DE102010054767A1

DE102010054767A1 - Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasmaprotein, Viren oder Virenbestandteilen

Info

Publication number: DE102010054767A1
Application number: DE102010054767A
Authority: DE
Inventors: Dr. Müller Dirk
Original assignee: PREVIPHARMA AG
Current assignee: Instraction GmbH
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-06-21
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: DE102010054767B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ist ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, wie dieses (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder den Virenbestandteil enthält, wobei das Verfahren zwei Chromatographie-Schritte umfasst, bei denen die Sorbentien jeweils aus festen Trägermaterialen bestehenen, deren Oberflächen mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen des IgG-Typs aus Humanplasma Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen, Viren oder Virenbestandteilen aus Mischungen, die (Blut)Plasmaproteine, den Viren oder den Virenbestandteile enthalten, die eine erste stationäre Phase mit umfassend ein Sorbenz 1 mit Ein- und Auslass zum Aufbringen der das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthaltenden Mischung bzw. Auffangen des vorgereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils, sowie eine zweite stationäre Phase umfassend ein Sorbenz 2 mit Ein- und Auslass zum Aufbringen der das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthaltenden Mischung bzw. Auffangen des vorgereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils umfasst, wobei ebenfalls Sorbenzien verwendet werden, die aus einem festen Trägermaterial bestehen, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung von (Blut)Plasmaproteinen, Viren oder Virenbestandteilen aus einer Mischung unter Verwendung von Sorbentien, deren Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert sind, wobei die Sorbentien als Chromatographiematerial eingesetzt werden.
Hintergrund der Erfindung
In den bisher in kommerziellen Prozessen verwendeten Aufreinigungsverfahren für Blut(Blut)Plasmaproteine wie IgG wird in der Regel eine zweifache chromatographische Reinigung über Ionentauschersäulen durchgeführt, wobei Ausbeuten des IgG von 70 bis 80% erzielt werden. Der Anteil an Verunreinigung mit kritischem IgA liegt dabei unter 0,4%. So beschreibt beispielsweise die DE 698 23 931 ein Chromatographieverfahren zur Aufreinigung von IgG unter Verwendung von zwei Anionenaustauschsäulen, von denen einer ein starker Anionentauscher und der zweite ein schwacher Anionentauscher ist, und wobei beide Säulen in Serie geschaltet werden können. Das in diesem Rahmen erhaltene IgG wurde in einer Ausbeute von 69% erhalten und weist eine Reinheit von etwa 99% auf. Hinsichtlich des Gehalts des in diesem Verfahren erhaltenen IgA's werden keine Angaben gemacht.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von IgG, das sich zur intravenösen Anwendung eignet, wird in CA 1 201 063 beschrieben. Dabei wird eine Plasma-Fraktion einem zweistufigen Trennverfahren mit zwei verschiedenen Anionenaustauschharzen unterzogen. In jeder Stufe wird der Puffer, der dazu verwendet wird, das Anionenaustauschharz in Gleichgewicht zu setzen, auch dazu verwendet, die IgG enthaltende Fraktion von dem Harz zu eluieren.
Schließlich ist ein Verfahren zur Isolierung einer Human-IgG und Albumin enthaltenden Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung in US 4,476,190 beschrieben, das Fällungsstufen unter gesteuerten Bedingungen des pH, der Ethanolkonzentration, der Ionenstärke und der Temperatur beinhaltet.
Die bisher verfügbaren Methoden zur Aufreinigung von (Blut)Plasmaproteinen, insbesondere von Antikörpern, weisen den Nachteil auf, dass sie in der Regel aufwendig und langwierig sind, die Verwendung nicht regenerierbarer Reinigungsmaterialien einbeziehen, oder die funktionelle Integrität des (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils durch die Aufreinigungsschritte beeinträchtigt wird und somit das (Blut)Plasmaprotein nur in geringer Ausbeute oder Reinheit und Aktivität erhalten werden können.
Beschreibung
Das technische Problem, mit dem sich die vorliegende Erfindung befasst, ist das zur Verfügung stellen eines neuen Reinigungs-, Aufkonzentrations- und/oder Trennungsverfahrens für (Blut)Plasmaproteine, Viren oder Virenbestandteile, ohne dass Nachteile der bisher bekannten Verfahren wie sie im vorstehenden Abschnitt zusammengefasst wurden, in Kauf genommen werden müssen. Dies bedeutet, dass das Verfahren die Isolation des gewünschten (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils in hoher Reinheit erlauben soll. Darüber hinaus soll eine weitgehende Automation möglich sein und eine hohe Ausbeute erzielt werden. Gleichzeitig soll die funktionale Integrität der (Blut)Plasmaproteine, Viren oder Virenbestandteile nicht beeinträchtigt und die Verwendung von teuren Materialien großteilig vermieden werden. Ebenso soll das neue Verfahren die Verwendung von Standard-Reinigungs- und Sterilisierungsprotokollen des Equipments während der Verwendung erlauben und so die Zulassung des Verfahrens zur Herstellung von pharmazeutischen Produkten durch die entsprechenden Behörden gewährleisten. In anderen Worten ist Ziel der vorliegenden Erfindung das zur Verfügung stellen des gewünschten (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils in wirtschaftlich günstiger Weise und in einer für pharmazeutische Produkte geeigneten Qualität.
Dieses technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder ein proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend:

(i) das in-Kontakt-Bringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden;
(ii) das in-Kontakt-Bringen des Sorbens 1 mit dem daran gebundenen (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen;
(iii) das in-Kontakt-Bringen des (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils aus (ii), das/der in einer Flüssigkeit 3 gelöst oder suspendiert ist mit einem Sorbens 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil an das Sorbens 2 zu binden;
(iv) das in-Kontakt-Bringen des Sorbens 2 mit dem daran gebundenen (Blut)Plasmaprotein, Virus oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 4 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil von dem Sorbens 2 zu lösen,

Weiterhin wird das Problem gelöst durch eine Vorrichtung zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder ein proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, die dieses (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthält umfassend:

– eine erste stationäre Phase umfassend ein Sorbens 1 mit einem Einlass zum Aufbringen der das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthaltenden Mischung und einem Auslass zum Auffangen des vorgereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils, und
– einer zweiten stätionären Phase umfassend ein Sorbens 2 mit einem Einlass zum Aufbringen der vorgereinigten (Blut)Plasmaprotein-, Viren- oder Virenbestandteilfraktionen und einem Auslass zum Auffangen des gereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils,

Das vorstehend dargestellte Verfahren kann dadurch vorteilhaft weitergebildet werden, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils an das Sorbens in Schritt (i) und/oder (iii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen wird. Alternativ oder zusätzlich kann das oben beschriebene Verfahren verbessert werden, indem im Anschluss an das Lösen des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils vom Sorbens in Schritt (ii) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird.
Schließlich kann das Verfahren auch der Gestalt weitergebildet werden, dass vor dem Binden des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils an das Sorbens in Schritt (i) und (iii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.
Bezüglich der Eigenschaften der zu reinigenden (Blut)Plasmaproteine, Viren oder Virenbestandteile bestehen keine besonderen Einschränkungen. Es hat sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn (Blut)Plasmaproteine, Viren oder Virenbestandteile aufgereinigt werden, deren isoelektrischer Punkt pI im Bereich von 5,5–8,5 liegt und die ein Molekulargewicht von dem Bereich von 100–500.000 Da aufweisen. Die (Blut)Plasmaproteine, Viren oder Virenbestandteile sind vorzugsweise Antikörper, und besonders bevorzugt Immunugloboline. Von diesen sind vor allem IgG, IgA und IgM für das beschriebene Verfahren besonders interessant. Neben Antikörpern können auch Fragmente oder Verbindungen von natürlichen Antikörpern, genetisch hergestellte Varianten von Virenbestandteilen mit dem beschriebenen Verfahren effektiv gereinigt werden.
Die das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthaltene Mischung kann eine natürliche oder synthetische Mischung sein, insbesondere kann die Mischung aus Blutplasma oder einem Zwischen- oder Endprodukt aus Blutplasma bestehen. Besonders bevorzugt wird das Verfahren unter Verwendung von Blutplasma oder einem proteinhaltigem Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren von Blutplasma erhalten wurde, durchgeführt. Zum Beispiel sind Cohn-Fällungsprodukte als A + 1, II + III oder I + II + III Pasten kommerziell erhältlich. Das natürliche Blut kann menschlichen oder tierischen Ursprungs sein, allerdings ist die Verwendung von menschlichem Blut bevorzugt.
Bei der Aufreinigung von (Blut)Plasmaproteinen kann vor dem eigentlichen Reinigungsverfahren oder innerhalb des Verfahrens nach den Schritten (ii) oder (iv) eine zusätzliche virale Inaktivierung durchgeführt werden. Typischerweise wird für eine solche Inaktivierung das Solvent-Detergent-Verfahren verwendet, bei dem vorhandene Viren durch Zugabe von nicht-ionischen Seifen und organischen Phosphaten zerstört werden, indem die Lipidschicht um die Virushülle aufgelöst wird. Die Durchführung eines solchen Schrittes ist beispielsweise durch B. Horowitz et al in blood, 79, 826–831 (1992) beschrieben. Alternativ können vorhandene Viren auch mit anderen Verfahren, beispielsweise durch die in der US 4,939,176 beschriebenen Behandlung mit Caprylsäure inaktiviert werden.
Bei dem im Verfahren verwendeten Sorbentien 1 und 2 handelt es sich jeweils um ein festes Trägermaterial, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist. Besonders bevorzugt besteht das Trägermaterial aus einem porösen Grundmaterial, das zur Einlagerung und Vernetzung einer Polyaminverbindung zunächst mit dieser Aminverbidung überzogen wird und anschließend unter Anknüpfung von funktionalisierten Rezeptormolekülen unter Ausbildung kovalenter Bindungen zwischen den Rezeptormolekülen und dem Polyamin funktionalisiert wird. Bei dem porösen Grundmaterial handelt es sich zweckmäßig um ein poröses Polystrol Als Polyaminverbindung hat sich die Verwendung von Polyvinylamin als besonders zweckmäßig erwiesen. Das Trägermaterial wird durch die Zugabe eines Vernetzungsmittels, beispielsweise Diepoxid, vernetzt. Die Herstellung von Trägermaterialien die mit Polyvinylamin überzogen sind, ist bereits im Stand der Technik, zum Beispiel in EP 1 141 038 und EP 1 232 018 beschrieben worden.
Anschließend wird das so erhaltene Polyamin beschichtete Sorbens mit zwei organischen Resten funktionalisiert. Dabei hat sich insbesondere die Verwendung von Säure-funktionalisierten Rezeptormolekülen oder Derivaten davon, bei denen nach Umsetzung mit dem Polyvinylamin Amid-Verknüpfungen ausgebildet werden, als besonders zweckmäßig erwiesen.
Es ist möglich, die im Sorbens vorhandenen Amingruppen vollständig mit organischen Resten zu funktionalisieren. In der Praxis der vorliegenden Erfindung ist es aber erwünscht, dass nur etwa 25 bis 98% der freien Amingruppen des Polyamins mit Rezeptormolekülen umgesetzt werden.
Für das Sorbens 1 hat es sich gezeigt, dass zum einen Rezeptormoleküle einem Pyridinring (-C₅H₄N) deren Wasserstoffatome substituiert sein können und Carboxylgruppen (-COOH) zu besonders selektiven Sorbenzien führen. Dabei können sowohl der Pyridinring als auch die Carboxylgruppe über einen kovalent gebundenen Linker mit dem Polyaminmaterial verbunden sein. Falls ein Linker vorhanden ist, ist dieser vorzugsweise konformationell flexibel, damit sich das Rezeptormolekül in die für die Bindung des Peptids oder Proteins günstigste Stellung drehen kann.
Für das Sorbens 2 führt hingegen die Verwendung von Benzopyrrolresten in Kombination mit Pyrrolresten zu besonders effizienten Trennungs- und Reinigungsergebnissen. Der Pyrrolrest kann insbesondere ein 3-Azapyrrolrest und besonders bevorzugt ein 4-Imidazolacryliamidrest sein. Der Benzopyrrolrest ist vorzugsweise ein 3-Indolpropionamidrest, wobei sich die Kombination der genannten speziellen Reste als besonders effektiv herausgestellt hat. Auch die Benzolpyrrol- und Pyrrolreste können über einen Linker, wie er vorstehend für das Sorbenz 1 beschrieben ist, mit der Polyaminverbindung im festen Trägermaterial verbunden sein.
Für die Verknüpfung der Rezeptormoleküle mit dem festen Trägermaterial kommen alle bekannten Verfahren zur Verknüpfung von Aminen mit anderen funktionellen Gruppen in Betracht, insbesondere Verfahren zur Bildung von Amidbindungen, Sulfonamidbindungen oder die Umsetzung der Amine mit Aldehyden unter reduktiven Bedingungen. Wird eine Säurefunktionalität zur Verknüpfung mit den Aminresten des Trägermaterials verwendet, wird nach der Umsetzung in der Regel eine Amidfunktionalität erhalten mit der das Rezeptormolekül an das Trägermaterial gebunden ist. Zur Bildung solcher Amidverknüpfungen kommen alle im Stand der Technik beschriebenen Reaktionsarten in Betracht, die dem Fachmann geläufig sind.
Auch die Bindung von Rezeptormolekülen an Trägermaterialien wie sie vorstehend beschrieben sind, wurde bereits im Stand der Technik, insbesondere in WO 2004/085046 , beschrieben.
Das Verfahren kann im Weiteren dadurch vorteilhaft ausgestaltet werden, dass die Flüssigkeiten 1 im Schritt (i) ein Puffer ist. Der Puffer hat bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 1 bis 100 mM, insbesondere von 2 bis 20 mM. Der pH-Wert der Flüssigkeit liegt unabhängig von der Konzentration zweckmäßigerweise in der Nähe des isoelektrischen Punktes pI des gebundenen (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils, insbesondere in einem pH-Bereich von etwa 4.0 bis 6.0.
Hinsichtlich des Verhältnisses des aufzureinigenden (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenses ergeben sich keine besonderen Beschränkungen. Es hat sich jedoch als zweckmäßig erwiesen, ein Verhältnis von 2–20, insbesondere 8–16 mg/ml zu wählen. Das Verhältnis von Flüssigkeit 1 zur Mischung enthaltend das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil im Schritt (i) unterliegt ebenfalls keinen besonderen Einschränkungen. Für dieses hat sich ein Verhältnisbereich von 5:1 bis 15:1, insbesondere 8:1 bis 10:1 bezogen auf das Gewicht Flüssigkeit zu Protein als besonders geeignet herausgestellt.
Der in Schritt (i) als Flüssigkeit 1 verwendete Puffer ist vorzugsweise eine Substanz, die einen pKa-Wert im Bereich von 4.0 bis 6.0 aufweist, da dadurch eine möglichst hohe Pufferkapazität gewährleistet werden kann. Vorzugsweise ist der Puffer der Flüssigkeit 1 aus Kohlensäure-Silikatpuffern, Essigsäurepuffern, Citrat-Puffern, Phosphatpuffern und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) Puffern ausgewählt.
Die im Schritt (ii) verwendete Flüssigkeit 2 kann ebenfalls ein Puffer sein, der eine höhere Konzentration als der in Schritt (i) verwendete Puffer aufweist, insbesondere eine Konzentration im Bereich von 50–200 und bevorzugt 80–120 mM. Der pH-Wert der Flüssigkeit 2 liegt zweckmäßig im Bereich des isoelektrischen Punktes pI des (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils, oder im Bereich von 6.5–8.5. Bevorzugt liegt der isoelektrische Punkt des (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils innerhalb dieses Bereichs. Dabei werden ebenfalls Puffer verwendet, deren pKa innerhalb dieses pH-Intervalls liegt wie zum Beispiel Carbonatpuffer, Ammoniakpuffer, TRIS-Puffer, HEPES, HEPPS oder Phosphatpuffer.
Es hat sich gezeigt, dass das Verfahren hervorragende Trennleitungen liefert, wenn der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4.0 bis 6.0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6.5 bis 8.5 liegt.
Für die im Schritt (iii) als Flüssigkeit 3 verwendete Flüssigkeit gelten die speziellen Ausführungsformeln als vorteilhaft, die vorstehend für Flüssigkeit 2 als vorteilhaft beschrieben worden sind. Dabei ist es besonders zweckmäßig wenn die Flüssigkeiten 2 und 3 im beschriebenen Verfahren identisch sind, da so ein Austausch der Flüssigkeiten vor dem Aufbringen auf das Sorbens 2 entfallen kann.
Bei der Flüssigkeit 4, die im Schritt (iv) verwendet wird, handelt es sich bevorzugt ebenfalls um eine Flüssigkeit auf Wasserbasis, insbesondere einen Puffer. Dieser weist zweckmäßigerweise einen pH-Wert im Bereich von 3.0 bis 6.5 auf. Der Puffer sollte weiterhin eine Konzentration (des Puffers) im Bereich von 50 bis 300 mM, insbesondere von 100 bis 200 mM aufweisen. Darüber hinaus hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Flüssigkeit neben dem Puffer noch ein neutrales Salz, insbesondere Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200 mM enthält. Auch der als Flüssigkeit 4 verwendete Puffer basiert zweckmäßigerweise auf einer Säure, deren pKa im Bereich des bevorzugten pH-Werts des Puffers, also im Bereich von 3.0 bis 6.5 liegt. So können wie bei der Flüssigkeit 1 Kohlensäure/Silikat, Essigsäure, Citrat, Phosphat und/oder 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) als Pufferbasis gewählt werden.
Für die Schritte (iii) und (iv) hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, wenn der pH-Wert der Flüssigkeit 3 im Bereich von 5.5 bis 8.5 und der pH-Wert der Flüssigkeit im Bereich von 3.0 bis 6.5 liegt.
Während des optional vorgeschalteten Equilibrierens der Sorbenzien 1 und/oder 2, das den Schritten (i) und/oder (iii) vorgeschaltet sein kann, wird vorzugsweise ein Puffer verwendet, der eine höher Konzentration aufweist als die Flüssigkeiten 1 und/oder 3. Für das dem Schritt (i) vorgeschaltete Equilibrieren des Sorbenzes 1 hat es sich als zweckmäßig herausgestellt, wenn der Puffer eine Konzentration im Bereich von 250 bis 3000 mM aufweist. Weiterhin ist es zweckmäßig einen Puffer auf demselben Säure/Salzsystem zu wählen, wie er als Flüssigkeit 1 verwendet wird und der denselben pH-Wert aufweist wie die danach verwendete Flüssigkeit 1. Anschließend kann das Sorbens 1 vor dem Aufbringen der Mischung im Schritt (i) zusätzlich noch mit der Flüssigkeit 1 gespült werden.
Für den Schritt (iii) wird als zum Equilibrieren verwendete Flüssigkeit vorzugsweise eine Säurelösung verwendet, insbesondere Essigsäurelösung. Diese sollte eine Konzentration im Bereich von 200–600 mM aufweisen. Anschließend kann auch vor dem Schritt (iii) das Sorbens 2 mit der Flüssigkeit 3 gespült werden, um den pH-Wert des Sorbenzes auf die zum Auftragen des vorgereinigten Peptids verwendete Flüssigkeit 3 einzustellen.
Bei den optionalen den Schritten (i) und (iii) nachgeschalteten Waschschritten der Sorbenzien 1 oder 2 wird zweckmäßigerweise die im jeweiligen Schritt (i) oder (iii) verwendete Flüssigkeit verwendet. Dabei hat sich herausgestellt, dass ein an den Schritt (iii) angeschlossenes Waschen zu keinen besseren Ergebnissen führt, so dass nur das Waschen nach dem Schritt (i) mit Flüssigkeit 1 angewandt werden sollte.
Beide Sorbentien 1 und 2 können durch Spülen mit stark basischer Lösung regeneriert und von auf den Sorbentien verbliebenem Protein oder Peptid gereinigt werden. Dabei beträgt der pH-Wert der basischen Lösung vorteilhaft mindestens 9, besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von etwa 10 verwendet. Als Base kann jede kommerziell erhältliche Base verwendet werden, aus Kostengründen empfiehlt es sich aber, Natriumhydroxyid oder Kaliumhydroxid zu verwenden. Vor der Regenerierung insbesondere des Sorbenzes 2 kann das Sorbens zusätzlich noch mit einer Säurelösung gespült werden, insbesondere mit einer Konzentration von zwischen 250 und 1000 mM.
Die Vorrichtung zur Trennung und Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses Protein oder Peptid enthält, kann durch die Verwendung der Sorbenzen 1 und 2, deren Aufbau vorstehend beschrieben ist, vorteilhaft ausgestaltet werden. Insbesondere werden in der Vorrichtung ein Sorbens 1 dessen Oberfläche mit Pyridin-4-carboxyamidresten und 3-Carboxamidopropionsäureresten funktionalisiert ist. Besonders gute Trennleistungen lassen sich daneben durch ein Sorbens 2 erzielen, dessen Oberfläche mit Benzopyrrolresten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist, insbesondere mit 3-Indolpropionamidresten und 4-Imidazolacrylamidresten.
Mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der Vorrichtung lassen sich Antikörper, insbesondere Immunglobuline wie IgG, IgM und IgA in wenigen Schritten und kostengünstig reinigen. Das folgende Beispiel soll aber nur zur Illustration der beschriebenen Erfindung dienen und deren Umfang nicht in irgendeiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Das Sorbenz 1 wird mit 500 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) gespült und anschließend mit der gleichen Menge 10 mM Citrat-Puffer (pH 5.0) equilibriert. Anschließend wird eine kommerzielle A + 1 Paste als 10%ige Lösung in 10 mM Citrat-Puffer bei pH 5 auf das Sorbens aufgebracht und mit demselben Puffer gespült. In den zuerst gewonnenen Fraktionen wird Albumin und Transferrin (Ausbeute quantitativ dazu, Reinheit rund 90%) erhalten, die in weiteren Reinigungsstufen (Ionentauscher) gereinigt werden können. Nach dem Auffangen der Albumin/Transferinfraktionen wurde die Säule mit weiterem 10 mM Citrat-Puffer bei pH (5.0) gespült. Anschließend wurde vorgereinigtes IgG durch Spülen mit 100 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4 von der Säure eluiert. Das dabei erhaltene IgG hatte Reinheit von ≥ 80% und wurde in einer Ausbeute von ≥ 98% erhalten. Das Produkt war Albumin- und Transferrinfrei.

Vor dem Auftragen dieses Zwischenprodukts auf das Sorbenz 2 wurde dieses ebenfalls zunächst durch Spülen mit 400 mM Essigsäurelösung und anschließendem Spülen mit 100 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) equilibriert. Anschließend wurde das vom Sorbenz 1 eluierte, in Phosphatpuffer gelöste Zwischenprodukt auf das Sorbens aufgebracht. Die Beladung betrug bezogen auf IgG 12 mg/ml Sorbensvolumen. Anschließend wurde durch Spülen mit 150 mM Acetatpuffer (pH 4,3)/100 mM Natriumchlorid reines IgG von der Säure eluiert. Das so erhaltene IgG kann auf 10–20% Gehalt aufkonzentriert werden. Schließlich wurde das Sorbens mit 500 mM Essigsäure gespült und IgA und IgM mit einer Ausbeute von ≥ 90% in hoher Reinheit gewonnen. Das gewonnene IgG als Lösungen mit einem Gehalt von 10% weist die folgenden Eigenschaften auf:

Reinheit:	> 99,5
Ausbeute:	93% (über zwei Säulen)
IgG-Aktivität:	95–105%
IgA:	10–20 μm/ml (≤ 0.01%)
IgM:	0.25 bis 0.50 μm/ml (0.00%)
Albonin:	50–100 μm/ml (≤ 0.05%)
Transferrin:	5–10 μm/ml (0.00%)
Restproteine:	Fibrinogen, Haptoglobolin, 2-Macroglobolin, Apolipoprotein A und B und IgD (alle unter dem Dedektionslimit ≤ 0.01%)

Als Sorbens 1 wurde ein mit Pyridin-4-carboxyamidresten und 3-Carboxamidopropionsäureresten funktionalisiertes Trägermaterial, als Sorbens 2 ein mit 3-Indolpropionamidresten und 4-Imidazolacrylamidresten funktionalisiertes Trägermaterial verwendet. Die kommerzielle A + 1 Paste hatte die folgende Zusammensetzung: IgG: 77%; IgA: 7%; IgM: 3%; Albumin 12%; Transferrin 1%; Gesamtproteingehalt: 75%.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

DE 69823931 [0002]
CA 1201063 [0003]
US 4476190 [0004]
US 4939176 [0013]
EP 1141038 [0014]
EP 1232018 [0014]
WO 2004/085046 [0020]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

B. Horowitz et al in blood, 79, 826–831 (1992) [0013]

Claims

Verfahren zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder ein proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend: (i) das in-Kontakt-Bringen der Mischung, die in einer Flüssigkeit 1 gelöst oder suspendiert ist mit einem Sorbens 1 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil an das Sorbens 1 zu binden; (ii) das in-Kontakt-Bringen des Sorbens 1 mit dem daran gebundenen (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil von dem Sorbens 1 zu lösen; (iii) das in-Kontakt-Bringen des (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils aus (ii), das/der in einer Flüssigkeit 3 gelöst oder suspendiert ist mit einem Sorbens 2 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil an das Sorbens 2 zu binden; (iv) das in-Kontakt-Bringen des Sorbens 2 mit dem daran gebundenen (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil mit einer Flüssigkeit 4 für einen ausreichenden Zeitraum, um das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil von dem Sorbens 2 zu lösen, wobei die Sorbenzien 1 und 2 jeweils ein festes Trägermaterial darstellen, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist, wobei die Oberfläche des Sorbenzes 1 mit Pyridin-4-carboxyamido-Resten und 3-Carboxamidopropionsäure-Resten und die Oberfläche des Sorbens 2 mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Binden des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils an das Sorbens im Schritt (i) und/oder (iii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Anschluss an das Lösen des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils vom Sorbenz im Schritt (ii) und/oder (iv) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit gewaschen und/oder regeneriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Binden des (Blut)Plasmaproteins, des Virus oder Virenbestandteils an das Sorbens in Schritt (i) und/oder (iii) das Sorbens mit einer weiteren Flüssigkeit equilibriert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeiten 2 oder 3 in der Nähe des isoelektrischen Punktes pI des gebundenen (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 1 im Bereich von 4.0 bis 6.0 und der pH-Wert der Flüssigkeit 2 im Bereich von 6.5 bis 8.5. liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der Flüssigkeit 3 im Bereich von 5.5 bis 8.5 und der pH-Wert der Flüssigkeit 4 im Bereich von 3.0 bis 6.5. liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)Plasmaprotein, der Virus oder Virenbestandteil einen isoelektrischen Punkt pI im Bereich von 5,5 bis 8,5 und ein Molekulargewicht von 100 bis 500.000 Da aufweist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das (Blut)Plasmaprotein, der Virus oder Virenbestandteil Immunoglobulin-G oder ein natürlicher Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Benzopyrrolreste 3-indolpropionamidreste und die 3-Azapyrrolreste 4-Imidazolacrylamidoreste darstellen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 1 in Schritt (i) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 1 bis 100, insbesondere 2 bis 20 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Gewicht des aufzureinigenden (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils in der Mischung zum Volumen des Sorbenzes im Bereich von 2 bis 20, insbesondere 8 bis 16 mg/mL liegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 2 in Schritt (ii) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200, insbesondere 80 bis 120 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 3 in Schritt (iii) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200, insbesondere 80 bis 120 mM ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeiten 2 und 3 identisch sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 4 in Schritt (iv) ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 50 bis 300, insbesondere 100 bis 200 mM ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit 4 weiterhin Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von 50 bis 200 mM enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (i) verwendete Flüssigkeit ein Puffer mit einer Konzentration im Bereich von 250 bis 2000 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer ein pH-Wert von zwischen 4.0 und 6.0 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (i) das Sorbens 1 mit Flüssigkeit 1 gespült wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Equilibrieren vor Schritt (iii) verwendete Flüssigkeit eine Säurelösung ist, die eine Konzentration im Bereich von 200 bis 600 mM aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt (iii) das Sorbens 2 mit Flüssigkeit 3 gespült wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet dass die zum Spülen nach dem Schritt (i) verwendete Flüssigkeit die Flüssigkeit 1 ist.
Verfahren nach Anspruch 3 oder einem davon abhängigen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorbens durch Spülen mit basischer Lösung und einem pH von mindestens 9 regeneriert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass Natriumhydroxidlösung mit einem pH-Wert von etwa 10 verwendet wird.
Vorrichtung zur Trennung, Aufkonzentration und/oder Reinigung eines (Blut)Plasmaproteins, eines Virus oder Virenbestandteils aus einer Mischung, die dieses (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthält, wobei die das (Blut)Plasmaprotein oder den Virenbestandteil enthaltende Mischung natürliches menschliches oder tierisches Blut oder ein Zwischen- oder fertiges Produkt von natürlichem menschlichen oder tierischen Blut ist, insbesondere Blutplasma oder ein proteinhaltiges Fällungsprodukt, das nach einem Fraktionierungsverfahren aus Blutplasma erhalten wurde, umfassend: – eine erste stationäre Phase umfassend ein Sorbens 1 mit einem Einlass zum Aufbringen der das (Blut)Plasmaprotein, den Virus oder Virenbestandteil enthaltenden Mischung und einem Auslass zum Auffangen des vorgereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils, und – einer zweiten stätionären Phase umfassend ein Sorbens 2 mit einem Einlass zum Aufbringen der vorgereinigten (Blut)Plasmaprotein, Virus oder Virenbestandteils und einem Auslass zum Auffangen des gereinigten (Blut)Plasmaproteins, Virus oder Virenbestandteils, wobei die Sorbenzien 1 und 2 jeweils ein festes Trägermaterial sind, dessen Oberfläche mit mindestens zwei Rezeptormolekülen funktionalisiert ist, wobei die Oberfläche des Sorbenzes 1 mit Pyridin-4-carboxyamido-Resten und 3-Carboxamidopropionsäure-Resten und die Oberfläche des Sorbens 2 mit Benzopyrrol-Resten und 3-Azapyrrolresten funktionalisiert ist.