CN102439128A - 用于纯化生物物质的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统和方法。所述流体样品纯化系统具有壳体，所述壳体具有远端和适于流体通过的远端开口及近端和适于流体通过的近端开口。远端保持器位于所述壳体内并在所述远端开口上方。近端保持器位于所述壳体内所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、或在所述近端开口上。所述系统还包含吸附材料，例如官能化颗粒，所述吸附材料在所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端保持器之间。所述吸附材料吸附不期望的物质，而同时拒绝期望的物质。还提供了用于使用所述流体样品纯化系统分离目标分子的方法。

Description

用于纯化生物物质的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年2月14日提交的名称为“Devices for Purifying Biological Materials”的共同未决美国临时专利申请序列号61/152,680和2009年12月28日提交的名称为“System and Methods for Purifying Biological Materials”的共同未决美国临时专利申请序列号61/290,333的优先权和利益，所述两件临时专利申请均为Jeffrey L.Helfer和Rhiannon R.Gaborski所提出，且其各自通过引用全文并入本文中。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明在来自美国国家卫生研究院的政府支持下进行，STTR批准号为R41RR024968-01和2R42RR024968-02。政府对本发明享有一定权利。
技术领域
本发明涉及用于纯化流体的系统和方法。本发明还涉及用于分离目标分子与不期望的物质的系统和方法。
背景技术
已知各个核酸(“NA”)序列(例如DNA序列)中的差异决定着疾病的存在、未来身体状况的倾向、及对特定治疗处理的可能响应。因此，NA的分析正在快速增长。例如，DNA序列分析和其他类型的DNA分析通常使用DNA扩增法进行，最常用的是聚合酶链反应(“PCR”)，所述DNA扩增法用来增加样品中所需基因序列或“靶物”的量。例如，有效的DNA测序需要从PCR扩增混合物中纯化特定的DNA靶物，因为未能移除杂质如DNA扩增过程中引入的过量引物和核苷酸(“dNTP”)可能干扰测序化学并可能导致不准确的结果。PCR扩增DNA的纯化在许多其他应用中也是需要的，例如微阵列分析和克隆。
2.1核酸的纯化
用于核酸纯化的现有产品通常使用两种不同的纯化技术：酶消化和总核酸(例如DNA)吸附，其各具有严重的缺点。酶消化法涉及加入酶以化学地降解杂质。该方法使用多步程序，需要在两个温度下孵育样品约30分钟或更久以产生适于分析的样品。但由于酶法不移除杂质，而是使其失活，故溶液中失活的杂质的存在将干扰后续的核酸定量方法，即杂质仍将影响常用来量化核酸靶物浓度的UV吸收法。因此，经酶法纯化的靶核酸(例如DNA、RNA、质粒等)的定量局限于技术如凝胶电泳，凝胶电泳最多不过是半定量的。
现有的总吸附法从使杂质以及靶DNA保留在吸附表面如膜或磁性珠子上开始，该方法需要多个复杂、耗时且昂贵的化学-机械过程来纯化和释放所需的靶核酸。后一纯化方法常被称为结合-洗涤-洗脱法。
现有的核酸纯化产品常受到使用者的批评，因为在产品中留下太多杂质并因此导致较差的试验结果；成本高(纯化试剂盒购买价格和最终用户劳力两方面)；且缓慢并需要大量“动手做的”时间(每个样品10-20分钟或更多)。特别地，总吸附法需要多个步骤以例如固定所有核酸扩增反应组分和选择性地洗脱(提取)所需的核酸靶物。这些产品的劳力密集性使得实际纯化成本远高于净化单个核酸样品目前所需的$1-$2(USD)的一次性成本并提供了其时操作者出错可能不利地影响纯化过程的许多机会。许多现有核酸纯化产品的使用还涉及溶剂的加入，如果溶剂没有有效地移除，则其可能阻碍核酸分析。
从样品纯化过程回收高百分率的流体样品也非常重要，特别是当只可得到小体积的样品时。许多现有的样品纯化过程常常保留高百分率的流体样品，这部分归因于多个纯化工艺步骤的使用，其各可能损失一小部分样品。保持高度的流体样品回收率是任何样品纯化过程的一个重要要求。
现有的纯化产品通常以“试剂盒”出售，其通常含制造商的材料，例如具有吸附膜的旋转柱和特殊试剂。最终用户通常提供流体处理耗材(例如移液器吸头)和常用的试剂。
2.2功能性移液器吸头
涉及流体的化学反应和分析常在反应或分析过程中使用移液器吸头来操纵流体。为帮助提高相关工作流的效率和降低相关工作流的成本，制造商常将反应或分析的元件整合在移液器吸头自身中-这通常被称为“功能性”移液器吸头。这些化学反应和分析常包括在移液器吸头内使用经特殊处理的颗粒以改善样品和所述颗粒所提供的化学间的相互作用。
用远端和近端布置的颗粒保持器约束颗粒常产生移液器吸头性能问题。一个这样的问题是由于过滤器所产生的流动阻力而减少流体抽吸和分配次数。另一问题在于保持器保留样品流体的倾向，从而减少样品收率。又一问题在于过滤器内孔隙尺寸的可变性，无论过滤器由陶瓷还是聚合物熔合物还是易碎膜组成。现有过滤器设计的再一问题是在多个移液器吸头中的过滤器上流体流动阻力不一致。现有过滤器设计的再一问题是成本高。
目前有若干市售的功能性移液器吸头。一个实例为Thermo FisherScientifics AspireTM移液器吸头(与Colpan等的名称为“Process andDevice for Separating and Cleaning Molecules”的WO88/09201中所公开的吸头相似)。该设计有着相当多的性能缺点。一个缺点是样品处理时间长。根本原因包括由于使用了高阻力过滤器以及使用了第二过滤器来在使用之前和过程中容留吸附介质故流体流率低、疏水性的吸附介质需要预先润湿、反应室夹带空气、和过滤器被所需的较大体积吸附介质所堵塞。
另一缺点是可靠性差。根本因素包括反应室内夹带空气的可能。
另一缺点是固有的较高的产品制造成本。
根本因素包括第二过滤器及所需较大体积吸附介质的使用，其还增加被保留的样品流体和增高移液器吸头制造成本。
功能性移液器吸头的另一实例为Millipore的Zip-TipTM(本领域中已知的相似吸头，参见例如Kopaciewicz等的名称为“Cast MembraneStructures for Sample Preparation”的美国专利No.6,048,457中所公开的吸头)。该设计也有着相当多的性能缺点，包括样品处理时间长。根本原因包括用来容留吸附材料的多孔基体所致的高流体流动阻力。
另一缺点是吸附表面积有限。根本原因包括可被固定在所用多孔基体内的吸附材料(例如颗粒)的数量有限以及当吸附材料与表面结合时发生的吸附材料表面积的减小(例如裸露的颗粒表面积的减小)。
另一缺点是靶物质的收率差的可能。多孔基体相对于例如固定在基体内的吸附颗粒的表面积而言的大表面积可与样品相互作用并移除靶物质，从而降低靶物收率。
又一缺点是大量的样品流体可能保留在用来容留吸附材料的多孔基体中。
因此本领域中需要一种靶物收率高、可靠性高、样品处理时间短、吸附能力大、样品体积回收率高且制造成本低的流体样品纯化系统。
部分2中或本申请的任何其他部分中任何参考文献的引用或提及均不应视为承认这样的参考文献可用以作为本发明的现有技术。
发明内容
本发明提供了一种快速、用户友好且不需要添加或后续移除分析物、试剂、或反应产物的流体样品纯化系统和方法。所述流体样品纯化系统和方法将减少出错的可能并产生花1分钟或以下而移除超过95％的杂质(即引物和未整合的核苷酸)的用户友好过程，同时留下充足的靶生物分子供后续分析用。用于分析的靶生物分子包括但不限于单链核酸如RNA或PCR引物、双链核酸如DNA(例如基因组DNA、质粒DNA)或PCR引物二聚体、核苷酸如核糖核苷酸、酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶、带标记的探针、限制酶或逆转录酶、染料如嵌入剂、水、重金属、毒素如带在血液里的毒素(例如尿素或肌酸酐)、血液组分包括代谢物、电解质、激素或药物、和抗体或抗原。
在一个实施方案中，提供了一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统。所述流体样品纯化系统可包括具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；和吸附材料，例如多个官能化颗粒。
所述流体样品纯化系统还可包括近端保持器，其中所述近端保持器位于所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者其中所述近端保持器与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口。
所述流体样品纯化系统还可包括壳体和吸附材料，但不包括远端或近端保持器。
在一个实施方案中，所述壳体为移液器吸头。在另一实施方案中，所述壳体为柱，例如毛细管、旋转柱或多孔微量滴定板。在另一实施方案中，所述系统可包括多个壳体。
在另一实施方案中，所述吸附材料为多个官能化颗粒，其中所述多个官能化颗粒位于所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端保持器之间。
在另一实施方案中，所述多个官能化颗粒将吸附不期望的物质、不为目标分析物的物质、或待与目标分子分离的物质。
在另一实施方案中，所述多个官能化颗粒为不同地官能化的颗粒，即所述多个颗粒可包含两种或更多种类型的官能化颗粒。
在另一实施方案中，所述吸附材料被施加或涂布在所述壳体的内部上。
在另一实施方案中，松散地容留的吸附材料(例如颗粒)容留在所述移液器吸头或柱内。另一实施方案中使用紧密堆积或被约束的吸附材料。在另一实施方案中，吸附材料被固定在流体可接触表面上或位于流体可接触表面中或上的纳米孔隙或其他部件中。
在另一实施方案中，所述流体样品纯化系统在所述壳体内含有吸附材料，其中所述吸附材料被固定在颗粒上或位于所述颗粒中或上的纳米孔隙或其他部件中。
在另一实施方案中，所述吸附材料是多孔的。在一个特定的实施方案中，所述官能化颗粒是多孔的，从而提供具有有效地清除较大量杂质的能力的较大吸附表面积，同时足够小以使被保留的流体样品的体积最小化，同时还足够大以使过滤器或保持器的堵塞最小化。在一个实施方案中，所述多孔颗粒显著提高(即10-20倍)吸附能力。
在另一实施方案中，所述吸附材料或所述多个官能化颗粒拒绝(或排除)目标分子。在另一实施方案中，流体样品中不期望的物质被吸附而同时流体样品中目标分子或期望的物质被排斥或拒绝。
在另一实施方案中，所述远端保持器和近端保持器间隔足够远以在所述多个官能化颗粒的存在下形成空隙，且其中所述空隙被制成一定尺寸，以使得官能化颗粒可在所述空隙内自由行进，从而当流体样品在空隙中时可允许官能化颗粒与流体样品间的充分混合。
在另一实施方案中，所述远端保持器和近端保持器间隔足够近以将所述多个官能化颗粒约束为紧密堆积构型，从而在所述多个官能化颗粒的成员间几乎不形成空隙或不形成空隙。
在另一实施方案中，所述系统包括与远端保持器连接的流体流动导管。流体流动导管可在壳体的内表面和插件上或壳体的内表面和插件中轴向延伸。在一个特定的实施方案中，轴向延伸的流体流动导管和插件形成远端保持器。
在另一实施方案中，轴向延伸的流体流动导管由壳体和插件间的空间形成。
在另一实施方案中，流动导管的宽度选择为使流体流动阻力最小化。
在另一实施方案中，插件由插件定位翼片定位在壳体内，从而形成轴向延伸的流体流动导管，其中所述轴向延伸的流体流动导管和所述插件形成远端保持器。
在另一实施方案中，轴向延伸的流体流动导管定位在壳体的内壁中，其中所述流动导管的宽度选择为使流体流动阻力最小化。
在另一实施方案中，轴向延伸的流体流动导管为在远端和远端保持器间产生的半球形导管，所述导管为流体流动提供大通流面积和低阻力。
在另一实施方案中，轴向延伸的流体流动导管产生的流体流动阻力小于相等厚度的多孔材料所产生的流体流动阻力且流动限制器的厚度被最小化。
在另一实施方案中，各个导管的长度小于导管的直径，且其中导管的长度为远端保持器的尺寸的10％至50％。
在另一实施方案中，远端保持器具有：
a.足够小的孔隙尺寸或流体流动导管以保留所述多个官能化颗粒，和
b.在所需的施加压力下足够高的流体样品流率以避免损伤目标分子。
在另一实施方案中，壳体内的吸附材料在单个步骤中吸附不期望的物质(例如未整合的核酸扩增引物和核苷酸)而同时拒绝期望的物质(例如PCR扩增子)。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统优先吸附(或结合)或拒绝不同类型的目标分子，例如生物分子如单链核酸如RNA或PCR引物、双链核酸如DNA(例如基因组DNA、质粒DNA)或PCR引物二聚体、核苷酸如核糖核苷酸、酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶、带标记的探针、限制酶或逆转录酶、染料如嵌入剂、水、重金属、毒素如带在血液里的毒素(例如尿素或肌酸酐)、血液组分包括代谢物、电解质、激素或药物、和抗体或抗原。
在一个实施方案中，流体样品纯化系统包含的官能化颗粒尺寸足够小以避免在溶液中快速沉降，而同时足够大以便能使用高流率过滤器并避免在产品制造过程中悬浮在空气中(即“成尘”)。
在另一实施方案中，远端或近端保持器可包含选自如下的材料：多孔聚合物或陶瓷基体；经穿孔的聚合物、陶瓷或金属(例如实心保持器或“塞”)；多孔聚合物、玻璃或金属织物；和羊毛形式的多孔聚合物、玻璃、或金属长丝。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统可包括这样的远端保持器，其流动导管或流动通道尺寸将有效保留上述优化的颗粒尺寸而同时在可得到的施加压力下允许高流体样品流率并避免损伤靶物质(例如ds-DNA)。
在一个实施方案中，远端保持器为过滤器，过滤器孔隙尺寸为10-40μm。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统可包括这样的远端保持器(例如过滤器)，其尺寸足够大以提供低施加压力下一致的流体流动阻力，即吸头到吸头的阻力变化小，而同时尺寸足够小以使被保留的样品的体积最小化并通过更靠近壳体的远端(例如移液器吸头吸嘴)布置而使壳体内的样品死体积最小化。在一个实施方案中，保持器(或过滤器)的物理尺寸为直径1.0至2.0mm。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统可包括这样的远端保持器，其含有易于润湿的(例如亲水性的)材料(或经用这样的材料处理)，所述材料实现低的流体侵入压力(即最小化使流体开始流过保持器所需的压力)和低的流体挤出压力(即最小化使流体从保持器出来所需的压力)而不吸附靶物。
在另一实施方案中，吸附材料(例如多孔的官能化颗粒)经处理以提高可润湿性。
在另一实施方案中，吸附材料为多孔的可分解材料。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统包括这样的远端保持器，其使用的孔隙尺寸可实现低的流体侵入和挤出压力而不通过官能化颗粒。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统包括这样的远端保持器材料，其既提供高结构强度又满足使用者要求如较大的孔隙尺寸和高流率、尺寸、及化学特性。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统包括这样的移液器吸头，其整合颗粒与保持器(或过滤器)而同时使样品死体积、内部空气总体积和DNA吸附最小化。
在另一实施方案中，近端保持器为近端过滤器。
在另一实施方案中，近端保持器为可刺穿的箔密封件或帽。
在另一实施方案中，不期望的物质比目标分子优先地与官能化颗粒结合。
在另一实施方案中，优先吸附基于的是尺寸、疏水性、电荷或亲和性。
在另一实施方案中，靶物质可以是期望的或不期望的物质，例如单链核酸、双链核酸、基因组DNA、质粒DNA、PCR引物二聚体、核苷酸、核糖核苷酸、带标记的探针、酶、染料、嵌入剂、水、重金属、毒素、代谢物、电解质、激素、药物、抗体或抗原。
在另一实施方案中，壳体为包含玻璃或廉价或日用塑料的移液器吸头或柱。在另一实施方案中，廉价或日用塑料为聚烯烃材料。在另一实施方案中，聚烯烃材料为聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、或聚苯乙烯。
在另一实施方案中，所述系统是一次性的。
在另一实施方案中，官能化颗粒的尺寸足够小以避免在溶液中快速沉降。
在另一实施方案中，官能化颗粒的尺寸足够大以便能使用高流率过滤器作为远端保持器并避免官能化颗粒在产品制造过程中悬浮在空气中。
在另一实施方案中，远端保持器具有足够小的孔隙尺寸以保留所述多个官能化颗粒，而同时足够大以实现在所需的施加压力下高的流体样品流率并避免损伤目标分子。
在另一实施方案中，远端保持器具有足够的尺寸以提供在所需的低施加压力下低的吸头到吸头流体流动阻力变化、使被保留的样品的体积最小化、和移液器吸头内的样品死体积最小化。
在另一实施方案中，远端保持器具有足够大的孔隙尺寸以实现低的流体侵入和挤出压力以及足够小的孔隙尺寸以防止官能化颗粒通过。
在另一实施方案中，内部空气总体积低于约200μl。
在另一实施方案中，内部空气总体积不超过样品体积的8-10倍。
在另一实施方案中，所述系统在壳体内包括反应室，反应室位于远端保持器和近端保持器之间的空间中。
还提供了用于使用流体样品纯化系统分离目标分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测分离出的目标分子。
在一个实施方案中，所述方法可包括：
a.提供待试验目标分子的存在的流体样品；
b.提供本发明的流体样品纯化系统；
c.将所述流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
d.使所述多个官能化颗粒或吸附材料与所述流体样品接触；和
e.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品，从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
所述方法可还包括从排出的流体样品回收目标分子的步骤。
在一个特定的实施方案中，提供了一种用于分离目标分子的方法，所述方法包括下述步骤：
a.提供流体样品纯化系统，其中所述系统包括：
i.具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；
ii.在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；
iii.近端保持器，其中所述近端保持器位于所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口；和
iv.多个官能化颗粒，其中：
所述多个官能化颗粒位于所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端保持器之间，
所述多个官能化颗粒吸附不期望的物质，且所述多个官能化颗粒为不同地官能化的颗粒；
b.将流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
c.使所述多个官能化颗粒与所述流体样品接触；和
d.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品；
从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
在一个实施方案中，获得的目标分子的收率至少为70％。
在另一实施方案中，获得的目标分子的收率至少为95％。
附图说明
本文中参考附图1-48来描述流体样品纯化系统，在附图中，相似的标号在整个若干视图中代表相似的元件。应理解，在一些情况下，本发明的各种方面可能被夸大或放大地示出以便于理解本发明。
图1：表格，示出了流体样品纯化系统的特定子系统部件与性能好处间的关系。
图2：现有技术移液器吸头的横截面示意图。
图3：其中纯化DNA的流体样品纯化系统和方法的一个实施方案的示意图。左侧略图描绘PCR溶液中靶DNA(“蓝色符号”)、未扩增的PCR引物(“黑色符号”)和未整合的核苷酸(“绿色圆点”)向含吸附颗粒的室中的抽吸。右手侧略图中的排出溶液含靶DNA而无杂质(例如引物和核苷酸)。
图4：用本发明的系统纯化流体样品时来自原液的扩增子(1956bp)、“引物二聚体”(ds 7bp)、单链物(ss 20bp)和dNTPs的保留。每组4个结果条带(％DNA剩余)的顺序为B(蓝)、R(红)、G(绿)、P(紫)。X轴上列出的每组记录均重复此“BRGP”顺序。
图5a-b。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案。(a)其中珠子直径大于移液器吸头的远端(吸嘴端)的实施方案。(b)其中吸头具有肋和塞作为抗堵塞部件以“设计”或引导流体样品在吸头壳体中的流动的实施方案。
图6a-b。“移液器吸头形式”(即包括为移液器吸头的壳体)的流体样品纯化系统的一个实施方案。
图7a。包括为移液器吸头的壳体和可刺穿的密封件或帽的流体样品纯化系统的一个实施方案。该特定的实施方案在密封件中具有预先形成的穿孔。
图7b。包括为移液器吸头的壳体和可拆卸的帽的流体样品纯化系统的一个实施方案。
图8。对单一溶液进行的PCR纯化，以比较现有技术(“竞争者Q”、“竞争者I”)纯化产品的性能与本发明的移液器吸头(“Diffinity吸头”)形式和柱(“Diffinity管”)形式的流体样品纯化系统的实施方案的性能。
图9。PCR原液自经纯化的PCR扩增子和杂质(462ng/μl dNTP、2.4ng/μl引物)制备。然后用现有技术产品(Q、I、和E)或用流体样品纯化系统的一个实施方案(功能性吸头或旋转柱)使该原液经受PCR纯化。
图10。Sanger测序是经纯化的PCR溶液的一种定量功能试验。用若干竞争者的产品(Q、I、和E)以及用Diffinity吸头和旋转柱按制造商的说明纯化未经纯化的模拟PCR溶液。左：序列质量的两个定量量度，上面画出了连续读长(CRL)和质量值(QV20)，各栏代表两个相同的独立序列反应的平均值。较长、较高质量的读长具有较高的值，而未经纯化的样品用作阴性对照并具有较低的值。右：来自已有序列的中间区域的序列色谱图可见地示出了未经纯化的和大多数经纯化的样品间峰质量的改进，如改进的信噪比所显示的。这些结果代表了在超过5个类似实验中所观察到的那些。
图11。用对照系统和本发明的流体样品纯化系统的一个实施方案纯化后的序列比较。在5个位点处独立地进行β测试以比较移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案(“Diffinity功能性PCR纯化吸头”)与各个测试实验室目前所使用的方法。将PCR样品分成与对照(80.92+/-6.59％)或Diffinity(80.99+/-6.51％)PCR纯化系统一起使用。测序后将连续读长(CRL)归一化为预期读长的百分数并对各组进行平均。所示为30个试验的平均值，加了标准误差棒。
图12a-c。随着其抽吸和分配水，市售Thermo Fisher ScientificAspireTM移液器吸头(“现有技术吸头”)内典型的样品抽吸和分配压力。
图13a-c。随着其抽吸和分配水，本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头内典型的样品抽吸和分配压力。
图14。其中壳体为一个或多个流体管道(例如柱或毛细管：毛细管#1、毛细管#1+M(整数)、毛细管#N(整数)等)的流体样品纯化系统实施方案。A-A截面图示出了多个嵌套的流体管道的横截面。毛细管半径r在远端右下角示出。
图15a。流体样品纯化系统的一个实施方案中使用的非圆形载体的示意图。在此特定的实施例中，壳体为移液器吸头且载体的宽度(示为“最小载体宽度”)宽于移液器孔口的直径。
图15b。其中球形颗粒由非圆形(椭圆形)移液器吸嘴保留的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图。在此特定的实施方案中，颗粒的最小直径大于椭圆形吸嘴的短轴的最大长度。
图16。用Bird、Stewart和Lightfoot(1960，Transport Phenomena，JohnWiley & Sons，ISBN 047107392X)所描述的方法计算预计的颗粒沉降时间。
图17a-d。从移液器吸头抽吸和分配流体的周期时间，该吸头装载了2.5或10.0毫克具有疏水表面的未经官能化颗粒。然后从吸头抽吸和分配流体。
图18a-d。示出在移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案中在样品分配周期过程中压紧在远端保持器(过滤器)的表面上的颗粒的结果的实验。尺寸小于53μm、为53-74μm、为74-100μm和为105-149μm的颗粒分别产生了3.4KPa、3.1KPa、3.0KPa和2.5KPa的最大分配压力。
图19。包括远端和近端保持器以保留颗粒、珠子或其他吸附材料的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图。该示意图中示出了近端保持器和远端保持器。(a)为移液器吸头的放大视图，示意了远端保持器。
图20a。包括远端和近端保持器以保留颗粒、珠子或其他吸附材料的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图。该示意图中示出了近端多孔基体保持器和远端多孔基体保持器。左侧为移液器吸头的放大视图，示出了远端保持器。
图20b。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图，示出了使用与壳体成一体的保持元件(肋)来保持远端保持器。
图20c。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图，示出了使用与壳体成一体的保持元件(折翼)来保持远端保持器。
图20d。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的示意图，示出了颗粒空隙体积与移液器吸头自由体积的关系，其中自由体积≥颗粒空隙体积。
图21。包括与壳体成一体的保持元件(肋)来保持内部过滤器的流体样品纯化系统的一个实施方案。
图22。包括远端保持器(过滤器)保持元件(肋)的流体样品纯化系统的另一实施方案。
图23。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案。保持器可用内部凸起的元件如倒钩固定就位于壳体内，所述内部凸起的元件利用机械干预来固定保持器。
图24。其中使用过滤材料(如陶瓷)提供可靠地维持孔隙尺寸所需的结构强度的流体样品纯化系统的一个实施方案。该图示出了加在过滤器上的强力和因此对高过滤器结构强度的需要。
图25。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案。移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头‘A’内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过由移液器吸头‘A’与插件‘B’间的空间所形成的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由插件‘B’中的凹进精确确定，例如由在移液器吸头注塑过程中精确地形成所述件的该特征的注模精确确定。流动导管‘D’的宽度‘E’选择为使流体流动阻力最小化，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
图26。移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案。移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。与图25中所示的流体样品纯化系统的实施方案不同，流动导管在移液器吸头‘A’的内壁中产生。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过形成进移液器吸头‘A’的壁中的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由在移液器吸头注塑过程中精确地形成移液器吸头‘A’的内表面的移液器吸头注模的“芯”精确确定。同前面一样，流动导管‘D’的宽度‘E’选择为使流体流动阻力最小化，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
图27。由于过滤器孔隙尺寸小而无DNA损伤。经用移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案(“Diffinity RapidTip”实施方案)处理的DNA在15或30个抽吸-分配周期后没有剪切损伤的迹象。
图28a-f。包含各种形式的颗粒或珠子的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案的示意图。(a)珠子大包装。(b)珠子小包装。(c)单个(大)珠子体。(d)多个(小)珠子体。(e)含多种吸附剂的多个(小)珠子体，每个珠子体一种吸附剂。(f)多个(小)珠子体，每个珠子体上多种吸附剂。
图29。其中在壳体(即移液器吸头)的内表面上施加或涂布了吸附剂的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案。
图30。其中向压缩薄膜中或长丝中引入了吸附剂并插入壳体内的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案。
图31。其中加入了一个或多个部件以增强壳体(移液器吸头)的内部润湿表面积的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案。吸附材料或吸附剂附着于在移液器吸头内用来增大可润湿表面积的多个部件上，例如多个内部轴向延伸的肋，例如该图中所示的那些。A-A截面图为所述部件的横截面视图，在该实施方案中，其为表面积增强肋。
图32。容纳了具有较大横截面积并因此具有较低流体流动阻力、同时使样品死体积最小化的过滤器的流体样品纯化系统的一个实施方案。所述移液器吸头在移液器吸嘴处具有小膛径且移液器吸头的内径快速增大以容纳较大的过滤器。
图33。包括容器并在样品溶液中包含吸附材料或吸附剂的流体样品纯化系统的实施方案。根据该实施方案，吸附材料或吸附剂被置于珠子或颗粒上，所述珠子或颗粒或被加到含待纯化的样品的容器如试管或PCR反应容器中，或在加入样品流体之前即已含在容器中，由此，吸附材料或吸附剂可附着于待从溶液中移除的物质。
图34。其中吸附材料或吸附剂附着于置于壳体(例如移液器吸头)内的膜的表面的流体样品纯化系统的实施方案。优选所述膜卷成柱(例如螺旋)以提供大的膜表面积。卷的直径优选大于移液器吸嘴的直径以容留所述膜于移液器吸头内。A-A截面图示出了卷的横截面视图。
图35。“多孔介质保持器”即管(这里为毛细管)或柱形式的流体样品纯化系统的实施方案。可使吸附材料或吸附剂附着于大表面积材料，例如一个或多个多孔介质体的内表面和/或外表面。然后使待纯化的样品流体与多孔介质保持器的远端接触。
图36。包括自给式纯化包的流体样品纯化系统的实施方案。根据该实施方案，将含吸附材料(例如颗粒)的包插在样品流体中并搅动，例如借助搅拌或反复插入和取出，以增强流体流过样品容器的运动，从而提高与待吸附的物质相遇的可能性，由此提高其吸附效率并缩短做到这所需的时间。
图37。各种类型的过滤材料对DNA的保留(吸附)。
图38。各种过滤器孔隙尺寸对DNA的保留。
图39。各种市售塑料移液器吸头与DNA的相互作用。自若干供应商获得移液器吸头并用来反复地抽吸和分配DNA溶液，持续90秒。处理前后用260nm下的吸光度测定DNA浓度并以％初始(处理后[]/处理前[]*100)给出。数据以三次重复试验的平均值示出，并以误差棒示出标准偏差。
图40a-b。(a)具有典型的移液器吸头尺寸的常规移液器吸头设计。(b)包括具有反应(或混合)室的移液器吸头的流体样品纯化系统的一个实施方案，并示出这种移液器吸头设计的尺寸产生优选约1.0的内部长细比(即高度与直径的比率)。
图41。使移液器吸头剩余体积最小化的移液器吸头形式的流体样品纯化系统实施方案。在已湿的壳体(移液器吸头)中，远端保持器(或过滤器)将被保留在远端保持器的远端和移液器吸头的远端之间(如尺寸“X”所示)的流体的体积最小化。优选颗粒保持器轴向布置为使“死体积”不大于被抽吸进移液器吸头中的样品流体的总体积的10％。
图42a。用来取得成功纯化的代表性混合方案。除混合方案外的所有实验条件均相同。方案C具有更快、更强力的混合，其导致最短的纯化时间。
图42b。方案改变影响纯化时间。试验A、B和C使用了相同的DNA溶液和移液器吸头形式流体样品纯化系统实施方案，唯一的不同在于混合方案。处理过程中通过260nm下的吸光度测定DNA浓度并归一化为处理前浓度的百分数。对于各个试验，垂直点线标示获得充分纯化(剩余杂质＜10％)所需的时间。由于进行了方案改进，故纯化时间从试验A中的2分钟降到试验B中的75秒并最后降到试验C中的45秒。
图43。约束在图20b中所示的“大膛径”移液器吸头中的官能化颗粒的结合动力学。将2.5mg官能化颗粒松散地插入移液器吸头中并用容积为50μl的移液器处理25μl DNA溶液。
图44。包括低内部体积功能性移液器吸头的流体样品纯化系统的一个实施方案。
图45。包括过滤柱和帽的流体样品纯化系统的一个实施方案。
图46。包括过滤柱、整合的试剂和帽的流体样品纯化系统的另一实施方案。
图47a-b。来自6.1部分(实施例1)中所讨论的流体样品纯化系统实施方案的两个试验的性能数据。所述系统在多个抽吸和分配周期上表现出非常一致的流体抽吸和分配压力。
图48。关于一系列移液器吸头吸嘴或颗粒保持器穿孔直径(列)和流体流率(行)的流体剪切速率的汇总表。详情参见5.7部分(移液器吸嘴和颗粒保持器孔口尺寸及流体分配速度)。
具体实施方式
提供了用于使用吸附材料纯化流体的系统、装置和方法。还提供了用于容留和操作待纯化的流体的系统、装置和方法。
在一个实施方案中，提供了一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统。所述流体样品纯化系统包括具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；近端保持器，其中所述近端保持器位于所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口；和多个官能化颗粒。
在一个实施方案中，所述壳体为移液器吸头。
在另一实施方案中，所述壳体为柱或管(例如毛细管)。
在另一实施方案中，所述流体样品纯化系统包括壳体(例如容器或管)但既不具有远端保持器也不具有近端保持器。壳体中的一个或多个开口可适于流体通过。
流体可以是液体或气体形式。根据本发明，任何流体均可被纯化，由此，流体中的组分可按尺寸、电荷、疏水性或亲水性、或对其他分子的亲和性加以区分。
还提供了用于总体地优化和整合吸附系统部件的方法以提供这样的流体样品纯化系统，其将获得不进行这样的部件级和系统级优化和整合将不能获得的系统性能水平。根据本发明，通过优化和整合多个相互依赖的子系统部件以满足通常矛盾的设计限制条件而获得了更高水平的系统级性能。
在一个实施方案中，待通过本发明的流体样品纯化系统和方法纯化的流体样品为生物流体。生物流体为位于生物体或生物体的组分内或由生物体或生物体的组分所产生的流体。生物体的主要组分可包括但不限于细胞和大分子。细胞可包括但不限于真细菌、古细菌和真核生物。生物体的亚细胞组分可包括但不限于胞核、线粒体和叶绿体、内质网、和微体。为大分子的组分可包括蛋白质和核酸、多糖、脂质及大分子的复杂组装体如核蛋白(即核酸与蛋白质的缔合体)和糖蛋白(即蛋白质与碳水化合物的缔合体)。核酸可以是本领域已知的任何核酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，包括质粒；和核糖核酸(RNA)，包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、其他非编码RNA、PCR引物、核酸探针等。蛋白质可以是本领域已知的任何蛋白质，例如多肽、肽、氨基酸、和抗体。
本发明还提供了用于纯化其他类型的流体样品的系统和方法。
本发明的流体样品纯化方法可基于所用的纯化过程(例如为纯化核酸)与目前可用的颗粒过滤区别开来，原因在于这些其他纯化过程将既吸附靶核酸又吸附杂质并利用所需靶物与杂质的溶解度差异通过使用一系列化学-机械过程来选择性地和顺序地洗脱杂质和所需靶物，再使杂质和/或所需靶物通过过滤膜。比较起来，本发明的流体样品纯化系统通过仅吸附杂质而允许所需靶物通过流体样品纯化系统而在单个步骤中起作用。
通过该部件级和系统级优化所获得的好处包括：样品处理时间非常短、靶物收率高、靶物质量高、吸附能力提高、样品体积回收率高、运行可靠性及产品制造的容易性和成本得到改善。图1中示出了特定子系统部件与系统性能好处间的关系。
与上面所描述并为本领域所已知的现有技术和产品大不相同，本发明的流体样品纯化系统在一个实施方案中仅使用单个一次性件和单个处理步骤而无试剂的添加或后续移除。该单步法将减少操作者出错的可能并使得过程非常快速、易于使用且成本低。当例如应用于从PCR溶液纯化DNA时，该过程花约30-60秒完成(现有技术和产品需要15-30分钟)并移除90％以上的杂质(即未整合的引物和核苷酸)，同时留下充足的靶DNA供后续分析用。其他系统性能好处将在后文中描述。
在单次暴露于样品溶液的过程中(单次“暴露”可包括多个流体抽吸和分配周期)，优选吸附材料选择性地吸附不期望的物质而同时拒绝期望的物质。
在一个实施方案中，由于例如尺寸、疏水性、电荷或亲和性的不同，不期望的物质比目标分子优先被官能化颗粒所结合、吸引或吸附。
取决于应用，被区别性地吸附(或拒绝)的物质可以是例如单链核酸如RNA或PCR引物、双链核酸如DNA(例如基因组DNA、质粒DNA)或PCR引物二聚体、核苷酸如核糖核苷酸、酶如DNA聚合酶、RNA聚合酶、带标记的探针、限制酶或逆转录酶、染料如嵌入剂、水、重金属、毒素如带在血液里的毒素(例如尿素或肌酸酐)、血液组分包括代谢物、电解质、激素或药物、和抗体或抗原。
表1描述了其中可采用本发明的流体样品纯化系统和方法的各种示例性应用。
表1
Figure BPA00001446975100211
Figure BPA00001446975100221
表1描述了其中可采用本发明的流体样品纯化系统和方法的各种示例性应用。
许多针对生物分子的扩增、纯化、诊断或检测方法可采用本发明的流体样品纯化系统和方法，包括但不限于PCR纯化、基因组DNA提取、质粒制备、RNA纯化、凝胶回收、下一代测序(例如barcoded样品、实验室制备、末端修复3’添加、适配体连接、PCR/大小选择)、限制酶切消化纯化、体外转录、逆转录、PCR、分子诊断、透析(参见表1)。为在这样的方法或检测中取得污染物从反应的选择性移除，可对纳米多孔材料的孔隙加以涂布以强烈地吸附某物质而纳米多孔材料的外部(无孔隙表面)制为抵抗该物质的吸附。这将导致材料的空间不均匀性官能化，空间不均匀性官能化通常指纳米多孔材料包含的表面带至少两种不同的官能团。
在一个实施方案中，纳米孔隙用不同的材料官能化，从而提供一些有效移除未整合的核苷酸(dNTP)和引物的官能化纳米孔隙表面。这样的材料的一个实例为带正电荷的或疏水的化合物。带正电荷的或疏水的化合物将吸附污染物如dNTP、引物、ssDNA等。为赋予孔隙表面以正电荷，可使用含胺或金属离子的化合物。含胺的化合物的一个实例为氨基丙基三甲氧基硅烷(APTMS)。正电荷可以用硅烷化化学反应(例如与氨基硅烷如APTMS的反应)或带正电荷的低分子量聚电解质(例如聚烯丙基胺、聚乙烯亚胺或聚赖氨酸)的自组装引入。
根据该实施方案，材料的外部(无纳米孔隙)表面可以用抵抗双链核酸如DNA PCR扩增子的吸附的化合物官能化，所述化合物向纳米孔隙中的扩散差。适宜的抗吸附材料可包括带负电荷的或亲水的化合物，或者任何已知将抵抗生物分子的吸附的化合物(例如聚乙二醇)。适宜的带负电荷的化合物包括但不限于阴离子、聚阴离子、聚电解质、羧酸盐、低聚乙二醇、氢氧化物、及其组合。
本发明的流体样品纯化系统的一个有用方面在于吸附材料同时充当排斥材料的能力，即在单个步骤中，溶液中不期望的物质被吸附而同一溶液中期望的物质同时被排斥(拒绝)。
在各种实施方案中，提供了这样的流体样品纯化系统，其使用从PCR溶液优先吸附各种类型的NA如移除杂质如寡核苷酸和单链引物而同时拒绝所需PCR产物(即双链DNA扩增子)的系统和子系统部件设计和材料。这可使样品的纯化在单个步骤中进行。这与现有产品和技术不同，在现有产品和技术中，杂质以及靶物质(例如靶DNA)均被吸附到吸附表面上，并需要多个复杂且耗时的步骤来移除杂质和释放所需的靶DNA。
在一个优选的实施方案中，提供了这样的流体样品纯化系统，其包含为功能性的一次性移液器吸头的外壳，所述移液器吸头装配在任何单个或多个、手动或自动的实验室移液器上。对于许多NA纯化应用，该总体设计实施方案将在单个移液器吸头中实现现有纯化产品通过使用多个一次性件、多种试剂、和复杂的机械-化学过程获得的全部纯化能力。
本发明的流体样品纯化系统可包装为试剂盒。这样的试剂盒可包括例如壳体(例如移液器吸头或毛细管)、吸附材料(含在壳体内或单独的容器中)、和使用说明。试剂盒可还包括一个或多个(成一体的)保持器或过滤器或对于所需流体样品纯化而言适宜的试剂。在另一实施方案中，试剂盒可包括吸附材料、保持器和使用说明，而流体处理耗材(例如壳体如移液器吸头)和常用试剂通常由最终用户提供。
这些部件被优化和整合在一起的方式创造出了性能优异的流体样品纯化系统，所述系统满足许多相竞争的子系统性能需求。本文描述了一系列系统和子系统部件设计概念、最佳的系统和子系统部件设计参数、及整合下面描述的子系统部件于一起以获得性能优异的流体样品纯化系统的措施。
为描述清楚起见，也非作为限制，将本发明的详细描述分成下面的子部分。
5.1移液器吸头和包含移液器吸头的流体样品纯化系统
提供了一种流体样品纯化系统。在一个实施方案中，流体样品纯化系统可包括移液器吸头，所述移液器吸头装配在任何常规的单个或多个、手动或自动的实验室移液器上。图2中示出了典型的现有技术移液器吸头设计。在其他实施方案中，流体样品纯化系统可包括柱形式而不是移液器吸头形式的部件。
在其中流体样品纯化系统包括移液器吸头的一个实施方案中，吸头可被充填以含吸附材料的颗粒(图6)。在使用该实施方案时，使用者将待处理的溶液如含扩增的双链DNA和杂质的PCR溶液抽吸进移液器吸头中。杂质如未整合的单链引物和寡核苷酸被移液器吸头内的颗粒所吸附。从移液器吸头分配溶液即产生含经纯化的双链DNA(即所需PCR扩增产物)的溶液。溶液纯化可用手持式移液器实现，手持式移液器是大多数实验室中的标准设备，或者可以用高通量应用中所用的标准全自动液体处理器实现。表明过程功效的结果在图8、9、10和11中给出。
图5a-b和图26示出了移液器吸头形式的流体样品纯化系统的实施方案。在图5a中，珠子直径大于移液器吸头的远端(吸嘴端)。在图5b和26中，吸头具有肋和塞作为抗堵塞部件以“设计”或引导流体样品在吸头壳体中的流动。
可使用内部一体式移液器部件如图5b中所示的轴向延伸的肋来使颗粒容留在壳体内而同时允许流体绕颗粒外部进出壳体。肋可以是例如模制在壳体中的部件或插入壳体中以提供相同的颗粒保持功能的单独的件。该后一部件可提供防止球形或接近球形的颗粒堵塞移液器吸头或其他壳体的吸嘴的附加好处。也可使用这些相同的轴向延伸的肋来创建图26中所示的流体流动管道。
在一个特定的实施方案中，吸附材料被固定在移液器吸头内所含(或所充填)的颗粒上。所述颗粒可在移液器吸头内自由移动或者可以被约束或束缚于移液器吸头内的一个或多个区域。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统的壳体的内表面包含不同地官能化的表面(例如经涂布的毛细管以处理特别小的样品体积)。
在另一实施方案中，吸附材料优先吸附核酸、蛋白质或其他生物分子的纯化中所涉及的单链或双链DNA、引物、寡核苷酸、其他生物物质或其他试剂。
在一个优选的实施方案中，提供了这样的流体样品纯化系统，其包括充填了“官能化”颗粒的移液器吸头，所述“官能化”颗粒包含一种或多种吸附材料(图6a)。将吸附材料A(这种情况下的颗粒)充填进移液器吸头B的远端并由过滤器C和D保持在移液器吸头内。过滤器C位于移液器吸头的近端附近，在这里，其起到使颗粒保持在移液器吸头中的作用。过滤器D位于移液器吸头的远端附近以保持颗粒以及使容留在移液器吸头吸嘴和过滤器D的(远)端之间的流体的体积最小化。图6b中示出了代表性产品的照片。
图6a还示出了流体样品纯化系统的一个实施方案。使用者将待纯化的溶液如含扩增的双链DNA和杂质的PCR溶液E抽吸进移液器吸头中。杂质如单链引物、引物二聚体和寡核苷酸被吸附到移液器吸头内的颗粒上。从移液器吸头分配溶液即在单个步骤中产生含经纯化的双链DNA G(即所需PCR扩增产物)的溶液。杂质F被吸附到吸附材料A上，吸附材料A由远端过滤器(保持器)D保持在移液器吸头B内，远端过滤器(保持器)D的孔隙尺寸选择为自由地通过样品溶液但不通过含杂质的吸附颗粒。可以将溶液自移液器吸头抽吸和分配若干次以帮助确保溶液与吸附颗粒之间充分的相互作用。溶液纯化可用手持式移液器实现，手持式移液器是大多数实验室中的标准设备，或者可以用高通量应用中所用的标准全自动液体处理器实现。
图7b示出了其中近端过滤器C被移液器吸头的近端处可移除的密封件所代替的另一实施方案。
图7a示出了其中流体样品纯化系统在移液器吸头的近端处包括密封件的另一实施方案。这些密封件优选包含较薄的可被轻易刺穿(例如用移液器)的不脱落材料。这样的密封件材料是本领域熟知的，可以是例如金属箔、聚合物膜或紧密织造的织物或纸材料。所述密封件可以预留或可以不预留刻痕以帮助确保适当的穿孔和/或刺穿。
为获得一致地高水平的产品性能，系统和子系统部件的优化和整合可按如下所述进行。虽然子系统部件的优化和整合是以顺次方式讨论的，但本领域技术人员应理解，正如系统设计优化通常会出现的情况一样，这些活动可以并列地进行。部件设计概念和最佳设计参数值的选择常常涉及在相竞争的产品性能需求之间进行折衷。
本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头的特性包括所用过滤器的数量和类型、反应室的设计、吸附材料的设计(例如吸附颗粒的类型、尺寸和体积)、样品死体积、内部空气总体积、靶物吸附特性、移液器相容性、及本文中公开的其他设计特征。
图8示出了流体样品纯化系统的实施方案的实验性能。对单一溶液进行PCR纯化以比较现有技术(“竞争者”)纯化产品的性能与本发明的流体样品纯化系统的实施方案(“Diffinity”)(图4)的性能。用Nanodrop 1000于PCR纯化前后测定DNA吸光度(260nm下)。PCR纯化按制造商的说明进行。DNA溶液在Diffinity吸头(即移液器吸头)中处理75秒，而在Diffinity管(即柱)中处理30秒。DNA浓度以％初始浓度给出，其中移除所有杂质而保留所有靶扩增子的理论上完美的纯化产品将具有0％的dNTP、0％的单链DNA(ssDNA)、和100％的双链DNA(dsDNA)。各个条代表3次独立实验的平均值+/-标准平均误差。未示出酶纯化法，因为其与浓度的吸光度测定不相容。在其他实验中，已在移液器吸头形式(“Diffinity吸头”)的流体样品纯化系统中获得了高达初始DNA浓度的95±5％的靶物收率(数据未示出)。
在图9中，自经纯化的PCR扩增子和杂质(462ng/μl dNTP、2.4ng/μl引物)制备了PCR原液。然后用现有技术产品(Q、I、和E)或用本发明的流体样品纯化系统的一个实施方案(功能性吸头或旋转柱)使该原液经受PCR纯化。遵循制造商的说明，让等量的经纯化的PCR和PCR原液在5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上相邻的泳道中试验。黑箭头指向PCR模板(λ基因组DNA)，灰箭头指向PCR扩增子(1956bp条带)，双箭头指向引物(24bp)。在经用竞争者Q或I纯化的泳道中可见扭曲的扩增子条带；该扭曲是由于在这些泳道中额外搭载染料以补偿其漂移的趋势(残余乙醇污染)。该凝胶是两个相同的独立实验之一。这些结果代表了在超过5个类似实验中所观察到的那些。
图10表明Sanger测序是经纯化的PCR溶液的一种定量功能试验。用若干竞争者的产品(Q、I、和E)以及用Diffinity吸头和旋转柱按制造商的说明或如“方法”中所述纯化未经纯化的模拟PCR溶液。左：序列质量的两个定量量度，上面画出了连续读长(CRL)和质量值(QV20)，各栏代表两个相同的独立序列反应的平均值。较长、较高质量的读长具有较高的值，而未经纯化的样品用作阴性对照并具有较低的值。右：来自已有序列的中间区域的序列色谱图可见地示出了未经纯化的和大多数经纯化的样品间峰质量的改进，如改进的信噪比所显示的。这些结果代表了在超过5个类似实验中所观察到的那些。
图11为用对照纯化系统和本发明的流体样品纯化系统的一个实施方案(“Diffinity功能性PCR纯化吸头”、“Diffinity吸头”)纯化后的序列比较。在5个位点处独立地进行β测试以比较Diffinity功能性PCR纯化吸头和各个测试实验室目前所使用的方法。将PCR样品分成与对照(80.92+/-6.59％)或Diffinity(80.99+/-6.51％)PCR纯化系统一起使用。测序后将连续读长(CRL)归一化为预期读长的百分数并对各组进行平均。所示为30个试验的平均值，加了标准误差棒。
图12a-c示出了随着其抽吸和分配水，市售Thermo Fisher ScientificAspireTM移液器吸头(“现有技术吸头”)内典型的样品抽吸和分配压力。如图12a-c中所示，三个连续的样品抽吸和分配周期的典型最小总周期时间为约13.4秒。平均样品抽吸周期时间(前三个抽吸周期)为约3.3秒/抽吸。该平均样品抽吸周期时间中含为约4.9秒的平均第一抽吸周期时间。
从随后的抽吸周期除去第一抽吸周期时间得到抽吸周期#2和#3中的每一个为约2.4秒的平均周期时间。三个连续的样品分配周期的平均样品分配周期时间为约1.3秒/分配。
图13a-c示出了随着其抽吸和分配水，本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头内典型的样品抽吸和分配压力。三个连续的样品抽吸和分配周期的典型最小总周期时间为约1.7秒，这比AspireTM产品的少约87％。平均样品抽吸周期时间(前三个抽吸周期)为约0.26秒/抽吸，这比AspireTM产品的少约92％。
第一样品抽吸周期的平均时间为约0.27秒，与为0.27秒的第二和第三抽吸周期的平均样品抽吸周期时间基本相同，表明不存在任何第一抽吸效应(例如吸附介质的润湿)。为约0.27秒的平均第一抽吸周期时间比AspireTM产品的少约91％。
平均样品分配周期时间(前三个分配周期)为约0.29秒/分配，这比AspireTM产品的少约77％。
本发明的流体样品纯化系统之所以能获得这些改进，部分是因为其具有较少的过滤器。在一个实施方案中，在使用前，流体样品纯化系统在移液器吸头的远端处使用单个过滤器(或滤头)来保留吸附材料(例如颗粒)。
在另一实施方案中，吸附材料由滤头、过滤器或保持器保持在近端和远端处。
在另一实施方案中，吸附材料由在使用时移除(即刺穿)的可刺穿的膜保持在近端处。在使用过程中，吸附材料可由移液器的一部分(例如吸头)保持，所述部分刺穿可刺穿的膜。单个过滤器的使用因此可提供固有地低的流体流动阻力。与流体样品纯化系统的此方面相关地增大的流体流率将有助于提供下述特定好处：
(1)由于流体抽吸和分配周期时间较短，故纯化过程时间缩短。
(2)由于在样品抽吸和分配过程中更高的流体流率导致更高的搅动水平，继而导致更快的吸附时间，故纯化过程时间缩短。
(3)通过消除潜在昂贵的部件而降低了产品制造成本。
(4)通过从产品设计中消除高要求部件而提高了产品可靠性。
虽然不与流体流率直接相关，但第二流体传输过滤器的消除还减少吸附所需靶物(例如ds-DNA)的可能，所需靶物的吸附将降低靶物收率。
5.2壳体
壳体可以呈本领域已知的任何移液器吸头或柱形式。
在一个实施方案中，壳体可以是一个或多个毛细管(图14)。在此实施方案中，样品流体i)从毛细管内或ii)绕形成毛细管道的毛细管外表面或iii)绕毛细管的内表面和外表面抽吸和分配。在此实施方案中，吸附材料被置于i)毛细管的内表面上或ii)毛细管的外表面上或iii)毛细管的内表面和外表面上。
该实施方案还具有产生大的涂布表面积/流体体积比率的优势。其还具有使用小壳体(毛细管)半径(“r”)以使质量输送扩散路径长度和扩散时间最小化从而使被抽吸样品中的物质到达毛细管表面并被吸附所需的时间最小化的优势。其还允许单利用毛细压力来抽吸样品，从而消除对抽吸流体的其他装置的需要。其还具有纯化非常小体积的样品的能力，例如小于10μl的样品体积。
在此实施方案中，经纯化的流体通过措施如i)施加正流体压力、ii)离心、或iii)通过例如使含流体的毛细管与具有足以从毛细管中抽出流体的更大表面能(即更高毛细压力)的亲水材料相接触所致的更大毛细力从毛细管挤出。
在另一实施方案中，壳体可以是包括非圆形或非球形移液器吸头吸嘴孔口的移液器吸头。该壳体可用来容留球形或接近球形的颗粒，其中所述吸嘴的非球形性同时使球形颗粒保持在移液器吸头内，还防止颗粒堵塞移液器吸头。在此特定的实施方案中，颗粒如上所述被容留，其中颗粒的最小弦长大于跨越非圆形移液器吸头吸嘴的最大维度和/或在移液器吸头的远端和/或近端处的保持措施的最大有效开口尺寸。图15b中示出了这个方面，在其中，球形颗粒被椭圆形的移液器吸嘴所保持。在此特定的实施方案中，颗粒的最小直径大于椭圆形吸嘴的短轴的最大长度。
5.3官能化颗粒及其他吸附材料
在某些实施方案中，本发明的流体样品纯化系统和方法可采用如下申请中所述的吸附材料：Lewis J.Rothberg于2009年2月11日提交的名称为“Spatially Inhomogenously Functionalized Porous Media andMethod for Use in Selective Removal of Contaminants”的美国临时申请号61/151,551和2010年2月11日提交的名称为“SpatiallyInhomogenously Functionalized Porous Media and Method for Use inSelective Removal of Contaminants”的国际申请号PCT/US10/23900(申请人：University of Rochester)，并概括如下。
本发明的流体样品纯化系统可使用由纳米多孔材料组成的吸附材料，在所述纳米多孔材料中，内表面(孔隙表面)被官能化为吸附小分子(例如引物和dNTP)而外表面被官能化为抑制较大分子(例如双链PCR扩增子)的吸附。由于较大的ds-DNA在本实施例中被孔隙内部所排斥，故仅小分子将被吸附到纳米多孔材料，因此，根据本实施方案，双链DNA可因内表面和外表面不同的官能化而从混合物得到纯化。
所述流体纯化系统实施方案中可使用的官能化颗粒可包括：i)涉及一种特定杂质吸附和靶物拒绝化学的单一类型颗粒，ii)涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的单一类型颗粒，iii)各涉及一种杂质吸附和靶物拒绝化学的多种类型颗粒，和iv)各涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的多种类型颗粒。同样，所述流体纯化系统实施方案中使用的任何吸附/拒绝表面可在表面内具有一个或多个构造为具有一个或多个上述吸附/拒绝化学构造的区域。
在一个特定的实施方案中，多个官能化颗粒为不同地官能化的颗粒，即所述多个官能化颗粒可包含两种或更多种类型的官能化颗粒。
在确定适宜的纳米多孔材料时，要考虑到希望移除的小分子(例如引物二聚体和未整合的引物和dNTP)的大小。这些小分子通常为几个纳米(nm)大小。因此，孔隙尺寸为约5nm到约150nm的纳米多孔材料将允许污染物充分进入所述孔隙中。这样的孔隙还将排斥较大的分子如可能为几百或更多个碱基对长度的双链DNA扩增子。在一些实施方案中，纳米多孔材料中不是所有的孔隙均具有相同的大小。但在各种实施方案中，优选70、80、90或95％落在5-150nm的范围。
纳米多孔材料可构造为表面、粒子或呈泡沫或凝胶形式。适宜的纳米多孔材料可包括例如多孔二氧化硅、多孔氧化铝、和沸石。适宜的大表面积凝胶可包括二氧化硅、氧化铝、沸石和二氧化钛。在一个实施方案中，使用了色谱级纳米多孔二氧化硅，其可以基本球形的颗粒获得，直径为40-60微米，孔隙尺寸为约具有这些特性的材料可从市场上买到，例如Merck 9385二氧化硅凝胶。
官能化颗粒可用作流体样品纯化系统中的吸附材料。流体样品纯化系统和方法的实施方案中待采用的适宜的官能化颗粒的化学和生物化学特性在Lewis J.Rothberg于2009年2月11日提交的名称为“Spatially Inhomogenously Functionalized Porous Media and Method forUse in Selective Removal of Contaminants”的美国临时申请号61/151,551和2010年2月11日提交的名称为“Spatially InhomogenouslyFunctionalized Porous Media and Method for Use in Selective Removal ofContaminants”的国际申请号PCT/US10/23900(申请人：University ofRochester)中有述。
此外，颗粒具有某些物理尺寸和颗粒类型特性。给定的颗粒体的总表面积随着颗粒尺寸减小而增大。在流体样品纯化系统中，增大的总表面积将提供能容留更大量吸附材料的优势，因为吸附材料的量取决于可利用的表面积。但减小颗粒尺寸将通过增大流体-空气界面处流体的毛细压力或“去润湿压力”，从而也将使得更难从润湿的颗粒团块移除流体。本领域中已知，毛细压力定义为Pc＝2γ/r，其中γ为流体的表面张力，r为流体-空气界面处流体表面的半径，其随颗粒尺寸减小而减小。从样品处理过程回收高百分率的样品流体常常很重要，特别是当只可得到小体积的样品时。
在本发明的另一改进中，用于负载吸附材料的颗粒尺寸为1.0至1000μm。具体颗粒尺寸的选择在很大程度上由具体应用的需要和所用的具体产品实施方案决定。在一个实施方案中使用1.0至10微米的颗粒尺寸以增大吸附材料的表面积。由于颗粒间孔隙尺寸非常小，故这些尺寸的颗粒的使用需要特殊的措施来从颗粒移除流体，例如离心，这在一些应用中是可接受的。10至150微米的颗粒尺寸将为最终应用如PCR溶液的纯化提供适宜的表面积，其中待移除的杂质(例如dNTP和引物)的量与可被置于可利用的颗粒表面积上的吸附材料一致，同时，所具有的去润湿压力能使流体在例如自流体移液器施加的通常为5-25千帕的轻微压力下较容易地移除。100至1000微米的颗粒尺寸将提供更小的颗粒表面积，其适合于其中待移除的杂质的量较低并与可被置于可利用的颗粒表面积上的吸附材料一致的最终应用，同时，所具有的非常低的去润湿压力能使流体非常容易地移除，例如使用重力从颗粒中排出流体。此颗粒尺寸还远更容易用例如一体式移液器吸头颗粒保持肋(图5b和图26)保持在移液器吸头中。
这个方面的优势包括使吸附材料的表面积最大化。其同时通过选择与预期应用中可用到的流体处理装置和方法一致的颗粒尺寸以降低有效移除流体所需的压力使从润湿的颗粒团块挤出流体所需的压力最小化。
还是关于颗粒的物理尺寸，颗粒优选足够小以避免在流体样品中快速沉降，因为沉降将阻止其与样品溶液中可能有的任何杂质相互作用。这样的适宜地小的颗粒尺寸的确定是本领域已知的。
在一个实施方案中，使用了一个范围的颗粒尺寸。在一个特定的实施方案中，颗粒尺寸可在10-100μm范围，优选50-100μm。当样品溶液被容留在流体样品纯化系统如图6a中所示的基于移液器吸头的实施方案中时，颗粒中的大多数将在溶液中保持均匀悬浮(图16)。
取决于所用移液器的类型(例如手动或自动)和操作者技术(例如快或慢)，样品溶液在移液器吸头内的停留时间或样品抽吸和分配周期之间的时间通常为1至5秒。因此，在该时间过程中，大多数颗粒优选保持悬浮于整个样品溶液体相中以与溶液中可能有的任何杂质有效地相互作用。颗粒的均匀悬浮有助于在样品溶液中可能有的任何杂质和吸附杂质的颗粒之间产生较短的平均扩散路径长度，从而使移除(即吸附)杂质和因此纯化样品溶液所需的时间最小化。
图16示出了用Bird、Stewart和Lightfoot(1960，TransportPhenomena，John Wiley & Sons，ISBN 047107392X)所描述的方法计算预计的沉降时间。沉降时间也可通过观察较大颗粒的浑浊溶液多快可变清来实验确定。
如图16中所示，对于1.5cm的吸头内样品高度，50％的大于约100μm的颗粒在不到约1.1秒内从溶液中沉降(即行进样品高度的一半)。同样，对于1.0和0.5cm的吸头内样品高度，50％的大于90μm和60μm的颗粒分别在不到约0.9和1.1秒内从溶液中沉降。由于这些颗粒不再可利用以从样品溶液的整个体相吸附杂质，故大于60和100μm的颗粒代表非最佳设计值，具体取决于实际的样品体积、移液器吸头设计和移液器吸头内样品柱的后来高度。同时，虽然小于约10μm的颗粒具有非常长的沉降时间和因此与溶液杂质的持续相互作用，但其可能易于被空气携带，故从产品制造和健康角度来说不合需要。因此，最佳颗粒设计尺寸为大于10μm而小于60至100μm，还是具体取决于实际的样品体积、移液器吸头设计和移液器吸头内样品柱的后来高度。
根据该实施方案，颗粒优选具有这样的适宜尺寸，其大到足以能使用具有使流体样品能够高流率地进出移液器吸头而不允许颗粒通过(矛盾的要求)所需的较大孔隙尺寸的过滤器，特别是远端布置的过滤器。确定适宜颗粒尺寸的一般方法是本领域已知的。
颗粒可以是球形的(或近似球形的)或者可以是非球形的。
在某些实施方案中，颗粒的非球形性可防止堵塞通常圆形的移液器吸头吸嘴(图15a)。例如，颗粒可以是有小面的实心颗粒(例如立方体或四面体形状的颗粒)。在该特定的实施方案中，颗粒如上所述被容留，其中颗粒的最小弦长(例如图15a中所示矩形颗粒的最短边的长度)大于移液器吸头吸嘴直径和/或移液器吸头内远端和近端颗粒保持措施的最大有效开口尺寸。
高流体流率是优选的，因为其有助于以若干途径使总的样品处理时间最小化，所述途径包括如下。第一，高流体流率将使在各个抽吸和分配周期中给定体积的流体样品进出移液器吸头所需的时间最小化。第二，高流体流率将在移液器吸头内产生更大的流体搅动，从而使吸附材料更频繁地与悬浮的杂质接触。
颗粒优选具有足够大的尺寸以使被保留在其空隙体积(即相邻颗粒间的空气或液体体积)内的流体能易于回收。这可通过例如创建大的毛细管半径做到，大的毛细管半径将减小毛细压力，继而减小使流体通过和挤出多孔介质所需的压力。另一方法是提高多孔介质的可润湿性，这也可以同样的效果减小毛细压力。关于高流体流率对样品纯化时间的影响的其他讨论和数据以及对流体样品回收的更详细讨论将在下面给出。
对于纯化移液器吸头而言，优选的颗粒尺寸为50-100μm，原因如下：
(a)由于流体样品纯化系统使用较小的颗粒尺寸(即100μm或以下)而消除了样品处理过程中的显著颗粒沉降，故纯化时间短。
(b)由于流体样品纯化系统使用较大的颗粒(即大于50μm)而伴随较大孔隙尺寸的过滤器的较高流体流率和较大搅动，故纯化时间短。
(c)由于较小的颗粒能更有效地移除样品溶液内的杂质，故样品质量得以提高(例如极少沉降)。
(d)由于能更容易地从较大的颗粒回收被保持的流体，故样品回收率得以提高。
(e)由于使用较大的颗粒(即大于10μm)，故产品制造更容易、更安全。
(f)是取得较短的纯化时间、较高的靶物收率、较高的样品回收率及产品制造容易性和安全性的最佳颗粒尺寸。
流体样品纯化系统可包含反应室，这将在下面于5.16部分中描述。在一个方面，反应室使用比重大于1.0的吸附颗粒，这将消除约束颗粒(例如Colpan等的WO88/09201 A1中所公开的空隙体积)的需要并因此提高系统性能。
可从溶液中移除的不期望的物质的量和移除所述不期望的物质所需的吸附材料的体积是任何流体样品纯化系统设计的重要方面。由于较小的颗粒产生较大的表面积，使得每单位体积的吸附材料吸附较大量不期望的物质，故需要较小的颗粒尺寸。
在另一实施方案中，使用多孔颗粒进行吸附，因为对于任何给定的颗粒尺寸，多孔颗粒可提供每单位体积大得多的面积。
如上面所讨论的，回收高百分率的样品体积是又一重要的系统性能参数，特别是当用小样品体积工作时。但较小的颗粒可能团聚在一起并将液体保持在相邻颗粒间的空隙内。润湿的颗粒将在流体-空气界面处产生毛细压力，毛细压力定义为Pc＝2γ/r，其中γ为流体的表面张力，r为流体-空气界面处流体表面的半径。对于水的25或50μm毛细管半径，毛细压力将分别为约9.0和4.5磅/平方英寸，远高于常规移液器所产生的约1.0磅/平方英寸的压力，从而使得移液器非常难以将流体从该尺寸的颗粒的润湿的团聚团块中挤出。因此从这个角度来说，较大的颗粒尺寸是优选的。但甚至在前面确定的100μm的最大最佳颗粒尺寸下，去润湿压力也将为约2.3磅/平方英寸，仍然高于可得到的移液器压力并很可能不利地影响样品回收。
其他方面都一样的话，较小颗粒的较小团块将有助于使被保留在相邻颗粒间的空隙中的流体的体积最小化。但较小的团块可能不利地影响可利用以吸附不期望的物质的颗粒表面积。
在其他实施方案中，提供了用于克服这些竞争参数的方法：通过使用亲水颗粒和多孔颗粒，其将或单独或一起简化样品体积回收，同时提供其他有利的性能好处。
首先，颗粒的亲水性用来使颗粒更可润湿(例如减小流体与实心颗粒表面之间的前进和后退接触角)，从而增大毛细管半径和因此减小去润湿压力至常规的手动或自动移液器可达到的水平。
其次，相对于相同尺寸的实心颗粒而言，多孔颗粒将提供非常高的颗粒表面积/体积比，从而使得可以用较小的颗粒团块来吸附相等水平的杂质，而同时由于其较小的总体积而截留较少的样品体积。典型的多孔粒子材料的实例有色谱级纳米多孔二氧化硅，其可例如以基本球形的颗粒获得，直径为40-60微米，孔隙尺寸为约具有这些特性的材料可从市场上买到，例如Merck 9385二氧化硅凝胶。2mg的量的颗粒将具有～10,000cm2的表面积。比较起来，2mg 50微米实心二氧化硅颗粒提供的表面积≈550cm2。
第三，在流体样品内较宽范围的杂质浓度上，较小体积的多孔颗粒的较高吸附能力将有助于确保高度的样品质量水平。此特征特别重要，例如当纯化PCR溶液时，与成功的PCR过程相比，其中PCR溶液扩增所需DNA靶物的失败将在溶液中留下非常高的水平的未整合核苷酸和引物，从而使得(未扩增的)靶DNA的回收难以完成。
第四，通过减小移除特定量的杂质所需的颗粒的体积，多孔颗粒将有助于维持流体以高流率流经用来使其保留在移液器吸头内的(远端)过滤器。更具体而言，颗粒保留过滤器通常被称为表面过滤器，意味着被保留的颗粒将由于颗粒相对于过滤器的有效孔隙尺寸而言较大的尺寸而聚集在其上游表面上。
图17a-d示出了来自装载了2.5或10.0毫克具有疏水表面的未经官能化颗粒的移液器吸头的结果。然后从吸头抽吸和分配流体。
图17a示出，含2.5mg颗粒的吸头的第一流体抽吸和分配周期时间分别为0.7和6.3秒。
图17c示出，含10.0mg颗粒的吸头的第一流体抽吸和分配时间分别为1.3和13.9秒，约为含2.5mg颗粒的吸头的第一流体抽吸和分配周期时间的2倍。
图17b示出，含2.5mg颗粒的吸头的后续流体抽吸和分配时间分别为0.5和1.3秒。
图17d示出，含10.0mg颗粒的吸头的后续流体抽吸和分配时间分别为0.8和2.0秒，比含2.5mg颗粒的吸头的后续流体抽吸和分配周期时间增加约60％。
这些数据表明，移液器吸头内较大的颗粒载量将增加第一和后续抽吸和分配周期的流体抽吸和分配时间。
图13a-c示出，对于三种流体样品纯化系统移液器吸头，第一抽吸周期时间为0.22、0.32和0.26秒，或者说平均为0.27秒。第二和第三抽吸时间平均为0.27秒。这些移液器吸头含0.25mg亲水颗粒。
所述0.27秒的总(即第一和后续周期)平均抽吸时间是伴随含2.5mg疏水颗粒的移液器吸头的0.7秒的第一抽吸周期时间的约38％，这表明，相对于在相似的条件下使用相同量的疏水颗粒而言，亲水颗粒的使用导致短得多的第一抽吸周期时间。
当使用亲水颗粒时，在第一和后续流体抽吸周期时间上也没有差异；相对于现有技术中可得到的当前的移液器吸头(参见图12a-c)以及其中使用亲水颗粒的流体样品纯化系统中的情况而言，所有的均同等地快。
图13a-c示出，对于三种流体样品纯化系统移液器吸头，第一分配周期时间为0.32、0.25和0.27秒，或者说平均为0.28秒。第二和第三分配时间平均为0.29秒。这些移液器吸头含0.25mg亲水颗粒。
所述0.29秒的总(即第一和后续周期)平均分配时间是伴随含2.5mg疏水颗粒的移液器吸头的6.3秒的第一分配周期时间的约5％，这表明，相对于在相似的条件下使用相同量的疏水颗粒而言，亲水颗粒的使用导致短得多的第一分配周期时间。
当使用亲水颗粒时，在第一和后续流体抽吸周期时间上也没有差异；相对于当前的(参见图12a-c)以及其中使用亲水颗粒的流体样品纯化系统中的情况而言，所有的均同等地快。
本发明的流体样品纯化系统相对于现有技术(图12a-c)而言较短的流体抽吸和分配周期时间很可能归因于使用了较小的颗粒团块(可以通过使用多孔颗粒制得)、使用了亲水颗粒、和使用了更少而更高效的过滤器。典型的现有技术第一流体分配时间(参见图12a-c)与使用本发明的流体样品纯化系统和方法的系统和方法的那些之间的显著差异反映了通过使用亲水颗粒、较少的颗粒、较少的过滤器和具有较低流体流动阻力的过滤器所提供的特定好处。
典型的固相萃取柱需要较长的“润湿”阶段。当使用当前设计的功能性移液器吸头时(参见图12a-c)存在此现象。由于其多孔性，故本发明的流体样品纯化系统和方法通过对任何给定的萃取容量需要使用亲水颗粒及通过使用较小的颗粒团块克服了这个问题。
流体样品纯化系统和方法中亲水颗粒的使用还有助于通过消除润湿吸附颗粒和引发样品纯化过程的化学方面所需的时间缩短样品处理(例如样品纯化)时间。最后，亲水颗粒的使用还减少在最初的润湿过程中在颗粒内夹带空气的可能，这将有助于改善操作的可靠性和样品处理周期时间(即排除夹带的气泡所需的时间)。
表面润湿是现有设计的色谱柱的经典问题。图12a-c示出，AspireTM设计的功能性移液器吸头伴随着过长的第一样品抽吸时间。
颗粒可设计为能快速移除大量杂质而同时使被保留的流体样品体积最小化，同时满足所有其他前述颗粒设计限制条件。
所述官能化颗粒是多孔的，因此提供较大的吸附表面积和有效地清除较大量杂质的能力，同时足够小以使被保留的流体样品的体积最小化，同时还足够大以使过滤器或保持器的堵塞最小化。在一个实施方案中，所述多孔颗粒显著提高(即10-20倍)吸附能力。
在一个方面，多孔颗粒位于流体样品纯化系统的移液器吸头内。对于给定的吸附能力需要，这些颗粒是无孔颗粒约10-20倍的非常高的表面积/体积比使得移液器吸头内使用的吸附颗粒的体积可减少10-20倍当量。由于颗粒在过滤器内和/或过滤器的面上的积聚将增大流动阻力，故本发明的流体样品纯化系统的该特征将有助于提高流体样品流率，继而因较高流率所致的较短样品抽吸和分配时间和较大的搅动而有助于缩短纯化时间。这些现象的证据参见图17a-d。
图12a-c和13a-c示出，AspireTM移液器吸头的最大抽吸和分配压力超过8.0KPa(即进行这些测定所用压力传感器的最大响应)，而本发明的流体样品纯化系统的平均抽吸和分配压力分别为2.2和2.4KPa，或者说比AspireTM的那些值低75％。由于流体流率通常与压力呈线性关系，故这意味着对于任何给定的移液器压力，本发明的流体样品纯化系统将获得更高的流体样品流率及这些更高的流率所提供的许多好处。
本发明的流体样品纯化系统的另一方面包括最佳大小以使过滤器内和过滤器的面上的积聚效应最小化的颗粒的使用。在样品分配周期过程中，颗粒将被压紧到过滤器的表面上。在图18a-d所示的实验中，尺寸小于53μm、为53-74μm、为74-100μm和为105-149μm的颗粒分别产生3.4KPa、3.1KPa、3.0KPa和2.5KPa的最大分配压力。因此，对于移液器吸头形式的流体样品纯化系统中的过滤器而言，颗粒尺寸优选为约100-150μm(或更大)，过滤器直径为1.0mm，孔隙尺寸为10-40μm。具有这样的很好地控制的尺寸分布的颗粒易于通过过筛或其他这类尺寸分离方法获得。应理解，具有较大或较小孔隙尺寸的过滤器可能优选使用较大或较小的颗粒尺寸，具体取决于特定应用的需要。
本发明的流体样品纯化系统比现有技术系统具有更低和更一致的吸头到吸头流体流动阻力。在单个移液器用多个与共用的抽吸/分配压力歧管相连的喙连接了多个移液器吸头且其中各个移液器吸头被施加了相同的抽吸/分配压力的应用中，该性能特征特别重要。不含任何内部过滤器的移液器吸头的流体流动阻力可忽略不计并通常认为将以相同的速率填充并至相同的水平。但随着流动阻力增大，流体流动阻力的任何变化(例如更限制性的远端保持器或过滤器)将导致受影响的移液器吸头接纳较多或较少的流体。在最糟的情况下，一个移液器吸头可能几乎不接纳流体或不接纳流体，另一个则被填满，从而可能溢流和污染移液器。本发明的流体样品纯化系统通过更好地控制过滤器流动特性(例如更低和更一致的过滤器到过滤器流动阻力)和颗粒引起的流动阻力并通过本文中所述的流体处理方案避免了这个问题，从而使流动阻力的变化最小化。
本发明的流体样品纯化系统中所用吸附颗粒的类型、尺寸和数量将有助于提供如下好处：
(a)由于流体抽吸和分配周期时间较短，故纯化过程时间缩短。
(b)由于较高的流体流率导致较大水平的搅动，结果使吸附时间较短，故纯化过程时间缩短。
(c)更一致的吸头到吸头抽吸和分配体积。
5.4吸附材料或官能化颗粒在壳体内的容留
在某些实施方案中，吸附材料或颗粒(例如官能化颗粒)可被容留(束缚或约束)在流体样品纯化系统的壳体(例如移液器吸头、柱)内。虽然下面的描述主要讨论的是移液器吸头形式的流体样品纯化系统内材料的容留，但本领域技术人员应认识，这样的容留措施和方法也可应用于其他壳体，例如柱形式。
在一个实施方案中，可如图5a中所示使用尺寸大于壳体(例如移液器吸头吸嘴、移液器吸头远端)的内径的颗粒。
在另一实施方案中，颗粒或吸附材料的远端保持器可以是多孔的(例如过滤器)并可布置在壳体的远端(孔口或吸嘴端)，由此，颗粒保持器的有效孔隙尺寸小于颗粒的尺寸(图19和20a)。
在另一实施方案中，可使用具有比颗粒尺寸小的穿孔的薄膜或厚膜颗粒保持器(图19，参见(a)放大视图)。所述膜颗粒保持器可以是圆形或非圆形的(例如椭圆或正方形形状的膜)。
可使用多孔介质如生物惰性聚丙烯网片或类似材料的纤维基体，其中所述基体的有效孔隙尺寸小于颗粒的尺寸(图20a)。可利用的材料的具体实例包括Filtrona Fibertec或Ahlstrom所制造的亲水纤维材料。使用这些材料的产品的具体实例包括分析化学用滤纸和用于液相色谱柱和反渗透过滤器的膜衬底。
保持器可用内部凸起的元件如圆形肋或倒钩保持就位于壳体内，如图20b或图23中所示，其利用机械干预来固定颗粒保持器。优选用于保持器的这些固定(或保持)元件(“保持元件”)模制为壳体(例如移液器吸头)的一部分，但也可包括插入壳体中的单独的件。
在另一实施方案中，流体样品纯化系统可如图21或22中所示包括内部保持器(如过滤器)的保持元件。可使用保持元件如内部肋或倒钩将过滤器作为保持器固定在位而不使用高的过滤器插入力、不压缩过滤器，也没有这些力可能导致的过滤器孔隙尺寸的减小。本发明的流体样品纯化系统可因此包括使过滤器保持在移液器吸头内而无需高的过滤器插入力的内部一体式设计部件，从而减少压缩过滤器和增大流体流动阻力的可能性。
在又一方面，颗粒保持器的外表面的锥度与壳体的内锥度相似以例如方便颗粒保持器的插入和保持以及有助于确保颗粒不在颗粒保持器和壳体的内表面之间通过。
近端保持器可布置在壳体的后开口处(例如最接近移液器的移液器吸头端)。在一个实施方案中，近端保持器可以是多孔的颗粒保持器，其中所述颗粒保持器的有效孔隙尺寸小于颗粒的尺寸(图19和20a)。如关于远端颗粒保持器或壳体末端的过滤器所描述的，可使用具有比颗粒的尺寸小的穿孔的薄膜或厚膜(图19)。也可使用多孔介质，例如用作气体阻挡器的生物惰性聚丙烯网片或类似材料的纤维基体，其中所述基体的有效孔隙尺寸小于颗粒的尺寸(图20a)。具体实例包括气溶胶阻挡器移液器吸头，例如Evergreen Scientific的AeroPureTM移液器吸头，其利用安放在样品和移液器轴之间的疏水过滤器来截留和防止气溶胶到达移液器吸头固定器而不阻碍气流。
在其他实施方案中，可使用近端布置的内部膜起保持作用，所述膜将在颗粒被置于壳体中之后坍塌而锁在一起(图20c)，其中所述锁定的膜沿例如联锁的接缝具有孔口，所述孔口足够小以容留颗粒但足够大以允许流体和/或气体通过。所述膜优选模制为移液器吸头的一部分，但也可包括插入移液器吸头中的单独的件。
如关于远端保持器所描述的，近端保持器可用内部凸起的部件如圆形肋(图20b)保持在位，其利用机械干预来保持所述组件。优选这些部件模制为壳体的一部分，但也可包括插入壳体中的单独的件。
在近端保持器的再一方面，近端保持器的锥度与壳体(移液器吸头)的内锥度相似以例如方便颗粒保持器的插入和保持以及有助于确保颗粒或流体不在颗粒保持器和移液器吸头的内表面之间通过。
5.5保持器结构特征
在某些实施方案中，远端和/或近端保持器可以是滤头、过滤器、或者包含过滤材料。本发明的流体样品纯化系统中使用的保持器材料优选具有一定的机械强度特征以便易于制造并可靠地满足使用时的性能要求。保持器优选能固定到移液器吸头中并随着时间的推移保持在适当的位置。当前的产品制造商通常把过滤器“压”到移液器吸头中并依赖于过滤器与移液器吸头之间的干预使过滤器保持在位。虽然这是一种简单的制造方法，但由于例如通常使用的聚合物过滤材料的松弛，故其不总是奏效。例如，本领域中已知，近端布置的气溶胶过滤器易于从移液器吸头掉落。
此外，由于移液器内表面的锥度，置于保持器上的法向力(即垂直于保持器外表面的力)可能比保持器插入力高许多倍，如图24所示，并可能常常压缩保持器，从而增大其流动阻力。保持器插入力的轻微变化因此可能产生保持器上法向(压缩)力的大的变化和因此不能抵抗压缩的保持器大的流动阻力变化的可能。在许多移液器吸头应用中，这样的压缩可能不是严重问题，特别是当流经保持器的流体为流体粘度非常低的空气时(例如气溶胶过滤器)。但当涉及液体时和当需要一致的吸头到吸头流率时，保持器流动阻力不能经受这样的变化。对于本领域中常用的聚丙烯过滤器来说，避免(不确定地)过滤器变形所需的插入力不能可靠地密封过滤器于移液器吸头中。
因此，本发明的流体样品纯化系统的再一方面是陶瓷过滤材料的使用，其为陶瓷过滤器提供例如约7,000-10,000磅/平方英寸的机械强度并为图25和26中所示的保持器提供远更高的机械强度以允许高插入力和可靠的过滤器定位(例如由于保持器或过滤器与移液器吸头之间高的机械干预)，而同时抵抗孔隙压缩。在此方面，过滤器或保持器材料具有高机械强度以可靠地定位而同时满足系统性能需要。这样的过滤器或保持器可在远端开口(例如移液器吸头)中形成不可压缩的(或几乎不可压缩的)“塞”。
在某些实施方案中，颗粒的保持或约束在流体样品纯化系统内通过为过滤器的保持器实现。本发明的流体样品纯化系统的过滤器特性包括孔隙或流道特性(例如尺寸)、过滤器的物理尺寸、低的侵入压力以易于开始流动、低的挤出压力以助于简化流体样品的移除、吸附DNA的倾向、和结构特性。
远端颗粒保持器或过滤器中的孔隙必须足够大以实现高流体流率(例如帮助在实验室移液器所提供的较低压力下使纯化时间最小化)，然而足够小以保留官能化颗粒。
在一个优选的实施方案中，基于快速纯化、使被保留的流体样品体积最小化和使产品制造容易的系统要求，颗粒尺寸为50-100μm(直径，如果是粗略球形的话；或最大宽度或长度，如果不是球形的话)。本发明的流体样品纯化系统可因此包括将保留该尺寸的颗粒的过滤器，尤其是有效孔隙直径小于50μm的过滤器。但本领域众所周知，对于给定的流体性质和施加压力的组合，稳态流率将随孔隙尺寸的减小而减小。因此存在满足颗粒保留需要而同时使在通常使用的移液器所提供的施加压力下的流体样品流率最大化的最佳孔隙尺寸。
本领域众所周知，增大直径1.0mm的远端过滤器中的孔隙尺寸将增大流经该过滤器的流率。同样，表2表明，孔隙尺寸为10μm的1.0mm直径过滤器能有效地保留具有最佳大小的颗粒(即直径为50至100μm的颗粒)。但流体流经所述过滤器的速率高于现有技术已知的过滤器，这部分归因于所述过滤器具有对于该尺寸的过滤器而言不寻常地大的孔隙尺寸。虽然其他移液器吸头制造商使用具有类似大小或甚至更大直径的过滤器，但其不能获得与本文中所提供的流体样品纯化系统相当的高流率。图12a-c示出了一种代表性的市售带过滤器的移液器吸头(Thermo Fisher Scientific的AspireTM产品)的流体抽吸和分配压力对时间的曲线。
表2：过滤器对颗粒的保留
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如表2中所示，流体样品纯化系统的实施方案(包含Axygen吸头和FAO10过滤器)保留了二氧化硅颗粒(平均尺寸53-74μm)。管被预先称重并装入0或50μl水。流体样品纯化系统(“原型”)装入5mg未经官能化的颗粒(53-74μm)并在原管中反复抽吸和分配50μl水，持续15个周期。然后用实验室抹布盖住管并让其空气干燥(～96小时)，然后再次称重。处理后，平均起来，对照样品2、3和4重了.231mg，而实验样品5、6和7重了0.2mg，表明在处理过程中没有颗粒漏过过滤器。
图13a-c中示出了本发明的流体样品纯化系统的一个实施方案的类似数据。这些曲线表明，与现有技术(图12a-12c)相比，流体以较高的流率通过本发明的流体样品纯化系统的远端过滤器。该流体样品纯化系统实施方案的对提高的性能作出贡献的特征包括在非常小的直径(例如直径1.0mm)的过滤器中使用20μm和40μm的孔隙尺寸、使用较短长度的过滤器(例如长1.0mm到1.5mm)以及使用较少的功能性颗粒和较少的过滤器。过滤器物理尺寸参数在下面公开。该流体样品纯化系统实施方案中使用的孔隙尺寸和过滤器尺寸产生的流体样品流率可实现短的流体抽吸和分配周期及高水平的流体搅动，其或单独或一起地帮助显著缩短样品纯化时间，而同时满足上述系统设计要求(例如有效地保留50-100μm大小的颗粒)。
过滤器孔隙尺寸的选择还受避免损伤靶物或滤出物(例如ds-DNA)的需要的束缚。图27表明，本发明的过滤器孔隙尺寸和在所述条件下获得的流体样品流率不损伤(即剪切)ds-DNA。相反，本领域中已知，让ds-DNA在不是最佳(即较高)的流率下通过类似大小的孔口将有效地剪切ds-DNA。
在图27中，DNA用移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案(“Diffinity RapidTip”实施方案)处理。图27表明，在15或30个抽吸-分配周期后DNA没有剪切损伤的迹象。从λ-DNA模板和定制引物(正向：TGA AAC GCT TGC TGC AAC GCC AAA[SEQ IDNO：1]和反向：AAA GCA ATT GGC GGT GAT GTA AAC ACT ATG[SEQ ID NO：2])产生了约2Kb(1956bp)PCR产物。将储备样品分成对照和处理样品。DG处理用25μl DNA样品在含2.5mg未经官能化的材料的移液器吸头形式的流体样品纯化系统中进行(Axygen吸头，FAO10过滤器-600g插件)。将样品交替地抽吸和分配15或30次。将等体积(5μl)的对照和处理样品在1％琼脂糖凝胶上相邻的泳道中试验，凝胶还含标准的DNA阶梯(Invitrogen 1Kb Plus)。典型的处理需要约15个抽吸-分配周期，产生2倍的安全余量。
本发明的流体样品纯化系统因此提供了保留具有最佳大小的颗粒的最佳过滤器孔隙尺寸，而同时允许流体在低的施加压力(即可自典型的移液器得到的那些)下以高流率流经过滤器而不损伤滤出物(例如ds-DNA)。
同流体样品纯化系统中的其他子系统一样，远端过滤器的物理尺寸受竞争的设计要求的支配。所述过滤器优选足够小以使样品死体积最小化(即允许将过滤器更靠近移液器吸头的远端安放)和使被保留的样品体积最小化(即具有极小的空隙体积和低的挤出压力)。同时，所述过滤器的横截面积必须足够大以提供低的流体流动阻力(例如较大数量的孔隙供流体通过)和制造的容易性。较低的流体分配速率将使移液器吸头内的搅动最小化，继而可能降低所达到的纯化水平和因此降低纯化样品质量水平或者增长达到特定的样品质量水平所需的时间(即样品抽吸/分配周期数)。
所述过滤器优选在多个过滤器上保持恒定的压力降，这在当在同时使用多个移液器吸头的流体处理系统如多通道移液器中使用任何移液器吸头(功能性或其他)时是需要的。这样的系统中的各个移液器吸头通常与共用的真空/压力歧管相连，在流体抽吸/分配周期过程中，所述真空/压力歧管向各个移液器吸头施加相同的真空/压力并持续相同的时间。用于一个或多个移液器吸头中的过滤器上真空/压力降的差异可能导致抽吸/分配周期过程中移液器吸头抽吸和分配较多或较少的流体。这可能在低流量移液器吸头中导致纯化不够、在高流量移液器吸头中导致溢流或二者。
本发明的流体样品纯化系统以若干方式克服了这些相冲突的要求。对于伴随功能性移液器吸头的最大过滤器直径需要(即大约1-2mm)和其通常需要处理的非常小的样品体积(例如5-50μl)，可使用大的过滤器孔隙尺寸(例如20μm和40μm)。在一个实施方案中，可使用过滤材料(例如陶瓷)，其将提供可靠地保持孔隙尺寸所需的结构强度，包括当受到高的过滤器插入力时，特别是如图24中所示移液器吸头内锥度所致的垂直于过滤器表面的力，以及在过滤器制造和组装过程中。在另一实施方案中(图25和图26)，过滤器由设计的不要求流经过滤器的流动管道所代替。在此实施方案中，没有经受插入力所致的压缩的多孔构件。
可以使用具有较短总长和因此较低流体流动阻力的过滤器。流经多孔过滤器的流动阻力随过滤器长度增加，因为对于较长的过滤器，流经过滤器的路径也较长。同时，出于制造目的，需要设计具有不同的直径和长度尺寸(例如长度比过滤器直径长或短50％)的过滤器，其可用来帮助组装过程中过滤器的定向。因此，本发明的流体样品纯化系统和方法的又一要素是产生和使用例如长度仅为1.0mm、长度为例如0.50或1.5mm并因此使得流体流动阻力比具有更高长径比的过滤器小的过滤器的能力。在一个实施方案中，可以使用单个过滤器。
在另一实施方案中(图26)，过滤器由设计的利用实心保持器的流动管道所代替，由此，实心(即无孔)保持器的高结构强度使得其非常薄，例如对于2-6mm的移液器内径，其厚0.10到1.0mm，从而提供流体流动阻力的进一步减小。
图5a和5b描述了尺寸大于移液器吸头吸嘴(即移液器吸头远端)的内径的颗粒的使用，其中内部轴向延伸的肋容留颗粒而同时允许流体绕颗粒外部进出移液器吸头。所述肋可以由模制在移液器吸头中的部件或者是插入移液器吸头中以提供相同的颗粒保持功能的单独的件组成。该后一部件将提供防止球形或接近球形的颗粒堵塞移液器吸头的吸嘴的附加好处。
图28a-b示出了类似于“茶叶袋”的多孔包装的使用，所述多孔包装可被置于移液器吸头中。在此实施方案中，所述包装由多孔膜如生物惰性聚丙烯网片或类似材料组成，其中所述网片的有效孔隙尺寸小于被保留在所述包装内的颗粒的尺寸。
图29示出，可将吸附材料或吸附剂附着于移液器吸头的内表面，从而消除对任何过滤器的需要。
图30示出了又一改进，其中将吸附材料或吸附剂附着于压缩成一个小膜体或多个膜体并置于移液器吸头内的膜的表面。所述压缩膜通过利用比移液器吸嘴的最大直径大的压缩膜体被阻止通过移液器吸头的远端，从而消除对任何过滤器的需要。
图31示出了又一改进，其中将吸附材料或吸附剂附着于移液器吸头内用来增大可润湿表面积的多个部件如多个内部轴向延伸的肋。所述肋可以是移液器吸头不可分割的部分(即移液器吸头的模制部件)或者是模制前(即夹物模制)或模制后安放在移液器吸头内的预成型构件，从而消除对任何过滤器的需要。
某些实施方案中第二过滤器的不存在可因此减小由第二过滤器所致的流体流动(或样品液体或移液器空气)阻力。同样，流体样品纯化系统使用的自由悬浮颗粒消除了对前述Zip-Tip所用较长柱(即色谱树脂)的需要，这是由于Zip-Tip产品实施方案可以安放在给定长度的过滤器中的颗粒数有限。
在本发明的流体样品纯化系统的另一实施方案中，也可使用图32中所示的移液器吸头形式。该设计通过在移液器吸嘴处采用小膛径并快速增大移液器吸头的内径以容纳较大过滤器而可容纳具有较大横截面积和因此较低流体流动阻力的过滤器，同时使样品死体积最小化。
由于许多样品处理程序通常使用大约5-50μl的流体样品体积，部分由于相竞争的使内部空隙体积最小化的需要和保留样品体积的可能，故过滤器横截面积不能被制得任意地大。受保留具有最佳大小的颗粒的需要所加的孔隙尺寸限制的束缚，直径小于1.0mm的过滤器将难以制造且不具有足够的孔隙数量以产生足够高的流体样品流率。此外，增大过滤器尺寸可能截留过大的流体样品体积。空隙百分率为50％的直径1.0mm、长1.5mm的过滤器(即适于处理大约5-10μl样品体积的过滤器)的空隙体积将为0.6mm3或0.6μl，或者说是5.0μl样品体积的约12％。同样，空隙百分率为50％的直径2.0mm、长3.0mm的过滤器(即适于处理大约10-25μl样品体积的过滤器)的空隙体积将为4.7mm3或4.7μl，或者说是25μl样品体积的总体积的约18％。比较起来，空隙百分率为50％的直径3.0mm、长4.50mm的过滤器(即适于处理大约25-50μl样品体积的过滤器)的空隙体积将为15.9μl，其为50μl样品体积的约32％，这样的损失甚至对于该大小的样品体积来说也不可接受地高。
虽然本发明的流体样品纯化系统由于前面指出的原因而可更有效地回收样品体积，但可能存在不能使用具有较大孔隙尺寸或具有亲水表面的过滤器的应用(例如需要过滤器具有疏水表面和因此较高的流体挤出压力时)。例如，对于特定的最终应用，可能并不总是需要大的过滤器孔隙尺寸和具有更亲水的表面的过滤器，因此仍必须考虑过滤器尺寸。由于许多样品处理程序通常使用5-50μl的流体体积，故可使用1.0-3.0mm的远端过滤器直径来处理大约5-50μl的流体体积，其对应的最大样品体积损失是大多数应用可以容忍的。
该过滤器尺寸范围还提供在典型的移液器压力下取得高样品流率而同时保留具有最佳尺寸的颗粒的能力。此外，由于该尺寸的过滤器所产生的低压力降相对于通常使用的移液器所产生的压力来说小，故归因于例如制造过程可变性的过滤器到过滤器压力降变化也将小，从而有助于确保可接受的过滤器到过滤器压力降变化水平和因此不同的移液器吸头上更一致的流动性能。
因此，本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头和远端过滤器设计使其可获得高样品回收率、高流率、更均一的吸头到吸头流率(例如抽吸和分配速率)和易于制造性，而同时满足前述系统性能要求。
在一个实施方案中，流体样品纯化系统使用具有低流体流动阻力和低靶物(例如DNA)吸附特性的远端保持器设计。此外，通过不将其吸附材料容留在多孔基体(例如Millipore的Zip-Tip)内，流体样品纯化系统还将避免伴随容留足够体积的吸附材料所需的较大多孔基体的高流动阻力。伴随流体样品纯化系统的此方面的增大的流体流率将提供如下好处：
(1)由于流体抽吸和分配周期时间较短，故纯化过程时间缩短。
(2)由于在样品抽吸和分配过程中更高的流体流率导致更高的搅动水平，继而导致更快的吸附，故纯化过程时间缩短。
(3)通过消除潜在昂贵的部件(例如Millipore的具有整合的吸附化学的多孔过滤器)而降低了产品制造成本。
虽然不与流体流率直接相关，但本发明的流体样品纯化系统使用的远端过滤器将避免因多孔基体相对于其中所容留的吸附材料的表面积而言的大表面积使靶物质被连接吸附材料于多孔基体表面的纯化系统所伴随的大表面积所吸附而降低靶物收率。此外，照这样，由于样品通过用来容留吸附材料的较大多孔基体，故还避免了对靶物质的损伤(例如剪切靶DNA)。
在优选的实施方案中，流体样品纯化系统包含这样的远端保持器，其具有非常低的流体流动阻力、一致的流体流动阻力、均一的流体流动管道尺寸、低的样品保留量和低的成本。与现有技术流体样品纯化系统不同，具有此远端颗粒保持器设计的流体样品纯化系统实施方案在移液器吸头内具有部件而不是单独的过滤器来提供颗粒保持功能。
在图25中，移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头‘A’内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过由移液器吸头‘A’与插件‘B’间的空间所形成的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由插件‘B’中的凹进精确确定，例如由在移液器吸头注塑过程中精确地形成所述件的该特征的注模精确确定。流动导管‘D’的宽度‘E’选择为使流体流动阻力最小化，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
在图26中，移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。与图25中所示的流体样品纯化系统的实施方案不同，流动导管在移液器吸头‘A’的内壁中产生。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过形成进移液器吸头‘A’的壁中的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由在移液器吸头注塑过程中精确地形成移液器吸头‘A’的内表面的移液器吸头注模的“芯”精确确定。同前面一样，流动导管‘D’的宽度‘E’选择为使流体流动阻力最小化，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
此过滤器设计具有有效地保持颗粒于移液器吸头内的能力。例如为0.002英寸(相当于50微米)的导管尺寸将有效防止50微米或更大的颗粒通过。在处理流体时，颗粒常常呈各种方式。取决于尺寸、形状、比重和搅动水平，常使用50至500微米或更大的颗粒来处理流体。因此，优选的导管宽度‘E’为0.002英寸到0.020英寸(即50-500微米)，最优选0.002至0.006英寸(50至150微米)。
此颗粒保持器设计具有使流动阻力最小化的能力。众所周知，较大的流动横截面将具有较小的流体流动阻力。相对于例如多孔过滤器如多孔滤头而言，此流体样品纯化系统实施方案中移液器吸头‘A’与插件‘B’之间产生的半球形导管将提供大的通流面积和因此低的流体流动阻力。在图25和图26中，为0.060英寸的移液器吸头内径和具有四个0.010英寸宽的定位翼片的插件(其产生0.004英寸的导管宽度)将提供0.000554平方英寸的总流动横截面积。比较起来，0.020英寸直径的移液器吸头吸嘴的流动横截面为0.000314平方英寸。在此特定的实例中，流动导管的横截面积是无限制的移液器吸嘴的1.76倍。同样，本实施方案的流动导管也远大于相同尺寸的任何多孔滤头或膜的有效流动横截面积。此外，本实施方案的直通流道设计将比相等厚度的多孔材料如多孔滤头产生较小的流体流动阻力。该设计使流动限制器‘B’的厚度‘t’最小化并因此使流动阻力最小化。
众所周知，流动通过导管的阻力与导管的长度成正比，长度越短产生的流动阻力越小。因此在本发明中，导管的长度‘t’优选小于导管的直径(例如安放插件处移液器的内径)，最优选长度介于插件尺寸的10％至50％。
该优选实施方案的其他特性将在6.1部分(实施例1)中讨论。
5.6使用松散堆积的颗粒以提高吸附效率
在另一实施方案中，可在壳体内使用松散堆积的颗粒或吸附材料。与现有的流过纯化装置如液相色谱柱不同，本发明的流体样品纯化系统的吸附材料可在被抽吸进移液器吸头中的溶液内自由移动而增大其与更大量的所需待吸附物质相遇的可能性。所述颗粒的吸附能力因此提高，其从溶液中更完全地移除物质的能力(即吸附效率)提高，同时减少纯化样品所需的时间(即过程时间)。优选壳体(移液器吸头)(图20d)内的颗粒体积使得移液器吸头内的自由体积(即图20d中标示为“自由体积”的不含颗粒的内部体积)大于或等于颗粒周围的空隙体积(图20d中标示为“颗粒空隙体积”的)。这将确保当流体被抽吸进移液器吸头中时进入颗粒周围的空隙体积的样品流体可以完全被起初未暴露于颗粒的流体代替至少一次。这将有助于确保样品流体不停滞在移液器吸头内颗粒周围，从而增加固定在颗粒上的吸附材料与待从样品溶液移除的物质相遇并结合的可能性。
在另一实施方案中，吸附材料或吸附剂被置于颗粒(如本文中所述)上，所述颗粒或被加到含待纯化的样品的容器或在加入样品流体之前即已含在容器中，由此，吸附材料或吸附剂可附着于待从溶液中移除的物质(例如单链DNA)，例如图13中所示。所述容器可以是本领域已知的用来容纳流体样品的任何适宜容器(或多个容器)，例如试管、微孔板、微量离心管、PCR反应容器等。含从样品中分离出的物质的颗粒然后通过若干颗粒分离方法如过滤、沉降、离心或磁分离中的任一种或多种与样品(例如杂质)分离开。在后一情况下，颗粒应具有磁性。
5.7移液器吸嘴和颗粒保持器孔口尺寸及流体分配速度
将特定颗粒尺寸保留在移液器吸头内的需要对最大移液器吸头吸嘴尺寸和/或远端布置的颗粒保持器的最大孔隙尺寸提出了要求。高的流体剪切速率已知将损伤流体样品中的分析物如核酸(参见Bowman和Davidson，Biopolymers 11，2601(1972)，Hydrodynamic shearbreakage of DNA；Yew和Davidson，Biopolymers 6，659(1968)；Balbi等，A simple model for DNA elution from filters，Evensen，Meldrum andCunningham，Review of Scientific Instruments，Volume 69，Number 2，1968，Automated fluid mixing in glass capillaries)。因此，存在移液器吸嘴和/或颗粒保持器孔口尺寸与流体速度的最佳或适宜组合，其使得含颗粒的移液器吸头可以高效地传递流体而不损伤分析物。
因此，在另一实施方案中，移液器吸头中孔口的尺寸(即吸嘴直径)或颗粒保持器中孔口的尺寸(如薄膜穿孔直径)与流体分配速率的组合选择为既容留颗粒又同时保持流体剪切力足够低以避免损伤DNA。用来确定移液器吸头吸嘴或颗粒保持器穿孔直径与流体流率的组合的流体剪切应力的分析是本领域已知的(参见Bowman和Davidson，Biopolymers 11，2601(1972)，Hydrodynamic shear breakage of DNA；Yew和Davidson，Biopolymers 6，659(1968)；Balbi等，A simple model forDNA elution from filters，Evensen，Meldrum and Cunningham，Review ofScientific Instruments，Volume 69，Number 2，1968，Automated fluidmixing in glass capillaries)。
图48示出了关于一系列移液器吸头吸嘴或颗粒保持器穿孔直径(列)和流体流率(行)的流体剪切速率的汇总表。基于Bowman的流体可不损伤DNA地经受的最大许可剪切应力的报道，图48中针对两种不同的DNA浓度给出了移液器吸头吸嘴或颗粒保持器穿孔直径与流体流率的一系列许可组合；所述两种浓度为：典型的PCR后DNA扩增浓度(通常100ng/μl)和典型的DNA测序样品浓度(通常10ng/μl)。按Bowman的报道，两种样品浓度可分别承受不超过约2,300和230达因/Cm2的剪切应力。图48中的表载明了在不损伤流体样品中的DNA的情况下可使用的移液器吸头吸嘴或颗粒保持器穿孔直径与流体流率的许可组合。
例如，看图48中的表，对于DNA浓度为100ng/μl的样品：由孔隙尺寸为10μm的薄膜组成的远端颗粒保持器可承受不超过0.05μl/sec的穿过保持器中各个孔隙的流率，0.05μl/sec的流率将产生所示的1286达因/Cm2的流体剪切应力。假定该薄膜保持器每平方米含约2.5*109个孔隙，则具有0.50毫米孔口的移液器吸头将含508个这样的孔隙。可使用“移液器吸头吸嘴流量考虑事项”(下面)中给出的分析进行该计算。
因此，通过这样的保持器的最大流体流率应为(508个孔隙)*(0.05μl/sec)或者说25.4μl/sec。对于典型的50μl样品体积，该特定移液器吸头和颗粒保持器设计将需要花约两秒来将样品流体抽吸进移液器吸头中(即50/25.4)。
移液器吸头吸嘴流量考虑事项
本领域众所周知，核酸(特别是DNA)可能因含DNA的溶液暴露于高流体剪切力下而受损(即“被剪切”成较短的长度)。下面的分析考察流体流动通过移液器吸头吸嘴和可渗透织物的情况以创建有助于最小化或消除这类损伤的流动条件。
情形I：流动通过直径＝0.020英寸(0.0508cm)的移液器吸嘴的剪切应力
该吸嘴的横截面积(“A吸嘴”)因此为πD2/4＝2.03×10-3cm2。
考虑50微升/秒的流经移液器吸头吸嘴的典型流体流率(“Q”)，其等于0.050毫升/秒，还等于0.050cm3/秒。
流经圆形孔口的平均流速(“Vavg”)定义为Q/A吸嘴，其等于(0.050cm3/sec)/(2.03×10-3cm2)＝24.6cm/sec。
流体剪切应力定义为τ＝μx(dVavg/dY)，其中μ＝流体的动力粘度，dVavg/dY为速度梯度，其因此＝(24.6cm/sec)/(0.0508cm/2)＝968/sec。
μ水＝20℃下＝0.0101泊＝0.0101达因-sec/cm2。
因此，在这些条件下的流体剪切应力＝(0.0101达因-sec/cm2)×968/sec)，其等于9.8达因/cm2。
情形II：流动通过直径＝0.005英寸(0.0127cm)的移液器吸嘴的剪切应力
该吸嘴的面积因此＝1.27×10-4cm2。
考虑相同的流体流率＝0.050cm3/秒。
平均流速因此等于(0.050cm3/sec)/(1.27×10-4cm2)＝395cm/sec。
速度梯度因此＝(395cm/sec)/(0.0127cm/2)＝62,200/sec。
考虑相同的流体动力粘度＝0.0101达因-sec/cm2。
因此，在这些条件下的流体剪切应力＝(0.0101达因-sec/cm2)×62,200/sec)，其等于628达因/cm2。
考虑以直线方式织造的含交替的10微米纤维的织物网片，其中各个方向上的各个相继的纤维间隔20微米的距离，从而产生穿透织物网片的10微米孔的“棋盘”阵列(即网片中的“孔隙”)。这种简单的直线网片设计因此在每3个含纤维的空间中产生1个孔隙。换句话说，孔隙百分率为1/(1+3)＝25％。因此，一平方厘米这样的织物将含25×10+4个10微米孔隙，或者说孔隙密度为25×10+4个孔隙/cm2。
情形III：流动通过置于0.020英寸直径的吸嘴上的10微米网片的剪切应力
0.020英寸或0.0508cm直径的横截面积＝2.03×10-3cm2。
照上面，网片具有25×10+4个孔隙/cm2。因此，覆盖吸嘴的孔隙数等于(25×10+4个孔隙/cm2)×(2.03×10-3cm2)＝508个孔隙。
考虑相同的流体流率＝0.050cm3/sec。假定该流量在所有孔隙上平均分配，则通过各个单独的孔隙的流率为(0.050cm3/sec)/(508个孔隙)，其等于0.00010cm3/sec。
由于各个单独的孔隙的面积为1.0×10-6cm2，故平均流速等于(0.00010cm3/sec)/(1.0×10-6cm2)＝100cm/sec。
速度梯度因此＝(100cm/sec)/(0.001cm/2)＝200,000/sec。
考虑相同的流体动力粘度＝0.0101达因-sec/cm2。
因此，在这些条件下的流体剪切应力＝(0.0101达因-sec/cm2)×200,000/sec)，其等于2,020达因/cm2。
情形IV：流动通过置于0.010英寸直径的吸嘴上的10微米网片的剪切应力
吸嘴的横截面积＝0.508×10-3cm2。
覆盖吸嘴的孔隙数等于(25×10+4个孔隙/cm2)×(0.508×10-3cm2)＝127个孔隙。
考虑相同的流体流率＝0.050cm3/sec。通过各个单独的孔隙的流率为(0.050cm3/sec)/(127个孔隙)，其等于0.00040cm3/sec。
平均流速因此等于(0.00040cm3/sec)/(1.0×10-6cm2)＝400cm/sec。
速度梯度因此＝(400cm/sec)/(0.001cm/2)＝800,000/sec。
考虑相同的流体动力粘度＝0.0101达因-sec/cm2。
因此，在这些条件下的流体剪切应力＝(0.0101达因-sec/cm2)×800,000/sec)，其等于8080达因/cm2。
参考Bowman等的“Hydrodynamic Shear Breakage of DNA”，Biopolymers 11，2601(1972)，特别是图4-起动DNA断链所需的剪切应力，我们看到，对于每1.0微克DNA/毫升溶液，需要23达因-sec/cm2的阈值剪切应力(即坡度)，或者说是23达因-ml/cm2-微克。
典型的聚合酶链反应浓度为100ng DNA/μl溶液，其等于100μg/ml溶液。因此，避免起动DNA剪切的最大许可流体剪切应力应为：
(23达因-ml/cm2-微克)×(100微克/ml)＝2,300达因/cm2。
同样，用于测序这种流行的DNA分析技术的典型DNA浓度为约10ng DNA/微升溶液，其等于10微克/毫升溶液。因此，避免起动DNA剪切的最大许可流体剪切应力应为：
(23达因-ml/cm2-微克)×(10微克/ml)＝2,300达因/cm2。
移液器吸头吸嘴和过滤器孔隙的实际尺寸、样品流率、及样品中DNA的浓度将决定各个具体应用的许可过程条件。
图48中针对两种流行的DNA浓度(即PCR和Sanger测序)列出了一系列流率的移液器吸头吸嘴直径和网片孔隙尺寸的阵列的汇总。
5.8吸附材料的表面积
在另一实施方案中，任何含吸附材料或吸附剂的载体(例如颗粒或膜)的表面积优选为0.001至0.500平方米/50μl样品体积。本发明的这个方面将产生高的吸附材料表面积/流体体积比率，该比率将提供小尺寸的装置包从50μl样品体积吸附适当比例的物质的能力。对于需要从溶液可靠地移除特定量的物质的领域，这将提供高的设计安全度。
5.9吸附材料的固定
在另一实施方案中，吸附颗粒(或材料)被固定到载体(或多个载体)上，其中所述载体的尺寸大于移液器吸头吸嘴孔口的直径。在此实施方案中，较小的颗粒被阻止从较大的移液器吸嘴出去或是堵塞吸嘴并依靠其附着于较大的载体而阻止流体流过吸嘴。
在此特定的实施方案中，载体的最小弦长大于跨越移液器吸头吸嘴的最大维度和/或在移液器吸头的远端和/或近端处的保持措施的最大有效开口尺寸。这样的载体的一个实例为图15a中所示的细长膜。在该特定的实例中，载体的宽度(图15a中示为“最小载体宽度”)宽于移液器孔口的直径。
5.10吸附材料的包装
在另一实施方案中，吸附材料被置于与“茶叶袋”类似的多孔包装中，所述多孔包装被置于移液器吸头中，如图28a-b中所示。在此实施方案中，所述包装由多孔膜如生物惰性聚丙烯网片或类似材料组成，其中所述网片的有效孔隙尺寸小于被保留在所述包装内的颗粒的尺寸。可以将该多孔容器一次或多次地放进含待从样品中移除的物质的壳体中并随后取出。
在另一实施方案中，含单一吸附材料的颗粒被置于包装中(含两个或更多个颗粒，例如图28b中所示)，两个或更多个包装被置于移液器吸头中。
在另一实施方案中，包装含颗粒的混合物，其中各个颗粒或含不同的吸附材料或是单个颗粒上含多种吸附材料，且一个或多个小包装被置于移液器吸头中。
在另一实施方案中，两个或更多个包装被置于移液器吸头中，其中各个包装含与被置于移液器吸头中的其他包装中所含吸附材料不同的单一吸附材料。
吸附材料的预先包装将简化移液器吸头制造过程中试剂的装载。其可允许对装载进移液器吸头中的吸附材料的体积和类型作出大的改变。含颗粒的包装可用上文中描述的任何保留颗粒的方法保持在移液器吸头内。当使用一个包装时，优选该包装的形状(例如图28a中角度θ所示的其锥度)与移液器吸头内部的形状相似，或者该包装是柔性的以便在施加小的包装插入力时能适形于移液器吸头的内部，从而确保最大流量的样品流体流经包装而非绕包装流过。
在该实施方案的另一方面中，使用了大小与移液器吸嘴的内径相似的最小包装直径“D”以使包装与移液器吸嘴之间的流体的体积(即样品“死体积”)最小化。由于不同大小的移液器吸头需要不同的“D”尺寸，故此要求适当地表示为限制此“死体积”优选不大于被抽吸进移液器吸头中以便纯化的样品流体的体积的10％。
在另一实施方案中，代替使用多孔材料来形成包装的做法，可使用例如生物惰性的粘合剂将颗粒粘结在一起形成单个颗粒体，这与图28a中所示相似，但不需要具有多孔壁的容器来容纳颗粒。在此实施方案中(在图28c中示出)，该单个颗粒粘结体被置于移液器吸头中。
在另一实施方案中，两个或更多个颗粒粘结体被置于移液器吸头中，其中各个颗粒含单一的相同的吸附材料。该特定构造在图28d中示出。
在另一实施方案中，一个或多个颗粒粘结体被置于移液器吸头中，其中各个粘结体含两种或更多种不同的吸附材料。根据此方面，各个粘结体中可使用多个颗粒。例如，各个颗粒可含不同的吸附材料或是各个单个颗粒上可含多种吸附材料。该特定构造在图28f中示出。
在另一实施方案中，两个或更多个颗粒粘结体被置于移液器吸头中，其中各个粘结体含与被置于移液器吸头中的其他颗粒粘结体中所含吸附材料不同的单一吸附材料。该特定构造在图28e中示出。
这些实施方案具有如下优势。在移液器吸头制造过程中试剂的装载得到简化。装载进移液器吸头中的吸附材料的体积和/或类型可有大的改变。颗粒粘结体可用本文中针对颗粒所描述的方式保持在移液器吸头内。
当使用一个粘结体时，优选该粘结体的形状(例如类似的图28a中角度θ所示的其锥度)与移液器吸头内部的形状相似，或者该粘结体是柔性的以便在施加小的插入力时能适形于移液器吸头的内部，从而确保最大流量的样品流体流经包装而非绕包装流过。图28a还示出，可使用大小与移液器吸嘴的内径相似的最小粘结体直径“D”以使颗粒粘结体的远端与移液器吸嘴之间的流体的体积最小化。由于不同大小的移液器吸头需要不同的“D”尺寸，故此要求适当地表示为限制此“死体积”优选不大于被抽吸进移液器吸头中以便纯化的样品流体的体积的10％。
5.11吸附材料的定位
在另一实施方案中，吸附材料被附着于移液器吸头的内表面(图29)。在另一实施方案中，移液器吸头被涂布以两种或更多种不同的吸附材料。
在另一实施方案中，吸附材料或吸附剂被附着于置于移液器吸头内的膜的表面(图34)。优选该膜被卷成柱(例如螺旋)以提供大的膜表面积。在此实施方案中，卷的直径优选大于移液器吸嘴的直径以容留所述膜于移液器吸头内。所述膜也可用前面针对容留颗粒或含颗粒的包装或粘结体所述的方式保持在移液器吸头内。该特定实施方案的又一改进是使用多孔膜以进一步增大表面积和因此被膜所容留的吸附材料的量，从而进一步提高可被给定尺寸的膜移除的物质的量。
在另一实施方案中，吸附材料或吸附剂被附着于压缩成一个小膜体或多个膜体并置于移液器吸头内的膜的表面(图30)。在此实施方案中，压缩膜通过利用比移液器吸嘴的最大直径大的一个或多个压缩膜体被阻止通过移液器吸头的远端。所述压缩膜如本文中所述保持在移液器吸头的近端中。
在另一实施方案中，吸附材料或吸附剂被附着于移液器吸头内用来增大可润湿表面积的多个部件如多个内部轴向延伸的肋，例如图31中所示的那些。在此实施方案中，肋可以是移液器吸头不可分割的部分(即移液器吸头的模制部件)或者是模制前(即夹物模制)或模制后安放在移液器吸头内的预成型构件。在后一实施方案中，所述预成型插件通过利用横截面积比移液器吸头吸嘴的直径大的预成型插件保持在移液器吸头的远端内。所述插件用本文中所述的各种方法和/或通过使用粘合剂或各种焊接技术如超声波焊接或激光焊接保持在近端处。
在另一实施方案中，壳体如试管或PCR反应容器中使用了可分解的多孔材料。在此实施方案中，可分解的介质可或被加到已含待纯化的样品的容器，由此，其通过毛细流动将待纯化的样品流体吸附进介质中、纯化样品并随后分解，或在加入样品流体之前即已含在容器中，由此，样品流体的加入导致流体被多孔介质通过毛细流动吸附进介质中、纯化样品流体、随后颗粒体分解。在任一情况下，毛细流动诱导的流体吸取将消除流体吸取过程中对专门的流体处理装置的需要。含杂质的颗粒按本文中所述与含经纯化的DNA的样品分离开来，分离方法包括过滤、沉降、离心、磁分离或其他分离技术。在磁分离的情况下，可分解的多孔介质应由具有磁性的颗粒组成。应理解，所述可分解的多孔介质体可含一种吸附材料或多种吸附材料。
吸附材料或吸附剂可被附着于置于移液器吸头内的高表面积材料，例如一个或多个多孔介质体的内和/或外表面，例如由亲水(即可润湿)材料的生物惰性基体组成的“海绵体”。适宜的可润湿材料是本领域熟知的。例如，固有地低润湿材料如聚丙烯的可润湿性可通过用氧等离子体激活表面并然后用PEG处理来提高。同样，二氧化硅材料的可润湿性可通过使其与寡聚乙二醇硅烷反应来提高。该实施方案包括大涂布表面积/单位样品体积的优势。待纯化的样品流体与多孔介质保持器的远端接触(图35)。通过例如流体压力的施加或以机械方式对多孔介质减压而在多孔介质体上产生的毛细压力和/或流体压差迫使流体进入多孔介质中，在这里，其与吸附材料接触。流体通过例如以物理方式压缩多孔介质保持器、在多孔介质上施加流体压差、或通过使多孔介质保持器的远端与比多孔介质保持器内的多孔介质具有更高表面能(即更高毛细力)的材料接触而使流体从多孔介质中挤出。使用毛细压力将流体传递到移液器吸头中消除了用装置如移液器来在流体吸取(即抽吸)过程中施加流体压力的需要。所述多孔介质通过本文中所述的方法保持在近端处。
本发明的流体样品纯化系统不限于使用压缩和/或流体压差来从多孔介质提取流体。实现此功能的其他实施方案可包括但不限于如下本领域已知的流体提取方法：(1)将移液器吸头和多孔介质暴露于离心力(例如在离心机中旋转移液器吸头)以迫使样品流体从介质中出来；(2)从移液器吸头取出多孔介质并施加压缩和/或流体压差以迫使样品流体从介质中出来。
在另一实施方案中，吸附材料用上述载体的组合如颗粒和/或颗粒包装和/或涂布的移液器内表面和/或膜被引入到移液器吸头中。
在另一实施方案中，吸附材料或吸附剂被附着于一个或多个由粘结颗粒组成的多孔介质体的表面(外表面和/或内表面)，还有的特征是，所述多孔介质可分解从而将粘结颗粒释放进溶液中，使得颗粒可例如通过沉降停留在溶液中，所有这些均在待纯化的样品流体与所述颗粒接触后发生。在此实施方案中，颗粒用本领域已知的适宜方法粘结在一起，例如通过使用：糖或其他可分解的生物相容粘合剂；静电吸引如通过用正电荷和负电荷材料涂布至少部分颗粒表面；或可分解的容纳颗粒的包装如与封装药物所用相似的多孔明胶材料。
该实施方案具有利用进入多孔介质中的毛细流动来促进流体吸取、利用粘结颗粒和多孔介质的分解、及简化纯化样品从颗粒的回收的附加好处。当在移液器吸头内使用这种颗粒构造时，含待从溶液移除的物质的可分解颗粒如本文中所述被保留在移液器吸头内。所述可分解的多孔介质体可含吸附材料的多种组合。
5.12颗粒的搅动
在另一实施方案中，通过例如使用摇动和/或振动对含松散堆积颗粒的上述移液器吸头或反应容器加以搅动，以增强颗粒在样品溶液中的运动和因此进一步提高其与样品中待移除的物质相遇的可能性，从而进一步提高其吸附能力(即从样品移除的物质的体积或质量)。使用流体搅动通常在样品流体与吸附表面之间产生高剪切力，并从而使吸附表面处质量扩散边界层的厚度最小化，这将有助于提高可被吸附的物质向被固定的吸附材料扩散的速率，从而使吸附样品中的物质所需的时间最小化。使用流体搅动还将增大含吸附材料的颗粒与待吸附的物质相遇的可能性，从而进一步提高吸附过程的效率。在一个特定的实施方案中，使用了混合过程，其中将待纯化的样品流体或其一部分交替地抽吸进出移液器吸头两次或更多次。
在另一实施方案中，通过使用磁力搅拌搅动移液器吸头或反应容器中的颗粒，以增强颗粒在样品溶液中的运动和因此进一步提高其与样品中可被吸附的物质如DNA相遇的可能性，从而进一步提高其吸附效率和吸附能力并缩短做到这所需的时间。在此实施方案中，颗粒应具有磁性。
在另一实施方案中，含颗粒的包装(例如图36中所示)被插入样品流体中并通过例如使用搅拌或反复插入和取出加以搅动，以增强流体流过样品溶液中所述容器的运动，从而提高与待吸附的物质如DNA相遇的可能性，由此提高其吸附效率并缩短做到这所需的时间。
5.13样品的热失活与变性
在另一实施方案中，壳体(例如移液器吸头或其他含样品的容器)被加热以使流体样品中的核酸(例如DNA)变性并实现作为双链核酸分子(例如ds-DNA)变性的结果发生的单链核酸(DNA)的吸附。在一个特定的实施方案中，变性在松散堆积的官能化颗粒或吸附材料的颗粒的存在下进行。
在本实施方案的一个特定改进中，样品流体被加热至优先使双链DNA如含碱基对错配并因这些错配而相对于其他DNA序列降低变性温度的杂交DNA对变性的温度。然后从溶液中选择性地移除被颗粒吸附的错配DNA。
在另一实施方案中，壳体(例如移液器吸头或其他含样品的容器)被加热以使其他杂质如用来促进PCR反应的酶——Taq聚合酶失活。
5.14靶物吸附
本发明的流体样品纯化系统可与同时吸附其他(不期望的)DNA物质的吸附材料组合地包含低靶物(例如DNA)吸附功能性移液器吸头(或柱)和/或低靶物DNA吸附过滤材料。
任何核酸流体样品纯化系统的性能可部分地通过纯化过程所返回的靶核酸的量来评估，所述量常称为“靶物收率”。
许多现有产品通过起初既吸附杂质(例如未整合的PCR引物和核苷酸)又吸附所需靶物(例如PCR扩增子)、然后利用杂质与所需靶物的溶解度差异顺序地再悬浮和移除各物质来分离生物物质。本发明的流体样品纯化系统的运行与之大不相同，其通过仅吸附杂质而同时排斥所需靶靶物起作用，所有这些均在单个步骤中进行，这是一个相当大的优势。因此，与现有纯化产品不同，本发明的流体样品纯化系统中使用的接触流体样品的材料需要抵抗而不促进不期望的所需靶物(例如ds-DNA)的吸附，因为没有其他步骤可利用来洗脱可能与流体样品纯化系统中使用的任何接触流体的材料结合的任何靶物质。相反，现有纯化产品不要求此条件。在实践中其也难以达到，因为核酸趋于在一定程度上与许多表面结合。
图37表明，常规过滤材料可吸附显著量的DNA。相反，本发明的流体样品纯化系统的另一方面包括包括抵抗所需靶物的吸附的过滤材料在内的流体样品接触材料的同时使用。材料的具体选择随应用和具体靶物类型而异。对于其中靶物为DNA的应用来说，在6.0-9.0的pH下具有中性或负表面电荷的材料吸附DNA的亲和性非常低。二氧化硅就是一种这样的材料，其吸附DNA的亲和性非常低。过滤器优选无任何在过滤器制造过程中使用的添加物，因为许多有机和无机取代基也可能结合DNA。图37示出了这样的过滤器，一种包含二氧化硅和氧化铝复合物的陶瓷过滤器。
本发明的流体样品纯化系统和方法的另一方面在于通过最小化过滤器面积而最小化靶物吸附(例如DNA吸附)的能力，过滤器面积是过滤器孔隙尺寸的函数。图38示出了两种不同的过滤材料SLA和SCT(均为二氧化硅和氧化铝复合物)和两种不同的过滤器孔隙尺寸(20μm和40μm)下被吸附的DNA的量。从该图明显可以看出，无论过滤材料是哪种类型，较大孔隙尺寸的过滤器均导致较少的DNA吸附，这是由于20μm的较小孔隙尺寸的过滤器伴随着较大表面积的缘故。因此，对于DNA吸附这一目的而言最佳的过滤器孔隙尺寸为40μm或更大，取决于其他系统限制条件(例如吸附颗粒保留)。
本发明的流体样品纯化系统和方法的另一方面在于浓缩样品的能力。在一个实施方案中，远端保持器的过滤材料通过将水拉出溶液而浓缩样品。图37示出，该流体样品纯化系统实施方案中使用的陶瓷过滤器将样品DNA浓度提高约14％(即14％的负吸附值)。这通过使用(化学地)从样品移除水而不移除所需靶物(例如DNA)从而提高剩余靶物浓度的过滤材料达到。移除水的这类过滤材料是本领域熟知的。因此，本发明的流体样品纯化系统采用能获得低DNA吸附或甚至DNA浓缩物而同时满足所有前述系统级和过滤器性能要求的移液器过滤器设计。此外，这样的移液器过滤器可与专门设计以同时吸附其他(不期望的)物质的吸附材料结合使用。
图39示出，标准的实验室移液器吸头和常用的移液器过滤器可吸附显著量的DNA。因此，本发明的流体样品纯化系统的另一方面在于使用官能化颗粒的移液器吸头的使用以吸附较少量的DNA。
可使用两种减少表面对DNA的吸附的一般方法。一种方法是用带负电荷的聚电解质如PAA处理含DNA的溶液的表面。表3示出，增大PAA暴露于与含DNA的溶液接触的移液器吸头表面将DNA吸附减少至多34％。
第二种方法是在与含DNA的溶液接触的移液器吸头表面上创造格外光滑的表面。表3示出，相对于表面粗糙度为2.0-5.5微英寸RMS的移液器吸头表面而言，表面粗糙度为0.7微英寸RMS到1.4微英寸RMS将使DNA吸附减少84％或更多。可以合理地预期，光滑和经化学处理的表面的组合将进一步减少DNA吸附。
表3：移液器吸头表面粗糙度及涂布对DNA吸附的影响
  移液器吸头#   表面粗糙度   DNA吸附
  #1   2.0-5.5微英寸   12.8％
  #2   0.7-1.4微英寸   2.1％
  #3   0.7-1.2微英寸   1.0％
  移液器吸头#   表面涂布   DNA吸附
  #1   无(对照)   12.8％
  #2   PAA(1min)   11.8％
  #3   PAA(5min)   9.8％
  #4   PAA(10min)   8.8％
  #5   PAA(15min)   8.5％
5.15过滤器侵入和挤出压力
过滤器侵入压力为润湿过滤器或流动管道以便流体可以开始流过过滤器或管道所需的压力。过滤器挤出压力为去润湿过滤器或流动管道并迫使可能容留在过滤器或管道的空隙中的任何流体样品离开所需的压力。二者均可以是本发明的流体样品纯化系统的特征。通过使保留在流体样品纯化系统内的样品的体积最小化而使返回给使用者的经纯化的流体样品的量最大化是一个有利的特征，特别是当处理非常小的样品体积时。
由于标准移液器产生的压力非常低，故需要低的侵入压力以帮助确保样品可靠地开始流过过滤器或管道并进入移液器吸头中。任何过滤材料或管道的可润湿性均是其前进接触角和孔隙或管道尺寸的函数：接触角大的材料比接触角小的材料更难润湿，小孔隙或小横截面管道由于其较小的毛细管半径而比较大的更难润湿(参见前面关于毛细管半径的讨论)。在移液器吸头的近端处安放气溶胶阻挡器时，移液器吸头制造商利用了这一特性，其中阻挡器的疏水(即不润湿)性将有助于阻断液体流出移液器吸头。通常使用的气溶胶阻挡器的侵入压力数据通常比移液器可产生的最大压力高数倍。但由于其如此高的侵入压力(高于常用移液器所产生的压力)，故这些材料(其常包括聚合物材料)是远端保持器的不良选择。
在本发明的流体样品纯化系统的某些实施方案中，具有小前进接触角的材料的远端保持器构成更适宜的远端保持器，因为其侵入压力与常用移液器的更相似。二氧化硅过滤材料具有的比通常使用的聚合物型过滤材料的低的侵入压力使其比许多通常使用的过滤材料更易于去润湿。提高低润湿材料的可润湿性的具体方法已在上面讨论。
因此，本发明的流体样品纯化系统使用具有低侵入和挤出压力(例如易于开始流动且样品回收率高)而同时满足使用者的系统性能需要的最佳移液器过滤材料。
5.16反应室
本发明的流体样品纯化系统可包含反应室。所述反应室可具有开放的反应室设计，其不刚性地容留反应颗粒(与例如AspireTM和Zip-TipTM产品所使用的设计形成对比)。开放的反应室设计使得吸附材料可以位于移液器吸头内的任何位置处，包括附着于移液器吸头的内壁。当吸附材料含在颗粒上或内时，开放的反应室设计将允许流体样品和吸附介质在移液器吸头的整个内部体积上相互作用。AspireTM产品的独特缺点在于，用来容留吸附材料于内部空隙体积内的两个过滤器不允许移液器吸头内但空隙体积外的任何样品与吸附材料相互作用。
同样，当使用多孔基体来容留吸附材料时(例如与Kopaciewicz的美国专利No.6,048,457中所公开的相似的Zip-TipTM和Millipore)，移液器吸头内但多孔基体外的任何样品均不允许与吸附材料相互作用。
因此，在本发明的流体样品纯化系统的一个实施方案中，采用了较大的流体样品-吸附材料反应室来进一步提高流体样品-吸附材料相互作用的效率。6.2部分(实施例2)公开了一种进一步利用这样的较大反应室的流体处理方案。
本发明的流体样品纯化系统的反应室设计消除了目前可得到的移液器吸头中如AspireTM移液器吸头和Kopaciewicz的美国专利No.6,048,457中所公开的移液器吸头中所见的反应室设计的失效模式，所述失效模式包括如下的特定失效模式：
(1)反应室内夹带气泡。功能性移液器吸头内采用的较小的内部尺寸使得流体在这样的室内的行为由表面张力(而非重力)效应主导。这些效应常可能在所述室内夹带气泡。影响可能包括增大流体流动阻力、减少与反应室内所含吸附材料(例如颗粒)的相互作用、以及需要另外的操作者交互和流体抽吸/分配周期来移除气泡，后者用自动化流体处理系统非常难以达到。
(2)产生通过反应室的优选流道，特别是当颗粒被更多地约束在反应室内时，这将阻止其中所含所有颗粒与流过反应室的样品发生相互作用。
本发明的流体样品纯化系统通过若干方式避免了这些问题：(1)消除Aspire和Zip-Tip功能性移液器吸头设计中使用的受约束的反应室，利用开放的反应室设计；(2)使用亲水颗粒；(3)采用如图40b中所示具有低长细比的反应室设计；和(4)使用比重大于1.0的颗粒。本发明的流体样品纯化系统的后一方面将确保颗粒不漂浮在无约束流体的表面上，这样的漂浮将阻止有效的样品相互作用。低长细比的反应室将在6.2部分(实施例2)中进一步讨论。
总起来说，本发明的流体样品纯化系统的开放的反应室设计有助于提供如下好处：
(1)由于更有效的流体样品-吸附材料相互作用，故纯化过程时间缩短。
(2)由于能将吸附材料固定于移液器吸头较大的内表面上，故吸附能力提高。
(3)操作可靠性提高(例如消除了反应室内夹带空气的可能)。
因此，根据本发明，以AspireTM和Zip-TipTM移液器吸头的方式刚性地约束颗粒的功能性移液器吸头设计的性能可通过若干方式加以改善，包括：(1)在受约束的反应区内使用较小数量的多孔颗粒，和(2)在受约束的反应区内使用亲水颗粒。
5.17流体样品死体积
在另一实施方案中，在已湿的移液器吸头中，远端布置的颗粒保持器(或过滤器)使被保留在所述远端布置的颗粒保持器的远端和移液器吸头的远端之间(如图41中尺寸“X”所示)的流体的体积最小化。优选所述颗粒保持器轴向布置为使该“死体积”不大于被抽吸进移液器吸头中的样品流体的总体积的10％。
在本发明的另一方面，被远端布置的颗粒保持器所保留的流体的体积(例如包含如图20a中所示多孔基体的颗粒保持器的空隙体积)优选不大于被抽吸进移液器吸头中的样品流体的总体积的10％。
使被保留在移液器吸头远端部分中的流体的“死体积”最小化具有特定的优势。其使不通过颗粒上并因此不被移液器吸头所纯化的流体的体积最小化，从而使所分配的样品中的杂质最小化(即提高样品总体质量)。其使从移液器吸头分配的流体的体积最大化，从而使可用于后续分析的经纯化样品的量最大化(即提高样品体积回收率)。
含在移液器吸头吸嘴与远端过滤器之间的任何流体样品均有不被抽吸进移液器吸头中而不被其中所含的吸附材料所纯化的风险。因此，最小化该体积将是有利的。图32中示出了达到此目的而同时满足其他产品设计约束条件的一个优选实施方案。吸附材料A被充填在移液器吸头B的远端中并由过滤器C(任选)和D保持在移液器吸头内。过滤器C位于移液器吸头的近端附近，在这里，其起到气溶胶阻挡器的作用以防止抽吸的流体污染移液器(未示出)。过滤器D位于移液器吸头的远端附近以使容留在移液器吸头吸嘴与过滤器D的(远)端之间的流体的体积最小化。为进一步减小样品死体积，使移液器吸头本体在远端过滤器D后在过渡区E上快速地逐渐变细成直径非常小的样品获取部件F。非常小的样品获取吸嘴与短过渡区的组合使用将起到使含在远端过滤器与移液器吸头吸嘴G之间的流体的体积最小化的作用。
本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头设计因此将最小化样品死体积，同时允许使用具有较大横截面积的远端保持器(或过滤器)，还同时满足前述要求。
5.18内部空气总体积
含在本发明的流体样品纯化系统的移液器吸头内的空气是可压缩的并将减小给定移液器可能产生的最大压力或真空。最小化该空气体积将有助于增大移液器施加的最大压力或真空，继而有助于提高流体流率和缩短样品处理时间。移液器吸头及其伴随的内部空气体积的具体选择随应用而异。但本发明人已确定，为获得最佳的系统总体性能，优选内部空气总体积不超过样品体积的8-10倍。对于25μl的样品大小，这相当于是说移液器吸头的内部空气体积不超过约200μl。此最大移液器吸头内部空气总体积因此将获得高流体流率和极短的样品处理时间。
5.19流体提取
移液器吸头中表面涂布和/或微毛细管道的使用可防止小颗粒的团块截留样品流体于移液器吸头(或其他壳体)中所含颗粒内，从而使得更易于从颗粒和移液器吸头提取样品流体。
润湿的颗粒将在流体-空气界面处产生毛细压力。该毛细压力定义为Pc＝2γ/r，其中γ为流体的表面张力，r为流体-空气界面处流体表面的半径。表面能大于颗粒表面能的亲水颗粒的使用将破坏流体-空气界面处这些较小的流体半径并将液体从润湿的颗粒体拉出。该实施方案具有防止小颗粒的团聚体利用其流体-空气界面处许多小流体半径截留流体的优势。
在该实施方案的另一方面，移液器吸头的内部被涂布以高能、高度润湿性的涂层以使流体从润湿的颗粒团块排出。提高低润湿材料的可润湿性的具体方法已在上面描述。
5.20流体样品纯化方法
本发明提供了用于使用所述流体样品纯化系统分离流体样品中目标分子的方法。在一个实施方案中，所述方法可包括：
a.提供待试验目标分子的存在的流体样品；
b.提供流体样品纯化系统；
c.将所述流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
d.使吸附材料或多个官能化颗粒与所述流体样品接触；和
e.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品，从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
所述方法可还包括从排出的流体样品回收目标分子的步骤。在各种实施方案中，目标分子的收率可达到至少70％或至少95％。
图3示出了其中纯化DNA的一个流体样品纯化系统实施方案的示意图。左侧略图描绘PCR溶液中靶DNA(“蓝色符号”)、未扩增的PCR引物(“黑色符号”)和未整合的核苷酸(“绿色圆点”)向含吸附颗粒的室中的抽吸。右手侧略图中的排出溶液含靶DNA而无杂质(例如引物和核苷酸)。
本发明的流体样品纯化方法可包括可与所述流体样品纯化系统一起使用的流体样品抽吸和分配方案。本文中用到的词语“方案”描述最终使用者如何操作所述流体样品纯化系统，例如可如何对移液器编程以操纵流体样品。
使用所述流体样品纯化系统的优选方法包括使用这样的流体抽吸和分配方案，其中吸附材料与待从被抽吸的样品中移除的物质之间的相互作用因“过抽吸”和“过分配”流体样品而得到改善。过抽吸涉及抽吸流体样品进入移液器吸头中并随后追加空气。此方法具有在移液器吸头内产生更大搅动的作用，这部分归因于流体样品的附加运动以及处于较高位置的流体柱通常的“压扁作用”和因此移液器吸头内较大的内径，其还具有更有效地分布颗粒于流体内的作用。图42a-b示出了其中抽吸和分配两倍于样品体积的总体积(即抽吸/分配一份样品和一份空气)的基准条件。这导致120秒的纯化反应时间。增大总的抽吸/分配体积至4倍于样品体积(即抽吸/分配一份样品和三份空气)导致75秒的纯化反应时间——缩短37％。在一个实施方案中，25μl样品和75μl空气被抽吸进和分配出200μl的移液器吸头。
使用过抽吸和过分配方案的另一方面在于显著缩短样品处理时间而同时提高过程可靠性的能力。更具体而言，过抽吸方案涉及抽吸小体积的液体、随后抽吸较大体积的空气以获得前述更高程度的样品搅动。空气以高得多的流率流经远端过滤器的事实将提供若干好处：
(1)缩短纯化时间。相对于其中抽吸/分配的体积全部为液体的情况而言，较快的空气流率将显著加快先前抽吸进移液器吸头中的流体的流率，从而缩短抽吸/分配周期时间并进一步增强样品搅动。
(2)吸头到吸头的抽吸和分配体积更一致。由于空气的粘度比液体低，故本发明的功能性移液器吸头组件在空气部分的抽吸/分配过程中具有低得多的空气流动阻力。由于较高的液体流动阻力仅在抽吸/分配周期的一部分而非整个上遭遇到，故吸头到吸头的液体填充体积变化得以最小化。
所述纯化方法可包括使用多个流体样品抽吸和分配周期的步骤以帮助确保保持器材料不被吸附颗粒所堵塞。迫使流体样品以交替的方向通过保持器(即抽吸和分配)将有助于确保在分配周期过程中可能被拉进保持器中或积聚在保持器的面上的任何颗粒可在随后的抽吸周期过程中被迫离开并再悬浮于溶液中。图17a-d示出，在许多相继的抽吸和分配周期上，填充了颗粒的移液器吸头内的分配压力保持恒定，虽然当颗粒积聚在保持器的面上时分配压力有瞬时增大。该自清洗作用在图47a-b中特别显著，其中示出流体抽吸和分配压力在多个抽吸和分配周期上非常一致。该自清洗作用还有助于保持高的流体流经保持器的流率以及有助于确保所有颗粒均可利用以与样品相互作用而有助于移除杂质。
所述纯化方法可包括使用过抽吸和过分配步骤的步骤以获得如下样品纯化改进：第一，过抽吸的使用用来迫使任何样品死体积进入移液器吸头中以确保该体积与所含的吸附材料相互作用而得到纯化，从而确保高的样品质量水平。第二，过分配的使用涉及分配额外体积的空气以确保过抽吸的样品从移液器吸头分配出。
因此，所述纯化方法允许流体以高流率流经过滤器和因此缩短的样品处理时间、避免颗粒保持器的堵塞、并有助于通过使样品死体积的影响最小化而确保高的样品质量水平。就流体样品抽吸和分配速率而论，官能化颗粒与样品溶液中的杂质结合所需的时间部分地取决于流体搅动水平，流体搅动水平部分地取决于流体样品被抽吸进和分配出移液器吸头的速率。图42a-b示出，从慢到快增大移液速度(例如移液器的(活塞)位移速率从低于约400μl/sec增至高于约500μl/sec)导致45秒的纯化反应时间，即纯化反应时间从75秒的前一周期时间又缩短了40％，尽管过抽吸/过分配比率从前面4X的最佳值减至了2.4X。
因此，本发明的流体样品纯化方法的实施方案将提供最佳的流体抽吸和分配速率以获得取得最短样品纯化时间所需的搅动水平。更具体而言，最小流体流率足够高以有效地搅动流体样品内的官能化颗粒，同时足够低以可用现有移液器通常所施加的压力水平达到。
5.21本发明的流体样品纯化系统和方法的优势
除满足高样品质量、高收率、高速度(低于一分钟)、及降低成本(尤其是劳力成本)的产品性能基本要求外，本发明的流体样品纯化系统还易于处置，因不需要大多数其他纯化方案典型需要的离心机、磁选机或真空歧管而释放工作台空间，且不需要大多数其他纯化方案中所需的额外溶剂或其他试剂。此外，纯化过程的可靠性因消除了对多位操作者交互的需要而显著提高。
本发明的流体样品纯化系统中涉及的优化和部件整合已实现具有远超现有纯化产品性能且在没有这样的系统方法将不可能达到的性能好处的流体样品纯化系统的开发。
除提供高样品质量和收率、易于使用性、速度和降低的成本(尤其是劳力成本)外，本发明的流体样品纯化系统还易于处置，因不需要大多数其他纯化方案典型需要的额外固定设备如离心机、磁选机或真空歧管而释放工作台空间，且不需要大多数其他纯化方案中所需的额外溶剂或其他试剂。此外，纯化过程的可靠性因消除了对多位操作者交互的需要而显著提高。
移液器吸头实际用在所有实验室中以从一个容器向另一个传递液体样品。由于用户已经使用具有现有纯化产品的移液器吸头，故使用移液器吸头形式的本发明流体样品纯化系统所需的设备(即移液器)和培训已经到位。实验室不需添加额外的设备，无论实验室的规模如何。自动化的实验室使用液体处理机器人来在其已建成的高通量设备上清洁样品。很明显，单个样品使用单个移液器纯化，移液器是普遍存在的一种实验室工具。作为用于处理待纯化样品的接受器，纯化柱同样普遍。本发明的产品设计的使用者会看到，该产品设计与其当前的实验室操作无缝匹配。实验室整合该技术的转换成本为零。对于用户来说，实施此产品的简易性是一个独特的优势。
本发明的流体样品纯化系统可与现有的手动和自动化实验室方法无缝地整合，特别地，包括DNA纯化方法。
本发明的流体样品纯化系统和方法提高了纯化过程的可靠性，这部分归因于最小化或在一些情况下消除了操作者交互和操作者出错的可能，否则，这些可能不利地影响后续核酸分析的质量，或在样品量有限的情况下，妨碍后续分析的进行。
取决于应用，短纯化时间是可能的(约30-60秒，而竞争者为15-30分钟或更久)，这归因于：
(a)本发明的流体样品纯化系统结合进纯化样品所需过程的单个移液器吸头或所有柱中的能力，特别地，所述纯化包括核酸的纯化；
(b)粘结材料的使用，由此，粘结反应系数可实现杂质接近即刻的粘结(参见附件1)；
(c)产生大的流体搅动的流体样品纯化系统实施方案的使用，从而使流体样品中的杂质扩散向吸附剂所需的时间最小化(即产生较短的杂质-颗粒扩散路径长度)；
(d)提高的杂质吸附能力和样品质量，即例如由于过量的吸附表面积以及使用搅动增大更高百分数的杂质与吸附剂接触的可能性而移除更大部分杂质的能力，从而提高纯化过程的效率。在本发明的流体样品纯化系统中，样品质量也因消除了其他纯化过程中使用的将不利地影响样品的后续分析的化学品的使用而受到积极的影响；
(e)提高的靶物收率。本发明的流体样品纯化系统与现有纯化方法根本不同，因为其仅吸附杂质(例如ss-DNA)而不吸附靶(双链)DNA。因此，本发明的流体样品纯化系统不受靶物从吸附剂释放的效率的影响。靶物收率也因低DNA吸附表面的使用而受到积极的影响。
(f)提高的样品体积回收率。本发明的流体样品纯化系统使用少得多的流体可接触耗材，这些耗材均可能保留流体样品。样品回收率还因低流体保持颗粒的使用而提高。
(g)低的总过程成本。本发明的流体样品纯化系统可部分地因为如下因素而显著降低样品(例如核酸)纯化成本：
(h)其中整合了纯化样品优选使用的许多(或全部)功能的移液器吸头减少了劳力需要，从而最小化或消除了产生经纯化的样品所需的劳力。
(i)进行纯化所需的一次性件的数量减少，且本发明的流体样品纯化系统使用廉价的一次性移液器或柱。消除了对额外的装置或所需维护(例如离心机或真空管线)的需要。
(j)消除了对额外的试剂的需要；
(k)包装尺寸小。部分地由于进行纯化所需的一次性件的数量减少，本发明在非常小的包装尺寸中提供完整的纯化能力。该特征有助于使产品贮存需要最小化；
(l)浪费减少，这归因于纯化功能完全含在单个移液器吸头或过滤柱内而不需要额外的耗材或试剂的事实；和
(m)易于使用。本发明的流体样品纯化系统通过将纯化含靶物的样品所需的全部功能整合进单个移液器吸头或过滤柱中而简化了样品纯化程序，使用者只需将移液器吸头装到手动或自动的流体移液器上。抽吸和分配样品的动作足以实现纯化。现有纯化过程仅使用移液器来传递样品而不纯化样品并涉及多得多的机械和化学过程。
很明显，基于吸附材料、壳体设计(例如移液器吸头或柱或容器)、系统部件(例如保持器和密封构造)、流体样品处理方案等的各种组合，本领域技术人员可想到本文中所述系统和方法的众多实施方案。下面的实施例为了说明而非为了限制给出。
实施例
6.1实施例1：流体样品纯化系统的优选实施方案
本实施例说明所述流体样品纯化系统的一个优选实施方案。该系统包含有效保留颗粒的远端颗粒保持器，流体流动阻力最小化，吸头到吸头流动阻力一致，样品处理时间较短，样品流体的保留最小化，产品可制造性提高，产品制造成本降低，且样品质量提高。
本实施例描述一种可用在流体样品纯化系统中的改进的移液器过滤器设计。该过滤器的具体特征包括：流体流动阻力非常低、流体流动阻力一致、孔隙尺寸均一、样品保留力低且成本低。与现有技术流体样品纯化系统不同，具有该过滤器设计的本发明流体样品纯化系统实施方案在移液器吸头内具有部件而不是单独的过滤器来提供过滤功能。
在图25中，移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头‘A’内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过由移液器吸头‘A’与插件‘B’间的空间所形成的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由插件‘B’中的凹进精确确定，例如由在插件注塑过程中精确地形成所述件的该特征的注模精确确定。流动导管‘D’的宽度‘E’选择为最小化流体流动阻力，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
在图26中，移液器吸头‘A’含厚度为‘t’、由插件定位翼片‘C’定位在移液器吸头内的插件‘B’，从而产生宽度为‘E’的流体流动导管‘D’。与图25中所示的流体样品纯化系统的实施方案不同，流动导管在移液器吸头‘A’的内壁中产生。通过移液器吸头‘A’的A-A横截面图示出了流体的流动通过形成进移液器吸头‘A’的壁中的轴向延伸流体流动导管‘D’。导管宽度‘E’由在移液器吸头注塑过程中精确地形成移液器吸头‘A’的内表面的移液器吸头注模的“芯”精确确定。同前面一样，流动导管‘D’的宽度‘E’选择为最小化流体流动阻力，同时在一个应用中防止较大的物体(例如颗粒)进出移液器吸头‘A’。
此过滤器设计具有有效地保持颗粒于移液器吸头内的能力。例如为0.002英寸(相当于50微米)的导管尺寸将有效防止50微米或更大的颗粒通过。在处理流体时，颗粒常常呈各种方式。取决于尺寸、形状、比重和搅动水平，常使用50至500微米或更大的颗粒来处理流体。因此，优选的导管宽度‘E’为0.002英寸到0.020英寸(即50至500微米)，最优选0.002至0.006英寸(50-150微米)。
此过滤器设计具有最小化流动阻力的能力。众所周知，较大的流动横截面将具有较小的流体流动阻力。相对于例如多孔介质如多孔滤头而言，此流体样品纯化系统实施方案中移液器吸头‘A’与插件‘B’之间产生的环形导管将提供大的通流面积和因此低的流体流动阻力。在图25或图26中，为0.060英寸的移液器吸头内径和具有四个0.010英寸宽的定位翼片的插件(其产生0.004英寸的导管宽度)将提供0.000554平方英寸的总流动横截面积。比较起来，0.020英寸直径的移液器吸头吸嘴的流动横截面为0.000314平方英寸。在此特定的实例中，流动导管的横截面积是无限制的移液器吸嘴的1.76倍。同样，本实施方案的流动导管也远大于相同尺寸的任何多孔滤头或膜的有效流动横截面积。此外，本实施方案的直通流道设计将比相等厚度的多孔材料如多孔滤头产生较小的流体流动阻力。该设计使流动限制器‘B’的厚度‘t’最小化并因此使流动阻力最小化。
众所周知，流动通过导管的阻力与导管的长度成正比，长度越短产生的流动阻力越小。因此在本发明中，导管的长度‘t’优选小于导管的直径(例如安放插件处移液器的内径)，最优选长度为插件尺寸的10％到50％。
此过滤器设计可实现较短的样品处理时间。本流体样品纯化系统的此实施方案可实现的较短的流体抽吸和分配时间可缩短样品处理时间，原因至少有二：第一，由于流体流动阻力减小，故流体移进移出移液器吸头所需的时间缩短。第二，样品抽吸和分配周期过程中较高的流体流率使得搅动水平较高，这将起到提高样品-颗粒反应动力学(例如样品中所含物质的吸附)的作用。
本流体样品纯化系统实施方案使流动限制器‘B’的厚度‘t’最小化并使样品流体的保留最小化。流动导管‘D’较窄的宽度‘E’可在流体进入和离开流动导管‘D’的点处产生高的毛细压力。在一些情况下，施加给移液器吸头‘A’(即例如由移液器所施加)的压力可能不足以迫使流体从导管‘D’出来。在这些情况下，使插件‘B’的厚度‘t’最小化将使被保留在流动导管‘D’中的液体的体积最小化。
流动导管精确受控的横截面积与限制器板精确受控的厚度相结合将产生非常一致的吸头到吸头流动阻力。在单个移液器用共用的抽吸/分配压力歧管连接了多个移液器吸头且其中各个移液器吸头被施加了相同的抽吸/分配压力的应用中，该性能特征特别重要。不含任何内部过滤器的移液器吸头的流体流动阻力可忽略不计并通常认为将以相同的速率填充并至相同的水平。但随着流动阻力增大，流体流动阻力的任何变化(例如更限制性的移液器吸头过滤器)将导致受影响的移液器吸头接纳较多或较少的流体。在最糟的情况下，一个移液器吸头可能几乎不接纳流体或不接纳流体，另一个则被填满，从而可能污染移液器。本实施方案通过既最小化总体流动阻力又精确地控制影响流动阻力的那些因素(包括流动导管的长度和横截面积)，而避免了这个问题。
本实施方案具有改进的产品可制造性。不需要精确定位插件‘B’以正确控制流体的流进、流出移液器吸头。与其中过滤元件必须靠在移液器吸头上固定(即密封)的许多过滤器设计不同，本发明依靠易于控制的移液器吸头内径和插件直径来将插件固定到移液器吸头中并产生精确受控的流动导管。这样产生的组件可因此正确地执行任务，而不管插件在移液器吸头内的竖直位置。此外，与在插入过程中可能被压缩至不确定的量从而产生不可控制的流体流动阻力变化的多孔滤头不同，本发明中使用的插件不仅不大可能被压缩(即所述插件自具有高压缩强度的实心材料产生)，而且更重要的是，由于流动将绕过插件而不是通过插件，故将不影响流体流动阻力。因此，所述插件的正确插入对组装过程中插入力的变化的敏感性要低得多。
本实施方案具有降低的产品制造成本。流动导管的特征在插件(图25)或移液器吸头模的芯(图26)的制造过程中确定，其一旦完成，将消除对昂贵的阻性滤头或易碎膜的需要。
本实施方案具有降低的损伤样品中物质的可能性。众所周知，使某些物质如DNA通过小的流动横截面可能损伤DNA。直通流道设计通过消除伴随材料如多孔滤头的相对曲折得多的流道避免了这一潜在问题。此方面也使得实现比通过材料如多孔滤头的那些高得多的流体流率。
图47a-b为流体抽吸和分配压力-时间曲线图，示出了本实施方案获得的非常低的流体流动阻力和短的周期时间。
流体过滤器的性能
图47a-b中示出了具有流动导管的移液器吸头形式的流体样品纯化系统的一个实施方案的性能，将其与图12a-c中的现有技术移液器吸头的性能进行对比。对本发明的流体样品纯化系统和现有技术移液器吸头绘制内部压力-时间性能曲线，每个吸头中使用两个样品。
具有流动导管的移液器吸头形式的流体样品纯化系统抽吸和分配流体比现有技术移液器吸头快得多。流动导管使得样品处理时间短得多，原因有二：(1)操纵样品流体的时间较少和(2)因获得更高水平的搅动而更快的杂质结合动力学，因此，达到相同的样品纯化水平所需的样品处理时间比现有技术移液器吸头的短。
具有流动导管的移液器吸头形式的流体样品纯化系统具有周期到周期和吸头到吸头非常一致的抽吸/分配性能，特别地，较短的流体抽吸和分配时间及较低的抽吸和分配压力。
具有流动导管的移液器吸头形式的流体样品纯化系统有效地消除了不期望的“调节时间”，即使相继的样品抽吸和分配周期达到最小时间所花的时间。比较起来，现有技术移液器吸头的抽吸时间开始为5+秒并在三个周期后达到2.6秒，而本流体样品纯化系统的抽吸时间开始为0.37-0.38秒并在相同的周期数后达到0.36-0.37秒。
6.2实施例2：包含具有混合(反应)室的移液器吸头的流体样品纯化系统
本实施例描述包含移液器吸头的流体样品纯化系统的另一实施方案，该移液器吸头具有与上面所述不同的流体混合(或反应)室设计。该混合(反应)室具有低细长比，这种设计允许被抽吸/分配的样品与吸附材料之间更有效的相互作用。图40b示出了含松散堆积颗粒(未示出但与图2相似)和远端颗粒保持器B并设计了具有低高度L的混合室C的移液器吸头A。(图40a示出了典型的现有技术移液器吸头构造)。存在在非常短的距离内从吸嘴直径d过渡到移液器内径D的过渡区。优选角度β约为三十度以帮助确保流体流动从移液器吸嘴到移液器吸头的较大内径的均匀过渡(例如无停滞的漩涡)。由于其小直径d，故被抽吸的流体进入移液器吸头的速度将高于流体进一步沿室C内运动的速度。由于短的过渡区和室C内较低的流体高度，故进入移液器吸头的较高速度流体能更有效地与移液器吸头内的样品混合。图43示出，从溶液中移除(即吸附)不期望的杂质所需的时间约为20-30秒。比较起来，图42a-b示出，在相似的条件下，移除不期望的杂质至相似的所需水平所需的时间超过45秒。
图40b示出，该移液器吸头设计的尺寸产生优选约1.0的内部长细比(即高度与直径的比率)。比较起来，图40a示出了具有典型的移液器吸头尺寸的更典型设计移液器吸头。这些尺寸产生约8-10或更大的长细比。由于具有与如图40b中所示相同的吸嘴直径d，故对于给定的施加真空，流体将以相同的速度进入移液器吸头。但对于被抽吸进移液器吸头中的任何给定体积的流体样品，由于较细长的移液器吸头较小的内部横截面积，故将在该移液器吸头内看到高得多的流体柱。
该较小的横截面积产生三个问题：第一，其使得被抽吸的流体与移液器吸头的内壁之间发生较高粘性的相互作用，从而减小流体速度和流体内的后续混合。第二，其使得进入吸嘴的较高速度流体行进至与流体柱上端处的流体(即第一次抽吸进移液器吸头中的流体)相互作用的路径长度较长，从而进一步减小流体的体相混合。第三，其使得流体内较高密度的颗粒从流体柱上端处的流体沉降较远的距离，从而使颗粒与流体间的相互作用最小化，这也导致移液器吸头内低效的流体体相混合。
这样的最佳设计的反应室的效果在图43中示出，可见非常快的杂质结合动力学和短的纯化过程时间。
6.3实施例3：包含具有最小内部空气体积的移液器吸头的流体样品纯化系统
本实施例描述包含移液器吸头的流体样品纯化系统的另一实施方案，该移液器吸头具有内部布置的活塞以最小化内部体积和产生较高的流体样品抽吸和分配压力。
本流体样品纯化系统实施方案包含移液器吸头和在移液器吸头内提供最小空气体积的活塞。由于移液器吸头内所含空气是可压缩的流体，故吸头中空气越多，对于移液器活塞的给定位移，移液器吸头内可产生的压力或真空越低。由于移液器吸头内外间的压差是使液体进出移液器吸头的原动力，故较小的压力或真空差将导致较低的样品流率。样品流率还因位于移液器吸头中的吸附介质和过滤器所致的流动阻力而进一步减小。由于减小的流体搅动(即吸附杂质需要较长时间)和所需的另外的抽吸/分配周期时间，故该较低的流率将增加处理特定样品所需的时间，可能至不可接受的水平。
通过使移液器吸头和移液器内的空气体积最小化，移液器活塞的给定位移将在移液器吸头内产生较高的压差和因此高得多的流体样品流率和较短的特定样品处理时间。最小化内部空气体积还将使得移液器吸头内有较高的内部压力而更有效地迫使流体从颗粒间的空隙体积内出来，从而提高样品体积回收率。
图44示出，移液器吸头A由活塞B和约束吸附材料D的过滤器C和D组成。活塞B位于移液器吸头内以产生最小的“死体积”，该“死体积”由夹带在过滤器C和E及吸附材料D内的空气组成。优选该死体积不超过样品体积的100％。同前面一样，使用者将待处理的流体样品抽吸进移液器吸头中。杂质被吸附到移液器吸头内所含的吸附材料上。从移液器吸头分配溶液即在单个步骤中产生所需的经纯化的样品。
6.4实施例4：包含过滤柱的流体样品纯化系统
本实施例描述包括过滤柱而不是移液器吸头的另一流体样品纯化系统实施方案。吸附材料或吸附剂或被附着于柱内的膜(即膜的表面具有吸附化学作用)或被置于颗粒上，所述颗粒或在加入流体样品之前即已含在过滤柱内或在样品被加到过滤柱中之前、过程中或之后被加到样品中，由此，其可附着于待从样品溶液移除的杂质。
本流体样品纯化系统实施方案包含颗粒和过滤柱，所述颗粒同时吸附杂质而排斥所需靶物。过滤柱、过滤器和颗粒尺寸的组合使得所需靶物(例如ds-DNA)可通过过滤器而杂质或被膜所吸附或被附着于被过滤器所保留的吸附性颗粒。
根据本实施例中描述的流体样品纯化方法，样品将在单个步骤中快速纯化而不需要额外的化学品。
本实施例中描述的流体样品纯化方法还允许施加的力如离心力、施加的压力或施加的真空足够高以从所述柱以及从所述颗粒和过滤器内的空隙空间高效地移除流体样品。
本实施例中描述的流体样品纯化方法可易于以过滤柱形式使用，其中所述柱容留颗粒，所述颗粒包含优先吸附不同类型的生物分子例如核酸如单链DNA而不是双链DNA或短双链DNA而不是长双链DNA的吸附材料。图45示出了含柱A以接纳样品的过滤容器。在柱A的底部为过滤器B。过滤器B的特性选择为使其可用不同的吸附材料官能化或者不让颗粒C和因此与所述颗粒结合的任何物质通过，而同时允许未与所述颗粒结合的所需物质通过。柱A位于收集管D中，收集管D具有流体样品收集贮存器E和可拆卸的帽F以将柱A固定在位并防止流体样品的损失。在膜与流体样品接触后，或者在颗粒已与未经纯化的样品G混合后，通过若干方法中的任一种或多种将经纯化的样品I转移至收集管D中的收集贮存器E，所述若干方法包括离心、向过滤器B的顶面施加正压力以“推动”流体通过过滤器、或在膜B的底面上施加真空以“拉动”流体通过过滤器。必要时，通过打开帽F、取出带杂质H的柱A、到达经纯化的样品I而从收集管取出经纯化的样品I。
相反，基于颗粒过滤的现有技术纯化过程通常既吸附靶物(例如PCR扩增DNA)又吸附杂质(例如未整合的PCR引物和核苷酸)并利用所需靶物与杂质的溶解度差异通过使用一系列化学-机械过程来选择性地和顺序地洗脱杂质和(最终)所需靶物，再使杂质和/或所需靶物通过过滤膜。
相反，本流体样品纯化系统通过仅吸附杂质而允许所需靶物(例如PCR扩增子)直接并立即通过过滤柱而在单个步骤中起作用。
在另一流体样品纯化系统实施方案中，过滤柱被整合成多个孔的阵列。更具体而言，多个柱(A)被整合成平面X-Y阵列(即X数量的柱在一个方向上、Y数量的柱在正交方向上)，而相同数量和X-Y取向的多个收集管(E)被整合成单独的平面阵列。然后将收集管的阵列置于柱的阵列下方，从而在单个两板组件中产生X乘Y数量的过滤柱。
6.5实施例5：包含柱或管的流体样品纯化系统
本实施例描述其中待纯化的样品不需在纯化之前与试剂和/或其他颗粒混合的其他流体样品纯化系统和方法实施方案。
一个流体样品纯化系统(“柱”或“管”形式)实施方案使用图46中所示的柱或管，其中所述过滤柱构造为含过滤室J，过滤室J被填充以固定在过滤器B的下游侧上的吸附颗粒D。吸附材料或吸附剂堆积进过滤室J中并由过滤器B(任选)和C保持在位。过滤器B和C的过滤特性选择为使其不让所述颗粒和因此与其结合的任何物质通过，而允许未与所述颗粒结合的所需物质通过。
待纯化的样品被加到柱A中。但根据该实施方案，不需要样品与颗粒的混合。可立即对含未经纯化样品的整个过滤柱组件离心或施加正压力或真空以使流体样品移动通过固定的颗粒床，在其中，杂质被吸附到过滤室J中固定的颗粒上，同时，所需靶物被固定的颗粒排斥而允许通过。必要时，通过打开帽G、取出柱A、到达经纯化的样品I而从收集贮存器取出经纯化的样品流体，杂质H留在柱A中。
现有技术纯化过程既吸附靶物(例如目标分子)又吸附杂质并利用所需靶物与杂质的溶解度差异通过使用一系列化学-机械过程来选择性地和顺序地洗脱杂质和所需靶物，再使杂质和/或所需靶物通过过滤膜。比较起来，本实施例中描述的流体样品纯化系统通过仅吸附杂质而允许所需靶物(例如PCR扩增子)通过过滤柱而在单个步骤中起作用。
在另一流体样品纯化系统实施方案中，过滤柱被整合成多个孔的阵列。更具体而言，多个柱(A)被整合成平面X-Y阵列(即X数量的柱在一个方向上、Y数量的柱在正交方向上)，而相同数量和X-Y取向的多个收集管(E)被整合成单独的平面阵列。然后将收集管的阵列置于柱的阵列下方，从而在单个两板组件中产生X乘Y数量的过滤柱。
6.6实施例6：在松散堆积的功能性颗粒存在下DNA的热变性
本实施例说明其中移液器吸头或过滤柱被加热以使DNA变性并实现作为ds-DNA变性的结果因此发生的单链DNA的吸附的一个流体样品纯化系统实施方案。
流体样品被加热至这样的温度，其也允许含碱基对错配并因这些错配而相对于其他DNA序列降低变性温度的双链DNA优先变性。然后从溶液中选择性地移除被颗粒吸附的错配DNA。
因此，根据该实施方案，热变性的使用可实现特定类型的ds-DNA(例如含碱基对错配的杂交DNA对)的优先吸附。
6.7实施例7：包含移液器吸头的流体样品纯化系统
本实施例描述固定过滤器于移液器吸头或其他类似的一次性件中的又一方法。在该实施方案中，如图23中所示，将优选自定心的凿子用力推入移液器中以以机械方式自移液器壁的材料形成一个或多个倒钩。然后在过滤器插入过程中，这些倒钩用来定过滤器的中心以及提供机械干预来帮助容留过滤器于移液器吸头内。该实施方案在若干方面特别有利。第一，相对于其中过滤器的边缘与移液器吸头完全接触的情况，过滤器与倒钩间小的接触面积将使倒钩与过滤器间具有较高水平的(局部化)接触压力，从而更好地固定过滤器于移液器吸头内。第二，以与图24中所示相似的方式，用较低的过滤器插入力即可获得高的(局部化)接触压力。然后该较低的力将不大可能损坏过滤器，尤其是通过压缩过滤器孔隙而改变其流体流动阻力。第三，本方法消除了对使用粘合剂来固定过滤器于移液器吸头的需要及这些粘合剂干扰移液器吸头所处理的样品的可能；该过滤器固定措施是移液器吸头材料自身。
本发明不限于本文中所述特定实施方案的范围。确实，除本文中所述的那些外，通过前面的描述，本发明的许多变型对本领域技术人员来说将是显而易见的。这样的变型涵盖在附随的权利要求的范围内。
本文中引用的所有参考文献通过引用并为所有目的全文并入本文中，就好像将每一个别公开案、专利或专利申请特定且个别地指出为所有目的通过引用全文并入一样。
任何公开案的引用针对的是本发明提交日前的公开但不应理解为承认本发明无权依据在先发明先于这类公开案。
Figure ISB00000736221300011

Claims (121)

1.一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统，所述系统包括：
具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；
在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；
近端保持器，其中所述近端保持器位于：
所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口；和
多个官能化颗粒，其中：
所述多个官能化颗粒在所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端保持器之间，
所述多个官能化颗粒吸附不期望的物质，且
所述多个官能化颗粒为不同地官能化的颗粒。
2.一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统，所述系统包括：
具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；
在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；
和
吸附材料；
其中：
所述吸附材料在所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端开口之间，
所述吸附材料吸附不期望的物质，且
所述吸附材料被不同地官能化。
3.一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统，所述系统包括：
具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；
和
吸附材料，其中：
所述吸附材料在所述壳体内并位于所述远端开口和所述近端开口之间，
所述吸附材料吸附不期望的物质，且
所述吸附材料被不同地官能化。
4.根据权利要求2所述的系统，所述系统还包括近端保持器，其中所述近端保持器位于所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口。
5.根据权利要求2所述的系统，所述系统包括多个壳体。
6.根据权利要求2所述的系统，其中所述吸附材料被施加或涂布在所述壳体的内部上。
7.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中使用小壳体半径(“r”)以使质量输送扩散路径长度和扩散时间最小化从而使被抽吸的流体样品中的物质到达所述壳体的内表面并被吸附所需的时间最小化。
8.根据权利要求2所述的系统，其中所述壳体为移液器、柱或管。
9.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述目标分子为生物分子。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒是非球形的。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒是多孔的。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述孔隙尺寸为5nm-150nm。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔官能化颗粒的内表面(或孔隙表面)被官能化以吸附小分子而外表面被官能化以抑制较大分子的吸附。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述较大的分子为双链PCR扩增子。
15.根据权利要求1所述的系统，其中相对于相同尺寸的实心颗粒而言，所述多孔颗粒提供非常高的颗粒表面积与体积的比。
16.根据权利要求1所述的系统，其中所述多孔官能化颗粒经处理以提高可润湿性。
17.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒包含i)涉及一种特定杂质吸附和靶物拒绝化学的单一类型颗粒，ii)涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的单一类型颗粒，iii)各涉及一种杂质吸附和靶物拒绝化学的多种类型颗粒，或iv)各涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的多种类型颗粒。
18.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料为官能化颗粒。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述官能化颗粒包含i)涉及一种特定杂质吸附和靶物拒绝化学的单一类型颗粒，ii)涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的单一类型颗粒，iii)各涉及一种杂质吸附和靶物拒绝化学的多种类型颗粒，或iv)各涉及超过一种杂质吸附和/或靶物拒绝化学的多种类型颗粒。
20.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒为不同地官能化的颗粒。
21.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料包含不同地官能化的颗粒。
22.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中：
所述流体样品中不期望的物质被吸附，和
同时所述流体样品中目标分子或期望的物质被排斥或拒绝。
23.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料是多孔的。
24.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料为可分解的多孔材料。
25.根据权利要求2或3所述的系统，其中负载所述吸附材料的颗粒的尺寸为1.0至1000μm。
26.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个官能化颗粒拒绝所述目标分子。
27.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料拒绝所述目标分子。
28.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒具有足够大的尺寸以清除杂质并具有足够小的尺寸以使被保留的流体样品的体积最小化。
29.根据权利要求1所述的系统，其中所述远端保持器和所述近端保持器间隔足够远以在所述多个官能化颗粒的存在下形成空隙，且其中所述空隙被制成一定尺寸，以使得官能化颗粒可在所述空隙内自由行进，从而当所述流体样品在所述空隙中时可实现所述官能化颗粒与所述流体样品间的充分混合。
30.根据权利要求1所述的系统，其中所述远端保持器和所述近端保持器间隔足够近以将所述多个官能化颗粒约束为紧密堆积构型，从而在所述多个官能化颗粒的成员间几乎不形成空隙或不形成空隙。
31.根据权利要求1所述的系统，所述系统在所述壳体内还包括反应室，所述反应室位于所述远端保持器和所述近端保持器之间的空间中。
32.根据权利要求31所述的系统，所述系统包括位于所述反应室中比重大于1.0的吸附颗粒。
33.根据权利要求1所述的系统，其中所述吸附颗粒是亲水的。
34.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料为多个颗粒且所述颗粒是亲水的。
35.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器包含选自如下的材料：多孔聚合物或陶瓷基体；经穿孔的聚合物、陶瓷或金属塞；多孔聚合物、玻璃或金属织物；和羊毛形式的多孔聚合物、玻璃、或金属长丝。
36.根据权利要求1所述的系统，所述系统包括与所述远端保持器连接的流体流动导管。
37.根据权利要求1所述的系统，所述系统包括在所述壳体的内表面和插件上或所述壳体的内表面和插件中轴向延伸的流体流动导管，其中所述轴向延伸的流体流动导管和所述插件形成所述远端保持器。
38.根据权利要求37所述的系统，其中所述轴向延伸的流体流动导管由所述壳体和所述插件间的空间形成。
39.根据权利要求37所述的系统，其中所述流动导管的宽度选择为使流体流动阻力最小化。
40.根据权利要求37所述的系统，其中所述插件由插件定位翼片定位在所述壳体内，从而形成轴向延伸的流体流动导管；其中所述轴向延伸的流体流动导管和所述插件形成所述远端保持器。
41.根据权利要求37所述的系统，其中所述轴向延伸的流体流动导管定位在所述壳体的内壁中，且其中所述流动导管的宽度选择为使流体流动阻力最小化。
42.根据权利要求37所述的系统，其中所述轴向延伸的流体流动导管为在所述远端和所述远端保持器间产生的半球形导管，且其中所述导管为流体流动提供大通流面积和低阻力。
43.根据权利要求37所述的系统，其中所述轴向延伸的流体流动导管产生的流体流动阻力小于相等厚度的多孔材料产生的流体流动阻力且其中流动限制器的厚度被最小化。
44.根据权利要求37所述的系统，其中所述各个导管的长度小于所述导管的直径，且其中所述导管的长度为所述远端保持器的尺寸的10％至50％。
45.根据权利要求1所述的系统，其中所述远端保持器具有：
a.足够小的孔隙尺寸或流体流动导管以保留所述多个官能化颗粒，和
b.在所需的施加压力下足够高的流体样品流率以避免损伤所述目标分子。
46.根据权利要求2所述的系统，其中所述远端保持器具有：
a.足够小的孔隙尺寸或流体流动导管以保留所述吸附材料，和
b.在所需的施加压力下足够高的流体样品流率以避免损伤所述目标分子。
47.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器具有足够的尺寸以：
a.提供在所需的低施加压力下低的吸头到吸头流体流动阻力变化，
b.使被保留的样品体积最小化，和
c.使所述壳体内的样品死体积最小化。
48.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器：
a.包含允许低的流体侵入和挤出压力的亲水或易于润湿的材料，和
b.拒绝所述目标分子。
49.根据权利要求1所述的系统，其中所述远端保持器具有：
a.足够大的孔隙尺寸或流体流动导管以实现低的流体侵入和挤出压力，和
b.足够小的孔隙尺寸或流体流动导管以阻挡官能化颗粒的进入。
50.根据权利要求2所述的系统，其中所述远端保持器具有：
a.足够大的孔隙尺寸或流体流动导管以实现低的流体侵入和挤出压力，和
b.足够小的孔隙尺寸或流体流动导管以阻挡吸附材料的进入。
51.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器包含提供高结构强度的过滤材料。
52.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器或所述近端保持器为过滤器。
53.根据权利要求1所述的系统，其中所述近端保持器为可刺穿的密封件、帽或膜。
54.根据权利要求53所述的系统，其中所述可刺穿的密封件、帽或膜为箔。
55.根据权利要求1或2所述的系统，所述系统包括用于所述远端保持器的保持元件。
56.根据权利要求1所述的系统，所述系统包括用于所述近端保持器的保持元件。
57.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料被粘结在一起以形成单个体。
58.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料被载体所负载，其中所述载体比所述远端开口的直径宽。
59.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述远端开口是非圆形的。
60.根据权利要求1所述的系统，其中所述不期望的物质比所述目标分子优先与所述官能化颗粒结合。
61.根据权利要求60所述的系统，其中所述优先结合基于尺寸、疏水性、电荷或亲和性。
62.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述不期望的物质比所述目标分子优先与所述吸附材料结合。
63.根据权利要求62所述的系统，其中所述优先结合基于尺寸、疏水性、电荷或亲和性。
64.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述不期望的物质为单链核酸、双链核酸、基因组DNA、质粒DNA、PCR引物二聚体、核苷酸、核糖核苷酸、酶、染料、嵌入剂、水、重金属、毒素、代谢物、电解质、激素、药物、抗体或抗原。
65.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头、管或柱。
66.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述壳体包含玻璃或廉价或日用塑料。
67.根据权利要求66所述的系统，其中所述廉价或日用塑料为聚烯烃材料。
68.根据权利要求67所述的系统，其中所述聚烯烃材料为聚乙烯、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、或聚苯乙烯。
69.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒的尺寸足够小以避免在溶液中快速沉降。
70.根据权利要求1所述的系统，其中所述官能化颗粒的尺寸足够大以便能使用高流率过滤器作为所述远端保持器并避免所述官能化颗粒在产品制造过程中悬浮在空气中。
71.根据权利要求1所述的系统，其中样品死体积和内部空气总体积低于约200μl。
72.根据权利要求71所述的系统，其中所述样品死体积和内部空气总体积不超过所述样品体积的8-10倍。
73.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述壳体包括用于保持远端或近端保持器的保持肋。
74.根据权利要求1所述的系统，其中所述壳体包括一个或多个轴向延伸的肋以保持所述多个官能化颗粒。
75.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述壳体包括一个或多个轴向延伸的肋以保持所述吸附材料。
76.根据权利要求1所述的系统，其中所述轴向延伸的肋形成流体流动导管。
77.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述轴向延伸的肋形成流体流动导管。
78.根据权利要求1或2所述的系统，所述系统包括在所述壳体中远端布置的抗堵塞塞。
79.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料包含珠子或被施加到珠子，且其中所述珠子直径大于所述远端开口。
80.根据权利要求2或3所述的系统，其中所述吸附材料被附着于膜的表面，且其中所述膜布置在所述壳体内。
81.根据权利要求1所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头且所述吸头中官能化颗粒的重量为10.0mg。
82.根据权利要求1或2所述的系统，所述系统包括内部一体式设计部件以使所述远端保持器保持在所述壳体内而无需高的保持器插入力。
83.根据权利要求1或2所述的系统，所述系统包括近端布置的内部膜以保留吸附材料或颗粒，所述膜能在吸附材料或颗粒被置于所述壳体中之后坍塌而锁在一起。
84.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器为可压缩性差或不可压缩的陶瓷过滤器或塞。
85.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头，所述远端保持器为过滤器，其中所述过滤器：
具有范围在20μm-40μm的孔隙，
直径为0.8-1.2mm，长度为1.0mm至1.5mm。
86.根据权利要求1或2所述的系统，所述系统包括设计的流动导管，其中所述远端保持器为实心保持器。
87.根据权利要求86所述的系统，其中：
所述壳体为移液器吸头，
所述移液器吸头的内径为2-6mm，和
所述实心保持器厚0.10至1.0mm。
88.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述官能化颗粒或吸附材料被附着于位于所述壳体内用来增大可润湿表面积的多个部件上。
89.根据权利要求88所述的系统，其中所述部件为内部轴向延伸的肋。
90.根据权利要求89所述的系统，其中所述肋是所述壳体的一体式部分或者是被放置在壳体内的预成型构件。
91.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头，所述移液器吸头的远端是小膛径的且所述移液器吸头快速增大内径以容纳较大的远端保持器。
92.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头，所述流体样品体积为5-50μl，所述远端保持器直径为1.0-3.0mm。
93.根据权利要求1所述的系统，其中所述壳体内颗粒的自由体积大于或等于所述颗粒周围的空隙体积。
94.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述壳体为移液器吸头且其中采用移液器吸头吸嘴、远端颗粒保持器穿孔直径和/或流体流率的容许组合来避免损伤所述流体样品中的DNA。
95.根据权利要求1、2或3所述的系统，所述系统包括载体，所述载体包含所述官能化颗粒或吸附材料，其中所述载体的表面积优选为0.001至0.500平方米/50μl流体样品体积。
96.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中官能化颗粒或吸附材料被附着于包含粘结的颗粒的可分解的多孔介质体的内表面或外表面，其中所述可分解的多孔介质能向溶液中释放所述粘结的颗粒。
97.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述目标分子为DNA且其中所述官能化颗粒或吸附材料在6.0至9.0的pH下具有中性或负表面电荷。
98.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述目标分子为DNA且其中所述远端保持器为具有40μm或更大孔隙尺寸的过滤器。
99.根据权利要求1所述的系统，其中所述目标分子为DNA且所述吸附材料选择为吸附较少量的DNA。
100.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述远端保持器位于所述壳体的远端附近以使容留在所述壳体的远端与所述保持器的远端之间的流体的体积最小化，并且其中所述壳体的本体在所述远端过滤器和所述远端处直径非常小的样品获取部件之间的短过渡区上快速地逐渐变细。
101.一种用于分离流体样品中目标分子的流体样品纯化系统，所述系统包括：
具有开口的容器，所述开口适于流体通过，和
吸附材料，其中：
所述吸附材料在所述容器内，
所述吸附材料吸附不期望的物质，和
所述吸附材料被不同地官能化。
102.根据权利要求1、2或3所述的系统，其中所述吸附材料在所述壳体内的多孔包装中。
103.根据权利要求101所述的系统，其中所述吸附材料在所述容器内的多孔包装中。
104.根据权利要求102所述的系统，其中所述多孔包装含官能化颗粒的混合物，其中各个官能化颗粒或包含不同的吸附材料或是单个颗粒上包含多种吸附材料。
105.根据权利要求103所述的系统，其中所述多孔包装含官能化颗粒的混合物，其中各个官能化颗粒或包含不同的吸附材料或是单个颗粒上包含多种吸附材料。
106.根据权利要求102所述的系统，其中两个或更多个多孔包装被置于所述壳体内，且其中各个包装含与被置于所述壳体内的其他包装中所含吸附材料在官能性上不同的单一吸附材料。
107.根据权利要求103所述的系统，其中两个或更多个多孔包装被置于所述容器内，且其中各个包装含与被置于所述容器中的其他包装中所含吸附材料在官能性上不同的单一吸附材料。
108.一种用于分离流体样品中目标分子的方法，所述方法包括步骤：
a.提供待试验目标分子的存在的流体样品；
b.提供根据权利要求1所述的流体样品纯化系统；
c.将所述流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
d.使所述多个官能化颗粒与所述流体样品接触；和
e.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品，从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
109.一种用于分离流体样品中目标分子的方法，所述方法包括步骤：
a.提供待试验目标分子的存在的流体样品；
b.提供根据权利要求2或3所述的流体样品纯化系统；
c.将所述流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
d.使所述吸附材料与所述流体样品接触；和
e.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品，从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
110.一种用于分离流体样品中目标分子的方法，所述方法包括步骤：
a.提供待试验目标分子的存在的流体样品；
b.提供根据权利要求101所述的流体样品纯化系统；
c.将所述流体样品置于所述流体样品纯化系统中；
d.使所述吸附材料与所述流体样品接触；
e.在所述系统中混合所述流体样品；和
f.从所述系统移除所述流体样品。
111.根据权利要求108或109所述的方法，所述方法还包括从排出的流体样品回收所述目标分子的步骤。
112.根据权利要求110所述的方法，所述方法还包括从移除的流体样品回收所述目标分子的步骤。
113.一种用于分离流体样品中目标分子的方法，所述方法包括步骤：
a.提供一种流体样品纯化系统，其中所述系统包括：
i.具有远端和近端的壳体，所述远端具有适于流体通过的远端开口，所述近端具有适于流体通过的近端开口；
ii.在所述壳体内并在所述远端开口上方的远端保持器；
iii.近端保持器，其中所述近端保持器位于：
所述壳体内并在所述远端保持器和所述近端开口之间，或者与所述近端开口相邻、接触、覆盖所述近端开口或密封所述近端开口；和
iv.多个官能化颗粒，其中：
所述多个官能化颗粒在所述壳体内并被约束在所述远端保持器和所述近端保持器之间，
所述多个官能化颗粒吸附不期望的物质，和
所述多个官能化颗粒为不同地官能化的颗粒；
b.将流体样品吸入所述流体样品纯化系统中；
c.使所述多个官能化颗粒与所述流体样品接触；和
d.用使流体流率保持一致并一致地高的抽吸/分配周期和流体流率抽吸和分配所述流体样品，从而从所述流体样品纯化系统排出所述流体样品。
114.根据权利要求113所述的方法，所述方法还包括从排出的流体样品回收所述目标分子的步骤。
115.根据权利要求113所述的方法，其中获得的目标分子的收率至少为70％。
116.根据权利要求113所述的方法，其中获得的目标分子的收率至少为95％。
117.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
壳体；和
吸附材料。
118.根据权利要求117所述的试剂盒，所述试剂盒包括流体样品纯化系统。
119.根据权利要求117所述的试剂盒，所述试剂盒还包括使用说明。
120.根据权利要求117所述的试剂盒，所述试剂盒包括远端或近端保持器。
121.根据权利要求117所述的试剂盒，所述试剂盒包括用于流体样品纯化的试剂。
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