WO2007080320A2 - Embout de pipette contenant un systeme reactif, procede de preparation et utilisation notamment dans le domaine des dosages unitaires par colorimetrie ou photometrie - Google Patents

Embout de pipette contenant un systeme reactif, procede de preparation et utilisation notamment dans le domaine des dosages unitaires par colorimetrie ou photometrie Download PDF

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Dominique Champiat
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above

Definitions

  • the present invention relates, as a new industrial product, to a pipette tip containing a solid or gelled reaction system. It also relates to the process for preparing such a tip and its use in particular in the field of colorimetric or photometric assays, where appropriate unitary.
  • Pipette tips containing sorption devices housed in the interior of said tips over part of their height are already known.
  • Published application US 2002/0185428 A discloses a pipette tip containing a disk (or truncated cone) consisting of (i) an assembly of several substrates (or membranes) polymers and porous, said assembly being used as a means of affixing elution, and (ii) a porous polymeric membrane, which envelops chromatographic particles.
  • the aim is concentration, separation and / or purification of a substance contained in a liquid which is sucked for treatment into the internal cavity of the tip.
  • US Pat. No. 6,537,502 B discloses a pipette tip containing on a portion of its inner wall a coating which is a solid matrix constituted by a mixture of an inert polymer substance, for example polytetrafluoroethylene (PTFE), and a chromatographic material, which may be a silica gel or other substance.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • This matrix is immobilized on the inner wall of the nozzle, without significantly obstructing the liquid flow at the lower orifice of the nozzle, "according to a physical or chemical means known per se, for example by adhesion, heat, pressure or engraving "(see US 6537502 B, column 2 lines 21-22).
  • This matrix is used as a means of sorption or fixation / elution in order to achieve, as indicated above, the concentration, separation and / or purification of a substance contained in a liquid sample to be tested which is sucked and pumped several times into the interior of the tip.
  • This patent particularly its example 1, is silent with regard to the method used to coat a portion of the inner wall of the tip.
  • These prior technical solutions are suitable for housing inside a pipette tip and keep it during storage until use a relatively low content of a powder reagent for colorimetric or photometric assay.
  • a pipette tip is a hollow body provided with two orifices and whose diameter is increasing, from the lower end to the upper end, on at least a portion of its lower part, the orifice (Oi), disposed at the lower end and which has a diameter smaller than that of the orifice (Os) disposed at the upper end, for the suction and delivery of a liquid, and the orifice of the upper end (Os), connected to a vacuum pump, for filling the nozzle with said liquid during the suction phase and to empty it during the discharge phase.
  • lyophilization When it comes to biological substances deemed particularly fragile because degradable or inactivable, especially by temperature rise, it is often used lyophilization for packaging in multidoses or sometimes in single doses, but in the latter case there are difficulties of reproducibility, in particular by loss of reagent by volatilization. However, lyophilization alone is not suitable. If a reagent system is lyophilized inside a pipette tip, a powder will be obtained coating a portion of the inner wall of the tip; but under the action of shock during storage or transport the powder will peel off the wall, and we are faced with the problem referred to above.
  • a device for determining qualitatively or quantitatively in a liquid sample to be tested, by at least one identification reaction, the desired product comprises a support and at least one reagent participating in the determination reaction, said reagent being deposited in the form of a dry layer on said support, intended to be brought into contact with a liquid medium, and not being bonded to said support, said support consisting of a unitary reaction container, arranged to directly receive all of the sample to be tested and to serve as a reaction chamber. It is possible to provide that a said layer comprises several determination reagents.
  • EP 0320842 A 5 of WO 90/01167 A and US 2004/006241 A discloses rigid porous supports, in particular of plastic, glass or ceramic, containing biological active ingredients incorporated by impregnation and then evaporation of the solvent.
  • the impregnation technique is not transferable to garnish the inside of a pipette tip because it provides dried products distributed in the pores and the outer surfaces.
  • the objective is to be able to house at least one reagent inside a mouthpiece so that this reagent is concentrated and bound (directly or indirectly as indicated above) to the inner wall of the mouthpiece during storage, transport and manipulations required before use, then be soluble or dispersible in the total reaction medium which is pumped and then expelled to a reaction vessel.
  • it is proposed to provide a new technical solution to solve all the aforementioned problems, in particular without loss of sensitivity with regard to colorimetric or photometric assays.
  • kits, kits or dosing kits containing one or more of said tips ready for use and intended for the realization of specific microdoses, such as those relating to the determination of chlorides, phosphates, impurities or pollutants.
  • a device for laboratory reaction and especially for colorimetric or photometric assay is provided as a new industrial product, said device, which is of the pipette tip type containing a reagent system, being characterized in that that he understands:
  • a reagent system comprising a wetting agent and at least one reagent at a known dose using a suitable reaction process, said reagent system, which (i) is solid or gelled, and which (ii) is soluble or dispersible in a reaction medium intended to be sucked at the moment of use, being temporarily immobilized, vis-à-vis the inner wall of said tip until the moment of use, in a form selected from the group consisting of :
  • a method for the preparation of a device according to the invention is advocated, said method being characterized in that a volume v of liquid or gel containing a reactive system comprising a wetting agent and at least one a reagent at a given dose occurring according to a reaction process which is appropriate to it, the volume v being less than the useful volume V of the tip, and then the liquid containing said reactive system in suspension or in dispersion is subsequently removed by drying, the gel can be preserved in the state or subjected to drying to give a powder adsorbed on a portion of the inner wall of the tip.
  • FIGS. 1-10 relate to the colorimetric calibration curve according to the invention of various reactive systems, in an optical density variation (OD) system on the ordinate, as a function of the concentration of the reagent of the reagent system concerned (in mg / ml).
  • OD optical density variation
  • FIG. 11 shows the calibration curve of FIG. 11 for low ATP contents (from 0 to 1.5 ng / t).
  • FIG. 12 schematically shows a pipette tip according to the invention. Detailed description of the invention
  • reactive system means here a reagent or several reagents involved either in a given laboratory reaction, which implements low weight amounts of reagent (s), or in a characterization reaction of a given substance according to a colorimetric assay ( a variation of absorbance) is measured or according to a photometric determination (the light emitted is measured, or even possibly a variation of the emitted light).
  • the liquid of the reaction medium, the liquid used to solubilize or disperse the reagent system during its incorporation into the inside of the pipette tip, and the liquid used to make the gel containing the reagent system to be sucked into a portion of the lumen of the tip may be (i) water or an aqueous solution, or (ii) an organic solvent compatible with the reaction process that will be followed.
  • the preferred liquid is optionally buffered water.
  • the measurements are made on said reaction medium poured into tubes (especially hemolysis tubes), into cuvettes or into microplate wells with a spectrometer. or a photometer.
  • the reaction medium contains the sample that one wants to test, it may also contain other usual additives in the chosen reaction process and, if necessary, any other reagent necessary in said reaction process. Alternatively, any other necessary reagent may be provided by another tip dedicated thereto or incorporated in said reagent system. In practice, the "trigger", which triggers the color reaction or the emission of photons, will be introduced last in the reaction medium.
  • the device according to the invention is particularly effective for the implementation of colorimetric or photometric assays. If necessary, it may be useful for storing and then supplying a known amount of a different laboratory reagent than the colorimetric and photometric reagents. However, the field where said reagent is most interesting is that of said colorimetric and photometric assays. According to the method of preparation of the device of the invention, the elimination of the liquid having conveyed the reactive system into the interior of the pipette tip is made:
  • centrifugal evaporation and zeodration rather than lyophilization are preferred here.
  • the centrifugal evaporation under vacuum (carried out at a temperature of less than or equal to 60 ° C.) gives good results, is less expensive than zeodration and advantageously provides dry annular deposits containing the reagent at a given dose.
  • a wetting agent is present in the reagent system.
  • said wetting agent will be introduced with the reagent into the liquid serving either as a vehicle to said reagent system or a means of swelling the gel containing said reagent system.
  • Suitable wetting agents include, but are not limited to, anionic surfactants and nonionic surfactants.
  • anionics dihexyl sodium sulphosuccinate of formula
  • the conditioning of the reactive system within a gel housed in a portion of the lumen of the tip is amply sufficient for the preservation and transport of the device of the invention.
  • the reagent contained in the gel is for convenience said "as being indirectly linked to the inner wall of the tip via said gel". This is an imaged language to distinguish the solid product deposited on a portion of the inner wall of the tip, the gel in contact with said inner wall according to a cylindrical ring or conical trunk.
  • Suitable gelling agents include water-soluble or water-dispersible gums and resins (such as xanthan gum), carboxymethylcellulose (CMC) and hydrophilic fumed silica having a sub-micron particle size in the dry state, in particular hydrophilic marketed by said company CABOT silicas under the nomenclature "CAB-O-SIL,” such as “CAB-O-SIL ® LM-150", “CAB-O-SIL ® M-5”, “CAB-O- SIL ® EH-5 "and” CAB-O-SIL ® M-7D ".
  • CAB-O-SIL such as "CAB-O-SIL ® LM-150", “CAB-O-SIL ® M-5", “CAB-O- SIL ® EH-5 "and” CAB-O-SIL ® M-7D ".
  • the gelling agent will be used at a concentration of 0.1 to 20% w / v relative to the liquid used for swelling.
  • the preferred gelling agent is xanthan gum, which is soluble in water at low concentrations and has antioxidant properties promoting the conservation of the device of the invention during storage.
  • the useful volume V of the inside of the nozzle is generally less than or equal to 200 ⁇ l, the volume v of the liquid vehicle of the reactive system will be less than or equal to 0.75 V and advantageously between 0.01 V and 0 In practice, a volume v between 0.5 ⁇ l and 50 ⁇ l will be used, and more preferably a volume v between 1 ⁇ l and 20 ⁇ l.
  • a volume v of liquid vehicle containing the reagent system is sucked into the pipette tip and the wetting agent, then ( ⁇ ) drying is carried out by eliminating said liquid vehicle in particular by vacuum centrifugal evaporation, by zeodration or by lyophilization.
  • Second Mode a volume v of gel containing a swelling liquid, the reactive system (reagent and wetting agent) is loaded into the mouthpiece.
  • drying is carried out according to step I ⁇ , the loaded gel obtained in step II.
  • the vehicle liquid stages Ia and I ⁇ , on the one hand, and the gel swelling liquid of stage Et, on the other hand, are advantageously aqueous liquids (mainly water or water). water with buffer). It is important that the device of the invention is hermetically sealed. After loading the volume v according to Ia or II, the orifice Oi is closed, for example by means of a cap to be removed at the time of use.
  • the closure may, where appropriate be carried out using a rubber or resin, for example nail polish or better a water-soluble or water-dispersible gum or resin such as xanthan gum.
  • the os hole is closed by means of a film (in particular optionally adhesive aluminum) which can be frangible or which can be peeled at the time of use.
  • a film in particular optionally adhesive aluminum
  • Hermetic sealing is required to prevent contamination, contamination, oxidation or humidification of the reagent system.
  • the evaporation operation should advantageously be carried out under vacuum and with rotary stirring.
  • the rotary agitation is generally produced during evaporation by a blade device housed in the vacuum circuit either in the pipette or outside thereof and which produces a vortex causing rotation of the volume v around the liner. axis of the mouthpiece.
  • the best mode of evaporation which is suitable for this purpose, is the vacuum centrifugal evaporation mentioned above. This ensures in cooperation with the wetting agent a connection to the inner wall of the nozzle such that it is able to withstand transport and especially shock without the solid product deposited on said wall falls by gravity on the closing the orifice Oi.
  • step (v) the ring-shaped deposit is located at a certain height above the lower orifice Oi of the nozzle. This height corresponds approximately to the level reached by the volume v at the end of step (iii).
  • each new deposit is disposed offset from the preceding deposit.
  • the sample (E) to be tested will constitute the reaction medium.
  • the reaction is triggered immediately with regard to a larger and better reactive system / sample exchange surface (SfE).
  • the reading is carried out: - as regards the luminescence reactions (bioluminescence (BL), chemiluminescence (CL) biochimiluminescence (BCL) and fluorescence (Fl)], the exchange surface (S / E) being maximal, the quantity of scattering photons at the end of the reaction; with regard to the reactions developing a color or producing a color change, the variation in optical density, in particular by transmission or diffraction (for example at an angle of ⁇ / 2), is evaluated by means of a spectrotometer.
  • the tip of the device of the invention which is non-hydrophobic, can also serve as a support for various materials [antibodies, nucleic probes and other substances such as alkaloids, their metabolites and proteins, including apolipoprotein H (ApoH)], which can be bound to magnetic beads.
  • antibodies, nucleic probes and other substances such as alkaloids, their metabolites and proteins, including apolipoprotein H (ApoH)
  • ApoH apolipoprotein H
  • such antibodies make it possible to trap (capture) specifically the targets (molecular and / or cellular) or the specific product (P) likely to be contained in the sample (E) and, by decantation or magnetic separation, they allow the concentration and purification of the desired targets in a heterogeneous medium.
  • the devices of the invention may be packaged in microplate format (for microtitration). This makes it possible to analyze unitarily only automatically (with a robot or PLC). If two or three different reagents are required for a reaction at the same time, they can also be deposited and dried as indicated above on different ranges of the inner wall of the tip; then at the time of aspiration of the sample (E) 5 they will be dissolved as a mixture in the reaction medium and, consequently, will be functional at the same time. Fortunately, several reagents can be deposited on the same range; this is the case of the luciferin / luciferase mixture which is useful in ATPmetry assays.
  • Dehydration allows a better conservation of the reagents even at room temperature and also an increase in sensitivity by a factor of 10 to 100 due to the non-dilution of the sample
  • the sample (E) can come from a sampling gas [in particular by bubbling], solid [in particular by contact, dissolution or dispersion] or liquid [in particular by extraction, dissolution or emulsion] by means of an aqueous or organic liquid, said sample may contain the product
  • the product (P) to be tested may be a chemical, biological or microbiological substance.
  • it may be a cellular material, such as tissue, bacteria, mold, algae or viruses, in short a set of cells, microorganisms or unicellular organisms.
  • the product (P) may also be a family of products having a specific function, for example an ester function, an alcohol function, an enzymatic function, an antiradical function, etc.
  • the product (P) to be tested may be in the form of a degradation product, a derivative that is characteristic of the substance to be evaluated, or even a metabolite of a biological or microbiological substance.
  • FIG. 12 schematically illustrates a device according to the invention which comprises a pipette tip 1, provided with a lower orifice 2 (O 1) and an upper orifice 3 (B), a solid product 4, which contains the system reagent constituted by the reagent and the wetting agent, being bonded in the form of a ring to the inner wall of the tip.
  • sample to be tested which serves as a reaction medium
  • Incubation was allowed 15 minutes to complete the transformation of MPA and ADP to ATP.
  • luciferin luciferase mixture of firefly extract
  • a pipette Eppendorf, Gelman, Biohit, or other
  • an aqueous solution of luciferin luciferase mixture of firefly extract
  • a nozzle having a useful volume of 200 ⁇ l
  • the water by centrifugal evaporation under vacuum at 55 ° C. 10 times the sample is sucked in and sucked into the rhesus tube.
  • the rhesus tube is placed in the chamber of a luminometer to integrate the photons emitted by the reaction for 10 seconds for example; a value X is obtained, expressed in units of relative light (RLU).
  • RLU relative light
  • the rhesus tube is taken up, the pipette tip is ejected and another tip is taken in which 100 picomoles of ATP have previously been loaded and dehydrated.
  • the sample is drawn in and sucked 10 times into the Rhesus tube.
  • the rhesus tube is again introduced into the luminometer chamber to integrate the photons emitted by the reaction for 10 seconds; we obtain a value Y expressed in RLU.
  • the calibration curves relating to the measurement of the following products were carried out according to the usual methods required in using a reaction medium of 200 .mu.l and pipette tips containing the dehydrated reagent system.
  • Example 13 The calibration curve relating to ATP was carried out according to the operating protocol given in Example 1. The results that have been obtained are recorded in FIG. 11.
  • FIG. 1a gives the calibration curve for contents. low in ATP (from 0 to 1.5 ng / tube).
  • Example 13
  • a swab is passed over a surface to be tested, said swab being A- moistened with a lysis solution and stirred in a rhesus tube containing a buffer solution (200 ⁇ l) constituting the reaction medium, in order to resuspend the ANs released by the lysed cells; the tube is the same throughout the analysis, until the final result is obtained; B- is wetted to collect the biomass on the surface and stirred in the rhesus tube containing a solution of pure water (200 ⁇ l) constituting the reaction medium in order to resuspend the cells; this tube is the same throughout the analysis, until the final result.
  • the pipette tip containing the solidified reagent corresponding to the lysis solution is taken.
  • the latter may be DMSO, hydrogen peroxide activated by CH 3 COOH, or EDTA TRIS.
  • the 200 .mu.l of sample are aspirated and forced 5 times to homogenize well and allow maximum cell growth.
  • ADP in ATP (myokinase, PEP, pyruvate kinase, buffer salt).
  • the 200 .mu.l of sample of the rhesus tube from the preceding step is aspirated and forced 5 times in order to homogenize well and collect the said enzymes.
  • the sample is drawn in and sucked 5 times into the Rhesus tube.
  • the rhesus tube is introduced into the luminometer chamber to integrate the photons emitted by the reaction for 10 seconds for example; we obtain a value X (in RLU).
  • the tube is taken up, ejected the pipette tip and takes another tip containing the standard solidified reagent, 100 picomoles of ATP. "The sample is drawn in and sucked 5 times into the Rhesus tube.
  • YX gives us the number of RLU per 100 picomoles of ATP in this sample and a rule of three, the number of NA in the tube.
  • the biomass, expressed in the form of a concentration of AN, which is present in the medium coming from the surface to be tested is thus precisely determined.
  • the device of the invention is particularly useful for assessing, by colorimetry or better photometry, the microbiological quality of a surface, an air sample or a liquid.

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Abstract

La présente invention a trait à un dispositif utile notamment pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend : (a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et (b) un système réactif comprenant un agent mouillant et au moins un réactif à une dose connue, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par : (1) la forme pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et (2) la forme gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un gel logé dans une portion de la lumière de l'embout. Elle concerne également le procédé de préparation de ce dispositif et son utilisation dans le domaine des dosages colorimétriques ou photométriques.

Description

Embout de pipette contenant un système réactif, procédé de préparation et utilisation notamment dans le domaine des dosages unitaires par colorimétrie ou photométrie
Domaine de l'invention
La présente invention a trait, en tant que produit industriel nouveau, à un embout de pipette contenant un système réactif solide ou gélifié. Elle concerne également le procédé de préparation d'un tel embout et son utilisation notamment dans le domaine des dosages colorimétriques ou photométriques, le cas échéant unitaires. Art antérieur
On connaît déjà des embouts de pipette contenant des dispositifs de sorption logés dans l'intérieur desdits embouts sur une partie de leur hauteur. De la demande publiée US 2002/0185428 A on connaît un embout de pipette contenant un disque (ou tronc de cône) constitué (i) d'un assemblage de plusieurs substrats (ou membranes) polymères et poreux, ledit assemblage intervenant comme moyen de fîxation/élution, et (ii) une membrane polymère et poreuse, qui enveloppe des particules chromatographiques. Dans les deux cas, le but recherché est la concentration, la séparation et/ou la purification d'une substance contenue dans un liquide qui est aspiré, pour traitement, dans la cavité interne de l'embout.
On connaît par ailleurs du brevet délivré US 6537502 B un embout de pipette contenant sur une portion de sa paroi interne un revêtement qui est une matrice solide constituée par un mélange d'une substance polymère inerte, par exemple du polytétrafluoroéthylène (PTFE), et d'un matériau chromatographique, qui peut être un gel de silice ou d'une autre substance. Cette matrice est immobilisée sur la paroi interne de l'embout, sans obstruer significativement le flux liquide au niveau de l'orifice inférieur de l'embout, «selon un moyen physique ou chimique connu en soi, par exemple par adhésion, chaleur, pression ou gravure» (voir US 6537502 B, colonne 2 lignes 21-22). Cette matrice intervient comme moyen de sorption ou fixation/élution afin de réaliser, comme indiqué plus haut, la concentration, la séparation et/ou la purification d'une substance contenue dans un échantillon liquide à tester qui est aspiré et refoulé plusieurs fois dans l'intérieur de l'embout. Ce brevet, notamment son exemple 1, est muet en ce qui concerne le procédé utilisé pour revêtir une portion de la paroi intérieure de l'embout. Ces solutions techniques antérieures ne conviennent pour loger à l'intérieur d'un embout de pipette et le conserver pendant le stockage jusqu'au moment de l'emploi une teneur relativement faible d'un réactif en poudre pour dosage colorimétrique ou photométrique.
En fait, jusqu'à présent on n'a pas encore utilisé à l'échelle industrielle des embouts de pipette prêts à l'emploi contenant dans leur intérieur un système réactif comprenant un ou plusieurs réactifs intervenant dans une réaction permettant de caractériser, déterminer ou faire réagir une substance donnée.
En effet, un embout de pipette est un corps creux pourvu de deux orifices et dont le diamètre est croissant, de l'extrémité inférieure vers l'extrémité supérieure, sur au moins une portion de sa partie inférieure, l'orifice (Oi), disposé à l'extrémité inférieure et qui a un diamètre inférieur à celui de l'orifice (Os) disposé à l'extrémité supérieure, servant à l'aspiration et au refoulement d'un liquide, et l'orifice de l'extrémité supérieure (Os), relié à une pompe à vide, servant à remplir l'embout par ledit liquide lors de la phase d'aspiration et à le vider lors de la phase de refoulement.
Une poudre ayant été chargée dans le corps intérieur de l'embout et Oi ayant été obturé avec un capuchon, il est clair que, lorsque l'on enlève le capuchon, on a un risque sérieux de perdre une portion indéterminée de la poudre (notamment par gravité et éclaboussures) avant de pouvoir dissoudre ce qui reste de la poudre dans le corps de l'embout. On est par suite contraint (i) de laisser tomber le capuchon dans le milieu réactionnel contenu dans la cuvette de réaction (ii) d'aspirer une portion du milieu réactionnel dans l'embout afin de dissoudre ou disperser le reste de la poudre, (iii) de faire couler le milieu réactionnel résultant, ainsi obtenu, dans la cuvette et (iv) espérer que le capuchon va pouvoir être efficacement rincé par le milieu réactionnel afin que l'on soit en mesure de recueillir en solution la totalité de la poudre provenant de l'embout.
Une telle technique n'est pas commode. Elle n'est pas adaptée aux dispositifs modernes de pipetage qui comprennent plusieurs rangées d'embouts. De plus, si l'on doit faire couler successivement plusieurs réactifs, il est manifeste que la multiplication des capuchons dans la cuvette de réaction va perturber ou empêcher l'agitation du milieu réactionnel qu'elle contient. Par ailleurs, on sait qu'il existe déjà un grand nombre de méthodes analytiques par dosages unitaires, notamment chimiques ou biologiques (analyse de l'eau, analyse biologique médicale, etc.). Ces méthodes impliquent le mélange ou l'ajout de plusieurs substances réactives, le cas échéant à des instants différents. Quand il s'agit de substances biologiques réputées particulièrement fragiles car dégradables ou inactivables, notamment par élévation de température, on a souvent recours à une lyophilisation pour un conditionnement en multidoses ou quelquefois en monodoses, mais dans ce dernier cas il y a des difficultés de reproductibilité, en particulier par perte de réactif par volatilisation. Or la lyophilisation seule ne convient pas. Si on lyophilise un système réactif à l'intérieur d'un embout de pipette, on obtiendra une poudre revêtant une portion de la paroi intérieure de l'embout ; mais sous l'action d'un choc pendant le stockage ou le transport la poudre va se décoller de la paroi, et on se trouve confronté au problème visé ci-dessus. De la demande publiée FR 2694809 A on connaît un dispositif destinée à déterminer qualitativement ou quantitativement dans un échantillon liquide à tester, par au moins une réaction d'identification, la produit recherché. Ce dispositif comprend un support et au moins un réactif participant à la réaction détermination, ledit réactif étant déposé sous forme de couche sèche sur ledit support, destiné à être mis au contact d'un milieu liquide, et n'étant pas lié audit support, ledit support consistant en un contenant unitaire réactionnel, agencé pour recevoir directement la totalité de l'échantillon à tester et pour servir d'enceinte réactionnelle. Il est possible de prévoir qu'une dite couche comprenne plusieurs réactifs de détermination.
Or il se trouve qu'un tel dispositif ne convient pas, d'une part, quand plusieurs réactions sont nécessaires pour caractériser un produit (P) donné, et d'autre part, quand on veut réaliser plusieurs mesures successives. En effet dans le cadre de plusieurs réactions de caractérisation ou de plusieurs mesures on doit entreprendre des dilutions. En particulier la personne du métier est conduite avec le dispositif de FR 2694809A à procéder à des opérations de rinçage qui entraînent des dilutions diminuant la sensibilité des analyses, dès que l'on veut réaliser des mesures supplémentaires.
On connaît par ailleurs de EP 0320842 A5 de WO 90/01167 A et de US 2004/006241 A des supports poreux rigides, notamment en plastique, verre ou céramique, contenant des matières actives biologiques incorporées par imprégnation puis évaporation du solvant. Or il se trouve que la technique d'imprégnation n'est pas transposable pour garnir l'intérieur d'un embout de pipette car elle fournit des produits desséchés répartis dans les pores et les surfaces extérieures. But de l'invention
II serait souhaitable de disposer d'embouts de pipette contenant des quantités minimes connues d'un ou plusieurs réactifs concentrés, qui sont liés, directement par adsorption ou indirectement par le biais d'un gel, à la paroi intérieure de façon temporaire jusqu'à ce que ledit ou lesdits réactifs soient déplacés par le milieu réactionnel, par aspiration et refoulement, dans la cuvette réactionnelle, afin de mettre en œuvre (i) des réactions de laboratoire, ou mieux (ii) des dosages colorimétriques ou photométriques.
L'objectif est de pouvoir loger au moins un réactif à l'intérieur d'un embout de façon que ce réactif soit concentré et lié (directement ou indirectement comme indiqué ci-dessus) à la paroi intérieure de l'embout pendant le stockage, le transport et les manipulations requises avant son emploi, puis soit soluble ou dispersable en totalité dans le milieu réactionnel qui est pompé puis expulsé vers une cuvette réactionnelle. Selon l'invention, on se propose de fournir une nouvelle solution technique pour résoudre l'ensemble des problèmes précités, notamment sans perte de sensibilité en ce qui concerne les dosages colorimétriques ou photométriques.
On se propose donc, selon un premier aspect de l'invention, de fournir des embouts de pipette, et avantageusement des embouts de dispositifs de pipetage pour microdosages colorimétriques ou photométriques, qui contiennent chacun un système réactif lié à la paroi interne desdits embouts et devant, le moment venu, intervenir dans un processus réactionnel connu, tel qu'une réaction colorimétrique ou photométrique. Selon un autre aspect, on se propose de fournir un procédé pour déposer et lier temporairement jusqu'au moment de l'emploi (qui débute par le remplissage des embouts avec le milieu réactionnel liquide de solubilisation ou de dispersion) ledit système réactif à une portion de la paroi intérieure desdits embouts.
Enfin selon encore un autre aspect de l'invention, on se propose de fournir aux utilisateurs des trousses, kits ou nécessaires de dosage contenant un ou plusieurs desdits embouts prêts à l'emploi et destinés à la réalisation de microdosages spécifiques, notamment tels que ceux ayant trait à la détermination des chlorures, des phosphates, des impuretés ou des polluants. Objet de l'invention
Selon l'invention, on met à disposition, en tant que produit industriel nouveau, un dispositif pour réaction de laboratoire et surtout pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et
(b) un système réactif comprenant un agent mouillant et au moins un réactif à une dose connue intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par :
(1) une forme pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et
(2) une forme gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un gel logé au contact de la paroi interne dans une portion de la lumière de l'embout.
Avec un tel dispositif, il suffit d'au moins une séquence d'aspiration- refoulement, et de préférence d'au moins trois séquences d'aspiration- refoulement, pour recueillir la totalité dudit système réactif présent dans l'embout. Selon l'invention on préconise un procédé pour la préparation d'un dispositif selon l'invention, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on aspire un volume v de liquide ou de gel contenant un système réactif comprenant un agent mouillant et au moins un réactif à une dose donnée intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, le volume v étant inférieur au volume utile V de l'embout, et l'on élimine ensuite par séchage le liquide contenant ledit système réactif en suspension ou en dispersion, le gel pouvant être conservé en l'état ou soumis au séchage pour donner une poudre adsorbée sur une portion de la paroi interne de l'embout.
Selon l'invention, l'on préconise également l'utilisation de ces embouts contenant un système réactif pour la mise en œuvre de dosages colorimétriques (par mesure d'une variation de densité optique par absorbance ou diffraction) ou photométriques (par multiplication et comptage des photons émis). Brève description des dessins
Dans les dessins annexés,
- les figures 1-10 concernent la courbe d'étalonnage par colorimétrie selon l'invention de divers systèmes réactifs, dans système variation de densité optique (DO) en ordonnées, en fonction de la concentration du réactif du système réactif concerné (en mg/litre, mmole/litre ou μg/litre) en abscisses ; il s'agit dans chaque cas d'une droite dont l'équation est donnée (sous la forme usuelle y = ax + b) avec le coefficient de corrélation (R2) correspondant ; - la figure 11 concerne la courbe d'étalonnage par photométrie selon l'invention (ATPmétrie) au moyen d'une gamme d'ATP, dans le système unité de lumière relative [en abrégé RLU (ou ULR)] en ordonnées, en fonction de la teneur en ATP par tube de mesure (ng/t) en abscisses ; il s'agit encore ici d'une droite dont l'équation est donnée (sous la forme y = ax + b) avec le coefficient de corrélation (R2) ;
- la figure l ia montre la courbe d'étalonnage de la figure 11 pour les faibles teneurs en ATP (de 0 à 1,5 ng/t) ; et
- la figure 12 représente schématiquement un embout de pipette selon l'invention. Description détaillée de l'invention
Par système réactif on entant ici un réactif ou plusieurs réactifs intervenant soit dans une réaction de laboratoire donnée, qui met en œuvre de faibles quantités pondérales de réactif(s), soit dans une réaction de caractérisation d'une substance donnée selon un dosage colorimétrique (on mesure une variation d'absorbance) ou selon un dosage photométrique (on mesure la lumière émise, voire le cas échéant une variation de la lumière émise).
Le liquide du milieu réactionnel, le liquide utilisé pour solubiliser ou disperser le système réactif lors de son incorporation dans l'intérieur de l'embout de pipette, et le liquide utilisé pour réaliser le gel contenant le système réactif devant être aspiré dans une portion de la lumière de l'embout, peuvent être (i) de l'eau ou une solution aqueuse, ou (ii) un solvant organique compatible avec le processus réactionnel qui va être suivi. Bien entendu, le liquide préféré est l'eau éventuellement tamponnée.
Après refoulement du milieu réactionnel contenant le système réactif initialement immobilisé dans l'embout de pipette, les mesures sont effectuées sur ledit milieu réactionnel versé dans des tubes (notamment des tubes à hémolyse), dans des cuvettes ou dans des puits de microplaque avec un spectromètre ou un photomètre.
Le milieu réactionnel contient l'échantillon que l'on veut tester, il peut également contenir d'autres additifs usuels dans le processus réactionnel choisi et, le cas échéant, tout autre réactif nécessaire dans ledit processus réactionnel. En variante, tout autre réactif nécessaire peut être amené par un autre embout qui lui est dédié ou incorporé dans ledit système réactif. De façon pratique, la "gâchette", qui déclenche la réaction colorée ou l'émission de photons, sera introduite en dernier dans le milieu réactionnel.
Le dispositif selon l'invention est particulièrement efficace pour la mise en œuvre de dosages colorimétriques ou photométriques. Le cas échéant, il peut être utile pour le stockage puis la fourniture d'une quantité connue d'un réactif de laboratoire différent des réactif de colorimétrie et de photométrie. Toutefois, le domaine où ledit réactif se révèle le plus intéressant est celui desdits dosages colorimétriques et photométriques. Selon le procédé de préparation du dispositif de l'invention, l'élimination du liquide ayant véhiculé le système réactif dans l'intérieur de l'embout de pipette est faite :
- par zéodratation, - par évaporation-concentration (notamment par évaporation centrifuge sous vide), ou
- par lyophilisation.
On préfère ici l'évaporation centrifuge sous vide et la zéodratation plutôt que la lyophilisation. L'évaporation centrifuge sous vide (réalisée à une température inférieure ou égale à 60 0C) donne de bons résultats, est moins onéreuse que la zéodratation et fournit avantageusement des dépôts annulaires sec contenant le réactif à une dose donnée..
Pour favoriser l'adsorption sur une portion de la paroi de l'embout, il est important, selon l'invention, qu'un agent mouillant soit présent dans le système réactif. De façon pratique, ledit agent mouillant sera introduit avec le réactif dans le liquide servant soit de véhicule audit système réactif soit de moyen de gonflement du gel contenant ledit système réactif.
Parmi les agents mouillants qui conviennent, on peut notamment citer les agents tensioactifs anioniques et les tensioactifs non-ioniques. Par exemple en ce qui concerne les anioniques, on peut signaler le dihexyl sodium sulfosuccinate de formule
Figure imgf000009_0001
et ses analogues du type dialkyle, les alkylsulfonates linéaires, les sels d'acide gras avec un métal (sodium, potassium, cobalt), et l'huile de ricin sulfatée ; et en ce qui concerne les non ioniques, on peut signaler les esters de polyglycols, les alcools polyoxyalkylénés, les esters de sorbitan et les esters de sorbitan polyoxyalkylénés. Comme indiqué plus haut, le conditionnement du système réactif au sein d'un gel logé dans une portion de la lumière de l'embout (i. e. dans la cavité interne de l'embout selon une portion de sa hauteur) est amplement suffisant pour la conservation et le transport du dispositif de l'invention. Dans cette circonstance, le réactif contenu dans le gel est par commodité dit «comme étant indirectement lié à la paroi interne de l'embout par l'intermédiaire dudit gel». Il s'agit là d'un langage imagé permettant de distinguer le produit solide déposé sur une portion de la paroi interne de l'embout, du gel en contact avec ladite paroi interne selon un anneau cylindrique ou tronc conique.
Parmi les agents gélifiants, qui conviennent, on peut notamment citer les gommes et résines hydrosolubles ou hydrodispersables (telles que la gomme xanthane), la carboxyméthylcellulose (CMC) et la silice pyrogénée hydrophile ayant à l'état sec une granulométrie submicronique, en particulier les silices hydrophiles commercialisées par la société dite CABOT sous la nomenclature «CAB-O-SIL », telles que «CAB-O- SIL® LM- 150», «CAB-O-SIL® M-5», «CAB-O-SIL® EH-5 », et « CAB-O- SIL® M-7D».
L'agent gélifiant sera utilisé à une concentration de 0,1 à 20 % p/v par rapport au liquide utilisé pour le gonflement. L'agent gélifiant préféré est la gomme xanthane, qui est soluble dans l'eau aux faibles concentrations et qui a des propriétés anti-oxydantes favorisant la conservation du dispositif de l'invention lors du stockage.
Le cas échéant, il est possible d'éliminer le liquide de gonflement du gel contenu dans l'embout, par évaporation-concentration, zéodratation ou lyophilisation, comme indiqué ci-dessus, afin d'obtenir un produit sec, comprenant l'agent gélifiant et le système réactif, et qui est adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout.
Le volume utile V de l'intérieur de l'embout est en général inférieur ou égal à 200 μl, le volume v du véhicule liquide du système réactif sera inférieur ou égal à 0,75 V et avantageusement compris entre 0,01 V et 0,5 V. En pratique on utilisera un volume v compris entre 0,5 μl et 50 μl, et mieux un volume v compris entre 1 μl et 20 μl.
On dispose de plusieurs modes de mise en œuvre du procédé de préparation selon l'invention. Premier mode
Selon un premier mode I de réalisation, (α) on aspire dans l'embout de pipette un volume v de véhicule liquide contenant le système réactif et l'agent mouillant, puis (β) on procède au séchage en éliminant ledit véhicule liquide notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation. Second mode Selon un second mode II de réalisation, on charge dans l'embout un volume v de gel contenant un liquide de gonflement, le système réactif (réactif et agent mouillant). Troisième mode
Selon un troisième mode III de réalisation, on procède au séchage selon l'étape Iβ, du gel chargé obtenu à l'étape II.
De façon pratique, le véhicule liquides étapes Ia et Iβ, d'une part, et le liquide de gonflement du gel de l'étape Et, d'autre part, sont avantageusement des liquides aqueux (principalement de l'eau ou de l'eau pourvue d'un tampon). II est important que le dispositif de l'invention soit hermétiquement fermé. Après le chargement du volume v selon Ia ou II, on obture l'orifice Oi, par exemple au moyen d'un capuchon devant être enlevé au moment de l'emploi. L'obturation peut, le cas échéant être réalisée au moyen d'une gomme ou résine, par exemple du vernis à ongle ou mieux une gomme ou résine hydrosoluble ou hydrodispersable comme la gomme xanthane. En outre, après les étapes Iβ, II ou III, on obture l'orifice Os au moyen d'une pellicule (notamment en aluminium éventuellement adhésivé) pouvant être frangible ou qui peut être pelée au moment de l'emploi. La fermeture hermétique est requise pour éviter toute pollution, contamination, oxydation ou humidification du système réactif.
En pratique, à l'issue du chargement du volume v de liquide ou de gel, on aspire un (faible) volume de gaz inerte. Cette opération fait monter le volume v dans l'embout le long de l'axe dudit embout.
Pour que le produit desséché adhère efficacement à la paroi interne de l'embout, il convient que l'opération d'évaporation soit avantageusement réalisée sous vide et sous agitation rotative. L'agitation rotative est en général produite pendant l'évaporation par un dispositif à pale logé dans les circuits de vide soit dans la pipette soit à l'extérieur de celle-ci et qui produit un tourbillon entraînant la rotation du volume v autour de l'axe de l'embout. Le meilleur mode d'évaporation, qui convient à cet effet, est l'évaporation centrifuge sous vide mentionnée plus haut. Celle-ci assure en coopération avec l'agent mouillant une liaison à la paroi interne de l'embout telle qu'elle soit capable de résister au transport et surtout aux chocs sans que le produit solide déposé sur ladite paroi tombe par gravité sur l'obturation de l'orifice Oi.
Le meilleur mode de mise en œuvre pour préparer le dispositif de l'invention, que l'on recommande ici, est un procédé qui comprend successivement :
(i) l'aspiration d'un volume v de liquide ou de gel, contenant ledit système réactif, dans l'embout à partir d'un réservoir contenant ledit liquide ou ledit gel, (ii) la sortie dudit embout dudit réservoir,
(iii) l'aspiration d'un volume v' (avantageusement inférieur ou égal à v, et de préférence compris entre 0,lv et 0,5v), pour faire monter le volume v d'une certaine hauteur le long de l'axe de l'embout,
(iv) l'obturation de l'orifice inférieur de l'embout ainsi obtenu à l'issue de l'étape (iii), et
(v) l'aspiration sous vide et sous agitation rotative (de préférence une évaporation centrifuge sous vide) pour obtenir le dépôt sur une portion de la paroi interne de l'embout, à l'état sec et en forme d'anneau du système réactif provenant dudit liquide de volume v, ou le cas échéant, l'aspiration sous vide et sous agitation rotative (de préférence une évaporation centrifuge sous vide) pour obtenir le dépôt sur une portion de la paroi interne de l'embout, à l'état sec et en forme d'anneau du produit contenant le système réactif provenant dudit gel de volume v.
Dans chaque cas de l'étape (v), le dépôt en forme d'anneau est situé à une certaine hauteur au-dessus de l'orifice inférieur Oi de l'embout. Cette hauteur correspond approximativement au niveau atteint par le volume v à l'issue de l'étape (iii).
Quand on souhaite un dispositif contenant plusieurs réactifs que l'on ne peut pas mélanger avant réaction, il est possible de reproduire plusieurs fois les séquences (i)-(iv) pour l'obtention des gels, et les séquences (i)-(v) pour l'obtention des dépôts de produits solides à des niveaux différents sur la paroi interne de l'embout. Dans une telle circonstance, chaque nouveau dépôt est disposé de façon décalée en dessous du dépôt qui précède. Quand on utilise le dispositif de l'invention pour réaliser principalement des dosages colorimétriques ou photométriques, il y a remise en solution ou suspension du système réactif (S) par aspiration du volume souhaité (par exemple, 100 μl ou mieux 200 μl, quand V = 220 μl) d'échantillon (E) à tester [ce volume ne variera plus pendant toute la durée de l'analyse]. De façon avantageuse, l'échantillon (E) à tester constituera le milieu réactionnel.
La réaction se déclenche immédiatement eu égard à une plus grande et meilleure surface d'échange système réactif/échantillon (SfE). Dans ce cas la lecture s'effectue : - en ce qui concerne les réactions de luminescence [bioluminescence (BL), çhimiluminescence (CL) bioçhimiluminescence (BCL) et fluorescence (Fl)], on lit, la surface d'échange (S/E) étant maximale, la quantité de photons diffusants à l'issue de la réaction ; - en ce qui concerne les réactions développant une couleur ou produisant un changement de couleur, on apprécie au moyen d'un spectrotomètre la variation de densité optique, notamment par transmission ou diffraction (par exemple selon un angle de π/2).
L'embout du dispositif de l'invention, qui est non hydrophobe, peut également servir de support pour diverses matières [des anticorps, des sondes nucléiques et d'autres substances telles que les alcaloïdes, leurs métabolites et les protéines, notamment l'apolipoprotéine H (ApoH)], pouvant être liées à des billes magnétiques. Par exemple, de tels anticorps permettent de piéger (capturer) spécifiquement les cibles (moléculaires et/ou cellulaires) ou le produit spécifique (P) susceptible d'être contenu dans l'échantillon (E) et, par décantation ou séparation magnétique, ils permettent la concentration et la purification des cibles recherchées dans un milieu hétérogène.
Les dispositifs de l'invention peuvent être conditionnés au format microplaque (pour microtitration). Cela permet de faire des analyses de façon unitaire que de façon automatique (avec un robot ou un automate). Si deux ou trois réactifs différents sont nécessaires à une réaction dans le même temps, ils peuvent également être déposés et séchés comme indiqué plus haut sur des plages différentes de la paroi interne de l'embout ; ensuite au moment de l'aspiration de l'échantillon (E)5 ils seront dissous en mélange dans le milieu réactionnel et, par suite, seront fonctionnels en même temps. Par chance plusieurs réactifs peuvent être déposés sur la même plage ; tel est le cas du mélange luciférine/luciférase utile dans les dosages par ATPmétrie.
La déshydratation permet une meilleure conservation des réactifs même à température ambiante et également une augmentation de la sensibilité d'un facteur 10 à 100 du fait de la non dilution de l'échantillon
(E) par du réactif en solution. Aussi les produits solides obtenus à l'étape
(v) ci-dessus sont en général préférés aux gels obtenus à l'étape (iv).
Pour l'utilisateur, les manipulations ne nécessitent pas d'équipement particulier puisque les embouts de pipette conformes à l'invention s'adaptent à n'importe quel dispositif de pipetage.
L'échantillon (E) peut provenir d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [notamment par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un liquide aqueux ou organique, ledit prélèvement pouvant contenir le produit
(P) à tester.
Le produit (P) à tester peut être une substance chimique, biologique ou microbiologique. En particulier, il peut être un matériau cellulaire, tel qu'un tissu, des bactéries, des moisissures, des algues ou des virus, en bref un ensemble de cellules, de microorganismes ou d'organismes unicellulaires.
Le produit (P) peut également être une famille de produits ayant une fonction spécifique, par exemple une fonction ester, une fonction alcool, une fonction enzymatique, une fonction antiradicalaire, etc.
Enfin, le produit (P) à tester peut se présenter sous la forme d'un produit de dégradation, d'un dérivé caractéristique de la substance à évaluer, voire encore d'un métabolite d'une substance biologique ou microbiologique.
La figure 12 illustre schématiquement un dispositif selon l'invention qui comprend un embout 1 de pipette, pourvu d'un orifice inférieur 2 (Oi) et d'un orifice supérieur 3 (Os), un produit solide 4, qui contient le système réactif constitué par le réactif et l'agent mouillant, étant lié sous la forme d'un anneau à la paroi interne de l'embout.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces éléments ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration. Exemple 1
ATP-métrie
Dosage des nucléotides adényliques (AN) par bioluminescence Dans un tube rhésus on déshydrate les enzymes nécessaires à la transformation de l'AMP et de L' ADP en ATP (myokinase, PEP, pyruvate kinase, sel tampon). Ce même tube servira au dosage final.
Au moment de l'utilisation, on ajoute dans le tube rhésus 200 μl d'échantillon à tester, qui sert de milieu réactionnel. On laisse incuber 15 minutes pour que la transformation de l'AMP et de l'ADP en ATP soit complète.
Avec une pipette (Eppendorf, Gelman, Biohit, ou autre) on charge dans un embout (ayant un volume utile de 200 μl), une solution aqueuse de luciférine luciférase (mélange extrait de luciole) en présence d'un agent mouillant, puis élimine l'eau par évaporation centrifuge sous vide à 55 0C. On aspire et refoule une dizaine de fois l'échantillon dans le tube rhésus.
On place le tube rhésus dans la chambre d'un luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes par exemple ; on obtient une valeur X exprimée en unités de lumière relative (RLU) On reprend le tube rhésus, éjecte l'embout de pipette et prend un autre embout dans lequel on a au préalable chargé et déshydraté 100 picomoles d'ATP. On aspire et refoule une dizaine de fois l'échantillon dans le tube rhésus.
On introduit, de nouveau le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes ; on obtient une valeur Y exprimée en RLU.
La différence Y-X donne le nombre de RLU pour 100 picomoles d'ATP dans cet échantillon et par une règle de trois, le nombre de AN dans le tube. Exemples 2 à 11
Essais colorimétriques
Les courbes d'étalonnage relatives à la mesure des produits suivants : ammonium, réserve alcaline (test vétérinaire de référence), calcium, chlorure, fer, magnésium, phosphate, phosphatase alcaline, albumine et cholestérol, ont été réalisées selon les méthodes usuelles requises en faisant appel à un milieu réactionnel de 200 μl et des embouts de pipette contenant le système réactif déshydraté.
Les résultats obtenus sont consignés dans les figures 1-10 ci-après, dans lesquelles la longueur d'onde ou la plage des d'ondes utilisées ont été précisées. Exemple 12
ΛTPmétrie
La courbe d'étalonnage relative à l'ATP a été réalisée selon le protocole opératoire donné à l'exemple 1. Les résultats qui ont été obtenus sont consignés dans la figure 11. La figure l ia donne la courbe d'étalonnage pour des teneurs faibles en ATP (de 0 à 1,5 ng/tube). Exemple 13
Contrôle de surface par ATPmétrie (1) On passe un écouvillon sur une surface à tester, ledit écouvillon étant A- soit humecté d'une solution de lyse et agité dans un tube rhésus contenant une solution tampon (200μl) constituant le milieu réactionnel, afin de remettre en suspension les AN libérés par les cellules lysées ; le tube est le même tout au long de l'analyse, jusqu'à l'obtention du résultat final ; B- soit humidifié pour récolter la biomasse sur la surface et agité dans le tube rhésus contenant une solution d'eau pure (200 μl) constituant le milieu réactionnel afin de remettre en suspension les cellules ; ce tube est le même tout au long de l'analyse, jusqu'à l'obtention du résultat final.
• Dans le cas B, les étapes qui suivent sont les mêmes que pour un milieu liquide (contrôle d'une eau de rinçage, contrôle de la qualité microbiologique d'un liquide biologique, suivi d'une fermentation.).
• On prend l'embout de pipette contenant le réactif solidifié correspondant à la solution de lyse. Cette dernière peut-être du DMSO, du peroxyde d'hydrogène activée par CH3COOH, ou de l'EDTA TRIS. • On aspire et refoule 5 fois les 200 μl d'échantillon pour bien homogénéiser et permettre une Iy se maximale des cellules.
(2) A partir de cette étape quelque soit l'origine du prélèvement : surface, liquide, air [dans le cas de l'atmosphère, nous aurions fait au préalable barboter, un volume précis, par aspiration de l'atmosphère à tester dans un volume d'eau pure (200 μl par exemple) pour retenir les particules et en particulier les microorganismes ; puis procéder à la lyse des cellules comme précédemment]
(3) On prend l'embout de pipette contenant le système réactif déshydraté contenant les enzymes nécessaires à la transformation de l'AMP et de
L'ADP en ATP (myokinase, PEP, pyruvate kinase, sel tampon). On aspire et refoule 5 fois les 200 μl d'échantillon du tube rhésus de l'étape précédente pour bien homogénéiser et recueillir lesdits enzymes.
• On laisse incuber 15 minutes pour que la transformation de l'AMP et de l' ADP en ATP soit complète
(4) On prend l'embout de pipette contenant avec le système réactif solidifié luciférine-luciférase (de luciole) obtenu comme indiqué à l'exemple 1.
• On aspire et refoule 5 fois l'échantillon dans le tube rhésus. On introduit le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes par exemple ; on obtient un valeur X (en RLU).
On reprend le tube, éjecte l'embout de pipette et prend un autre embout contenant le réactif solidifié standard, 100 picomoles d'ATP. " On aspire et refoule 5 fois l'échantillon dans le tube rhésus .
• On introduit, de nouveau le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction (RLU) pendant 10 secondes. On obtient une valeur Y (en RLU).
• Y-X nous donne le nombre de RLU pour 100 picomoles d'ATP dans cet échantillon et par une règle de trois, le nombre de NA dans le tube. On détermine ainsi avec précisions la biomasse, exprimée sous forme de concentration en AN, qui présente dans le milieu issu de la surface à tester. Le dispositif de l'invention est particulièrement utile pour apprécier, par colorimétrie ou mieux par photométrie, la qualité microbiologique d'une surface, d'un échantillon d'air ou d'un liquide.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif pour réaction de laboratoire et surtout pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et
(b) un système réactif comprenant un agent mouillant et au moins un réactif à une dose connue intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par :
(1) une forme pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et
(2) une forme gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un gel logé au contact de la paroi interne dans une portion de la lumière de l'embout.
2. Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est l'échantillon liquide à tester, ledit échantillon étant une composition aqueuse et provenant d'un prélèvement gazeux, solide ou liquide.
3. Dispositif suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est destiné à la détermination d'un produit à tester qui est une substance chimique, biologique ou microbiologique.
4. Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ladite forme gélifiée est desséchée pour donner une poudre adsorbée sur une portion de la paroi interne de l'embout.
5. Procédé pour la préparation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on aspire un volume v de liquide ou de gel contenant un système réactif comprenant un agent mouillant et au moins un réactif à une dose donnée intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, le volume v étant inférieur au volume utile V de l'embout, et l'on élimine ensuite par séchage le liquide contenant ledit système réactif en suspension ou en dispersion, le gel pouvant être conservé en l'état ou soumis au séchage pour donner une poudre adsorbée sur une portion de la paroi interne de l'embout.
6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que (i) on aspire dans l'embout de pipette un volume v de véhicule liquide contenant le système réactif comprenant ledit réactif et ledit agent mouillant, puis (ii) procède au séchage en éliminant ledit véhicule liquide notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation, l'évaporation centrifuge sous vide étant le moyen de séchage préféré.
7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'on charge dans l'embout un volume v de gel contenant un liquide de gonflement et le système réactif constitué par ledit réactif et ledit agent mouillant.
8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en outre par le fait que l'on procède au séchage du gel, notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation, l'évaporation centrifuge sous vide étant le moyen de séchage préféré.
9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce qu'il comprend successivement :
(i) l'aspiration d'un volume v de liquide ou de gel, contenant ledit système réactif, dans l'embout à partir d'un réservoir contenant ledit liquide ou ledit gel, (ii) la sortie dudit embout dudit réservoir,
(iii) l'aspiration d'un volume v' (avantageusement inférieur ou égal à v, et de préférence compris entre 0,2v et 0,8v), pour faire monter le volume v d'une certaine hauteur le long de Taxe de l'embout, (iv) l'obturation de l'orifice inférieur de l'embout ainsi obtenu à l'issue de l'étape (iii), et
(v) l'aspiration sous vide et sous agitation rotative (de préférence une évaporation centrifuge sous vide) pour obtenir le dépôt sur une portion de la paroi interne de l'embout, à l'état sec et en forme d'anneau du système réactif provenant dudit liquide de volume v, ou le cas échéant, l'aspiration sous vide et sous agitation rotative (de préférence une évaporation centrifuge sous vide) pour obtenir le dépôt sur une portion de la paroi interne de l'embout, à l'état sec et en forme d'anneau du produit contenant le système réactif provenant dudit gel de volume v.
10. Utilisation, caractérisée en ce que l'on fait appel à un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la mise en œuvre de dosages colorimétriques ou photométriques.
11. Utilisation suivant la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend l'appréciation, par colorimétrie ou mieux par photométrie, de la qualité microbiologique d'une surface, d'un échantillon d'air ou d'un liquide.
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