FR2895921A1 - Embout de pipette contenant un systeme reactif, procede de preparation et utilisation notamment dans le domaine des dosages unitaires par colorimetrie ou photometrie - Google Patents

Abstract

La présente invention a trait à un dispositif pour réaction de laboratoire et surtout pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend :(a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et(b) un système réactif comprenant au moins un réactif intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par :(1) pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et(2) gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un gel logé dans une portion de la lumière de l'embout.Elle concerne également le procédé de préparation de ce dispositif et son utilisation dans le domaine des dosages colorimétriques ou photométriques.

Description

Embout de pipette contenant un système réactif, procédé de préparation et

utilisation notamment dans le domaine des dosages unitaires par colorimétrie ou photométrie Domaine de l'invention La présente invention a trait, en tant que produit industriel nouveau, à un embout de pipette contenant un système réactif solide ou gélifié. Elle concerne également le procédé de préparation d'un tel embout et son utilisation notamment dans le domaine des dosages colorimétriques ou photométriques, le cas échéant unitaires. Art antérieur Jusqu'à présent on n'a pas encore utilisé à l'échelle industrielle des embouts de pipette prêts à l'emploi contenant dans leur intérieur un système réactif comprenant un ou plusieurs réactifs intervenant dans une réaction permettant de caractériser, déterminer ou faire réagir une substance donnée. En effet, un embout de pipette est un corps creux pourvu de deux orifices et dont le diamètre est croissant de l'extrémité inférieure vers l'extrémité supérieure sur au moins une portion de sa partie inférieure, l'orifice (Oi), disposé à l'extrémité inférieure et qui a un diamètre inférieur à celui de l'orifice (Os) disposé à l'extrémité supérieure, servant à l'aspiration et au refoulement d'un liquide, l'orifice (Os) relié à une pompe à vide servant à remplir l'embout par ledit liquide lors de la phase d'aspiration et à le vider lors de la phase de refoulement. Une poudre ayant été chargée dans le corps intérieur de l'embout et Oi ayant été obturé avec un capuchon, il est clair que, lorsque l'on enlève le capuchon, on a un risque sérieux de perdre une portion indéterminée de la poudre (notamment par gravité et éclaboussures) avant de pouvoir dissoudre ce qui reste de la poudre dans le corps de l'embout. On est par suite contraint (i) de laisser tomber le capuchon dans le milieu réactionnel contenu dans la cuvette de réaction (ii) d'aspirer une portion du milieu réactionnel dans l'embout afin de dissoudre ou disperser le reste de la poudre, (iii) de faire couler le milieu réactionnel résultant, ainsi obtenu, dans la cuvette et (iv) espérer que le capuchon va pouvoir être efficacement rincé par le milieu réactionnel afin que l'on soit en mesure de recueillir la totalité de la poudre provenant de l'embout.

Une telle technique n'est pas commode. Elle n'est pas adaptée aux dispositifs modernes de pipetage qui comprennent plusieurs rangées d'embouts. De plus, si l'on doit faire couler successivement plusieurs réactifs, il est manifeste que la multiplication des capuchons dans la cuvette de réaction va perturber ou empêcher l'agitation du milieu réactionnel qu'elle contient. Par ailleurs, on sait qu'il existe déjà un grand nombre de méthodes analytiques par dosages unitaires, notamment chimiques ou biologiques (analyse de l'eau, analyse biologique médicale, etc.). Ces méthodes impliquent le mélange ou l'ajout de plusieurs substances réactives, le cas échéant à des instants différents. Quand il s'agit de substances biologiques réputées particulièrement fragiles car dégradables ou inactivables, notamment par élévation de température, on a souvent recours à une lyophilisation pour un conditionnement en multidoses ou quelquefois en monodoses, mais dans ce dernier cas il y a des difficultés de reproductibilité, en particulier par perte de réactif par volatilisation.

Or la lyophilisation seule ne convient pas. Si on lyophilise un système réactif à l'intérieur d'un embout de pipette, on obtiendra une poudre revêtant une portion de la paroi intérieure de l'embout ; mais sous l'action d'un choc pendant le stockage ou le transport la poudre va se décoller de la paroi, et on se trouve confronté au problème visé ci-dessus.

De la demande publiée FR 2694809 A on connaît un dispositif destinée à déterminer qualitativement ou quantitativement dans un échantillon liquide à tester, par au moins une réaction d'identification, la produit recherché. Ce dispositif comprend un support et au moins un réactif participant à la réaction détermination, ledit réactif étant déposé sous forme de couche sèche sur ledit support, destiné à être mis au contact d'un milieu liquide, et n'étant pas lié audit support, ledit support consistant en un contenant unitaire réactionnel, agencé pour recevoir directement la totalité de l'échantillon à tester et pour servir d'enceinte réactionnelle. Il est possible de prévoir qu'une dite couche comprenne plusieurs réactifs de détermination. Or il se trouve qu'un tel dispositif ne convient pas, d'une part, quand plusieurs réactions sont nécessaires pour caractériser un produit (P) donné, et d'autre part, quand on veut réaliser plusieurs mesures successives. En effet dans le cadre de plusieurs réactions de caractérisation ou de plusieurs mesures on doit entreprendre des dilutions. En particulier la personne du métier est conduite avec le dispositif de FR 2694809A à procéder à des opérations de rinçage qui entraînent des dilutions diminuant la sensibilité des analyses, dès que l'on veut réaliser des mesures supplémentaires. On connaît par ailleurs de EP 0320842 A, de WO 90/01167 A et de US 2004/006241 A des supports poreux rigides, notamment en plastique, verre ou céramique, contenant des matières actives biologiques incorporées par imprégnation puis évaporation du solvant. Or il se trouve que la technique d'imprégnation n'est pas transposable pour garnir l'intérieur d'un embout de pipette car elle fournit des produits desséchés répartis dans les pores et les surfaces extérieures. But de l'invention Il serait souhaitable de disposer d'embouts de pipette contenant des quantités minimes connues d'un ou plusieurs réactifs concentrés, liés à la paroi intérieure de façon temporaire jusqu'à ce que ledit ou lesdits réactifs soient déplacés par le milieu réactionnel, par aspiration et refoulement, dans la cuvette réactionnelle, afin de mettre en oeuvre (i) des réactions de laboratoire et/ou des dosages colorimétriques ou photométriques.

L'objectif est de pouvoir loger au moins un réactif à l'intérieur d'un embout de façon que ce réactif soit concentré notamment par séchage, soit lié à la paroi intérieure de l'embout pendant le stockage, le transport et les manipulations requises avant son emploi, puis soit soluble ou dispersable en totalité dans le milieu réactionnel qui est pompé puis expulsé vers la cuvette réactionnelle. Selon l'invention, on se propose de fournir une nouvelle solution technique pour résoudre l'ensemble des problèmes précités, notamment sans perte de sensibilité en ce qui concerne les dosages colorimétriques ou photométriques.

On se propose donc, selon un premier aspect de l'invention, de fournir des embouts de pipette, et avantageusement des embouts de dispositifs de pipetage pour microdosages colorimétriques ou photométriques, qui contiennent chacun un système réactif lié à la paroi interne desdits embouts et intervenant dans un processus réactionnel connu.

Selon un autre aspect, on se propose de fournir un procédé pour déposer et lier temporairement jusqu'au moment de l'emploi (i. e. le remplissage des embouts par le milieu réactionnel liquide de solubilisation ou de dispersion) ledit système réactif à l'intérieur desdits embouts.

Enfin selon encore un autre aspect de l'invention, on se propose de fournir aux utilisateurs des trousses, kits ou nécessaires de dosage contenant ou plusieurs desdits embouts prêts à l'emploi et destinés à la réalisation de microdosages spécifiques, notamment tels que détermination des chlorures, des phosphates, des impuretés ou des polluants.

Objet de l'invention Selon l'invention, on met à disposition, en tant que produit industriel nouveau, un dispositif pour réaction de laboratoire et surtout pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend : (a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et (b) un système réactif comprenant au moins un réactif intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par : (1) pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et (2) gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un gel logé dans une portion de la lumière de l'embout. Avec un tel dispositif, il suffit d'au moins une séquence d'aspiration-refoulement, et de préférence d'au moins trois séquences d'aspiration- refoulement, pour recueillir la totalité dudit système réactif présent dans l'embout. Selon l'invention on préconise un procédé pour la préparation de ce dispositif, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on aspire un volume v de liquide ou de gel contenant une quantité donnée de système réactif, v étant inférieur au volume utile V de l'embout, on élimine ensuite par séchage le liquide contenant ledit système réactif en suspension ou en dispersion, le gel pouvant être conservé en l'état ou soumis au séchage pour donner une poudre adsorbée sur une portion de la paroi interne de l'embout.

Selon l'invention, l'on préconise également l'utilisation de ces embouts contenant un système réactif pour la mise en oeuvre de dosages colorimétriques (par mesure d'une variation d'absorbance) ou photométriques (par multiplication et comptage des photons émis).

Brève description des dessins

Dans les dessins annexés, - les figures 1-10 concernent la courbe d'étalonnage par colorimétrie selon l'invention de divers systèmes réactifs, dans système variation d'absorbance (DO), en ordonnées en fonction de la concentration du système réactif concerné (en mg/litre, mmole/litre ou g/litre; en abscisses, il s'agit dans chaque cas d'une droite dont l'équation est donnée (sous la forme usuelle y = ax + b) avec le coefficient de corrélation (R2) ;

- la figure 11 concerne la courbe d'étalonnage par photométrie selon l'invention (ATPmétrie) au moyen d'une gamme d'ATP, dans le système unité de lumière relative [en abrégé RLU (ou ULR)], en ordonnées, en fonction de la teneur en ATP par tube de mesure (ng/t), en abscisses ; il s'agit encore ici d'une droite dont l'équation est donnée (sous la forme y = ax + b) avec le coefficient de corrélation (R2) ;

- la figure 11 a montre la courbe d'étalonnage de la figure 11 pour les faibles teneurs en ATP (de 0 à 1,5 ng/t).

Description détaillée de l'invention Par système réactif on entant ici un réactif ou plusieurs réactifs intervenant soit dans une réaction de laboratoire donnée, qui met en oeuvre de faibles quantités pondérales de réactif(s), soit dans une réaction de caractérisation d'une substance donnée selon un dosage colorimétrique (on mesure une variation d'absorbance) ou selon un dosage photométrique (on mesure la lumière émise, voire le cas échéant une variation de la lumière émise).

Le liquide du milieu réactionnel, le liquide utilisé pour solubiliser ou disperser le système réactif lors de son incorporation dans l'intérieur de l'embout de pipette, et le liquide utilisé pour réaliser le gel contenant le système réactif devant être aspiré dans une portion de la lumière de 6 2895921 l'embout, peuvent être (i) de l'eau ou une solution aqueuse, ou (ii) un solvant organique compatible avec le processus réactionnel qui va être suivi. Bien entendu, le liquide préféré est l'eau éventuellement tamponnée. Après refoulement du milieu réactionnel contenant le système réactif 5 initialement immobilisé dans l'embout de pipette, les mesures sont effectuées sur ledit milieu réactionnel versé dans des tubes (notamment des tubes à hémolyse), dans des cuvettes ou dans des puits de microplaque avec un spectromètre ou un photomètre. Le milieu réactionnel contient l'échantillon que l'on veut tester, il peut 10 également contenir d'autres additifs usuels dans le processus réactionnel choisi et, le cas échéant, tout autre réactif nécessaire dans ledit processus réactionnel. En variante, tout autre réactif nécessaire peut être amené par un autre embout qui lui est dédié ou incorporé dans ledit système réactif. De façon pratique, la "gâchette", qui déclenche la réaction colorée ou 15 l'émission de photons, sera introduite en dernier dans le milieu réactionnel. Selon le procédé de préparation du dispositif de l'invention, l'élimination du liquide ayant véhiculé le système réactif dans l'intérieur de l'embout de pipette est faite : par zéodratation, 20 - par évaporation-concentration (notamment par évaporation centrifuge sous vide), ou - par lyophilisation. On préfère ici l'évaporation centrifuge sous vide et la zéodratation plutôt que la lyophilisation. L'évaporation centrifuge sous vide (réalisée à 25 une température inférieure ou égale à 60 C) donne de bons résultats et est moins onéreuse (à l'heure actuelle) que la zéodratation. Pour favoriser l'adsorption du système réactif sur une portion de la paroi de l'embout, il est recommandé (surtout dans le cas de la lyophilisation) d'incorporer un agent mouillant dans le liquide servant de 30 véhicule au système réactif. Parmi les agents mouillants qui conviennent, on peut notamment citer les agents tensioactifs anioniques et les tensioactifs non-ioniques. Par exemple en ce qui concerne les anioniques, on peut signaler le dihexyl sodium sulfosuccinate de formule CH3 0 S03 Na H 3 C O 0 CH 0 CH3 et ses analogues du type dialkyle, les alkylsulfonates linéaires, les sels d'acide gras avec un métal (sodium, potassium, cobalt), et l'huile de ricin sulfatée ; et en ce qui concerne les non iononiques, on peut signaler les esters de polyglycols, les alcools polyoxyalkylénés, les esters de sorbitan et les esters de sorbitan polyoxyalkylénés.

Comme indiqué plus haut, le conditionnement du système réactif au sein d'un gel logé dans une portion de la lumière de l'embout est amplement suffisant pour la conservation et le transport du dispositif de l'invention. Parmi les agents gélifiants, qui conviennent, on peut notamment citer la gomme xanthane, de la gomme xanthane, la carboxymethylcellulose (CMC) et la silice pyrogénée hydrophile ayant à l'état sec une granulométrie submicronique, en particulier les silices hydrophiles commercialisées par la société dite CABOT sous la nomenclature CAB-OSIL , telles que CAB-O-SIL LM-150 , CAB-O-SIL M-5 , CABO-SIL EH-5 , et CAB-O-SIL M-7D .

L'agent gélifiant sera utilisé à une concentration de 0,1 à 20 % p/v par rapport au liquide utilisé pour le gonflement. L'agent gélifiant préféré est la gomme xanthane, qui est soluble dans l'eau aux faibles concentrations et qui a des propriétés anti-oxydantes favorisant la conservation du dispositif de l'invention.

Le cas échéant, il est possible de sécher le gel par évaporation-concentration, zéodratation ou lyophilisation, comme indiqué ci-dessus, pour l'élimination du liquide de gonflement, afin d'obtenir un produit sec, comprenant l'agent gélifiant et le système réactif, qui est adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout.

Le volume utile V de l'intérieur de l'embout est en général inférieur ou égal à 200 l, le volume v du véhicule liquide du système réactif sera inférieur ou égal à 0,75 V et avantageusement compris entre 0,01 V et 0,5 V. En pratique on utilisera un volume v compris entre 0,5 l et 50 l, et mieux un volume v compris entre 1 l et 20 l. 3 On dispose plusieurs modes de mise en oeuvre du procédé de préparation selon l'invention. (1 ) Selon un premier mode, (i) on aspire dans l'embout de pipette un volume v de véhicule liquide contenant le système réactif et, avanta- geusement, un agent mouillant, puis (ii) procède au séchage en éliminant ledit véhicule liquide notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation. (2 ) Selon un second mode de réalisation, on charge dans l'embout un volume v de gel contenant un liquide de gonflement, le système réactif et 10 avantageusement un agent mouillant. (3 ) Selon un troisième mode de réalisation, on procède au séchage, selon (1 )(ii) du gel chargé en (2 ). Il est important que le dispositif de l'invention soit hermétiquement fermé. Après le chargement du volume v selon (1 )(i) ou (2 ), on obture 15 l'orifice Oi, par exemple au moyen d'un capuchon devant être enlevé au moment de l'emploi. En outre, après (1 )(ii), (2 ) ou (3 ), on obture l'orifice Os (par exemple au moyen d'une pellicule notamment en aluminium éventuellement adhésivé) pouvant être frangible ou qui peut être pelée au moment de l'emploi. La fermeture hermétique est requise pour éviter toute 20 oxydation ou humidification du système réactif. Quand on utilise le dispositif de l'invention pour réaliser principalement des dosages colorimétriques ou photométriques, il y a remise en solution ou suspension du système réactif (S) par aspiration du volume souhaité (par exemple 100 l ou mieux 200 l, quand V = 200 l) 25 d'échantillon (E) à tester [ce volume ne variera plus pendant toute la durée de l'analyse]. De façon avantageuse, l'échantillon (E) à tester constitue le milieu réactionnel. La réaction se déclenche immédiatement eu égard à une plus grande et meilleure surface d'échange système réactif/échantillon (S/E). Dans ce cas 30 la lecture s'effectue : - en ce qui concerne les réactions de luminescence [bioluminescence (BL), chimiluminescence (CL) biochimiluminescence (BCL) et fluorescence (Fl)], on lit la quantité de photons diffusants à l'issue de la réaction, la surface d'échange S/E étant maximale ; - en ce qui concerne les réactions développant une couleur ou produisant un changement de couleur, on apprécie au moyen d'un spectrotomètre la variation de densité optique, notamment par transmission ou réflexion. Le dispositif de l'invention, qui est non hydrophobe peut également servir de support d'anticorps, de sondes nucléiques et d'autres substances telles que l'apolipoprotéine H (ApoH), liés à des billes magnétiques. Par exemple, de tels anticorps permettent de piéger (capturer) spécifiquement les cibles (moléculaires et/ou cellulaires) ou le produit spécifique (P) susceptible d'être contenu dans l'échantillon (E) et, par décantation ou séparation magnétique, permettent la concentration et la purification des cibles recherchées dans un milieu hétérogène. Les dispositifs de l'invention peuvent être conditionnés au format microplaque (pour microtitration) permet de faire de l'analyse aussi bien unitairement que de manière robotisée.

Si trois réactifs différents sont nécessaires à une réaction dans le même temps, ils peuvent également être déposés sur des plages différentes de la paroi interne de l'embout, puis séchés ; ensuite au moment de l'aspiration de l'échantillon (E), ils seront dissous et mélangés et par suite donc fonctionnels au même instant.

La déshydratation permet une meilleure conservation des réactifs même à température ambiante et également une augmentation de la sensibilité d'un facteur 10 à 100 du fait de la non dilution de l'échantillon (E) par du réactif en solution. Pour l'utilisateur, les manipulations ne nécessitent pas d'équipement 25 particulier puisque les embouts de pipette conformes à l'invention s'adaptent à n'importe quel dispositif de pipetage. L'échantillon (E) peut provenir d'un prélèvement gazeux [notamment par barbotage], solide [notamment par contact, dissolution ou dispersion] ou liquide [notamment par extraction, dissolution ou émulsion] au moyen d'un 30 liquide aqueux ou organique, ledit prélèvement pouvant contenir le produit (P) à tester. Le produit (P) à tester peut être une substance chimique, biologique ou microbiologique. En particulier, il peut être un matériau cellulaire, tel qu'un tissu, des bactéries, des moisissures, des algues ou des virus, en bref un 35 ensemble de cellules, de microorganismes ou d'organismes unicellulaires.

Le produit (P) peut également être une famille de produits ayant une fonction spécifique, par exemple une fonction ester, une fonction alcool, une fonction enzymatique, une fonction antiradicalaire, etc. Enfin, le produit (P) à tester peut se présenter sous la forme d'un produit de dégradation, d'un dérivé caractéristique de la substance à évaluer, voire encore d'un métabolite d'une substance biologique ou microbiologique. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation. Bien entendu, ces éléments ne sont pas limitatifs, mais sont fournis à titre d'illustration. Exemple 1 A TP-m étrie Dosage des nucléotides adényliques (AN) par bioluminescence Dans un tube rhésus on déshydrate les enzymes nécessaires à la 15 transformation de l'AMP et de L'ADP en ATP (myokinase, PEP, pyruvate kinase, sel tampon). Ce même tube servira au dosage final. Au moment de l'utilisation, on ajoute dans le tube rhésus 200 l d'échantillon à tester, qui sert de milieu réactionnel. On laisse incuber 15 minutes pour que la transformation de l'AMP et de l'ADP en ATP soit 20 complète. Avec une pipette (Eppendorf, Gelman, Biohit, ou autre) on charge dans un embout (ayant un volume utile de 200 l), une solution aqueuse de luciférine luciférase (mélange extrait de luciole) en présence d'un agent mouillant, puis élimine l'eau par évaporation centrifuge sous vide à 55 C. 25 On aspire et refoule une dizaine de fois l'échantillon dans le tube rhésus. On place le tube rhésus dans la chambre d'un luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes par exemple ; on obtient une valeur X exprimée en unités de lumière relative (RLU) 30 On reprend le tube rhésus, éjecte l'embout de pipette et prend un autre embout dans lequel on a au préalable chargé et déshydraté 100 picomoles d'ATP. On aspire et refoule une dizaine de fois l'échantillon dans le tube rhésus.

On introduit, de nouveau le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes ; on obtient une valeur Y exprimée en RLU. La différence Y-X donne le nombre de RLU pour 100 picomoles 5 d'ATP dans cet échantillon et par une règle de trois, le nombre de AN dans le tube. Exemples 2 à 11 Essais colorimétriques Les courbes d'étalonnage relatives à la mesure des produits suivants : 10 ammonium, réserve alcaline (test vétérinaire de référence), calcium, chlorure, fer, magnésium, phosphate, phosphatase alcaline, albumine et cholestérol, ont été réalisées selon les méthodes usuelles requises en faisant appel à un milieu réactionnel de 200 gl et des embouts de pipette contenant le système réactif déshydraté. 15 Les résultats obtenus sont consignés dans les figures 1-10 ci-après, dans lesquelles la longueur d'onde ou la plage des d'onde utilisées ont été précisées. Exemple 12 ATPmétrie 20 La courbe d'étalonnage relative à l'ATP a été réalisée selon le protocole opératoire donné à l'exemple 1. Les résultats qui ont été obtenus sont consignés dans la figure 11. La figure lla donne la courbe d'étalonnage pour des teneurs faibles en ATP (de 0 à 1,5 ng/tube. Exemple 13 25 Contrôle de surface par ATPmétrie (1) On passe un écouvillon sur une surface à tester, ledit écouvillon étant A- soit humecté d'une solution de lyse et agité dans un tube rhésus contenant une solution tampon (200111) constituant le milieu réactionnel, afin de remettre en suspension les AN libérés par les cellules lysées ; le tube 30 est le même tout au long de l'analyse, jusqu'à l'obtention du résultat final ; B- soit humidifié pour récolter la biomasse sur la surface et agité dans le tube rhésus contenant une solution d'eau pure (200 l) constituant le milieu réactionnel afin de remettre en suspension les cellules ; ce tube est le même tout au long de l'analyse, jusqu'à l'obtention du résultat final. • Dans le cas B, les étapes qui suivent sont les mêmes que pour un milieu liquide (contrôle d'une eau de rinçage, contrôle de la qualité microbiologique d'un liquide biologique, suivi d'une fermentation.). • On prend l'embout de pipette contenant le réactif solidifié correspondant à la solution de lyse. Cette dernière peut-être du DMSO, du peroxyde d'hydrogène activée par CH3COOH, ou de l'EDTA TRIS. • On aspire et refoule 5 fois les 200 l d'échantillon pour bien homogénéiser et permettre une lyse maximale des cellules. (2) A partir de cette étape quelque soit l'origine du prélèvement : surface, liquide, air [dans le cas de l'atmosphère, nous aurions fait au préalable barboter, un volume précis, par aspiration de l'atmosphère à tester dans un volume d'eau pure (200 l par exemple) pour retenir les particules et en particulier les microorganismes ; puis procéder à la lyse des cellules comme précédemment] (3) On prend l'embout de pipette contenant le système réactif déshydraté contenant les enzymes nécessaires à la transformation de l'AMP et de L'ADP en ATP (myokinase, PEP, pyruvate kinase, sel tampon). On aspire et refoule 5 fois les 200 l d'échantillon du tube rhésus de l'étape précédente pour bien homogénéiser et recueillir lesdits enzymes. ^ On laisse incuber 15 minutes pour que la transformation de l'AMP et de l'ADP en ATP soit complète (4) On prend l'embout de pipette contenant avec le système réactif solidifié luciférine-luciférase (de luciole) obtenu comme indiqué à l'exemple 1.

On aspire et refoule 5 fois l'échantillon dans le tube rhésus. On introduit le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction pendant 10 secondes par exemple ; on obtient un valeur X (en RLU). On reprend le tube, éjecte l'embout de pipette et prend un autre embout 30 contenant le réactif solidifié standard, 100 picomoles d'ATP. ^ On aspire et refoule 5 fois l'échantillon dans le tube rhésus . ^ On introduit, de nouveau le tube rhésus dans la chambre du luminomètre pour intégrer les photons émis par la réaction (RLU) pendant 10 secondes. On obtient une valeur Y (en RLU). 5 ^ Y-X nous donne le nombre de RLU pour 100 picomoles d'ATP dans cet échantillon et par une règle de trois, le nombre de NA dans le tube. On détermine ainsi avec précisions la biomasse, exprimée sous forme de concentration en AN, qui présente dans le milieu issu de la surface à tester. Le dispositif de l'invention est particulièrement utile pour apprécier, par colorimétrie ou mieux par photométrie, la qualité microbiologique d'une surface, d'un échantillon d'air ou d'un liquide.

Claims (10)

REVENDICATIONS

1. Dispositif pour réaction de laboratoire et surtout pour dosage colorimétrique ou photométrique, ledit dispositif, qui est du type embout de pipette contenant un système réactif, étant caractérisé en ce qu'il comprend : (a) un embout de pipette en matière non hydrophobe et de préférence transparente, et (b) un système réactif comprenant au moins un réactif intervenant selon un processus réactionnel qui lui est approprié, ledit système réactif, qui (i) est solide ou gélifié, et qui (ii) est soluble ou dispersable dans un milieu réactionnel destiné à être aspiré au moment de l'emploi, étant temporairement immobilisé, vis-à-vis de la paroi interne dudit embout jusqu'au moment de l'emploi, sous une forme choisie parmi l'ensemble constitué par : (1) pulvérulente, ledit système réactif desséché étant adsorbé sur une portion de la paroi interne de l'embout, et (2) gélifiée, ledit système réactif étant réparti dans la masse d'un 20 gel logé dans une portion de la lumière de l'embout.

2. Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu réactionnel est l'échantillon liquide à tester, ledit échantillon étant une composition aqueuse et provenant d'un prélèvement gazeux, solide ou liquide. 25

3. Dispositif suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est destiné à la détermination d'un produit à tester qui est une substance chimique, biologique ou microbiologique.

4. Dispositif suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ladite forme gélifiée est desséchée pour donner une poudre adsorbée sur une portion de 30 la paroi interne de l'embout.

5. Procédé pour la préparation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on aspire un volume v de liquide ou de gel contenant une quantité donnée de système réactif, v étant inférieur au volume utile V de l'embout, on élimine ensuite 35 par séchage le liquide contenant ledit système réactif en suspension ou endispersion, le gel pouvant être conservé en l'état ou soumis au séchage pour donner une poudre adsorbée sur une portion de la paroi interne de l'embout.

6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que (i) on aspire dans l'embout de pipette un volume v de véhicule liquide contenant le système réactif et, avantageusement, un agent mouillant, puis (ii) procède au séchage en éliminant ledit véhicule liquide notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation.

7. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l'on charge dans l'embout un volume v de gel contenant un liquide de gonflement, le 10 système réactif et avantageusement un agent mouillant.

8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en outre par le fait que l'on procède au séchage du gel, notamment par évaporation centrifuge sous vide, par zéodratation ou par lyophilisation.

9. Utilisation, caractérisée en ce que l'on fait appel à un dispositif selon 15 l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la mise en oeuvre de dosages colorimétriques ou photométriques.

10. Utilisation suivant la revendication 9, caractérisée en ce qu'elle comprend l'appréciation, par colorimétrie ou mieux par photométrie, la qualité microbiologique d'une surface, d'un échantillon d'air ou d'un liquide.