- n-butyldi- n-butyldi- di-n-butyldi- Kemlski modlmqngsmedel klorsilan metylklorsilan metylklorsilan klorsrlan 1,1,3,3,5,5- . 1,1,3,3,5,5- . _ Åndkapslingsmedel hexametyl- tr'me.:y|k|°" hexametyl- mmseiglrlflm cyklotrisilazan s! a" cyklotrisilazan Koncentration av Si som eluerats genom passage av 12 223 134 23 alkalivätska (ppm) Betinqelser för passage av vätska av alkalisk mobil fas Mobil fas: acetonitril/0,01 N vattenhaltig natriumhydroxidlösning (pH- värde: 12) =~10l90 (volymförhållande) Flödeshastighet: 1,7 ml/min Temperatur: 40°C Vätskepassagetid: 5 timmar Mätning av koncentration av eluerat Si Mätning utfördes genom användning av induktivt kopplad plasmaemís- sionsspektrometri (lCP). 10 15 20 25 30 35 530 'N32 12 3) Separationstest av proteiner Packningsmaterialen för vätskekromatografi som erhölls i exempel 1 och jämförande exempel 1 packades respektive i en rostfri kolonn med en inre diameter av 6 mm och en längd av 250 mm genom ett uppslamnings- förfarande. Genom användning av en blandning av typiska proteiner som ett standardprov utfördes ett vätskekromatografiutvärderingstest. Diagram på vätskekromatografi som erhölls i separationstestet av proteiner, i vilket vart och ett av packnlngsmaterialen i exempel 1 och jämförande exempel 1 an- vändes, visas i fig 1 respektive fig 2.

Packningsmaterialet för vätskekromatografi i exempel 1 som framställ- des genom användning av den bifunktionella silanföreningen [l] som det ke- miska modifieringsmedlet och det bifunktionella cykliska silazanet [ll] som ändkapslingsmedlet uppvisade inte bara oförändrad selektivitet av proteiner- na och ordningsföljden av deras eluering, utan möjliggjorde även separation av ytterst små orenheter vilka inte kunde ha separerats konventionellt (se fig 1), varvid bättre separationsutförande därmed antyds ijämförelse med pack- ningsmaterlalet för vätskekromatografi ijämförande exempel 1 som framställ- des genom användning av den konventionella monofunktionella silanföre- ningen som det kemiska modifieringsmedlet och ändkapslingsmedlet.

Förfarandebetingelser för vätskekromatografi Mobil fas Vätska A) acetonitril/vatten/trifluorättiksyra = 20/80l0,1 (volymförhållande) Vätska B) acetonitril/vatten/trifluorättiksyra = 60/40/0,1 (volymförhållande) O till 25 minuter, linjär gradient från vätska A till vätska B 25 till 35 minuter, vätska B 100% Flödeshastighet: 1,7 ml/min Kolonntemperatur: 35°C Detektor: UV 220 nm Standardprov: blandning av 1) till 6) 1) Ribonukleas A (2,0 mg/ml) 2) Cytokrom C (1,5 mg/ml) 3) Lysozym (1,5 mg/ml) 4) Bovint serumalbumin (4,0 mg/ml) 5) Myoglobin (2,0 mg/ml) 6) Ovalbumin (5,0 mg/ml) lnjektion: 10 pl 530 132 13 Kort beskrivning av ritnimarna I fig 1 åskådliggörs ett diagram avseende vätskekromatografi som er- hölls i separationstestet av proteiner genom användning av packningsmate- rialet för vätskekromatografi som erhölls i exempel 1. l fig 2 åskådliggörs ett diagram avseende vätskekromatografi som er- hölls i separationstestet av proteiner genom användning av packningsmate- rialet för vätskekromatografi som erhölls ijämförande exempel 1.

Claims (7)

10 15 20 530 132 14 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av ett packningsmaterial för vätskekromatografi, vilket innefattar kemisk modifiering av silikagel med en bifunktionell silanförening som är representerad av den generella formeln [l]: [varvid X1 och X2, desamma eller olika, representerar en väteatom, en halogenatom eller en alkoxigrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och R1 representerar en aikylgrupp med från 1 till 30 kolatomer som kan ha substituent(er)], och utförande av en ändkapslingsreaktion av den resulterande kemiskt modifierade silikagelen genom användning av bifunktionellt cykliskt silazan som är representerat av den generella formeln [|l]: [varvid Rz och R3, desamma eller olika, representerar en aikylgrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och n representerar ett värde som indikerar antalet enheter som bildar ringen, vilket är ett heltal av från 2 till 101.

2. Förfarande för framställning av ett packningsmaterial för vätskekromatografi enligt krav 1, varvid alkylgruppen som är representerad av R1 i den generella formeln [l] har en arylgrupp, en aminogrupp, en cyano- grupp eller en nitrogrupp vid änden därav, eller har en amidgrupp, en karbamatgrupp, en karbamidgrupp, en estergrupp eller en karbonatgrupp vid ett annat ställe än änden därav.

3. Förfarande för framställning av ett packningsmaterial för vätskekromatografi enligt krav 'l eller 2, varvid bifunktionellt cykliskt silazan 10 15 530 132 15 som är representerat av den generella formeln [ll] och en bifunktionell si- lanförening som är representerad av den generella formeln [lll]: [ut] [varvid X3 och X4, desamma eller olika, representerar en väteatom, en halogenatom eller en alkoxylgrupp som har från 1 till 4 kolatomer; och R"' och R5, desamma eller olika, representerar en alkylgrupp som har från 1 till 4 kol- atomer] används i kombination.

4. Packningsmaterial för vätskekromatografi som är framställt genom förfarandet enligt något av kraven 1 till 3.

5. Kolonn för vätskekromatografi som är packad med ett packningsmaterial för vätskekromatografi enligt krav 4.

6. Förfarande för analys eller förfarande för fraktionering av en förening, varvid kolonnen för vätskekromatografi enligt krav 5 används.

7. Förfarande för analys eller förfarande för fraktionering av en förening enligt krav 6, varvid föreningen enligt krav 6 är en peptid eller ett protein som är inkluderat i ett biologiskt prov.