JP3970702B2 - 液体クロマトグラフィー用ｏｄｓ化シリカゲル充填剤の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術の分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
シリカゲルを基材とした液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用充填剤は、高純度シリカゲルを原料とすることで飛躍的な進歩を遂げ、分離選択性の極めて高い固定相が数多く開発・市販されるに至っている。
これらの中でもオクタデシルシリル化（ＯＤＳ）シリカゲル充填剤はＨＰＬＣの発展を支えてきた主役である。しかしながら、この充填剤は、その開発以来の問題点として、シリカゲル由来のシラノールによる不可逆的な二次相互作用を起こすことも周知の事実であり、この不可逆的二次相互作用を解消することを目的にこれまで数多くＯＤＳ化シリカゲル充填剤の不活性化（エンドキャッピング）の技術が開発・報告され、かつ実用化されている。
【０００３】
これまで、報告されてきたエンドキャッピングの代表的な技術をまとめると、１．トルエン還流法
本方法はトルエンを溶媒として使用し、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）およびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を単独もしくは混合液でピリジン（K. Jinno, S. Shimura, N. Tanaka, J. C. Fetze, R. Biggs Chromatographia, 27, 285 (1989)）もしくはジエチルアミン（N. Tanaka, H. Kinoshita, M. Araki, J. Chromatogr., 332, 57(1985)）の存在下、反応する一段階エンドキャッピングの方法である。
【０００４】
２．高温液相法
トルエン還流温度下で一次エンドキャッピングの終了したＯＤＳ化シリカゲル充填剤にＴＭＣＳ及びＨＭＤＳを単独または混合液で加え、さらに高温（230℃〜250℃）でエンドキャッピングをおこなう二段階反応。
密閉系の反応（細田誠、酒井芳博 Chromatography, 17, 39(1996)）、流動パラフィン（酒井芳博、浜川大爾、太田鈴枝 第2回LCテクノプラザ講演要旨集BP2、５１（１９９７））、特開２００２−２２７２１等の方法が存在する。
【０００５】
３．気相方法（特開平４-２２１２０５８号）
ＯＤＳ化シリカゲルを合成した後、これを密閉容器中でシラン化剤と共に加熱反応する方法。一段階もしくは二段階エンドキャップ反応。
【０００６】
４．超臨界法（鎗田孝、井原俊英、堀本能之、野村明 第４回LCテクノプラザ講演要旨集、BP2 ３６（１９９９）、特許第２８１８８５７号）
ＯＤＳ化シリカゲルを合成した後、超臨界流体中でＨＭＤＳ等でエンドキャッピングする一段階エンドキャップ反応。
等があり、この中でエンドキャッピング剤（シラン化剤）の種類、反応条件（雰囲気、温度等）が検討されてきた。
【０００７】
このように、さまざまなエンドキャッピングの技術が開発されているが、前記１．のトルエン還流法は、最も古くから実用化されており、かつ最も一般的なエンドキャッピングの技術である。現在実施されているトルエン還流温度下におけるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成方法（エンドキャッピングを含む）において特徴的なことは、シリル化反応を促進するために使用される塩基がＯＤＳ化及びエンドキャッピング共に同じ化合物が使用されている点にある。すなわち、ＯＤＳ化シリカゲルの合成にジエチルアミン（ＤＥＡ）（第二級アミン）を反応促進剤として使用するとすれば、エンドキャッピングにおいてもＤＥＡが使用されており、ピリジン（第三級アミン）をＯＤＳ化シリカゲルの合成に使用すればエンドキャッピングにもピリジンを使用する方法が採用されていることに特徴がある。しかしながら、本トルエン還流法は、長時間（２４時間以上）の反応を行っても完全エンドキャッピングが困難である点に問題がある。
【０００８】
また、前記２．〜前記４．は前記１．の技術では不完全であるエンドキャッピングをより完全にするために開発された技術であるが、反応の雰囲気（オートクレーブ中、超臨界流体中）等、特殊な条件を必要とするとともに、これらの方法においてもＯＤＳ化シリカゲル充填剤がフルエンドキャッピングされていないため、オキシン銅のような配位性化合物や強塩基性化合物を分析するにはピークテーリングが生じるなど測定結果に再現性がないという問題点があった。
一方で、近年シリカゲルを基材とした液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用充填剤については、測定しようとする対象成分の用途に合わせて分離選択性の極めて高いものが数多く開発・市販されるに至っている。たとえば、ゴルフ場農薬分析用、糖分析用、アミノ酸分析用、光学活性物質分析用などのカラムが市販されている。
その中の一つ、ゴルフ場農薬は公共水域等で監視が必要であり、１９９３年度版（上水試験方法 １９９３年版）上水試験方法においては、オキシン銅などを含む８種類の農薬をＨＰＬＣ法によりＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムで試験する方法が採用されている。
しかしながら、昨年改定された上水試験法の２００１年版（上水試験方法 ２００１年版）では、第一優先に使用されるカラムの充填剤が、ＯＤＳ化シリカゲル系充填剤からポリマー系充填剤へ変更されている。
ポリマー系充填剤の使用が優先される原因として、対象成分の溶離が安定しているためと考えられ、すなわち、ＯＤＳ化シリカゲル系充填剤では、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤のロット間で、残存シラノールによる品質のばらつきが依然存在しているためであると考えられる。
しかしながら、ポリマー系充填剤は価格が高く、カラムの理論段数が低く対象物質の分離が不十分という問題点があった。
【０００９】
したがって、現状の上水試験法においては、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を使用した場合、５０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液（ｐＨ３．５）を溶離液に用いるとともに、再現性を確保することを目的にエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を溶離液に添加することでオキシン銅の溶離を安定化している。
しかし、ＥＤＴＡ−２Ｎａ等の塩基性物質を溶離液に添加することは、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤にダメージを与え、化学的な耐久性を短くすると共に、ＥＤＴＡ−２Ｎａは残存シラノールが多いカラムに入るとなかなかカラム外に排出されにくく、一般の分析を行う際、再現性に問題が発生する可能性が高くなるといった問題点があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のような問題点を解消し、短時間に簡便にＯＤＳ化シリカゲルをフルエンドキャッピングし、さらに再現性よく、微少量まで対象物質を測定することができるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造方法において、反応条件が穏和で、かつ特殊な装置を必要とせず、短時間にエンドキャッピングをすることにより、残存するシラノールを完全になくし、有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液により洗浄することで、従来困難であった、極めて微少量の配位性化合物や強塩基性化合物を良好なピーク形状で再現性よく測定することを可能とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造法を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造する方法であって、反応促進剤として２種以上の異なるアミン化合物を用いてエンドキャッピングを行うことを含む、前記方法に関する。
また本発明は、２種以上の異なるアミン化合物が、第二級アミンおよび第三級アミンの組み合わせであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに本発明は、第二級アミンがジエチルアミンであり、第三級アミンがトリエチルアミンであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらにまた本発明は、エンドキャッピングを２回以上に分けて行うことを特徴とする、前記方法に関する。
【００１２】
本発明は、各エンドキャッピングを、級の異なるアミン化合物を用いて行うことを特徴とする、前記方法に関する。
また本発明は、各エンドキャッピング後、有機溶媒を含む洗浄液により３０〜１１０℃の温度でおよび／または酸を含む洗浄液により洗浄することを特徴とする、前記方法に関する。
また本発明は、１次エンドキャッピング後の洗浄を有機溶媒を含む洗浄液で行い、２次エンドキャッピング後の洗浄を酸を含む洗浄液で行うことを特徴とする、前記方法に関する。
さらに本発明は、有機溶媒が、メタノールであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらにまた本発明は、酸が、りん酸であることを特徴とする、前記方法に関する。
【００１３】
本発明によれば、シリル化反応の特異性（E. Colin "Silicon in Organic Synthesis" Buttrworks 1981）およびシリカゲル表面のシラノールの構造を考慮し、エンドキャッピングを異なるアミン化合物（シリル化剤と反応し、シリルアミンとしてシリカゲルに作用する）を用いて行い、有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液により洗浄することで、特殊な条件および装置を用いることなく、従来困難であった完全なフルエンドキャッピングを短時間で簡便に行え、バッチ間でも再現性よく製造することができる。
また、本発明の方法で得られたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、従来ポリマー系充填剤を使用しなければ困難であった極めて微少量の金属配位性化合物および塩基性化合物のいずれの溶離も良好で、再現性よく測定できる。
さらに、本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いればＥＤＴＡ−２Ｎａを含まない溶離液で配位性化合物等を測定することができ、化学的耐久性のあるＨＰＬＣ用充填剤として優れるものである。
また、本発明によればオキシン銅等の配位性の強い化合物に対しても、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤のエンドキャッピングが十分に行われるので、残存シラノールと不可逆的二次相互作用を引き起こすことなく、カラムの材質にかかわらず、再現性よく分析することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるシリカゲルは、化学修飾を高効率に行える５０〜８００ｍ2/ｇの比表面積のものが好適に用いられる。より好ましくは２００〜４００ｍ2/ｇである。さらに、粒子径２〜２００μｍ、より好ましくは２〜１５μｍ、細孔径４０〜１０００Å、より好ましくは４０〜２００Åのものが好適に用いられる。
シリカゲルに化学結合させるＯＤＳ基としては、ジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基、オクタデシル基のようなオクタデシル基を有するものであればいずれも使用することができる。
【００１５】
本発明におけるＯＤＳ化およびエンドキャッピングに反応促進剤として用いられるアミン化合物は、第一級、第二級および第三級のアミンのいずれも用いることができる。第一級アミンは、エチルアミン、ブチルアミン、プロピルアミン等が例示され、第二級アミンは、ジエチルアミン（ＤＥＡ）、ジブチルアミン、ジイソプロピルアミン、モルフォリン、ヘキサメチルジシラザン等が例示され、第三級アミンは、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリブチルアミン、ピリジン等が例示される。常温で液体であり、使い易さの点から、第二級アミンのジエチルアミン、ヘキサメチルジシラザン、第三級アミンのトリエチルアミン、ピリジンが好適に用いられる。さらに組み合わせとしては、ジエチルアミンとトリエチルアミン、ヘキサメチルジシラザンとピリジンが挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＯＤＳ化シリカゲル充填剤のエンドキャッピング方法は、トルエンまたは流動パラフィンなどを溶媒とする公知の方法が用いられる。
ヘキサメチルジシラザンを反応促進剤に使用する場合は、より短時間にエンドキャッピングを行うために、流動パラフィンを溶媒に用いることが望ましい。
エンドキャッピングは、２種以上の異なるアミン化合物を用いて行うのであれば、いずれの方法を用いて行ってもよいが、例えば、同じ反応系でトリメチルクロロシランおよび異なるアミン化合物を連続して加える、または異なるアミン化合物をそれぞれ分けて異なる反応系で行うなどして、２回以上に分けてエンドキャッピングを行うこともできる。それぞれの反応促進剤により行われるエンドキャッピングを完全なものとするためには、異なる反応系で行うことが好ましい。また異なるアミンの組み合わせとしては、級の異なるものが好ましく、さらに第二級および第三級アミン化合物の組み合わせが好ましい。
【００１７】
例えば、ＯＤＳ化にＤＥＡ等の第二級アミンを反応促進剤として使用した場合、エンドキャッピングは反応促進剤としてＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させ、フルエンドキャッピングを行う。３〜４時間の反応時間で金属配位性化合物（酸性条件下でのオキシン銅の溶離等）および強塩基化合物（中性条件下でのベンジルアミンの溶離等）の溶離が良好になり完全疎水化が可能となる。
【００１８】
また、例えば、ＯＤＳ化反応に第三級アミンであるＴＥＡを反応促進剤に使用した場合、エンドキャッピングは反応促進剤としてピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させ、フルエンドキャッピングを行う。３〜４時間反応させることで金属配位性化合物および塩基性化合物の溶離が可能となる。
また、本発明によるＯＤＳ化反応には、特開２００２−２２７２１などの公知の方法を用いることができる。
【００１９】
さらに本発明では、エンドキャッピング後、温めた有機溶媒を含む洗浄液でＯＤＳ化シリカゲルを洗浄することが好ましい。再現性良く対象物質を測定するためには、さらに酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
２回以上に分けてエンドキャッピングを行う場合、それぞれの洗浄に有機溶媒を含む洗浄液および酸を含む洗浄液を使用しても、有機溶媒を含む洗浄液または酸を含む洗浄液のいずれかを使用してもよい。この場合、有機溶媒を含む洗浄液および酸を含む洗浄液の使用する順序、回数は問わない。一次エンドキャッピング時に用いるピリジン等の反応促進剤を効率よく除き、二次エンドキャッピング以降のエンドキャッピングを十分進行させるためには、一次エンドキャッピング後に有機溶媒を含む洗浄液で、二次エンドキャッピング後に酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
【００２０】
かかる有機溶媒は、メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などを用いることができる。比較的取り扱い易く、水と混和するメタノールが好適に用いられる。
また、一次エンドキャッピング後のＯＤＳ化シリカゲルが十分洗浄されれば、１種の有機溶媒を用いてもよく、２種以上の有機溶媒を組合せて用いてもよく、２種以上の有機溶媒を混合して用いてもよい。また、水と混和する有機溶媒にあっては、水と組み合わせて用いてもよい。より効率よく洗浄するためには、水および水と混和する有機溶媒を混合して用いることが好ましい。水と混和する有機溶媒にメタノールを用い、メタノール水溶液とした場合、その濃度は、２０〜８０％が好ましく、より好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％である。
また、ピリジンなどの反応促進剤を効率よく除去するためには、３０〜１１０℃に温めた有機溶媒を用いることが好ましい。温めたメタノール水溶液を用いる場合は、２０〜７０℃が好ましく、５０〜６０℃がより好ましい。温めた有機溶媒を含む洗浄液による洗浄を実施しないと二次エンドキャッピング工程において反応中にＯＤＳ化シリガゲルが褐色に変化する場合があり、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤が得られないことがある。
これは、反応促進剤のアミンが、塩酸塩としてＯＤＳ化シリカゲル表面に残存し、これを除去しないまま２次エンドキャッピングを行うと、温度上昇により、アミンやＯＤＳ化シリカゲルが炭化するためであると思われる。
したがって、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤を得るためには、残存アミンを完全に除去することが必要である。
洗浄時間に特に制限はないが、３０分〜６時間が好ましく、特に好ましくは３〜４時間である。
【００２１】
一次エンドキャッピングでの温めた有機溶媒を含む洗浄液による洗浄後、ＯＤＳ化シリカゲルの洗浄効果を高めるために、さらに再度メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などの有機溶媒で洗浄し、乾燥させることが好ましい。また、乾燥は、二次エンドキャッピングに影響を与えないように１００〜１５０℃で１〜４時間乾燥することが好ましい。
洗浄方法は、ＯＤＳ化シリカゲルを有機溶媒などが入ったビーカーなどの容器に浸漬させて洗浄を行っても、攪拌しながら行なってもよく、また直接有機溶媒などをかけてもよい。
【００２２】
エンドキャッピング後、酸を含む洗浄液で洗浄する場合、その酸は、りん酸、酢酸、塩酸、硫酸、などを用いることができるが、比較的取り扱い易く、カラムの洗浄として一般的に用いられているりん酸または酢酸が好適に用いられる。
これらの酸はＯＤＳ化シリカゲル充填剤の耐久性などに影響を与えなければ１種で用いても、２種以上を組合せても、２種以上混合して用いてもよい。また、これらの酸を水溶液として用いることもできる。効率よく洗浄を行うためには、酸の水溶液を用いることが好ましい。その場合の濃度はＯＤＳ化シリカゲル充填剤の耐久性などに影響を与えなければよく、りん酸水溶液を用いる場合０．５〜５％が好ましく、０．５〜１％がより好ましい。また、酢酸水溶液を用いる場合０．５〜５％が好ましく、０．５〜１％がより好ましい。さらに、酸およびメタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物などの有機溶媒を混合して使用すれば残存する有機物、例えばパラフィンなどを取り除くことができ好適である。
この場合の混合比率は、酸／有機溶媒にりん酸水溶液／メタノールを使用する場合、３０／７０〜７０／３０(ｖｏｌ/ｖｏｌ)が好ましく、４０／６０〜６０／４０(ｖｏｌ/ｖｏｌ)がさらに好ましい。
【００２３】
エンドキャッピングは、塩基性条件下で行われるため、ＯＤＳ化シリカゲル表面は塩基性となっており、このままでは、オキシン銅との相互作用が大きく溶離が不十分となるので、ＯＤＳ化シリカゲル表面を中性にするため、酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
したがって、かかる酸を含む洗浄液で洗浄して得た、ＯＤＳ化シリカゲル充填カラムは、試料の分析時にカラム洗浄を行わなくとも簡便に対象物質を再現性よく分析できる。洗浄時間に特に制限はないが、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤を得るためには３０分〜６時間が好ましく、特に好ましくは３〜４時間である。
酸を含む洗浄液で洗浄後、ＯＤＳ化シリカゲルの洗浄効果を高めるために、さらに有機溶媒で洗浄し、乾燥させることが好ましい。この場合の有機溶媒は、メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などの有機溶媒を用いることができるが、残存するりん酸などを取り除くためにメタノールが好適に用いられる。そして、エンドキャッピング後のＯＤＳ化シリガゲルを完全に乾燥させるため、１２０℃で２時間乾燥させることが好ましい。
この様にして製造したＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、カラムに充填されＨＰＬＣ測定に用いられる。カラムの材質は、ステンレス性もしくはポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリスチレンなどの樹脂性であってもよい。
【００２４】
本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤で測定できる物質に特に制限はない。例えば、オキシン銅、チウラム、アシュラム、メコプロップ、ベンスリドなどのゴルフ場農薬、アルジカルブ、メチオカルブなどのカーバメート系農薬、ベンジルアミン、プロカインアミドなどの塩基性物質、安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸などの有機酸やそのエステル類、カフェインやフェノールなどの種々の物質が挙げられる。これらの中でも、従来再現性よく分析することが困難であったオキシン銅に特に好ましく適用することができる。
本発明により、不可逆的な二次相互作用を起こす残存シラノ―ルを完全にエンドキャッピングしたＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造することが可能となり、さらに一次エンドキャッピング後の温メタノール水溶液による洗浄と、二次エンドキャッピング後の１％りん酸水溶液／メタノール混合液による洗浄により１ｎｇのオキシン銅を特別な前処理（ＥＤＴＡ−２Ｎａ等の添加等）をすることなく安定して溶離させることが可能となった。
【００２５】
【実施例】
〔実施例１〕エンドキャッピングの効果
（１） ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成
シリカゲルのＯＤＳ化は、シリカゲルの酸洗浄を行った後、それぞれシリル化反応を実施することで合成した。
（１）−１． シリカゲルの洗浄
液体クロマトグラフィー用シリカゲル（粒子径５μｍ、比表面積３５０ｍ2/ｇ、細孔直径１２ｎｍ、細孔容積１．１ｍｌ／ｇ）５０ｇを６ｍｏｌ／ｌ塩酸２００ｍｌ中で５時間加熱還流する。シリカゲルは、ろ過後純水にてろ液が中性になるまで洗浄される。その後、アセトン５０ｍｌにて洗浄し１３０℃で４時間乾燥する。
【００２６】
（１）−２． 第二級アミン（ＤＥＡ）と第三級アミン（ＴＥＡ）の組み合わせによるＯＤＳ化シリカゲル充填剤（ＯＤＳ-ＤＥＡ）の合成
＜ＯＤＳ化＞ 塩酸洗浄したシリカゲル２５ｇを１リットルの丸底四つ口フラスコ中で、乾燥トルエン５００ｍｌに分散させる。その後ジメチルクロロオクタデシルシラン (ＤＭＣＯＤＳ）４５ｇ、ＤＥＡ２５ｇを順次加え約５時間加熱還流する。生成物はろ過した後テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍｌ・メタノール（ＭｅＯＨ）１００ｍｌで順次洗浄し１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｄ−１とする。
【００２７】
＜一次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｄ−１、２５ｇを乾燥トルエン５００ｍｌに分散させ、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）１０ｍｌとＤＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流することで第二級アミンによるシリル化反応を完了させる。生成物はろ過後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ １００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｄ−２とする。
＜二次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｄ−２、２０ｇを乾燥トルエン３００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌとＴＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流しエンドキャッピングを行う。生成物はろ過後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この様にして合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤をＯＤＳ‐ＤＥＡとする。
【００２８】
（１）−３． 第三級アミン（ＴＥＡ）と第二級アミン（ＤＥＡ）の組み合わせによるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成（ＯＤＳ-ＴＥＡ）
＜ＯＤＳ化＞ 塩酸洗浄したシリカゲル２５ｇを１リットルの丸底四つ口フラスコ中で乾燥トルエン５００ｍｌに分散させる。その後ＤＭＣＯＤＳ４５ｇ、ＴＥＡ２５ｇを順次加え約５時間加熱還流する。生成物はろ過した後ＴＨＦ２００ｍｌ・ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｔ−１とする。
【００２９】
＜一次エンドキャッピング＞ 乾燥した充填剤ＯＤＳ−Ｔ−１、２５ｇを乾燥トルエン５００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌと ＴＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流することで第三級アミンによるシリル化を完了させる。生成物はＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｔ−２とする。
＜二次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｔ−２、２０ｇを乾燥トルエン３００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌとＤＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流する。生成物はろ過した後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この様にして合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤をＯＤＳ‐ＴＥＡとする。
【００３０】
（２）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の評価
合成された各ＯＤＳ化シリカゲル充填剤はスラリー法で内径４．６ｍｍφ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムに充填されエンドキャッピングの評価をおこなった。
エンドキャッピングの評価はオキシン銅（ｐＨ２．１の溶離液）およびベンジルアミン（ｐＨ７．６の溶離液）をＨＰＬＣで測定することにより実施した。
【００３１】
溶離試験条件を下記に示す。
▲１▼オキシン銅溶離試験条件
溶離液 ： ２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸水溶液：アセトニトリル＝９５：５
流 速 ： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
温 度 ： ４０℃
検 出 ： ＵＶ ２５０ｎｍ
試 料 ： ５μｌ（ウラシル；４．５μｇ、オキシン銅；２０μｇ、カフェイン１５０μｇ／ｍｌ）
【００３２】
▲２▼ベンジルアミン溶離試験
ベンジルアミン試験は、田中試験（K. Kimata, K. Iwaguchi, S. Onishi, K. Jinno, R. Eksteen, K. Hosoya, M. Araki, N. Tanaka, J. Chromatogr. Sci., 721, 27, 1989）として知られているイオン交換性シラノールの良否を確認する手法であるが、中性付近のｐＨ（ｐＨ＝７．６）下でベンジルアミンの溶離状況を測定するものである。以下に溶離条件を示す。
溶離液 ： ２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液：メタノール＝７０：３０
流 速 ： ０．６ｍｌ／ｍｉｎ
温 度 ： ４０℃
検 出 ： ＵＶ ２５４ｎｍ
試 料 ： １０μl（ベンジルアミン０．５９ｍｇ、フェノール０．４１ｍｇ／ｍｌ）
【００３３】
（３）結果及び考察
前記方法に従って合成された２種類の充填剤のオキシン銅およびベンジルアミンの溶離状況を図１（ＯＤＳ‐ＤＥＡ）ａ）、ｂ）および図２（ＯＤＳ‐ＴＥＡ）ａ）、ｂ）に示す。
従来、エンドキャッピングの良否の判定手段としてピリジン／フェノール法が広く使用されてきたが、今回我々はこの方法より更に厳しくエンドキャッピングの良し悪しを確認することができるオキシン銅評価（配位性化合物とシラノールの相互作用を確認する方法）とベンジルアミン評価（イオン交換性シラノールと強塩基性化合物の相互作用を確認する方法）の２種類を採用した。
オキシン銅試験は弱酸性付近で活性化される水素結合性シラノールを確認する試験であり、ベンジルアミン試験は、中性でのイオン交換性シラノールの存在を確認する試験である。
【００３４】
図１ａ）、ｂ）および図２ａ）、ｂ）に示されるように、ＯＤＳ-ＤＥＡ、ＯＤＳ-ＴＥＡ共にオキシン銅およびベンジルアミンは良好なピーク形状で溶離している。特にオキシン銅のピーク対称性はＯＤＳ-ＤＥＡが１．３３、ＯＤＳ-ＴＥＡが１．３０という結果を得た。これはすなわち充填剤との不可逆的な相互作用が小さいことを示しており、良好にエンドキャッピングが進行したことを意味している。
この様に本発明におけるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成方法により、従来困難であった完全に不活性化されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成が可能となることが判明した。
【００３５】
〔実施例２〕ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成
（１）ＯＤＳ化
６ｍｏｌ／ｌ塩酸で洗浄し乾燥した液体クロマトグラフィー用高純度シリカゲルａ（粒子径 ５μｍ、表面積２７０ｍ２／ｇ、細孔径１３ｎｍ、細孔容積 １．０ｍｌ／ｇ）の５０ｇを乾燥トルエン５００ｍｌ中に分散させる。これにジメチルクロロオクタデシルシラン（ＤＭＣＯＤＳ）９０ｇを加えた後、ジエチルアミン（ＤＥＡ）５０ｍｌを加え約５時間加熱還流する。冷却後、生成物をろ集し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍｌ、メタノール（ＭｅＯＨ）５００ｍｌ、５０％メタノール水溶液５００ｍｌで洗浄した後、１２０℃で約２時間乾燥する。
これにより、炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルが得られた。
同様にして、高純度シリカゲルｂ（粒子径 ５μｍ、表面積３４０ｍ２/ｇ、細孔径１２ｎｍ、細孔容積１．１ｍｌ／ｇ）も処理し、シリカゲルｂを用いた場合は炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルが得られた。
【００３６】
（２）一次エンドキャッピング
（１）で得られた炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルａ ５０ｇを乾燥トルエン５００ｍｌ中に分散させる。これにトリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）２０ｍｌとピリジン２５ｍｌを順次加え約５時間加熱還流する。
反応終了後、生成物をろ集し、ＴＨＦ５００ｍｌ、ＭｅＯＨ５００ｍｌ、５０％ＭｅＯＨ水溶液５００ｍｌで順次洗浄し、５０％ＭｅＯＨ水溶液で３〜４時間５０〜６０℃で加熱洗浄する。ろ過後ＭｅＯＨで洗浄し、１２０℃で約２時間乾燥する。
炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルｂ ５０ｇについても、同様に１次エンドキャッピングを行った。
【００３７】
（３）二次エンドキャッピング
炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルａを用いて、（２）で一次エンドキャッピングが終了したＯＤＳ化シリカゲルの２５ｇを流動パラフィン５００ｍｌ中に分散させる。これにＴＭＣＳ５ｍｌとヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）１７ｍｌを加え、約２３０℃の温度で約３時間反応する。
冷却後、生成物をろ集しヘキサン３００ｍｌ、ＴＨＦ３００ｍｌ、ＭｅＯＨ３００ｍｌそして５０％ＭｅＯＨ水溶液３００ｍｌで順次洗浄した後、１％りん酸水溶液／ＭｅＯＨ＝５０／５０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２５０ｍｌで６０℃２時間洗浄する。更に５０％ＭｅＯＨ水溶液で３〜４時間加熱還流し洗浄する。ろ過後、ＭｅＯＨ３００ｍｌで洗浄した後、１２０℃で２時間乾燥させる。
これにより、本発明の目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤（以下、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａと略す。）を合成することができた。
炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルｂ ２５ｇについても、同様に２次エンドキャッピングを行い、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤（以下、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂと略す。）を合成することができた。
【００３８】
〔実施例３〕一次エンドキャピング後の洗浄効果
一次エンドキャッピング後の洗浄効果を比較するために、実施例２でシリカゲルｂを用いて合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂと実施例２の（２）において温５０％ＭｅＯＨ水溶液洗浄を行なわない以外は実施例２と同様に操作して得た、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてオキシン銅の分析を行った。
オキシン銅の溶離試験は基本的に上水試験方法１９９３年版のＨＰＬＣ条件に準じて実施したが、溶離液にはＥＤＴＡ−２Ｎａを添加せずに使用した。以下に測定条件を示す。なお、使用したカラムは、本発明による充填剤をスラリー法により長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφのステンレスカラムに充填し、アントラセンをサンプルとして理論段数９０，０００段／ｍｍ以上のカラム性能を示すものを使用した。
オキシン銅のＨＰＬＣによる測定条件（ｐＨは３．５）を以下に示す。
溶離液： ５０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液：アセトニトリル＝６０：４０
検出 ： ＵＶ ２３０ｎｍ
温度 ： ４０℃
流速 ： １ｍｌ／ｍｉｎ
注入量： １μｌ（オキシン銅溶液 １μg／ｍｌ；調製方法は浄水試験法２００１年版に従った）
結果を図３に示す。ａ）は温メタノール洗浄の後二次エンドキャッピングを行った場合、ｂ）は温メタノール洗浄を行わず二次エンドキャッピングを行った場合のＯＤＳ化シリカゲル充填剤を使用したオキシン銅のクロマトグラムである。４分付近のピークがオキシン銅のものであり、図３ａ）、ｂ）より、エンドキャッピング後に温メタノール洗浄を行った場合は、１ｎｇという微小量までのオキシン銅が溶離可能となった。
温メタノール洗浄を行なわず二次エンドキャッピングを行なった場合、１ｎｇという微少量まで、再現性よく溶離をおこなうことはできない。これは、二次エンドキャッピング工程におけるエンドキャッピング時の温度が上昇するにしたがって反応溶液が着色し、すなわち、ＯＤＳ化シリカゲルおよび残存する反応促進剤が炭化するためと考えられる。したがって、１ｎｇという微少量まで分析を行うためには、反応促進剤を十分除去することが必要であり、一次エンドキャピング時の十分な洗浄が必要であることがわかった。
【００３９】
〔実施例４〕二次エンドキャップ後の洗浄効果
二次エンドキャッピング後の洗浄効果を比較するために、実施例２でシリカゲルａを用い合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａと実施例２の（３）において１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行なわない以外は実施例２と同様に操作して得たＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてオキシン銅の分析を行った。
その結果を図４に示す。ａ）が１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行った場合、ｂ）が１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行わなかった場合を示しており、３分付近がオキシン銅のピークである。溶離条件および使用カラムは実施例３と同様である（注入量１μｌ）。
図４ｂ）では、１ｎｇオキシン銅は、わずかにピークを確認できるにすぎないが、図４ａ）では１ｎｇの測定においても最初から良好なピーク形状を示すことが明らかとなった。したがって、二次エンドキャッピング後りん酸水溶液／メタノール混合液で十分な洗浄を行うことで、オキシン銅の溶離が改善されることが分かった。
【００４０】
〔実施例５〕実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムを用いたオキシン銅の分析
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａ、ＢおよびＥＤＴＡ−２Ｎａを含まないｐＨ３．５の溶離液を用い、1ｎｇのオキシン銅を測定した。そのクロマトグラムを図５に示す。溶離条件および使用カラムは実施例３記載の条件にしたがい、１μｌ注入した。いずれのＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてもオキシン銅が良好なピーク形状で溶離することが確認された。
【００４１】
〔実施例６〕樹脂カラム及びステンレスカラムによるオキシン銅の溶出挙動
ピーク樹脂カラムとステンレスカラムを用いた場合のオキシン銅の溶出挙動を比較した。その結果を図６に示す。いずれのカラムについても、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを使用し、溶離条件および使用したカラムは実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
図６に示すとおり、ほとんどその溶出挙動に差異は認められなかった。したがって、オキシン銅の溶出挙動は、本発明のＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いれば、カラムの材質に影響されないことが確認された。
【００４２】
〔実施例７〕検出における再現性の測定
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを実施例３記載の方法により充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものを使用し、上水試験法の溶離液下で１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇのオキシン銅の再現性を測定した。比較試験として、オキシン銅との不可逆的二次相互作用のないポリマー系充填剤を充填したカラム（ゴルフパック：Waters社製）を同様に試験した。その結果を表に示す。変動係数（ＣＶ値）はそれぞれの濃度で５回測定し、その面積値から求めた。溶離条件は実施例３に従った。
【００４３】
【表１】
【００４４】
表に示すように、本発明のオキシン銅分析用カラムは１ｎｇの測定において、その繰り返し再現性を示すピーク面積の変動係数は９％であった。また、オキシン銅の注入量が５ｎｇ、１０ｎｇと増えていくと変動係数が小さくなることも判明した。これら変動係数をポリマー系カラムのそれと比較すると、ほとんど両者に差は見られないことも判明した。
また本発明は、上水試験法で示される２０ｎｇの濃度における面積の変動係数２０％以内を満たしており、さらに環境省令で示される検出限界５ｎｇ を分析した場合、ピーク面積の変動係数５．４６％と良好な値を示している。
【００４５】
〔比較例１〕１種類のアミン化合物を用いてエンドキャッピングを１回実施した場合の塩基性化合物の溶離に与える効果
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成において反応促進剤が果たす役割を解明するために、ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピングした充填剤とＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピングした充填剤を使用しベンジルアミンの溶離状況を評価することでＯＤＳ化およびエンドキャッピングにおける反応促進剤の塩基性化合物の溶離に与える効果を比較した。
【００４６】
この結果を図７ａ）、ｂ）に示す。溶離条件および使用カラムは実施例１と同様である。
図７の結果は、シリル化剤の役割を良く表した結果を示した。８分付近がベンジルアミンのピークであるが、ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤は、ベンジルアミンの溶離において相互作用の強いテーリングピークを示している。しかしながらＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）でエンドキャッピングをした充填剤では、比較的良好なクロマトグラムを見せている。
この結果により、第二級シリルアミンによるエンドキャッピングは、塩基性物質の溶離に効果的であることが示唆された。
【００４７】
〔比較例２〕１種類のアミン化合物を用いてエンドキャッピングを１回実施した場合の金属配位性化合物の溶離に与える効果
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成において反応促進剤が果たす役割を解明するために、ＯＤＳ−Ｔ−１、ＯＤＳ−Ｔ−１にＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理した充填剤、およびＯＤＳ−Ｔ−１にＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理したＯＤＳ−Ｔ−２を使用し、ＯＤＳ化およびエンドキャッピングにおける反応促進剤の金属配位性化合物の溶離に与える効果を比較した。
図８は、金属配位性化合物の溶離の状況を示すが、この場合評価のための試料としてデヒドロ酢酸を使用した。その理由として、本来であればオキシン銅を使用することが最も良策であるがエンドキャッピングが不十分であると図９に示すようにオキシン銅は溶離しないため、比較的溶離しやすいデヒドロ酢酸を選択した。
【００４８】
図８ａ）は、ＯＤＳ−Ｔ−１のクロマトグラム、図８ｂ）は、ＯＤＳ−Ｔ−１にＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理した充填剤（図７ｂ）と同じ）のクロマトグラム、図８ｃ）は、ＯＤＳ−Ｔ−２のクロマトグラムであり、デヒドロ酢酸は、９分付近のピークである。
以下に溶離条件を示す。
溶離条件（ｐＨ＝４．６）
溶離液： ２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液：アセトニトリル＝２：１
流速 ： ０．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ： ４０℃
検出 ： ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量： ５μｌ（試料は、ソルビン酸２０ｍｇ、安息香酸２０ｍｇ、デヒドロ酢酸２０ｍｇ／ｌ）
図８ａ）とｂ）を比較すると、未エンドキャッピング品であるＯＤＳ−Ｔ−１も、ＤＥＡ-ＴＭＣＳエンドキャッピング品でもほとんど同じクロマトグラムを示している。特に図８ｂ）に示す充填剤は、図７ｂ）に示したようにベンジルアミンが比較的良好に溶離しているにもかかわらず、デヒドロ酢酸の溶離に問題がある。この結果は、ＯＤＳ化と異なるアミン化合物による第二級シリルアミンを使用し１回のエンドキャッピングを行ってもほとんど金属配位性化合物の溶離に対して効果がないことを示している。しかしながら、図８ｃ）に示すＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピングを実施したＯＤＳ-Ｔ２充填剤においては相互作用することなくデヒドロ酢酸は溶離することが確認された。
この結果により、第三級シリルアミンによるエンドキャッピングは、金属配位性化合物の溶離には効果的であることが示唆された。
【００４９】
〔比較例３〕１種のアミン化合物を使用し、エンドキャッピングを二回実施した場合における溶離状況
図１０は、実施例１におけるＯＤＳ−Ｄ−１を使用し、第二級アミンを反応促進剤として２回エンドキャッピングを実施したＯＤＳ化シリカゲル充填剤の結果を示すａ）はオキシン銅、ｂ）はベンジルアミンのクロマトグラムを示す。溶離条件は、実施例１と同様である。塩基性化合物であるベンジルアミン（６分付近のピーク）は比較的良好に溶離しているが、オキシン銅（５分付近のピーク）は吸着が強くテーリングの激しいクロマトグラムを示している。塩基性化合物の溶離には効果を見せるが、金属配位性化合物の溶離改善には効果が見られていないことを示している。
【００５０】
比較例の結果からもわかるように、２回のエンドキャッピングに同じ反応促進剤を使用する限りにおいて、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の完全不活性化は困難であることを示している。
以上示してきたように、第二級アミンを反応促進剤に使用して合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、第二級アミンの存在下ＴＭＣＳでエンドキャッピングを行った後、第三級アミンの存在下ＴＭＣＳでさらにエンドキャッピングすることにより、また第三級アミンを反応促進剤に使用して合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、第三級アミンの存在下ＴＭＣＳでエンドキャッピングを行った後、第二級アミンの存在下ＴＭＣＳでさらにエンドキャッピングすることにより、強塩基性化合物および金属配位性化合物を相互作用なく溶離する完全疎水化が実現できることが明らかとなった。
【００５１】
〔比較例４〕上水試験法に準じたオキシン銅の溶離試験
種々のカラムを用いて上水試験法の方法でＥＤＴＡ−２Ｎａ無添加溶離液を用いてオキシン銅を比較測定した。使用したカラムはＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを実施例３に記載の方法でカラムに充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものおよび比較カラムとして、Wakosil‐Cu、Wakopak Navi C18-5 GT（和光純薬製）、GL ODS-Cu（GLサイエンス社製）、Capcell Pack UG 120（資生堂製）を使用し、カラムサイズは、いずれも長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφのものを使用した。結果を図１１に示す。溶離条件は実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
クロマトグラムは、ａ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラム、ｂ）Wakosil Cu、ｃ）Wakopak Navi C18-5 GT、ｄ）GL ODS-Cu、e）Capcell Pack UG120Aの結果を示しており、保持時間約３〜４分付近のピークがオキシン銅を示している。
ａ）に示すとおり、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムは、良好なピーク形状を示していることがわかるが、その他のカラムは、ｃ）を除けば、不可逆的な二次相互作用が強く、ほとんどピークとして検出することが困難であることを示している。
ｃ）とｄ）は、両カラムともに、上水試験法でカラムを評価しオキシン銅分析用として市場に提供されているカラムであるが、ＥＤＴＡ−２Ｎａを添加しない溶離液の場合、図１１ａ〜ｅに示すように非常に強い二次相互作用を示すことが明らかとなった。
【００５２】
〔比較例５〕オキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性
オキシン銅のＨＰＬＣ分析は、従来ｐＨ２付近の強酸性溶離液を使用することが多くまた、ｐＨを上げると二次相互作用が強くなることが見うけられることから、オキシン銅のＨＰＬＣ測定においては、基本的にいかなるｐＨでもオキシン銅は溶出する必要がある。そこで、オキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性を測定した。
使用したＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを使用し、実施例３に記載の方法でカラムに充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものを使用した。測定ｐＨは、２．１、３．５、４．５を使用し、溶離液以外のＨＰＬＣ条件実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
その結果を図１２に示す。
図１２に示すようにＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムは、ｐＨが上昇するに従って溶離時間は遅れていくものの、良好にオキシン銅が溶離することが確認された。
【００５３】
一方、他社のカラムにおいても同様に測定した。その結果を図１３ａから図１５ｃに示す。
ｐＨ２．１の場合は（図１３ａ、図１４ａ、図１５ａ）比較的良好なピーク形状を示しているが、ｐＨが高くなるにしたがってオキシン銅と充填剤の二次相互作用が強くなり、溶出が困難になっていることが明らかとなった。
特に図１５ａ〜ｃのCapcell PakC18UG 120Aは、ｐＨ３．５においては他のカラムに比べ良好なピーク形状を見せているが（図１５ｂ）、ｐＨ４．５になると溶離時間が遅くなるとともに、ピークのテーリングも大きくなり、充填剤とオキシン銅との二次相互作用が顕著に現れている(図１５ｃ）。
この結果は、すなわちCapcell PakC18UG 120Aは、残存シラノールが多い充填剤であると考えられる。
この様に溶離液のｐＨが高くなるとオキシン銅の二次相互作用が強くなる理由は、溶離液のｐＨが高くなると、充填剤表面の残存シラノール基が活性化されることにより、オキシン銅のオキシンと水素結合を生じるためと考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドキャッピング後に有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液でＯＤＳ化シリカゲルを洗浄することにより、再現性良く、耐久性のあるＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造することが可能となった。また、本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、低濃度のオキシン銅を精度良く、しかも再現性よく、さらにＥＤＴＡ-２Ｎａを含まない溶離液を用いて分析できることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のエンドキャッピング方法によるＯＤＳ−ＤＥＡ充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験（クロマトグラムは順にウラシル、オキシン銅、カフェインを示す。）
ｂ）ベンジルアミン試験（クロマトグラムは順にベンジルアミン、フェノールを示す。）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図２】 本発明のエンドキャッピング方法によるＯＤＳ−ＴＥＡ充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験のクロマトグラム（クロマトグラムは順にウラシル、オキシン銅、カフェインを示す。）
ｂ）ベンジルアミン試験のクロマトグラム（クロマトグラムは順にベンジルアミン、フェノールを示す。）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図３】 一次エンドキャッピング後の温メタノール洗浄の効果を示す。
ａ）温メタノールで洗浄した場合のクロマトグラム
ｂ）温メタノールで洗浄をしなかった場合のクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示した。４分付近のピークがオキシン銅である。
【図４】 二次エンドキャッピング後の１％りん酸水溶液／メタノール混合液による洗浄効果を示す。
ａ）１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄した場合のクロマトグラム
ｂ）１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄しなかった場合のクロマト グラム
溶離条件は実施例３に示した。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図５】 実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムによるオキシン銅の溶離の結果を示す。
ａ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを用いた場合のクロマトグラム
ｂ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂを用いた場合のクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示す。注入量は１μｌで行なった。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図６】 ピーク樹脂カラムとステンレスカラムの比較を示す。
ａ）ピーク樹脂カラムのクロマトグラム
ｂ）ステンレスカラムのクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示した。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図７】 １種の反応促進剤を使用してエンドキャッピングを１回行った場合における、ベンジルアミンの溶離状況を示したクロマトグラムである。
ａ）ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
ｂ）ＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図８】 １種の反応促進剤を使用してエンドキャッピングを１回行った場合における、デヒドロ酢酸の溶離状況を示したクロマトグラムである。
ａ）ＯＤＳ−Ｔ−１のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
ｂ）ＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
ｃ）ＯＤＳ−Ｔ−２のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
溶離条件は、比較例２に示した。
【図９】 ＯＤＳ−Ｔ−１を第二級シリルアミンでエンドキャッピングした充填剤を使用したオキシン銅の溶離状況を示したクロマトグラム（クロマトグラムは順にウラシル、カフェイン）である。
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図１０】 ＯＤＳ−Ｄ−１を第二級シリルアミンで２回エンドキャッピングした充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験のクロマトグラム（ピークは順にウラシル、オキシン銅、カフェイン）
ｂ）ベンジルアミン試験のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図１１ａ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｂ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Wakosil-Cuカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｃ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Wakopak Navi C18-5カラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｄ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、GL ODS-Cuカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｅ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Capcell Pak UG 120Aカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１２】 ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性の結果を示す。
ａ）ｐＨ２．１の場合
ｂ）ｐＨ３．５の場合
ｃ）ｐＨ４．５の場合
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ａ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ｂ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のスペクトルを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ｃ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ａ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ｂ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ｃ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ａ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ｂ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ｃ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【発明の属する技術の分野】
本発明は、液体クロマトグラフィー用ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
シリカゲルを基材とした液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用充填剤は、高純度シリカゲルを原料とすることで飛躍的な進歩を遂げ、分離選択性の極めて高い固定相が数多く開発・市販されるに至っている。
これらの中でもオクタデシルシリル化（ＯＤＳ）シリカゲル充填剤はＨＰＬＣの発展を支えてきた主役である。しかしながら、この充填剤は、その開発以来の問題点として、シリカゲル由来のシラノールによる不可逆的な二次相互作用を起こすことも周知の事実であり、この不可逆的二次相互作用を解消することを目的にこれまで数多くＯＤＳ化シリカゲル充填剤の不活性化（エンドキャッピング）の技術が開発・報告され、かつ実用化されている。
【０００３】
これまで、報告されてきたエンドキャッピングの代表的な技術をまとめると、１．トルエン還流法
本方法はトルエンを溶媒として使用し、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）およびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を単独もしくは混合液でピリジン（K. Jinno, S. Shimura, N. Tanaka, J. C. Fetze, R. Biggs Chromatographia, 27, 285 (1989)）もしくはジエチルアミン（N. Tanaka, H. Kinoshita, M. Araki, J. Chromatogr., 332, 57(1985)）の存在下、反応する一段階エンドキャッピングの方法である。
【０００４】
２．高温液相法
トルエン還流温度下で一次エンドキャッピングの終了したＯＤＳ化シリカゲル充填剤にＴＭＣＳ及びＨＭＤＳを単独または混合液で加え、さらに高温（230℃〜250℃）でエンドキャッピングをおこなう二段階反応。
密閉系の反応（細田誠、酒井芳博 Chromatography, 17, 39(1996)）、流動パラフィン（酒井芳博、浜川大爾、太田鈴枝 第2回LCテクノプラザ講演要旨集BP2、５１（１９９７））、特開２００２−２２７２１等の方法が存在する。
【０００５】
３．気相方法（特開平４-２２１２０５８号）
ＯＤＳ化シリカゲルを合成した後、これを密閉容器中でシラン化剤と共に加熱反応する方法。一段階もしくは二段階エンドキャップ反応。
【０００６】
４．超臨界法（鎗田孝、井原俊英、堀本能之、野村明 第４回LCテクノプラザ講演要旨集、BP2 ３６（１９９９）、特許第２８１８８５７号）
ＯＤＳ化シリカゲルを合成した後、超臨界流体中でＨＭＤＳ等でエンドキャッピングする一段階エンドキャップ反応。
等があり、この中でエンドキャッピング剤（シラン化剤）の種類、反応条件（雰囲気、温度等）が検討されてきた。
【０００７】
このように、さまざまなエンドキャッピングの技術が開発されているが、前記１．のトルエン還流法は、最も古くから実用化されており、かつ最も一般的なエンドキャッピングの技術である。現在実施されているトルエン還流温度下におけるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成方法（エンドキャッピングを含む）において特徴的なことは、シリル化反応を促進するために使用される塩基がＯＤＳ化及びエンドキャッピング共に同じ化合物が使用されている点にある。すなわち、ＯＤＳ化シリカゲルの合成にジエチルアミン（ＤＥＡ）（第二級アミン）を反応促進剤として使用するとすれば、エンドキャッピングにおいてもＤＥＡが使用されており、ピリジン（第三級アミン）をＯＤＳ化シリカゲルの合成に使用すればエンドキャッピングにもピリジンを使用する方法が採用されていることに特徴がある。しかしながら、本トルエン還流法は、長時間（２４時間以上）の反応を行っても完全エンドキャッピングが困難である点に問題がある。
【０００８】
また、前記２．〜前記４．は前記１．の技術では不完全であるエンドキャッピングをより完全にするために開発された技術であるが、反応の雰囲気（オートクレーブ中、超臨界流体中）等、特殊な条件を必要とするとともに、これらの方法においてもＯＤＳ化シリカゲル充填剤がフルエンドキャッピングされていないため、オキシン銅のような配位性化合物や強塩基性化合物を分析するにはピークテーリングが生じるなど測定結果に再現性がないという問題点があった。
一方で、近年シリカゲルを基材とした液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用充填剤については、測定しようとする対象成分の用途に合わせて分離選択性の極めて高いものが数多く開発・市販されるに至っている。たとえば、ゴルフ場農薬分析用、糖分析用、アミノ酸分析用、光学活性物質分析用などのカラムが市販されている。
その中の一つ、ゴルフ場農薬は公共水域等で監視が必要であり、１９９３年度版（上水試験方法 １９９３年版）上水試験方法においては、オキシン銅などを含む８種類の農薬をＨＰＬＣ法によりＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムで試験する方法が採用されている。
しかしながら、昨年改定された上水試験法の２００１年版（上水試験方法 ２００１年版）では、第一優先に使用されるカラムの充填剤が、ＯＤＳ化シリカゲル系充填剤からポリマー系充填剤へ変更されている。
ポリマー系充填剤の使用が優先される原因として、対象成分の溶離が安定しているためと考えられ、すなわち、ＯＤＳ化シリカゲル系充填剤では、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤のロット間で、残存シラノールによる品質のばらつきが依然存在しているためであると考えられる。
しかしながら、ポリマー系充填剤は価格が高く、カラムの理論段数が低く対象物質の分離が不十分という問題点があった。
【０００９】
したがって、現状の上水試験法においては、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を使用した場合、５０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液（ｐＨ３．５）を溶離液に用いるとともに、再現性を確保することを目的にエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を溶離液に添加することでオキシン銅の溶離を安定化している。
しかし、ＥＤＴＡ−２Ｎａ等の塩基性物質を溶離液に添加することは、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤にダメージを与え、化学的な耐久性を短くすると共に、ＥＤＴＡ−２Ｎａは残存シラノールが多いカラムに入るとなかなかカラム外に排出されにくく、一般の分析を行う際、再現性に問題が発生する可能性が高くなるといった問題点があった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のような問題点を解消し、短時間に簡便にＯＤＳ化シリカゲルをフルエンドキャッピングし、さらに再現性よく、微少量まで対象物質を測定することができるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造方法において、反応条件が穏和で、かつ特殊な装置を必要とせず、短時間にエンドキャッピングをすることにより、残存するシラノールを完全になくし、有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液により洗浄することで、従来困難であった、極めて微少量の配位性化合物や強塩基性化合物を良好なピーク形状で再現性よく測定することを可能とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤の製造法を見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造する方法であって、反応促進剤として２種以上の異なるアミン化合物を用いてエンドキャッピングを行うことを含む、前記方法に関する。
また本発明は、２種以上の異なるアミン化合物が、第二級アミンおよび第三級アミンの組み合わせであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらに本発明は、第二級アミンがジエチルアミンであり、第三級アミンがトリエチルアミンであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらにまた本発明は、エンドキャッピングを２回以上に分けて行うことを特徴とする、前記方法に関する。
【００１２】
本発明は、各エンドキャッピングを、級の異なるアミン化合物を用いて行うことを特徴とする、前記方法に関する。
また本発明は、各エンドキャッピング後、有機溶媒を含む洗浄液により３０〜１１０℃の温度でおよび／または酸を含む洗浄液により洗浄することを特徴とする、前記方法に関する。
また本発明は、１次エンドキャッピング後の洗浄を有機溶媒を含む洗浄液で行い、２次エンドキャッピング後の洗浄を酸を含む洗浄液で行うことを特徴とする、前記方法に関する。
さらに本発明は、有機溶媒が、メタノールであることを特徴とする、前記方法に関する。
さらにまた本発明は、酸が、りん酸であることを特徴とする、前記方法に関する。
【００１３】
本発明によれば、シリル化反応の特異性（E. Colin "Silicon in Organic Synthesis" Buttrworks 1981）およびシリカゲル表面のシラノールの構造を考慮し、エンドキャッピングを異なるアミン化合物（シリル化剤と反応し、シリルアミンとしてシリカゲルに作用する）を用いて行い、有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液により洗浄することで、特殊な条件および装置を用いることなく、従来困難であった完全なフルエンドキャッピングを短時間で簡便に行え、バッチ間でも再現性よく製造することができる。
また、本発明の方法で得られたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、従来ポリマー系充填剤を使用しなければ困難であった極めて微少量の金属配位性化合物および塩基性化合物のいずれの溶離も良好で、再現性よく測定できる。
さらに、本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いればＥＤＴＡ−２Ｎａを含まない溶離液で配位性化合物等を測定することができ、化学的耐久性のあるＨＰＬＣ用充填剤として優れるものである。
また、本発明によればオキシン銅等の配位性の強い化合物に対しても、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤のエンドキャッピングが十分に行われるので、残存シラノールと不可逆的二次相互作用を引き起こすことなく、カラムの材質にかかわらず、再現性よく分析することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるシリカゲルは、化学修飾を高効率に行える５０〜８００ｍ2/ｇの比表面積のものが好適に用いられる。より好ましくは２００〜４００ｍ2/ｇである。さらに、粒子径２〜２００μｍ、より好ましくは２〜１５μｍ、細孔径４０〜１０００Å、より好ましくは４０〜２００Åのものが好適に用いられる。
シリカゲルに化学結合させるＯＤＳ基としては、ジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基、オクタデシル基のようなオクタデシル基を有するものであればいずれも使用することができる。
【００１５】
本発明におけるＯＤＳ化およびエンドキャッピングに反応促進剤として用いられるアミン化合物は、第一級、第二級および第三級のアミンのいずれも用いることができる。第一級アミンは、エチルアミン、ブチルアミン、プロピルアミン等が例示され、第二級アミンは、ジエチルアミン（ＤＥＡ）、ジブチルアミン、ジイソプロピルアミン、モルフォリン、ヘキサメチルジシラザン等が例示され、第三級アミンは、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリブチルアミン、ピリジン等が例示される。常温で液体であり、使い易さの点から、第二級アミンのジエチルアミン、ヘキサメチルジシラザン、第三級アミンのトリエチルアミン、ピリジンが好適に用いられる。さらに組み合わせとしては、ジエチルアミンとトリエチルアミン、ヘキサメチルジシラザンとピリジンが挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＯＤＳ化シリカゲル充填剤のエンドキャッピング方法は、トルエンまたは流動パラフィンなどを溶媒とする公知の方法が用いられる。
ヘキサメチルジシラザンを反応促進剤に使用する場合は、より短時間にエンドキャッピングを行うために、流動パラフィンを溶媒に用いることが望ましい。
エンドキャッピングは、２種以上の異なるアミン化合物を用いて行うのであれば、いずれの方法を用いて行ってもよいが、例えば、同じ反応系でトリメチルクロロシランおよび異なるアミン化合物を連続して加える、または異なるアミン化合物をそれぞれ分けて異なる反応系で行うなどして、２回以上に分けてエンドキャッピングを行うこともできる。それぞれの反応促進剤により行われるエンドキャッピングを完全なものとするためには、異なる反応系で行うことが好ましい。また異なるアミンの組み合わせとしては、級の異なるものが好ましく、さらに第二級および第三級アミン化合物の組み合わせが好ましい。
【００１７】
例えば、ＯＤＳ化にＤＥＡ等の第二級アミンを反応促進剤として使用した場合、エンドキャッピングは反応促進剤としてＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させ、フルエンドキャッピングを行う。３〜４時間の反応時間で金属配位性化合物（酸性条件下でのオキシン銅の溶離等）および強塩基化合物（中性条件下でのベンジルアミンの溶離等）の溶離が良好になり完全疎水化が可能となる。
【００１８】
また、例えば、ＯＤＳ化反応に第三級アミンであるＴＥＡを反応促進剤に使用した場合、エンドキャッピングは反応促進剤としてピリジンやＴＥＡ等の第三級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させた後、さらに級の異なるＤＥＡ、ヘキサメチルジシラザン等の第二級アミンの存在下トリメチルクロロシランを作用させ、フルエンドキャッピングを行う。３〜４時間反応させることで金属配位性化合物および塩基性化合物の溶離が可能となる。
また、本発明によるＯＤＳ化反応には、特開２００２−２２７２１などの公知の方法を用いることができる。
【００１９】
さらに本発明では、エンドキャッピング後、温めた有機溶媒を含む洗浄液でＯＤＳ化シリカゲルを洗浄することが好ましい。再現性良く対象物質を測定するためには、さらに酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
２回以上に分けてエンドキャッピングを行う場合、それぞれの洗浄に有機溶媒を含む洗浄液および酸を含む洗浄液を使用しても、有機溶媒を含む洗浄液または酸を含む洗浄液のいずれかを使用してもよい。この場合、有機溶媒を含む洗浄液および酸を含む洗浄液の使用する順序、回数は問わない。一次エンドキャッピング時に用いるピリジン等の反応促進剤を効率よく除き、二次エンドキャッピング以降のエンドキャッピングを十分進行させるためには、一次エンドキャッピング後に有機溶媒を含む洗浄液で、二次エンドキャッピング後に酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
【００２０】
かかる有機溶媒は、メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などを用いることができる。比較的取り扱い易く、水と混和するメタノールが好適に用いられる。
また、一次エンドキャッピング後のＯＤＳ化シリカゲルが十分洗浄されれば、１種の有機溶媒を用いてもよく、２種以上の有機溶媒を組合せて用いてもよく、２種以上の有機溶媒を混合して用いてもよい。また、水と混和する有機溶媒にあっては、水と組み合わせて用いてもよい。より効率よく洗浄するためには、水および水と混和する有機溶媒を混合して用いることが好ましい。水と混和する有機溶媒にメタノールを用い、メタノール水溶液とした場合、その濃度は、２０〜８０％が好ましく、より好ましくは３０〜７０％、さらに好ましくは４０〜６０％である。
また、ピリジンなどの反応促進剤を効率よく除去するためには、３０〜１１０℃に温めた有機溶媒を用いることが好ましい。温めたメタノール水溶液を用いる場合は、２０〜７０℃が好ましく、５０〜６０℃がより好ましい。温めた有機溶媒を含む洗浄液による洗浄を実施しないと二次エンドキャッピング工程において反応中にＯＤＳ化シリガゲルが褐色に変化する場合があり、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤が得られないことがある。
これは、反応促進剤のアミンが、塩酸塩としてＯＤＳ化シリカゲル表面に残存し、これを除去しないまま２次エンドキャッピングを行うと、温度上昇により、アミンやＯＤＳ化シリカゲルが炭化するためであると思われる。
したがって、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤を得るためには、残存アミンを完全に除去することが必要である。
洗浄時間に特に制限はないが、３０分〜６時間が好ましく、特に好ましくは３〜４時間である。
【００２１】
一次エンドキャッピングでの温めた有機溶媒を含む洗浄液による洗浄後、ＯＤＳ化シリカゲルの洗浄効果を高めるために、さらに再度メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などの有機溶媒で洗浄し、乾燥させることが好ましい。また、乾燥は、二次エンドキャッピングに影響を与えないように１００〜１５０℃で１〜４時間乾燥することが好ましい。
洗浄方法は、ＯＤＳ化シリカゲルを有機溶媒などが入ったビーカーなどの容器に浸漬させて洗浄を行っても、攪拌しながら行なってもよく、また直接有機溶媒などをかけてもよい。
【００２２】
エンドキャッピング後、酸を含む洗浄液で洗浄する場合、その酸は、りん酸、酢酸、塩酸、硫酸、などを用いることができるが、比較的取り扱い易く、カラムの洗浄として一般的に用いられているりん酸または酢酸が好適に用いられる。
これらの酸はＯＤＳ化シリカゲル充填剤の耐久性などに影響を与えなければ１種で用いても、２種以上を組合せても、２種以上混合して用いてもよい。また、これらの酸を水溶液として用いることもできる。効率よく洗浄を行うためには、酸の水溶液を用いることが好ましい。その場合の濃度はＯＤＳ化シリカゲル充填剤の耐久性などに影響を与えなければよく、りん酸水溶液を用いる場合０．５〜５％が好ましく、０．５〜１％がより好ましい。また、酢酸水溶液を用いる場合０．５〜５％が好ましく、０．５〜１％がより好ましい。さらに、酸およびメタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物などの有機溶媒を混合して使用すれば残存する有機物、例えばパラフィンなどを取り除くことができ好適である。
この場合の混合比率は、酸／有機溶媒にりん酸水溶液／メタノールを使用する場合、３０／７０〜７０／３０(ｖｏｌ/ｖｏｌ)が好ましく、４０／６０〜６０／４０(ｖｏｌ/ｖｏｌ)がさらに好ましい。
【００２３】
エンドキャッピングは、塩基性条件下で行われるため、ＯＤＳ化シリカゲル表面は塩基性となっており、このままでは、オキシン銅との相互作用が大きく溶離が不十分となるので、ＯＤＳ化シリカゲル表面を中性にするため、酸を含む洗浄液で洗浄することが好ましい。
したがって、かかる酸を含む洗浄液で洗浄して得た、ＯＤＳ化シリカゲル充填カラムは、試料の分析時にカラム洗浄を行わなくとも簡便に対象物質を再現性よく分析できる。洗浄時間に特に制限はないが、本発明が目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤を得るためには３０分〜６時間が好ましく、特に好ましくは３〜４時間である。
酸を含む洗浄液で洗浄後、ＯＤＳ化シリカゲルの洗浄効果を高めるために、さらに有機溶媒で洗浄し、乾燥させることが好ましい。この場合の有機溶媒は、メタノール、エタノール、変性アルコールなどのアルコール類、ヘキサン、アセトン、酢酸エチルなどの脂肪族有機化合物、トルエンなどの芳香族有機化合物などの有機溶媒を用いることができるが、残存するりん酸などを取り除くためにメタノールが好適に用いられる。そして、エンドキャッピング後のＯＤＳ化シリガゲルを完全に乾燥させるため、１２０℃で２時間乾燥させることが好ましい。
この様にして製造したＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、カラムに充填されＨＰＬＣ測定に用いられる。カラムの材質は、ステンレス性もしくはポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリスチレンなどの樹脂性であってもよい。
【００２４】
本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤で測定できる物質に特に制限はない。例えば、オキシン銅、チウラム、アシュラム、メコプロップ、ベンスリドなどのゴルフ場農薬、アルジカルブ、メチオカルブなどのカーバメート系農薬、ベンジルアミン、プロカインアミドなどの塩基性物質、安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸などの有機酸やそのエステル類、カフェインやフェノールなどの種々の物質が挙げられる。これらの中でも、従来再現性よく分析することが困難であったオキシン銅に特に好ましく適用することができる。
本発明により、不可逆的な二次相互作用を起こす残存シラノ―ルを完全にエンドキャッピングしたＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造することが可能となり、さらに一次エンドキャッピング後の温メタノール水溶液による洗浄と、二次エンドキャッピング後の１％りん酸水溶液／メタノール混合液による洗浄により１ｎｇのオキシン銅を特別な前処理（ＥＤＴＡ−２Ｎａ等の添加等）をすることなく安定して溶離させることが可能となった。
【００２５】
【実施例】
〔実施例１〕エンドキャッピングの効果
（１） ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成
シリカゲルのＯＤＳ化は、シリカゲルの酸洗浄を行った後、それぞれシリル化反応を実施することで合成した。
（１）−１． シリカゲルの洗浄
液体クロマトグラフィー用シリカゲル（粒子径５μｍ、比表面積３５０ｍ2/ｇ、細孔直径１２ｎｍ、細孔容積１．１ｍｌ／ｇ）５０ｇを６ｍｏｌ／ｌ塩酸２００ｍｌ中で５時間加熱還流する。シリカゲルは、ろ過後純水にてろ液が中性になるまで洗浄される。その後、アセトン５０ｍｌにて洗浄し１３０℃で４時間乾燥する。
【００２６】
（１）−２． 第二級アミン（ＤＥＡ）と第三級アミン（ＴＥＡ）の組み合わせによるＯＤＳ化シリカゲル充填剤（ＯＤＳ-ＤＥＡ）の合成
＜ＯＤＳ化＞ 塩酸洗浄したシリカゲル２５ｇを１リットルの丸底四つ口フラスコ中で、乾燥トルエン５００ｍｌに分散させる。その後ジメチルクロロオクタデシルシラン (ＤＭＣＯＤＳ）４５ｇ、ＤＥＡ２５ｇを順次加え約５時間加熱還流する。生成物はろ過した後テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２００ｍｌ・メタノール（ＭｅＯＨ）１００ｍｌで順次洗浄し１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｄ−１とする。
【００２７】
＜一次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｄ−１、２５ｇを乾燥トルエン５００ｍｌに分散させ、トリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）１０ｍｌとＤＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流することで第二級アミンによるシリル化反応を完了させる。生成物はろ過後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ １００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｄ−２とする。
＜二次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｄ−２、２０ｇを乾燥トルエン３００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌとＴＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流しエンドキャッピングを行う。生成物はろ過後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この様にして合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤をＯＤＳ‐ＤＥＡとする。
【００２８】
（１）−３． 第三級アミン（ＴＥＡ）と第二級アミン（ＤＥＡ）の組み合わせによるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成（ＯＤＳ-ＴＥＡ）
＜ＯＤＳ化＞ 塩酸洗浄したシリカゲル２５ｇを１リットルの丸底四つ口フラスコ中で乾燥トルエン５００ｍｌに分散させる。その後ＤＭＣＯＤＳ４５ｇ、ＴＥＡ２５ｇを順次加え約５時間加熱還流する。生成物はろ過した後ＴＨＦ２００ｍｌ・ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｔ−１とする。
【００２９】
＜一次エンドキャッピング＞ 乾燥した充填剤ＯＤＳ−Ｔ−１、２５ｇを乾燥トルエン５００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌと ＴＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流することで第三級アミンによるシリル化を完了させる。生成物はＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この充填剤をＯＤＳ−Ｔ−２とする。
＜二次エンドキャッピング＞ 充填剤ＯＤＳ−Ｔ−２、２０ｇを乾燥トルエン３００ｍｌに分散させ、ＴＭＣＳ１０ｍｌとＤＥＡ２０ｍｌを加え３〜４時間加熱還流する。生成物はろ過した後ＴＨＦ２００ｍｌ、ＭｅＯＨ１００ｍｌで順次洗浄し、１２０℃で４時間乾燥する。この様にして合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤をＯＤＳ‐ＴＥＡとする。
【００３０】
（２）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の評価
合成された各ＯＤＳ化シリカゲル充填剤はスラリー法で内径４．６ｍｍφ、長さ１５０ｍｍのステンレスカラムに充填されエンドキャッピングの評価をおこなった。
エンドキャッピングの評価はオキシン銅（ｐＨ２．１の溶離液）およびベンジルアミン（ｐＨ７．６の溶離液）をＨＰＬＣで測定することにより実施した。
【００３１】
溶離試験条件を下記に示す。
▲１▼オキシン銅溶離試験条件
溶離液 ： ２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸水溶液：アセトニトリル＝９５：５
流 速 ： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
温 度 ： ４０℃
検 出 ： ＵＶ ２５０ｎｍ
試 料 ： ５μｌ（ウラシル；４．５μｇ、オキシン銅；２０μｇ、カフェイン１５０μｇ／ｍｌ）
【００３２】
▲２▼ベンジルアミン溶離試験
ベンジルアミン試験は、田中試験（K. Kimata, K. Iwaguchi, S. Onishi, K. Jinno, R. Eksteen, K. Hosoya, M. Araki, N. Tanaka, J. Chromatogr. Sci., 721, 27, 1989）として知られているイオン交換性シラノールの良否を確認する手法であるが、中性付近のｐＨ（ｐＨ＝７．６）下でベンジルアミンの溶離状況を測定するものである。以下に溶離条件を示す。
溶離液 ： ２０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液：メタノール＝７０：３０
流 速 ： ０．６ｍｌ／ｍｉｎ
温 度 ： ４０℃
検 出 ： ＵＶ ２５４ｎｍ
試 料 ： １０μl（ベンジルアミン０．５９ｍｇ、フェノール０．４１ｍｇ／ｍｌ）
【００３３】
（３）結果及び考察
前記方法に従って合成された２種類の充填剤のオキシン銅およびベンジルアミンの溶離状況を図１（ＯＤＳ‐ＤＥＡ）ａ）、ｂ）および図２（ＯＤＳ‐ＴＥＡ）ａ）、ｂ）に示す。
従来、エンドキャッピングの良否の判定手段としてピリジン／フェノール法が広く使用されてきたが、今回我々はこの方法より更に厳しくエンドキャッピングの良し悪しを確認することができるオキシン銅評価（配位性化合物とシラノールの相互作用を確認する方法）とベンジルアミン評価（イオン交換性シラノールと強塩基性化合物の相互作用を確認する方法）の２種類を採用した。
オキシン銅試験は弱酸性付近で活性化される水素結合性シラノールを確認する試験であり、ベンジルアミン試験は、中性でのイオン交換性シラノールの存在を確認する試験である。
【００３４】
図１ａ）、ｂ）および図２ａ）、ｂ）に示されるように、ＯＤＳ-ＤＥＡ、ＯＤＳ-ＴＥＡ共にオキシン銅およびベンジルアミンは良好なピーク形状で溶離している。特にオキシン銅のピーク対称性はＯＤＳ-ＤＥＡが１．３３、ＯＤＳ-ＴＥＡが１．３０という結果を得た。これはすなわち充填剤との不可逆的な相互作用が小さいことを示しており、良好にエンドキャッピングが進行したことを意味している。
この様に本発明におけるＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成方法により、従来困難であった完全に不活性化されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成が可能となることが判明した。
【００３５】
〔実施例２〕ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成
（１）ＯＤＳ化
６ｍｏｌ／ｌ塩酸で洗浄し乾燥した液体クロマトグラフィー用高純度シリカゲルａ（粒子径 ５μｍ、表面積２７０ｍ２／ｇ、細孔径１３ｎｍ、細孔容積 １．０ｍｌ／ｇ）の５０ｇを乾燥トルエン５００ｍｌ中に分散させる。これにジメチルクロロオクタデシルシラン（ＤＭＣＯＤＳ）９０ｇを加えた後、ジエチルアミン（ＤＥＡ）５０ｍｌを加え約５時間加熱還流する。冷却後、生成物をろ集し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５００ｍｌ、メタノール（ＭｅＯＨ）５００ｍｌ、５０％メタノール水溶液５００ｍｌで洗浄した後、１２０℃で約２時間乾燥する。
これにより、炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルが得られた。
同様にして、高純度シリカゲルｂ（粒子径 ５μｍ、表面積３４０ｍ２/ｇ、細孔径１２ｎｍ、細孔容積１．１ｍｌ／ｇ）も処理し、シリカゲルｂを用いた場合は炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルが得られた。
【００３６】
（２）一次エンドキャッピング
（１）で得られた炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルａ ５０ｇを乾燥トルエン５００ｍｌ中に分散させる。これにトリメチルクロロシラン（ＴＭＣＳ）２０ｍｌとピリジン２５ｍｌを順次加え約５時間加熱還流する。
反応終了後、生成物をろ集し、ＴＨＦ５００ｍｌ、ＭｅＯＨ５００ｍｌ、５０％ＭｅＯＨ水溶液５００ｍｌで順次洗浄し、５０％ＭｅＯＨ水溶液で３〜４時間５０〜６０℃で加熱洗浄する。ろ過後ＭｅＯＨで洗浄し、１２０℃で約２時間乾燥する。
炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルｂ ５０ｇについても、同様に１次エンドキャッピングを行った。
【００３７】
（３）二次エンドキャッピング
炭化水素量１５％のＯＤＳ化シリカゲルａを用いて、（２）で一次エンドキャッピングが終了したＯＤＳ化シリカゲルの２５ｇを流動パラフィン５００ｍｌ中に分散させる。これにＴＭＣＳ５ｍｌとヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）１７ｍｌを加え、約２３０℃の温度で約３時間反応する。
冷却後、生成物をろ集しヘキサン３００ｍｌ、ＴＨＦ３００ｍｌ、ＭｅＯＨ３００ｍｌそして５０％ＭｅＯＨ水溶液３００ｍｌで順次洗浄した後、１％りん酸水溶液／ＭｅＯＨ＝５０／５０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）２５０ｍｌで６０℃２時間洗浄する。更に５０％ＭｅＯＨ水溶液で３〜４時間加熱還流し洗浄する。ろ過後、ＭｅＯＨ３００ｍｌで洗浄した後、１２０℃で２時間乾燥させる。
これにより、本発明の目的とするＯＤＳ化シリカゲル充填剤（以下、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａと略す。）を合成することができた。
炭化水素量２０％のＯＤＳ化シリカゲルｂ ２５ｇについても、同様に２次エンドキャッピングを行い、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤（以下、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂと略す。）を合成することができた。
【００３８】
〔実施例３〕一次エンドキャピング後の洗浄効果
一次エンドキャッピング後の洗浄効果を比較するために、実施例２でシリカゲルｂを用いて合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂと実施例２の（２）において温５０％ＭｅＯＨ水溶液洗浄を行なわない以外は実施例２と同様に操作して得た、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてオキシン銅の分析を行った。
オキシン銅の溶離試験は基本的に上水試験方法１９９３年版のＨＰＬＣ条件に準じて実施したが、溶離液にはＥＤＴＡ−２Ｎａを添加せずに使用した。以下に測定条件を示す。なお、使用したカラムは、本発明による充填剤をスラリー法により長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφのステンレスカラムに充填し、アントラセンをサンプルとして理論段数９０，０００段／ｍｍ以上のカラム性能を示すものを使用した。
オキシン銅のＨＰＬＣによる測定条件（ｐＨは３．５）を以下に示す。
溶離液： ５０ｍｍｏｌ／ｌりん酸カリウム水溶液：アセトニトリル＝６０：４０
検出 ： ＵＶ ２３０ｎｍ
温度 ： ４０℃
流速 ： １ｍｌ／ｍｉｎ
注入量： １μｌ（オキシン銅溶液 １μg／ｍｌ；調製方法は浄水試験法２００１年版に従った）
結果を図３に示す。ａ）は温メタノール洗浄の後二次エンドキャッピングを行った場合、ｂ）は温メタノール洗浄を行わず二次エンドキャッピングを行った場合のＯＤＳ化シリカゲル充填剤を使用したオキシン銅のクロマトグラムである。４分付近のピークがオキシン銅のものであり、図３ａ）、ｂ）より、エンドキャッピング後に温メタノール洗浄を行った場合は、１ｎｇという微小量までのオキシン銅が溶離可能となった。
温メタノール洗浄を行なわず二次エンドキャッピングを行なった場合、１ｎｇという微少量まで、再現性よく溶離をおこなうことはできない。これは、二次エンドキャッピング工程におけるエンドキャッピング時の温度が上昇するにしたがって反応溶液が着色し、すなわち、ＯＤＳ化シリカゲルおよび残存する反応促進剤が炭化するためと考えられる。したがって、１ｎｇという微少量まで分析を行うためには、反応促進剤を十分除去することが必要であり、一次エンドキャピング時の十分な洗浄が必要であることがわかった。
【００３９】
〔実施例４〕二次エンドキャップ後の洗浄効果
二次エンドキャッピング後の洗浄効果を比較するために、実施例２でシリカゲルａを用い合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａと実施例２の（３）において１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行なわない以外は実施例２と同様に操作して得たＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてオキシン銅の分析を行った。
その結果を図４に示す。ａ）が１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行った場合、ｂ）が１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄を行わなかった場合を示しており、３分付近がオキシン銅のピークである。溶離条件および使用カラムは実施例３と同様である（注入量１μｌ）。
図４ｂ）では、１ｎｇオキシン銅は、わずかにピークを確認できるにすぎないが、図４ａ）では１ｎｇの測定においても最初から良好なピーク形状を示すことが明らかとなった。したがって、二次エンドキャッピング後りん酸水溶液／メタノール混合液で十分な洗浄を行うことで、オキシン銅の溶離が改善されることが分かった。
【００４０】
〔実施例５〕実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムを用いたオキシン銅の分析
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａ、ＢおよびＥＤＴＡ−２Ｎａを含まないｐＨ３．５の溶離液を用い、1ｎｇのオキシン銅を測定した。そのクロマトグラムを図５に示す。溶離条件および使用カラムは実施例３記載の条件にしたがい、１μｌ注入した。いずれのＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いてもオキシン銅が良好なピーク形状で溶離することが確認された。
【００４１】
〔実施例６〕樹脂カラム及びステンレスカラムによるオキシン銅の溶出挙動
ピーク樹脂カラムとステンレスカラムを用いた場合のオキシン銅の溶出挙動を比較した。その結果を図６に示す。いずれのカラムについても、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを使用し、溶離条件および使用したカラムは実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
図６に示すとおり、ほとんどその溶出挙動に差異は認められなかった。したがって、オキシン銅の溶出挙動は、本発明のＯＤＳ化シリカゲル充填剤を用いれば、カラムの材質に影響されないことが確認された。
【００４２】
〔実施例７〕検出における再現性の測定
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを実施例３記載の方法により充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものを使用し、上水試験法の溶離液下で１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇのオキシン銅の再現性を測定した。比較試験として、オキシン銅との不可逆的二次相互作用のないポリマー系充填剤を充填したカラム（ゴルフパック：Waters社製）を同様に試験した。その結果を表に示す。変動係数（ＣＶ値）はそれぞれの濃度で５回測定し、その面積値から求めた。溶離条件は実施例３に従った。
【００４３】
【表１】
表に示すように、本発明のオキシン銅分析用カラムは１ｎｇの測定において、その繰り返し再現性を示すピーク面積の変動係数は９％であった。また、オキシン銅の注入量が５ｎｇ、１０ｎｇと増えていくと変動係数が小さくなることも判明した。これら変動係数をポリマー系カラムのそれと比較すると、ほとんど両者に差は見られないことも判明した。
また本発明は、上水試験法で示される２０ｎｇの濃度における面積の変動係数２０％以内を満たしており、さらに環境省令で示される検出限界５ｎｇ を分析した場合、ピーク面積の変動係数５．４６％と良好な値を示している。
【００４５】
〔比較例１〕１種類のアミン化合物を用いてエンドキャッピングを１回実施した場合の塩基性化合物の溶離に与える効果
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成において反応促進剤が果たす役割を解明するために、ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピングした充填剤とＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピングした充填剤を使用しベンジルアミンの溶離状況を評価することでＯＤＳ化およびエンドキャッピングにおける反応促進剤の塩基性化合物の溶離に与える効果を比較した。
【００４６】
この結果を図７ａ）、ｂ）に示す。溶離条件および使用カラムは実施例１と同様である。
図７の結果は、シリル化剤の役割を良く表した結果を示した。８分付近がベンジルアミンのピークであるが、ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤は、ベンジルアミンの溶離において相互作用の強いテーリングピークを示している。しかしながらＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）でエンドキャッピングをした充填剤では、比較的良好なクロマトグラムを見せている。
この結果により、第二級シリルアミンによるエンドキャッピングは、塩基性物質の溶離に効果的であることが示唆された。
【００４７】
〔比較例２〕１種類のアミン化合物を用いてエンドキャッピングを１回実施した場合の金属配位性化合物の溶離に与える効果
ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の合成において反応促進剤が果たす役割を解明するために、ＯＤＳ−Ｔ−１、ＯＤＳ−Ｔ−１にＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理した充填剤、およびＯＤＳ−Ｔ−１にＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理したＯＤＳ−Ｔ−２を使用し、ＯＤＳ化およびエンドキャッピングにおける反応促進剤の金属配位性化合物の溶離に与える効果を比較した。
図８は、金属配位性化合物の溶離の状況を示すが、この場合評価のための試料としてデヒドロ酢酸を使用した。その理由として、本来であればオキシン銅を使用することが最も良策であるがエンドキャッピングが不十分であると図９に示すようにオキシン銅は溶離しないため、比較的溶離しやすいデヒドロ酢酸を選択した。
【００４８】
図８ａ）は、ＯＤＳ−Ｔ−１のクロマトグラム、図８ｂ）は、ＯＤＳ−Ｔ−１にＤＥＡ-ＴＭＣＳ（第二級シリルアミン）で１回エンドキャッピング処理した充填剤（図７ｂ）と同じ）のクロマトグラム、図８ｃ）は、ＯＤＳ−Ｔ−２のクロマトグラムであり、デヒドロ酢酸は、９分付近のピークである。
以下に溶離条件を示す。
溶離条件（ｐＨ＝４．６）
溶離液： ２０ｍｍｏｌ／ｌ酢酸ナトリウム水溶液：アセトニトリル＝２：１
流速 ： ０．５ｍｌ／ｍｉｎ
温度 ： ４０℃
検出 ： ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量： ５μｌ（試料は、ソルビン酸２０ｍｇ、安息香酸２０ｍｇ、デヒドロ酢酸２０ｍｇ／ｌ）
図８ａ）とｂ）を比較すると、未エンドキャッピング品であるＯＤＳ−Ｔ−１も、ＤＥＡ-ＴＭＣＳエンドキャッピング品でもほとんど同じクロマトグラムを示している。特に図８ｂ）に示す充填剤は、図７ｂ）に示したようにベンジルアミンが比較的良好に溶離しているにもかかわらず、デヒドロ酢酸の溶離に問題がある。この結果は、ＯＤＳ化と異なるアミン化合物による第二級シリルアミンを使用し１回のエンドキャッピングを行ってもほとんど金属配位性化合物の溶離に対して効果がないことを示している。しかしながら、図８ｃ）に示すＴＥＡ-ＴＭＣＳ（第三級シリルアミン）で１回エンドキャッピングを実施したＯＤＳ-Ｔ２充填剤においては相互作用することなくデヒドロ酢酸は溶離することが確認された。
この結果により、第三級シリルアミンによるエンドキャッピングは、金属配位性化合物の溶離には効果的であることが示唆された。
【００４９】
〔比較例３〕１種のアミン化合物を使用し、エンドキャッピングを二回実施した場合における溶離状況
図１０は、実施例１におけるＯＤＳ−Ｄ−１を使用し、第二級アミンを反応促進剤として２回エンドキャッピングを実施したＯＤＳ化シリカゲル充填剤の結果を示すａ）はオキシン銅、ｂ）はベンジルアミンのクロマトグラムを示す。溶離条件は、実施例１と同様である。塩基性化合物であるベンジルアミン（６分付近のピーク）は比較的良好に溶離しているが、オキシン銅（５分付近のピーク）は吸着が強くテーリングの激しいクロマトグラムを示している。塩基性化合物の溶離には効果を見せるが、金属配位性化合物の溶離改善には効果が見られていないことを示している。
【００５０】
比較例の結果からもわかるように、２回のエンドキャッピングに同じ反応促進剤を使用する限りにおいて、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤の完全不活性化は困難であることを示している。
以上示してきたように、第二級アミンを反応促進剤に使用して合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、第二級アミンの存在下ＴＭＣＳでエンドキャッピングを行った後、第三級アミンの存在下ＴＭＣＳでさらにエンドキャッピングすることにより、また第三級アミンを反応促進剤に使用して合成されたＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、第三級アミンの存在下ＴＭＣＳでエンドキャッピングを行った後、第二級アミンの存在下ＴＭＣＳでさらにエンドキャッピングすることにより、強塩基性化合物および金属配位性化合物を相互作用なく溶離する完全疎水化が実現できることが明らかとなった。
【００５１】
〔比較例４〕上水試験法に準じたオキシン銅の溶離試験
種々のカラムを用いて上水試験法の方法でＥＤＴＡ−２Ｎａ無添加溶離液を用いてオキシン銅を比較測定した。使用したカラムはＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを実施例３に記載の方法でカラムに充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものおよび比較カラムとして、Wakosil‐Cu、Wakopak Navi C18-5 GT（和光純薬製）、GL ODS-Cu（GLサイエンス社製）、Capcell Pack UG 120（資生堂製）を使用し、カラムサイズは、いずれも長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφのものを使用した。結果を図１１に示す。溶離条件は実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
クロマトグラムは、ａ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラム、ｂ）Wakosil Cu、ｃ）Wakopak Navi C18-5 GT、ｄ）GL ODS-Cu、e）Capcell Pack UG120Aの結果を示しており、保持時間約３〜４分付近のピークがオキシン銅を示している。
ａ）に示すとおり、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムは、良好なピーク形状を示していることがわかるが、その他のカラムは、ｃ）を除けば、不可逆的な二次相互作用が強く、ほとんどピークとして検出することが困難であることを示している。
ｃ）とｄ）は、両カラムともに、上水試験法でカラムを評価しオキシン銅分析用として市場に提供されているカラムであるが、ＥＤＴＡ−２Ｎａを添加しない溶離液の場合、図１１ａ〜ｅに示すように非常に強い二次相互作用を示すことが明らかとなった。
【００５２】
〔比較例５〕オキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性
オキシン銅のＨＰＬＣ分析は、従来ｐＨ２付近の強酸性溶離液を使用することが多くまた、ｐＨを上げると二次相互作用が強くなることが見うけられることから、オキシン銅のＨＰＬＣ測定においては、基本的にいかなるｐＨでもオキシン銅は溶出する必要がある。そこで、オキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性を測定した。
使用したＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを使用し、実施例３に記載の方法でカラムに充填し、理論段数９０，０００段/ｍ以上のカラム性能を示すものを使用した。測定ｐＨは、２．１、３．５、４．５を使用し、溶離液以外のＨＰＬＣ条件実施例３にしたがった（注入量２０μｌ）。
その結果を図１２に示す。
図１２に示すようにＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムは、ｐＨが上昇するに従って溶離時間は遅れていくものの、良好にオキシン銅が溶離することが確認された。
【００５３】
一方、他社のカラムにおいても同様に測定した。その結果を図１３ａから図１５ｃに示す。
ｐＨ２．１の場合は（図１３ａ、図１４ａ、図１５ａ）比較的良好なピーク形状を示しているが、ｐＨが高くなるにしたがってオキシン銅と充填剤の二次相互作用が強くなり、溶出が困難になっていることが明らかとなった。
特に図１５ａ〜ｃのCapcell PakC18UG 120Aは、ｐＨ３．５においては他のカラムに比べ良好なピーク形状を見せているが（図１５ｂ）、ｐＨ４．５になると溶離時間が遅くなるとともに、ピークのテーリングも大きくなり、充填剤とオキシン銅との二次相互作用が顕著に現れている(図１５ｃ）。
この結果は、すなわちCapcell PakC18UG 120Aは、残存シラノールが多い充填剤であると考えられる。
この様に溶離液のｐＨが高くなるとオキシン銅の二次相互作用が強くなる理由は、溶離液のｐＨが高くなると、充填剤表面の残存シラノール基が活性化されることにより、オキシン銅のオキシンと水素結合を生じるためと考えられる。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドキャッピング後に有機溶媒を含む洗浄液および／または酸を含む洗浄液でＯＤＳ化シリカゲルを洗浄することにより、再現性良く、耐久性のあるＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造することが可能となった。また、本発明によるＯＤＳ化シリカゲル充填剤は、低濃度のオキシン銅を精度良く、しかも再現性よく、さらにＥＤＴＡ-２Ｎａを含まない溶離液を用いて分析できることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のエンドキャッピング方法によるＯＤＳ−ＤＥＡ充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験（クロマトグラムは順にウラシル、オキシン銅、カフェインを示す。）
ｂ）ベンジルアミン試験（クロマトグラムは順にベンジルアミン、フェノールを示す。）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図２】 本発明のエンドキャッピング方法によるＯＤＳ−ＴＥＡ充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験のクロマトグラム（クロマトグラムは順にウラシル、オキシン銅、カフェインを示す。）
ｂ）ベンジルアミン試験のクロマトグラム（クロマトグラムは順にベンジルアミン、フェノールを示す。）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図３】 一次エンドキャッピング後の温メタノール洗浄の効果を示す。
ａ）温メタノールで洗浄した場合のクロマトグラム
ｂ）温メタノールで洗浄をしなかった場合のクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示した。４分付近のピークがオキシン銅である。
【図４】 二次エンドキャッピング後の１％りん酸水溶液／メタノール混合液による洗浄効果を示す。
ａ）１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄した場合のクロマトグラム
ｂ）１％りん酸水溶液／メタノール混合液で洗浄しなかった場合のクロマト グラム
溶離条件は実施例３に示した。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図５】 実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤を充填したカラムによるオキシン銅の溶離の結果を示す。
ａ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを用いた場合のクロマトグラム
ｂ）ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ｂを用いた場合のクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示す。注入量は１μｌで行なった。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図６】 ピーク樹脂カラムとステンレスカラムの比較を示す。
ａ）ピーク樹脂カラムのクロマトグラム
ｂ）ステンレスカラムのクロマトグラム
溶離条件は実施例３に示した。３分付近のピークがオキシン銅である。
【図７】 １種の反応促進剤を使用してエンドキャッピングを１回行った場合における、ベンジルアミンの溶離状況を示したクロマトグラムである。
ａ）ＯＤＳ−Ｄ−１をＴＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
ｂ）ＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図８】 １種の反応促進剤を使用してエンドキャッピングを１回行った場合における、デヒドロ酢酸の溶離状況を示したクロマトグラムである。
ａ）ＯＤＳ−Ｔ−１のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
ｂ）ＯＤＳ−Ｔ−１をＤＥＡ-ＴＭＣＳでエンドキャッピングした充填剤のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
ｃ）ＯＤＳ−Ｔ−２のクロマトグラム（ピークは順に安息香酸、ソルビン酸、デヒドロ酢酸）
溶離条件は、比較例２に示した。
【図９】 ＯＤＳ−Ｔ−１を第二級シリルアミンでエンドキャッピングした充填剤を使用したオキシン銅の溶離状況を示したクロマトグラム（クロマトグラムは順にウラシル、カフェイン）である。
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図１０】 ＯＤＳ−Ｄ−１を第二級シリルアミンで２回エンドキャッピングした充填剤の評価結果を示す。
ａ）オキシン銅試験のクロマトグラム（ピークは順にウラシル、オキシン銅、カフェイン）
ｂ）ベンジルアミン試験のクロマトグラム（ピークは順にベンジルアミン、フェノール）
溶離条件は、実施例１（２）に示した。
【図１１ａ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、実施例２で合成したＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｂ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Wakosil-Cuカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｃ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Wakopak Navi C18-5カラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｄ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、GL ODS-Cuカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１１ｅ】 上水試験法の溶離液ｐＨ３．５（ＥＤＴＡ−２Ｎａ無）を用い、Capcell Pak UG 120Aカラムを使用した場合のオキシン銅（２０ｎｇ）の溶離挙動を示す。
溶離条件は、実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１２】 ＯＤＳ化シリカゲル充填剤Ａを充填したカラムによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ依存性の結果を示す。
ａ）ｐＨ２．１の場合
ｂ）ｐＨ３．５の場合
ｃ）ｐＨ４．５の場合
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ａ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ｂ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のスペクトルを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１３ｃ】 Wakosil Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。４〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ａ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ｂ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１４ｃ】 GL ODS-Cuによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜５分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ａ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ２．１の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ｂ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ３．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
【図１５ｃ】 Capcell Pak C18UG 120Aによるオキシン銅の溶離におけるｐＨ４．５の場合のクロマトグラムを示す。
溶離条件は実施例３に示した。３〜４分付近のピークがオキシン銅である。
Claims (8)
- ＯＤＳ化シリカゲル充填剤を製造する方法であって、反応促進剤として２種以上の異なるアミン化合物を用いるエンドキャッピングを行うことを含み、エンドキャッピングは２回以上に分けて行われ、アミン化合物として各エンドキャッピングにおいて相互に異なるものが用いられる、前記方法。
前記方法。 - ２種以上の異なるアミン化合物が、第二級アミンおよび第三級アミンの組み合わせであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 第二級アミンがジエチルアミンであり、第三級アミンがトリエチルアミンであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- 各エンドキャッピングを、級の異なるアミン化合物を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 各エンドキャッピング後、有機溶媒を含む洗浄液により３０〜１１０℃の温度でおよび／または酸を含む洗浄液により洗浄することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- １次エンドキャッピング後の洗浄を有機溶媒を含む洗浄液で行い、２次エンドキャッピング後の洗浄を酸を含む洗浄液で行うことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 有機溶媒が、メタノールであることを特徴とする、請求項５また６に記載の方法。
- 酸が、りん酸であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
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