KR100431163B1 - 고정된올리고뉴클레오티드를사용한삼중나선형성의dna정제방법 - Google Patents

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아방티 파르마 소시에테 아노님
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Abstract

기타 성분과의 혼합물에 DNA를 함유하는 용액이 삼중 나선을 형성하기 위해 DNA 상에 존재하는 특정 서열과 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 커플링된 지지체를 통과하는 이본쇄 DNA의 정제 방법.

Description

고정된 올리고뉴클레오티드를 사용한 삼중 나선 형성의 DNA 정제 방법{PURIFICATION OF A TRIPLE HELIX FORMATION WITH AN IMMOBILIZED OLIGONUCLEOTIDE}
유전자와 세포 처치 기술은 현재 주목할만한 발전을 이루고 있다. 그러나, 이러한 기술은 대량의 DNA의 약학적 순도를 생성할 가능성을 수반한다. 사실상, 이러한 신규한 처치에 있어서, 약제는 종종 DNA 자체로 이루어지고, 적합한 양으로 제조하는 것, 이를 분리하는 것 및 사람에게 치료 용도로 적합한 방법으로 이를 정제할 수 있는 것이 중요하다.
본 발명은 DNA 정제의 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 약학적으로 이용할 수 있는 이본쇄 DNA가 수월하게 정제될 수 있도록 한다. 좀더 상세하게, 본 발명에 따른 정제 방법은 DNA 서열과 올리고뉴클레오티드 사이의 특정한 하이브리드를 포함한다.
본 발명은 DNA 정제에 대한 단순하고 특히 유효하고 신규한 방법을 제시한다. 이는 고수율로 특히 고순도를 수득하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 본질적으로 정제될 DNA와 자연적이거나 변형된 염기로 이루어진 올리고뉴클레오티드에 삽입된 서열 사이의 특정한 상호작용을 기본으로 한다.
최근에 일부의 올리고뉴클레오티드가 삼중 나선을 국부적으로 형성하기 위해서 DNA 이중 나선의 방대한 홈(groove)에서 특정적으로 상호작용할 수 있고, 표적 유전자의 전사의 억제를 일으킬 수 있다는 것을 보여준다 (참고문헌: Helene et Toulme, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). 이러한 올리고뉴클레오티드는 올리고퓨린-올리고피리미딘 서열, 즉 한 가닥에 올리고퓨린 서열을, 상보적인 가닥에 올리고피리미딘 서열을 포함하는 부위에서 DNA 이중 나선을 선택적으로 인식하고, 여기에 국부적으로 삼중 나선을 형성한다. 제 3 가닥(올리고뉴클레오티드)의 염기는 왓슨-크릭 염기 쌍의 퓨린과 수소 결합(Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 결합)을 형성한다.
플라스미드를 분리하는 이러한 유형의 상호작용의 용도는 종래 기술에 기재되어 있다. 따라서, Ito et al. (참고문헌: PNAS 89 (1992) 495)에는 플라스미드의 특정 서열을 인식하고 여기에 삼중 나선을 형성할 수 있는 바이오틴 첨가 올리고뉴클레오티드의 용도가 기재되어 있다. 이어서 형성된 복합체는 스트렙타비딘-코팅 마그네틱 비드와 접촉하게 된다. 이어서 바이오틴과 스트렙타비딘 간의 상호작용이 플라스미드가 비드의 자기 분리에 의해 분리되고 이어서 용출될 수 있도록 한다. 그러나, 이러한 방법에는 약간의 약점이 있다. 특히, 첫째 올리고뉴클레오티드와 플라스미드 간에, 둘째 바이오틴 첨가 복합체와 스트렙타비딘 비드간에 두개의 연속적인 특정 상호작용을 필요로한다. 더욱이, 최종 용액은 약학 조성물에서 사용될수 없는 바이오틴 첨가 올리고뉴클레오티드로 오염될 수 있다.
본 발명은 이러한 유형의 상호작용을 이용한 DNA 정제의 신규한, 개선된 방법을 기재한다. 좀더 상세하게, 본 발명의 방법은 지지체에 공유적으로 커플링된 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 이러한 방법은 특히 신속하고, 이것은 특히 고수율 및 순도를 생성한다. 더욱이, DNA가 특히 기타 핵산, 단백질, (리포폴리사카라이드와 같은) 내독소, 뉴클레아제 등을 포함하는 복합 혼합물로부터 정제될 수 있도록 한다. 사용된 지지체는 또한 신속하게 회수되고, 수득된 DNA는 개선된 약학적 안전성을 나타낸다. 최근에 이러한 방법은 종래 기술과는 대조적으로 한 단계만을 수반한다.
그러므로 본 발명의 제 1 주제는 기타 성분으로 혼합된 DNA를 함유하는 용액이 상기 DNA에 존재하는 특정 서열과의 하이브리드에 의해서 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 커플링된 지지체를 통과함에 따른 이본쇄 DNA의 정제 방법에 있다. 특정 서열은 이본쇄 DNA에 자연적으로 존재하는 서열이거나 이본쇄 DNA에 인공적으로 도입된 합성 서열일 수 있다.
본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드는 이본쇄 DNA와 직접적으로 하이브리드된 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 하기의 염기를 함유할 수 있다:
- 이본쇄 DNA의 A.T 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있는 티미딘(T)(참고문헌 : Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);
- 이본쇄 DNA의 A.T 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있는 아데닌(A);
- 이본쇄 DNA의 G.C 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있는 구아닌(G);
- 이본쇄 DNA의 A.T 더블렛과 트리플렛을 형성할 수 있는 양성자화 시토신(C+) (참고문헌 : Rajagopal et al., loc. cit.);
- A.U 또는 A.T 염기쌍과 트리플렛을 형성할 수 있는 우라실(U).
바람직하게는 사용된 올리고뉴클레오티드는 시토신-풍부 호모피리미딘 서열을 포함하고, DNA에 존재하는 특정 서열은 호모퓨린-호모피리미딘 서열이다. 시토신의 존재는 시토신이 양성화되는 산 pH에서 안정하고, 시토신이 중화되는 알칼리에서 불안정화되는 삼중 나선을 갖는 것을 가능하게 한다.
하이브리드에 의한 삼중 나선의 형성을 허용하는 것은 올리고뉴클레오티드 및 DNA에 존재하는 특정 서열이 상보적으로 존재하기 위해 중요하다. 이와 관련하여, 최상의 수율과 최상의 선택성을 수득하기 위해서, 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 특정 서열이 본 발명의 방법에 사용된다. 이들은 특히 올리고뉴클레오티드 폴리(CTT) 및 특정 서열 폴리(GAA)일 수 있다. 예로서, 올리고뉴클레오티드가 언급될 수 있고; 염기 GAGG가 삼중 나선을 형성하지는 않지만 올리고뉴클레오티드가 커플링 암으로부터 멀리 간격을 두도록 할 수 있는 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)7; 서열 번호 1) 및, 서열 (CTT)7(서열 번호 26)이 또한 언급될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 상보적 단위(GAA)를 함유하는 특정 서열로 삼중 나선을 형성할 수 있다. 당해 서열은 실시예에 기재된 바와 같이 특히 7, 14 또는 17 GAA 단위를 함유하는 부위이다.
특정한 관심이 되는 다른 서열은 서열:
5' -AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (서열 번호 5)이다.
이러한 서열은 올리고뉴클레오티드
5' -AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (서열 번호 6) 또는
5' -TTGGTGGTGGGTGGGT-3' (서열 번호 7)로 삼중 나선을 형성한다.
이러한 경우에, 올리고뉴클레오티드는 퓨린 가닥에 반평행 배위로 결합한다. 이러한 삼중 나선은 Mg2+의 존재시에만 안정하다 (참고문헌 : Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251 ; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
전술한 바와 같이, 특정 서열은 이본쇄 DNA에 자연적으로 존재하는 서열이거나 이본쇄 DNA에 인공적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 이본쇄 DNA, 예를 들면 플라스미드 복제의 오리진 또는 마커 유전자에 자연적으로 존재하는 서열로 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 특히 유리하다. 이에 관련하여, 출원인은 플라스미드 서열 분석을 수행하여 이들 DNA의 일부 오리진 특히 복제 오리진에서 호모퓨린-호모피리미딘 부위를 포함할 수 있다는 것을 보여줄 수 있었다. 이러한 자연적인 호모퓨린-호모피리미딘 부위로 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 합성은 유리하게 본 발명의 방법이 비변형된 플라스미드 특히 시판 플라스미드 pUC, pBR322, pSV 등의 유형에 적용될 수 있도록 한다. 이본쇄 DNA에 자연적으로 존재하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열 사이에 복제 ColE1의 E_ coli 오리진에 존재하는 서열 5' -CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (서열 번호 2)의 모두 또는 일부를 포함하는 서열이 언급될 수 있다. 이러한 경우에, 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 서열: 5' -GAAGGTTCTCCCTCTTTCC-3' (서열 번호 3)을 포함하고, Beal과 Dervan (참고문헌: J. Am. chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) 및 Jayasena와 Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288)에 의해 기재된 바와 같이 이중 나선의 두 가닥에 교대로 결합한다. 플라스미드 pBR322β-락타마제 유전자 (Duval - Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508)의 서열 5' -GAAAAAGGAAGAG-3' (서열 번호 4)이 또한 언급될 수 있다. 복제의 오리진 또는 마커 유전자에 존재하는 서열로 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 사용은 이것이 동일한 올리고뉴클레오티드를 가지고 상기 복제의 오리진 또는 상기 마커 유전자를 함유하는 여타의 DNA를 정제하는 것을 가능하게 하므로 특히 유리하다. 따라서, 플라스미드나 이본쇄 DNA에 인공적인 특정 서열을 포함하기 위해서 플라스미드나 이본쇄 DNA를 변형할 필요가 없다.
완전하게 상보적인 서열이 바람직하지만, 약간의 미스매치가 올리고뉴클레오티드의 서열과 DNA에 존재하는 서열 사이에서 묵인될 수 있다. 단, 이들은 친화력의 매우 대단한 손실을 초래한다. E. coli.β-락타마제 유전자에 존재하는 서열 5′ -AAAAAAGGGAATAAGGG-3′ (서열 번호 8)가 언급될 수 있다. 이러한 경우에, 폴리퓨린 서열을 방해하는 티민은 제 3 가닥의 구아닌에 의해 인식될 수 있고, 이로 인해 2개의 TAT 트리플렛이 측면에 접할 경우 안정한 ATG 트리플렛을 형성한다(참고문헌 : Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).
특별한 양태에 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 서열 (CCT)n, 서열(CT)n또는 서열 (CTT)n을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 15의 정수이다. 유형(CT)n또는 (CTT)n의 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 출원인은 사실상, 정제 수율이 올리고뉴클레오티드의 C의 양에 영향을 받는다는 것을 보여 주었다. 특히 실시예 7에서 제시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드가 시토신을 더 적게 함유할 경우, 정제 수율은 증가한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 단위를 결합시킨다고 알려져 있다.
사용된 올리고뉴클레오티드는 (비변형된 자연적인 염기로 이루어진) 자연적인 것이거나 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 특히 올리고뉴클레오티드는 유리하게도 뉴클레아제에 대한 내성 또는 보호 또는 특정 서열에 대한 친화력을 증가시킬 수 있는 특정한 화학적 변형을 포함한다.
본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 또한 이를 뉴클레아제에 대해 더욱 내성을 갖도록 할 의도로 스켈레톤의 변형을 수행한 뉴클레오시드의 일부 연결된 연속물을 의미한다고 알려져 있다. 가능한 변형 중에서, DNA와 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트(참고문헌: Xodo et al., Nucleic acids Res., 1994, 22, 3322-3330) 및 포름아세탈 또는 메틸포스포네이트 스켈레톤을 포함하는 올리고뉴클레오티드(참고문헌: Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc.,1991, 113, 7767-7768)가 언급될 수 있다. 또한 DNA로 삼중 나선을 형성하는 뉴클레오티드의α아노머로 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다(참고문헌: Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760)스켈레톤의 다른 변형은 포스포아미데이트 결합이다. 예를 들면, DNA로 특히 안정한 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오타이드를 생성하는, Gryaznov와 Chen에 의해 기재된 N3'-P5'인터뉴클레오티드 포스포라미데이트 결합(참고문헌: J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144)이 언급될 수 있다. 스켈레톤의 기타 변형 중에서, 2′ -O-메틸리보스, 포스포디에스테르 등(참고문헌: Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144)의 사용이 또한 언급된다. 최근에 인-기제 스켈레톤은 또한 삼중 나선을 형성할 수 있는 PNA(펩티드 핵산)에서와 같이 폴리아미드 스켈레톤(참고문헌: Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481)으로, 또는 또한 삼중 나선을 형성할 수 있는 DNA의 다양이온성 동족체, DNG(디옥시리보뉴클레익 구아니딘)(참고문헌: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101)에서와 같이 구아니딘-기제 스켈레톤으로 대체할 수 있다.
제 3 가닥의 티미딘은 또한 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력을 증가시키는 5-브로모우라실로 대체할 수 있다 (참고문헌: Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). 제 3 가닥은 또한 7-deaza-2' -디옥시크산토신(참고문헌: Malligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-디옥시-β-D-리보퓨라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(참고문헌: Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-옥소아데닌,2-아미노퓨린, 2' -O-메틸슈도이소시티딘, 또는 당분야 전문가들에게 공지되어 있는 일부 기타 변형(참고문헌 : Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356)으로 언급될 수 있는 비자연적인 염기를 함유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 다른 변형 유형은 좀더 상세하게 올리고뉴클레오티드와 특정 서열 사이의 상호작용 및/또는 친화력을 개선할 의도를 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 대부분의 유리한 변형은 올리고뉴클레오티드의 시토신을 메틸화하는 데에 있다 (실시예 5 참조). 따라서, 메틸화된 올리고뉴클레오티드는 중성(5 이상)에 밀접한 pH 범위에서 특정 서열로 안정한 삼중 나선을 형성하는 주목할만한 성질을 나타낸다. 따라서, 이는 종래 기술의 올리고뉴클레오티드보다 더 높은 pH 수치, 즉 플라스미드 DNA의 분해 위험이 훨썬 적은 pH 수치에서 작업하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드의 길이는 적어도 3 염기, 바람직하게는 5 내지 30 염기이다. 10 염기 이상 길이의 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용된다. 길이는 원하는 선택성 및 상호작용의 안정성에 맞도록 각각의 개별적인 경우에 대해서 당분야 전문가들에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 여타의 공지되어 있는 기술에 의해 합성될 수 있다. 특히 이들은 핵산 합성기에 의해 제조될 수 있다. 당분야 전문가들에게 공지되어 있는 기타의 방법이 매우 명백하게 사용될 수 있다.
이의 지지체로의 공유적인 커플링을 허용하기 위해서, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 작용화된다. 따라서, 이것은 5' 또는 3' 위치에서 티올, 아민 또는 카복실 말단 그룹에 의해 변형될 수 있다. 특히 티올, 아민, 또는 카복실 그룹의 첨가는 예를 들면 올리고뉴클레오티드를 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카복실, 에스테르, 에폭사이드, 시아노겐 브로마이드 또는 알데히드 작용을 갖는 지지체에 커플링시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 커플링은 올리고뉴클레오티드와 지지체 사이에 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합의 성립에 의해 형성한다. 예를 들면 이작용성 커플링 시제와 같이 당분야 전문가들에게 공지되어 있는 기타 방법이 사용될 수 있다.
또한 커플링된 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드를 개선하기 위해서, 올리고뉴클레오티드가 "암" 및 "스페이서" 염기 서열을 함유하는 것이 유리할 수 있다. 암의 이용은 DNA와의 상호작용의 조건이 개선되도록 할 수 있는 지지체로부터의 선택된 거리에서 올리고뉴클레오티드를 결합시키는 것을 가능하게 한다. 암은 유리하게는 컬럼에 결합하도록 허용하는 1 내지 18, 바람직하게는 6 또는 12 (CH2) 그룹 및 아민을 포함하는 선형 탄소쇄로 이루어져 있다. 암은 하이브리드를 방해하지 않는 올리고뉴클레오터드, 또는 염기로 이루어진 "스페이서"의 포스페이트에 연결되어 있다. 따라서, "스페이서"는 퓨린 염기를 포함한다. 예로서, "스페이서"는 서열 GAGG를 포함할 수 있다. 암은 유리하게는 6개 내지 12개 탄소 원자를 포함하는 선형 탄소쇄로 이루어져 있다.
본 발명의 수행에 있어서, 상이한 유형의 지지체가 사용될 수 있다. 이들은 작용화된 크로마토그래프 지지체의 덩어리 형태 또는 컬럼 형태로 예비패킹된 것,작용화된 가소성 표면 또는 작용화된 라텍스 비드, 자기 등일 수 있다. 크로마토그래피 지지체가 바람직하게 사용된다. 예로서, 사용될 수 있는 크로마토그래피 지지체는 아가로스, 아크릴아미드 또는 덱스트란 및 (세파덱스, 세파로스, 수퍼로스 등과 같은) 이의 유도체, 폴리(스티렌/디비닐벤젠)과 같은 중합체, 또는 그래프팅된 또는 비그래프팅된 실리카이다. 크로마토그래피 컬럼은 확산 또는 관류 모드로 작동될 수 있다.
더욱 양호한 정제 수율을 수득하기 위해서, 플라스미드 상에서 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드의 여러 위치를 함유하는 서열을 사용하는 것이 특히 유리하다. 여러 하이브리드 위치의 존재는 사실상 정제 수율의 개선을 일으키는 상기 서열과 올리고뉴클레오티드 간의 상호작용을 촉진한다. 따라서, (CCT), (CT) 또는 (CTT) 모티프의 n개의 반복 단위를 함유하는 올리고뉴클레오티드에 있어서, 적어도 n 개의 상보적인 모티프, 바람직하게는 n+1 개의 상보적 모티프를 함유하는 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, n+1 개의 상보적 모티프를 운반하는 서열은 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드 위치를 2개 제공할 수 있다. 유리하게는 DNA 서열은 11개 이하의 하이브리드 위치, 즉 n+10 개의 상보적 모티프를 함유한다.
본 본명에 따른 방법은 일부 유형의 이본쇄 DNA를 정제하는 데에 사용할 수 있다. 이본쇄 DNA의 예로서, 일반적으로 치료에 중요한 1개 이상의 유전자를 운반하는 플라스미드와 같은 순환성 DNA가 있다. 이러한 플라스미드는 또한 복제의 오리진, 마커 유전자 등을 운반할 수 있다. 본 발명의 방법은 세포 용해질에 직접적으로 적용할 수 있다. 이러한 양태에서, 형질전환과 이어서 세포 배양에 의해 증폭된 플라스미드는 세포 용혈 후 직접적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 투명한 용해질, 즉 세포 용해질의 중화 및 원심분리 후 수득된 상등액에 적용할 수 있다. 이것은 또한 공지되어 있는 방법에 의해 정제된 용액에 매우 명백하게 적용할 수 있다. 이러한 방법은 또한 선형 또는 순환성 DNA가 상이한 서열의 DNA를 포함하는 혼합물로부터 정제되기 위해 중요한 서열을 운반하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따른 방법은 또한 이본쇄 DNA의 정제에 사용할 수 있다.
세포 용해질은 원핵 또는 진핵 세포의 용해질일 수 있다.
원핵 세포에 관해서는 세균 E. coli, B. subtilis, S. typhimurium 또는 Strepomyces가 예로서 언급될 수 있다. 진핵 세포에 관해서는 동물 세포, 효모, 곰팡이 등이 언급될 수 있고, 좀더 상세하게는 Kluyveromyces 또는 Saccharomyces yeasts 또는 COS, CHO, C127, NIH3T3 등의 세포일 수 있다.
본 발명의 방법은 매우 고순도의 플라스미드 DNA를 신속하고 간단하게 수득할 수 있도록 하기 때문에 특히 유리하다. 실시예에서 설명한 바와 같이 특히 이러한 방법은 당해 플라스미드 DNA가 분획 염색체 DNA, 내독소, 단백질, 뉴클레아제 등과 같은 오염시키는 성분으로부터 효과적으로 분리되도록 할 수 있다. 좀더 상세하게, 본 발명의 방법은 이본쇄 DNA의 제조, 특히 0.5 % 이하의 염색체 DNA 함량을 갖는 플라스미드 오리진의 제조가 수득되도록 할 수 있다. 또한 좀더 상세하게, 수득된 DNA 제조는 0.2% 이하의 염색체 DNA 함량을 갖는다. 따라서 본 발명은 약학적으로, 특히 유전자 또는 세포 치료에 사용될 수 있는 플라스미드 DNA를 포함하는조성물을 기재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 주제는 또한 상기에 기재된 방법에 따라 제조된 이본쇄 DNA, 선형 DNA 또는 플라스미드 오리진을 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명은 또한 0.5 % 이하, 바람직하게는 0.2 % 이하, 좀더 바람직하게는 0.1 % 이하의 염색체 DNA 함량을 갖는 플라스미드 DNA 제조에 관한 것이다.
조성물은 "네이키드" 또는 리포좀, 미세입자, 양이온 리피드, 중합체, 재조합 바이러스 또는 단백질 등과 같은 전달 담체와 결합된 플라스미드 DNA를 함유할 수 있다.
본 출원은 설명적이고 비제한적이라고 언급된, 하기의 실시예에 의해 더욱 상세하게 기재될 것이다.
클로닝 및 분자 생물학의 일반적인 기술
제한 효소로의 분해, 겔 전기영동, E. coli에서의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 전통적인 방법이 참고문헌(Maniatis et al., T., E.F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular cloning: a laboratary manual, second edition. Cold Spring Harbor Laboratary, Cold Spring Harbor Laboratary Press, New York; Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kinston, D.D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.)에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 서열은 이미 간행된 프로토콜(Ausubel et al., 1987)에 따른 쇄 종결 방법에 의해 결정된다.
제한 효소는 New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs)에 의해 제공된다.
연결을 수행하기 위해, DNA 분획은 파지 T4 DNA 리가아제(Biolabs)의 존재하에 50 mM 트리스-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 및 2 mM ATP를 포함하는 완충제에서 배양된다.
올리고뉴클레오티드는 포스포라미다이트 화학물질을 시아노에틸 그룹에 의해β위치에서 보호된 포스포라미다이트와 함께 사용하여(참고문헌 : Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XⅧ : Use ofβ-cyanoethyl-N,N-dialkylamino -/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifyng deprotection and isolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557: Glies, J.W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Doc.), Biosearch 8600 자동 DNA 합성기와 함께 제조기의 재조합을 사용하여 합성한다.
연결된 DNA 또는 형질전환의 효력에 대해 시험될 DNA가 경쟁하게 되는 하기의 균주를 형질전환하는 데에 사용된다:
E. coliDH5α[F/endA1, hsdr17, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, △(lacZYA-argE)U169, deoR,Φ80dlac(lacZ△M15)]
플라스미드 DNA의 미니예비제조는 Klein et al., 1980.에 따라 제조된다.
LB 배양 배지는 E. coli. 균주를 키우기 위해 사용된다(참고문헌: Maniatis et al., 1982). 균주는 37℃에서 배양된다. 세균은 적합한 항생제로 보충된 LB 배지의 디쉬에서 플레이팅 한다.
실시예 1
1.1 컬럼의 제조
장비 :
사용된 컬럼은 연동 펌프(결과 < 1㎖/분)에 연결된 NHS(N-하이드록시숙신이미드, 약제)로 활성화된 1 ㎖의 HiTrap 컬럼이다. 사용된 특정 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 NH2그룹을 포함하고, 이것의 서열을 하기와 같다:
5' -GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)
이러한 실시예에서 사용된 완충제는 하기와 같다:
커플링 완충제: 0.2 M NaBCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충제 A: 0.5 M 에탄올라민, 0.5 M NaCl, pH 8.3.
완충제 B: 0.1 M 아세테이트, 0.5 M NaCl, pH 4.
방법:
컬럼을 6 ㎖의 1 mM HCl로 세척하고, 이어서 커플링 완충제로 희석된 올리고뉴클레오티드(1 ㎖ 중의 50 nmol)를 컬럼에 적용하고, 30분 동안 실온에 방치한다. 컬럼을 연속적으로 6 ㎖의 완충제 A와 6 ㎖의 완충제 B로 세번 세척한다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 CONH 결합을 통하여 컬럼에 공유 결합한다. 컬럼을 PBS, 0.1 % NaN3에, 4 ℃에서 저장하고 적어도 4회 사용할 수 있다.
1.2. 플라스미드 제조
하기 2개의 올리고뉴클레오티드가 합성된다.
올리고뉴클레오티드 4817:
.5'-
Figure pct00001
올리고뉴클레오티드 4818:
5' -
Figure pct00002
플라스미드로 하이브리드되고 클로닝될 경우, 이러한 올리고뉴클레오티드는 호모퓨린-호모피리미딘 서열 (GAA)17을 상기에 기재된 바와 같이 상응하는 플라스미드로 도입한다.
이러한 2개의 하이브리드 올리고뉴클레오티드에 상응하는 서열은 암피실린 내성 유전자를 운반하는 플라스미드 pBKS+의 다중 클로닝 부위에서 클로닝된다(Stratagene Cloning System, La Jolla CA). 이러한 말단에서, 올리고뉴클레오티드는 하기의 방법으로 하이브리드된다: 이러한 두 올리고뉴클레오티드 1 ㎍을 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2를 포함하는 최종 완충제 40 ㎖에 함께 넣는다. 이러한 혼합물을 95 ℃로 가열하고, 이어서 실온에 배치하여 온도가 점차로 하강시킨다. 하이브리드 올리고뉴클레오티드의 혼합물 10 ng을 최종 30 ㎕에서BamHI와 EcoRI로 분해된 플라스미드 pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) 200 ng로 연결시킨다. 연결 후, 앨리쿼트가 DH5a로 형질전환된다. 형질전환 혼합물을 암피실린(50 mg/ℓ)과 X-gal(20 mg/ℓ)로 보충된 L 배지에서 플레이팅한다.
재조합 클론은 E. coliβ-갈락토시다아제의 분획 ω의α-보충을 허용하는 부모 플라스미드와는 대조적으로 이러한 배지에 파란색 착색이 없음을 나타내야 한다. 6개의 클론으로부터 플라스미드를 미니예비제조한 후, 이들은 모두 pBKS+의 EcoRI 및 BamHI 부위 사이에 위치하는 PstI 부위의 부재와 다중 클로닝 부위를 함유하는 48-bp PvuII 밴드의 분자량의 증가를 보여준다. 하나의 클론이 선택되고 상응하는 플라스미드가 pXL2563으로 표시된다. 클로닝된 서열은 플라스미드 pBKS+(Stratagene Cloning System, La Jolla CA)에 대해 프라이머 -20 (5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (서열 번호 11))를 사용하여 시퀀싱함으로써 입증된다 (참고문헌: Viera J. and J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268). 플라스미드 pXL2563은 제공자의 추천에 따른 Wizard Megaprep kit (Promega Corp. Madison, WI)에 따라 정제된다. 이러한 플라스미드 DNA 제조는 이후에 하기 기재된 실시예에 사용된다.
1.3. 플라스미드 정제
장비:
(1.2에 기재된) 플라스미드 pXL2563이 1.1에 기재된 올리고뉴클레오티드에커플링된 HiTrap 컬럼 상에서, 또한 플라스미드 pBKS+를 함유하는 용액으로부터 정제된다. 이러한 정제에 사용된 완충제는 하기와 같다.
완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.
완충제 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
방법:
컬럼은 6 ㎖의 완충액 F로 세척하고, 플라스미드(400 ㎕의 완충제 F 중의 20 ㎍의 pXL2563 및 20 ㎍의 pBKS+)를 컬럼에 적용하고 2시간 동안 실온에서 배양한다. 컬럼을 10 ㎖의 완충제 F로 세척하고, 이어서 완충제 E로 용출을 수행한다. 플라스미드를 1% 아가로즈스 겔 상에서 전기영동하고 에티듐 브로마이드로 염색한후 검사한다. 용액의 플라스미드의 비율은 E. coli.에서의 이들의 형질전환 활성도를 측정함으로써 평가된다.
결과:
30%의 pXL2563 및 70%의 pBKS+를 함유하는 혼합물, 100%의 pXL2563을 함유하는 용액으로부터의 개시는 컬럼 결과에서 회수된다. 260과 280nm OD 비에 의해 측정된 순도가 1.9 에서 2.5로 상승하고, 이것은 단백질을 오염시키는 것이 이러한 방법으로 제거된다는 것을 나타낸다.
실시예 2
2.1. - 이러한 실시예에는 플라스미드 DNA 정제 실험이 기재된다. 올리고 뉴클레오티드 (5' -GAGGCTTTTCCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1))의 컬럼에의 커플링이 실시예 1에서 기재된 바와 같이 수행된다. 커플링을 위하여, 올리고뉴클레오티드는5' 말단에서 6개의 탄소 원자를 함유하는 암에 의해 스페이서의 포스페이트에 연결된 아민 그룹으로 변형된다 (변형된 올리고뉴클레오티드 Eurogentec SA, Belgium). 플라스미드 pXL2563은 제공자의 추천에 따른 Wizard Megaprep kit (Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 정제된다. 이러한 실시예에 사용된 완충제는 하기와 같다.
완충제 F: 0-2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5 내지 5.
완충제 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼을 6 ㎖의 완충제 F로 세척하고, 400 ㎕의 완충제 F로 희석한 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 컬럼에 적용하고 2시간 동안 실온에서 배양한다. 컬럼을 10 ㎖의 완충제 F로 세척하고, 이어서 완충제 E로 용출을 수행한다. 플라스미드를 260 nm에서 광학 밀도를 측정함으로써 측량한다.
이러한 실시예에서, 결합은 NaCl에 관한 몰래러티가 0 내지 2 M으로 변화하는 완충제(완충제 F)에서 수행된다. NaCl의 몰래러티가 감소할 때 정제 수율은 감소한다. 결합 완충제의 pH는 4.5 내지 5로 변화할 수 있고, 정제 수율은 4.5에서 더욱 양호하다. 또한 염기성 pH의 다른 용출 완충제를 사용하는 것이 가능하다: 따라서 용출은 50 mM 보레이트, pH 9, 0.5 mM EDTA를 포함하는 완충제로 수행된다.
2.2. - 올리고뉴클레오티드 (5' -GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)의 컬럼에의 커플링은 실시예 1에서와 같이 수행된다. 플라스미드 pXL2563은 제공자의 추천에 따른 Wizard Megaprep kit (Promega Corp., Madison, WI)를 사용하여 정제된다. 이러한 실시예에 사용된 완충제는 하기와 같다.
완충제 F: 0.1 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 5.
완충제 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
컬럼은 6 ㎖의 완충액 F로 세척하고, 400 ㎕의 완충제 F로 희석한 100 ㎍의 플라스미드 pXL2563을 컬럼에 적용하고 1시간 동안 실온에서 배양한다. 컬럼을 10 ㎖의 완충제 F로 세척하고, 이어서 완충제 E로 용출을 수행한다. 올리고뉴클레오티드 컬럼을 통과하기 전후에 플라스미드 샘플에 존재하는 게놈 또는 염색체 E.coli DNA의 함량을 측정한다. 이러한 게놈 DNA은 E. coli galK 유전자의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 측량된다. 하기 프로토콜에 따라서: 이러한 프라이머의 서열이 Debouck et al.에 의해 기재되어 있다 (참고문헌: Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841-1853):
5' -CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (서열 번호 24) 및
5' -CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (서열 번호 25).
반응 매질은 25 ㎕의 PCR 완충제(Promega France, Charbonnieres) 중에: 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0.5 ㎛ 프라이머; 20 U/㎖ Taq 폴리머라제 (Promega)를 포함한다. 반응은 서열에 따라 수행된다:
- 95 ℃에서 5분
- 95 ℃에서 10초의 30 사이클
60 ℃에서 30초
78 ℃에서 1분
-78 ℃에서 10분.
124 염기쌍 길이의 증폭된 DNA 분획은 SybrGreen I의 존재하에 3%의 아가로즈 겔상의 전기 영동에 의해 분리되고 (Molecular Probes, Eugene, USA), 이어서 E. coli 균주 B (Sigma, ref D4889)로부터의 Ultrapur 게놈 DNA 시리즈를 참고로 하여 측량된다.
컬럼에 적용된 샘플 중의 염색체 DNA는 1%, 올리고뉴클레오티드 컬럼 상에서 정제된 샘플 중의 염색체 DNA는 0.2%이다.
실시예 3. 투명한 용해질상의 실험
이러한 실시예에는 "미니예비" 스케일이라고 불리우는 세균 배양의 투명한 용해질로부터의 플라스미드 DNA 정제가 기재된다: 플라스미드 pXL2563을 함유하는 DH5α균주의 밤새 배양한 1.5 ㎖를 원심분리하고, 펠렛을 100 ㎕의 50 mM 글루코스, 25 mM Tris-HCl, pH 8,10 mM EDTA에 재부유시킨다. 200 ㎕의 0.2 M NaOH, 1% SDS를 첨가하고, 튜브를 거꾸로하여 혼합하고, 이어서 150 ㎕의 3M 칼륨 아세테이트, pH 5를 첨가하고 튜브를 거꾸로하여 혼합한다. 원심분리 후, 상등액이 실시예 1에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 컬럼 상에 회수되고 생성된다. 결합, 세척 및 용출은 실시예 1에서 기재된 것과 동일하다. 약 1 ㎍의 플라스미드가 1.5 ㎖의 배양액으로부터 회수된다. 수득되어 아가로즈 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석된 플라스미드는 "수퍼코일" 순환성 DNA의 단독 밴드의 형태를 취한다. 고분자량 (염색체) DNA 또는 RNA의 어떠한 추적도 이러한 방법에 의해 정제된 플라스미드에서 검사할 수 없다. 260 및 280 nm의 광학 밀도의 비는 2 이상이다.
실시예 4
4.1. : 이러한 실시예에는 플라스미드 pXL2563을 함유한 DH5α균주의 세균 배양액 20 ㎖로 개시하고, 실시예 3에서와 같은 조건하에서 수행되는 플라스미드 DNA 정제 실험이 기재된다. 세포 펠렛을 1.5 ㎖의 50 mM 글루코스, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA에 용해시킨다. 2㎖의 0.2 M NaOH, 1% SDS로 용혈을 수행하고, 1.5 ㎖의 3 M 칼륨 아세테이트, pH 5로 중화한다. 이어서 DNA를 3 ㎖의 2-프로프란올롤로 침전시키고, 펠렛을 0.5 ㎖의 0.2 M 나트륨 아세테이트, pH 5, 0.1 M NaCl에 용해시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 올리고뉴클레오티드 컬럼상에 생성한다. 결합, 컬럼의 세척, 및 용출을 세척 완충제, NaCl에 관해 몰래러티가 0.1 M인 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된다. 약 16 ㎍의 플라스미드가 수득된다. 수득되어 아가로즈 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색에 의해 분석된 플라스미드는 "수퍼코일" 순환성 DNA의 단독 밴드의 형태를 취한다. 고분자량 (염색체) DNA 또는 RNA의 어떠한 추적도 정제된 플라스미드에서 검사할 수 없다. 제한 효소의 플라스미드의 분해는 3 킬로염기의 예상된 분자량에서 단독 밴드를 생성한다. 샘플의 단백질 농도는 투명한 용해질중에 125 ㎍/㎖ 내지 정제된 플라스미드 중에 1 ㎍/㎖로 감소한다 (Micro-BCA assay, Pierce). LAL 분석(Biosepra)에 의해 측정된 내독소 농도는 개시 투명 용해질에 상대적인 정제된 플라스미드에서 10 이상의 인자에 의해 배분된다.
4.2. : 사용된 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 프로모터, 루시페라제 암호 유전자 및 플라스미드 pXL2563으로 부터 기원한 호모퓨린-호모피리미딘 서열(GAA)17을 함유하는 카세트를 함유한다. 이러한 플라스미드를 함유하는 균주 DH1(Maniatis et al., 1989)이 7-ℓ 발효기에서 배양된다. 투명한 용해질이 200 g의 세포로부터 제조된다: 세포 펠렛을 2 ℓ의 25 mM Tris, pH 6.8, 50 mM 글루코스, 10 mM EDTA에 용해시키고, 2 ℓ의 0.2 M NaOH, 1% SDS을 첨가한다. 용해질은 1 ℓ의 3 M 칼륨 아세테이트를 첨가함으로써 중화된다. 철저한 여과후, 이러한 4 ㎖의 용해질을 실시예 1.1에 기재된 방법에 따라 올리고뉴클레오티드 서열 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)에 커플링된 5 ㎖의 HiTrap-NHS 컬럼에 적용한다. 세척 및 용출은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행한다. 약 400 ㎍의 플라스미드가 회수된다. 실시예 2.2에 기재된 기술에 의해 측정된 이러한 샘플 중의 게놈 DNA의 수준은 0.1%이다.
실시예 5. 변형된 올리고뉴클레오티드의 사용
이러한 실시예에는 메틸화된 시토신을 생성하는 올리고뉴클레오티드의 사용이 기재된다. 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같다.
Figure pct00003
이러한 올리고뉴클레오티드는 5' 말단.MEC = 5-메틸시토신에 NH2그룹을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 pXL2563이 pH 5의 결합 완충제를 갖는 실시예 1의 조건하에서 정제되도록 할 수 있다 (이로 인해 플라스미드의 분해 위험이 감소된다).
실시예 6
상기 실시예에서, 사용된 올리고뉴클레오티드는 5' -터미널 말단에서 6개의 탄소 원자를 함유하는 암(NH2-(CH2)6을 통해 포스페이트에 연결된 아민 그룹으로 변형된다. 이러한 실시예에서, 아민 그름은 12개의 탄소 원자를 함유하는 암(NH2-(CH2)12을 통해 5' -터미널 말단의 포스페이트에 연결된다. 올리고뉴클레오티드의 커플링과 컬럼의 통과는 실시예 2에 기재된 바와 같이 완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5로 수행된다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 더욱 양호한 정제 수율을 수득하는 것을 가능하게 한다 : 6개의 탄소 원자를 함유하는 올리고뉴클레오티드로 53%의 수율이 수득되고, 이러한 수율은 동일한 조건하에서 45%에 유사하다.
실시예 7
실시예 1.2에 기재된 클로닝 전략에 이어서, 호모퓨린-호모피리미딘 서열을 운반하는 다른 두개의 플라스미드가 수행된다: 서열 (GGA)16을 함유하는 플라스미드 pXL2725와 서열 (GA)25를 함유하는 플라스미드 pXL2726.
실시예 7.1: 플라스미드의 제조
플라스미드 pXL2725와 플라스미드 pXL2563의 동족체인 pXL2726이 실시예 1.2에 기재된 클로닝 전략에 따라 하기 올리고뉴클레오티드 쌍을 사용하여 제조된다:
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
올리고뉴클레오티드 쌍 5986과 5987은 pBKS+의 BamHI와 EcoRI 부위에서 올리고뉴클레오티드를 클로닝함으로써 플라스미드 pXL2726을 제조하는 데에 사용되고(참고문헌: Stratagene Cloning System, La Jolla CA), 반면에 올리고뉴클레오티드 5981과 5982는 플라스미드 pXL2725의 제조에 사용된다. 플라스미드 pXL2563의 제조에서와 같은 동일한 실험적 조건이 사용되고, 올리고뉴클레오티드 쌍만이 변한다. 유사하게, 클로닝된 서열은 플라스미드 상에서 시퀀싱함으로써 입증된다. 이것은 플라스미드 pXL2725가 예상된 서열에 관한 변형을 포함한다는 것을 보여줄 수 있게 하고, GGA가 17번 반복된 서열 대신에 GGAGA(GGA)15 (서열 번호 17)이 있다.
실시예 7.2: 컬럼의 제조와 정제
이러한 호모퓨린 서열로 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 실시예 1.1에 기재된 기술에 따라 HiTrap 컬럼에 커플링된다. 서열 5' -AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (서열 번호 18)의 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 pXL2725의 정제에 사용되고, 서열 5' -AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (서열 번호 19)의 올리고뉴클레오티드는 플라스미드 pXL2726의 정제에 사용된다.
이로 인해 수득된 2개의 컬럼은 상응하는 플라스미드가 실시예 2에 기재된 기술에 따라 하기 완충제로 정제될 수 있도록 한다.
완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완충제 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
수득된 수율은 pXL 2725와 pXL 2726에 대해 각각 23%와 31%이다.
실시예 8
이러한 실시예는 정제 수율에 대한 플라스미드에 존재하는 특정 서열의 길이의 영향을 설명한다.
실시예 8.1: 플라스미드의 제조
본 발명의 조성물의 활성도를 나타내기 위해 이러한 실험에 사용된 리포터 유전자는 루시페라제(Luc) 암호 유전자이다.
플라스미드 pXL2621은 MluI과 HindIII 부위에서 루시페라제 암호 유전자의 상향으로 벡터 pGL 염기 벡터로(Promega Corp., Madison, WI) 클로닝된 제한 효소 MluI과 Hind Ⅲ로의 분할에 의해 pcDNA3(Invitrogen Corp., San Diego, CA)으로부터 추출된 661-bp 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하는 카세트를 함유한다. 이러한 플라스미드는 분자 생물학의 표준 기술을 사용하여 제조된다.
플라스미드 pXL2727-1과 플라스미드 pXL2727-2는 하기의 방법으로 제조된다:
2 ㎍의 플라스미드 pXL2621을 BamHI로 선형화하고; 효소를 65 ℃에서 10분 동안 처리함으로써 불활성화시키고; 동시에, 올리고뉴클레오티드 6006과 6008을 플라스미드 pXL2563의 제조에서 기재된 바와 같이 하이브리드한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
이러한 하이브리드 혼합물을 DH5a로의 형질전환후 플라스미드 pXL2621의 BamHI 말단에서 클로닝하고, 올리고뉴를레오티드가 pstI 부위를 도입하므로 재조합 클론을 PstI 효소 제한 분석에 의해 동정한다. 두개의 클론을 선택하고, 클로닝된 분획의 뉴클레오티드 서열은 시퀀싱 반응 프라이머로서 프라이머 (6282, 5'-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (서열 번호 22)를 사용하여 입증한다 (참고문헌: Viera J. and J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259-268).
제 1 클론 (pXL2727-1)은 GAA가 10번 반복된 서열을 함유한다. 제 2의 클론 (pXL2727-2)은 서열 5' -GAAGAAGAG(GAA)7GAAGAGAA-3' (서열 번호 23)를 함유한다.
실시예 8.2: 컬럼의 제조와 정제
실시예 1에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 5' -GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (서열 번호 1)에 커플링된 컬럼이 사용된다.
플라스미드 pXL2727-1은 GAA가 14번 반복되는 서열을 운반한다. 상응하는 하이브리드 서열 CTT가 7번 반복되는 상기에 기재된 서열만을 함유하는 올리고뉴클레오티드는 8개의 상이한 위치에서 플라스미드와 하이브리드할 수 있다. 대조적으로 플라스미드 pXL2727-2는 컬럼에 결합된 올리고뉴클레오티드에서와 동일한 길이의 하이브리드 서열 (GAA)7를 포함한다. 따라서 이러한 올리고뉴클레오티드는 pXL2727-2 상의 한 위치에서만 하이브리드할 수 있다.
실험은 하기 완충제로의 실시예 2에서 기재된 것과 동일하다.
완충제 F: 2 M NaCl, 0.2 M 아세테이트, pH 4.5.
완층제 E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0.5 mM EDTA.
정제 수율은 플라스미드 pXL2727-1에서 29%, pXL2727-2에서 19%이다.
실시예 8.3 : 포유 동물 세포의 시험관에서의 형질감염
사용된 세포는 50,000 세포/웰을 기본으로한 24-웰 평판 배양으로 실험하기 하루전에 배양된 NIH 3T3 세포이다. 플라스미드를 150 mM NaCl로 희석하고 리포펙턴트 RPR115335와 혼합한다. 리포펙턴트 양전하/DNA 음전하 비가 6인 것이 사용된다. 혼합물을 와동하고, 실온에서 10분 동안 방치하고, 태송아지 혈청을 함유하지 않는 매질로 희석하고, 이어서 배양 웰 당 1㎍의 비율로 DNA를 세포에 첨가한다. 37℃에서 2시간 후, 10%의 용적/용적의 태송아지 혈청을 첨가하고 세포를 5%의 CO2의 존재하에 37℃에서 48시간 동안 배양한다. 세포를 PBS로 두번 세척하고, 루시페라제 활성을 Lumat LB9501 luminometer(EG and G Berthold, Evry)에 기재된 프로토콜에 따라서(Promega kit, Promega Corp. Msdison, WI) 측정한다. 실시예 8.2에서 기재된 바와 같이 정제된 플라스미드 pXL2727-1은 Wizard Megaprep kit (Promega Corp. Medison, WI)를 사용하여 정제된 동일한 플라스미드로 수득된 수율의 2배의형질 감염 수율을 생성한다.
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Claims (34)

  1. 이본쇄 DNA를 기제로 하여 약제를 제조하는 방법에 있어서, 기타 성분과 혼합된 상기 DNA를 함유하는 용액이 상기 DNA에 존재하는 특성 서열과의 혼성에 의해 삼중나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 공유적으로 커플링된 지지체를 통과하는 적어도 하나의 정제 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA를 함유하는 용액이 세포 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 세포 용해질이 투명 용해질임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 이본쇄 DNA가 예비정제됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, DNA에 존재하는 특정 서열이 호모퓨린-호모피리미딘 서열을 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 이러한 호모퓨린-호모피리미딘 서열과 삼중 나선을 형성하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 서열을 이본쇄 DNA에 인공적으로 도입함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 폴리(CTT) 서열을 포함하고, DNA에 존재하는 특정 서열이 폴리(GAA) 서열임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열 GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(서열 번호 1)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열 (CTT)7(서열 번호 26)을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, DNA 에 존재하는 특정 서열이 서열 (GAA)7, (GAA)14또는 (GAA)17을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 5 항에 있어서, DNA에 존재하는 특정 서열이 서열 번호 5를 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 6 또는 서열 번호 7을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 5 항에 있어서, DNA에 존재하는 특정 서열이 서열 번호 17을 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 18을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 5 항에 있어서, DNA에 존재하는 특정 서열이 서열 (GA)25를 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 19를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 서열이 이본쇄 DNA에 자연적으로 존재하는 특정 서열임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, DNA에 자연적으로 존재하는 특정 서열이 플라스미드 복제 기원(origin)에 존재하는 호모퓨린-호모피리미딘 서열임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 특정 DNA 서열이 E.coil 복제 기원 ColE1내에 존재하는 서열 번호 2의 모두 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 3을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 특정 DNA 서열이 플라스미드 pBR322 β-락타마제 유전자내에 존재하는 서열 번호 4 또는 서열 번호 8의 모두 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 다이설파이드, 티오에테르, 에스테르 또는 아민 결합을 통하여 지지체에 커플링됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 n이 1 내지 18의 정수인 탄소쇄(CH2)n로 이루어진 암(arm)에 의해 칼럼에 결합되고, 상기 암은 포스페이트를 통하여 올리고뉴클레오티드에 연결되고 아미드 결합을 통하여 칼럼에 연결됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 암이 6 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 탄소쇄로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 암이 12 개의 탄소 원자를 함유하는 선형 탄소쇄로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 대해 내성이거나 보호되도록 하는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하거나, 특정 서열에 대한 그의 친화도를 증가시키는 적어도 하나의 화학적 변형을 포함함 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 하나의 시토신이 메틸화된 호모피리미딘 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, DNA가 치료에 중요한 하나 이상의 서열을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 이본쇄 DNA가 플라스미드와 같은 환형 DNA임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 이본쇄 DNA에 존재하는 특정 서열이 올리고뉴클레오티드와의 혼성화를 위한 여러 위치를 함유함을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 지지체가 작용화된 크로마토그래피 지지체, 작용화된 가소성 표면 및 작용화된 라텍스 비드 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 지지체가 크로마토그래피 지지체임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 약제가 0.5% 이하의 염색체 DNA 함량을 지님을 특징으로하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 약제가 0.2% 이하의 염색체 DNA 함량을 지님을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 약제가 0.1% 이하의 염색체 DNA 함량을 지님을 특징으로 하는 방법.
  33. 이본쇄 DNA의 정제 방법에 있어서, 기타 성분과 혼합된 RNA를 함유하는 용액이 상기 RNA에 존재하는 특정 서열과의 혼성에 의해 삼중 나선을 형성 할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 커플링된 지지체를 통과하는 적어도 하나의 정제 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  34. 플라스미드 DNA의 정제 방법에 있어서, 기타 성분과 혼합된 DNA를 함유하는 용액이 상기 DNA에 존재하는 특정 서열과의 혼성에 의해 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 커플링된 지지체를 통과하는 적어도 하나의 정제 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
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