CZ303086B6 - Zpusob purifikace dvojretezcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu - Google Patents
Zpusob purifikace dvojretezcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303086B6 CZ303086B6 CZ20023865A CZ20023865A CZ303086B6 CZ 303086 B6 CZ303086 B6 CZ 303086B6 CZ 20023865 A CZ20023865 A CZ 20023865A CZ 20023865 A CZ20023865 A CZ 20023865A CZ 303086 B6 CZ303086 B6 CZ 303086B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- double
- stranded dna
- dna
- sequence
- oligonucleotide
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 187
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 74
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims abstract description 67
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 76
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 141
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 12
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 7
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 7
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims 4
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 29
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 9
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 8
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000742579 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor B Proteins 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102100038217 Vascular endothelial growth factor B Human genes 0.000 description 2
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- -1 lipopoysaccharides) Chemical class 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical group N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N (morpholin-4-ylamino)phosphonous acid Chemical compound OP(O)NN1CCOCC1 VJUBYQUPDRGGMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2,3-dimethylquinoxaline Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N=C(C)C(C)=NC2=C1 CNNSWSHYGANWBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2C=C1 NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Chemical group 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101001128634 Homo sapiens NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical group O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032194 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Rešení se týká nového zpusobu purifikace dvojretezcové DNA. Zpusob je založen na tom, že roztok obsahující požadovanou DNA ve smesi s dalšími složkami prochází pres nosic, na který je kovalentne navázaný oligonukleotid schopný hybridizovat se specifickou sekvencí prítomnou v DNA a vytváret s ní trojšroubovicovou strukturu.
Description
Způsob purifikace dvoj řetězcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového způsobu purifikace DNA. Způsob podle vynálezu umožňuje rychlou purifikaci farmakologicky užitečné dvoj řetězcové DNA. Způsob purifikace podle vynálezu využívá specifické hybridizace mezi sekvencí DNA a oligonukleotidem.
Dosavadní stav techniky
Postupy genové a buněčné terapie prodělávají v současné době pozoruhodný rozvoj. Avšak tyto postupy přinášejí také potřebu produkovat velká množství DNA ve farmaceutické čistotě. Při těchto nových léčebných postupech často léčivo sestává ze samotné DNA nebojí obsahuje, aje proto nezbytné, aby tato DNA mohla být vyráběna v potřebném množství, a aby byla izolována a purifikována takovým způsobem, aby byla vhodná pro použití v humánní medicíně.
V současnosti byla v mnoha publikacích prokázána možnost injekce plazmidové DNA pro účely genové terapie nebo vakcinace, kde bylo ukázáno, že DNA expresní vakcinace, kde bylo ukázáno, že DNA expresní vektory mohou být přijímány různými typy buněk a geny kódované těmito plazmidy mohou být následně exprímovány (Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129).
K požadovaným genům pro genové terapie nebo vakcinace patří například nádorové supresorové geny, tzv. „sebevražedné“ geny nebo anti-sense sekvence. Mohou to být také geny kódující proteiny jako je například alfa-fetoprotein AFP (Morinaga, N83. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, S0, 4604), enzymy, hormony, cytokiny, růstové faktory jako je například FGF (Jouanneau et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2893) nebo VEGFB (Olofsson B al., 1996, Proceedings 93, 576), koagulační faktory jako ,3-deleted“ faktor VIII (faktor VIII s B delecí) (Truett et al., 1985, DNA 4, 333), apolipoproteiny, neurotransmitery, neurotrofícké faktory, přírodní nebo chimérické imunoglobuliny. A také reportérové geny jako je například gen lacZ kódující βgalaktozidázu z Escherichia coli.
Hlavními úkoly, které je třeba řešit při používání plazmidové DNA jako vektoru pro přenos genů v humánní medicíně jsou i) výroba a ii) čistota produktu jakožto léčiva. Technologie pro produkci plazmidových vektorů s vysokým počtem kopií v hostiteli Escherichia coli byly vyvinuty. Plazmidy používané v současné době jsou buďto plazmidy odvozené z plazmidu ColEl, jako je například pBR322, pUC nebo pBluescript (Lahijaní et al., 1996, Hum. Gene Ther.l, 7, 1971), nebo plazmidy pCOR (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482).
Druhý soubor problémů spojených s použitím plazmidové DNA jako vektoru pro genové terapie je čistota plazmidového vektoru samotného. Současné metody purifikace jako je například ultracentrifugace vCsCl gradientu nebo chromatografie mohou být někdy neúčinné při odstranění kontaminujících složek jako je například hostitelská genomová DNA a RNA nebo proteiny. Konkrétně, hostitelská genomová DNA, jejíž chemická struktura je velmi blízká plazmidové DNA, je mimořádně obtížně odstranitelná s využitím klasické chromatografie. Typické koncentrace hostitelské genomové DNA, které jsou naměřeny v plazmidových preparátech získaných pomocí klasické chromatografie, jsou až 0,5 až 1 %. Tudíž pro přípravu plazmidové DNA jako bezpečného vektoru pro humánní genovou terapii je potřebná technologie purifikace, která sníží obsah hostitelské genomové DNA na mnohem nižší hladiny, typicky 0,1 nebo 0,01 % nebo dokonce nižší.
Předkládaný vynález popisuje nový jednoduchý a obzvláště účinný způsob purifikace DNA. Tento způsob konkrétně umožňuje dosáhnout obzvláště vysoké čistoty současně s vysokým výtěžkem. Způsob podle vynálezu je založen v podstatě na specifické interakci mezi sekvencí vlože- 1 CZ 303086 B6 nou do DNA, která má být purifikována, a oligonukleotidem, který je složen z přírodních nebo modifikovaných bází.
Nedávno bylo ukázáno, že některé oligonukleotidy jsou schopné specifické interakce s širokým žlábkem dvojšroubovice DNA, kdy vzniká lokální trojšroubovicová struktura, která vede k inhibici transkripce cílových genů (Heléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tyto oligonukleotidy selektivně rozpoznávají DNA dvojšroubovici v oligopurinoligopyrimidinové sekvenci, což jsou úseky obsahující oligopurinové sekvence vjednom řetězci a oligopyrimidinové sekvence v druhém komplementárním řetězci, a tam lokálně vytvářejí trojšroubovici. Báze ío tohoto třetího řetězce (oligonukleotidu) vytvářejí vodíkové vazby (Hoogsteenovy nebo reverzní
Hoogsteenovy vazby) s puriny Watson-Crickových párů bází.
Použití tohoto typu interakce k izolaci plazmidu již bylo popsáno v dřívějším stavu techniky. Ito et al. (PN AS 89 (1992) 495) popsali použití biotinylovaného oligonukleotidu schopného rozpoz15 návat konkrétní sekvenci plazmidu a vytvářet s ní trojšroubovici. Takto vytvořené komplexy jsou pak přivedeny do kontaktu s magnetickými perličkami potaženými streptavidinem. Interakce mezi biotinem a streptavidinem pak umožní, aby plazmid byl izolován pomocí magnetické separace perliček a následné eluce. Avšak i tento způsob má některé nevýhody. Konkrétně, dvě po sobě následující specifické interakce jsou potřebné, a sice první mezi oligonukleotidem a plazmi2o dem a druhá mezí biotinylovaným komplexem a streptavidinem potaženými perličkami. A dále, konečný roztok může být kontaminován biotinylovaným i oligonukleotidy, které však nesmějí být ve farmaceutickém přípravku.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje nový, zlepšený způsob purifikace DNA s využitím tohoto typu interakce. Způsob podle vynálezu užívá zejména oligonukleotidy kovalentně navázané (kondenzované) na nosič. Takový způsob purifikace je obzvláště rychlý a poskytuje i obzvláště vysoké výtěžky a stupeň čistoty. Navíc umožňuje purifikovat DNA z komplexní směsi, která obsahuje konkrétně další nukleové kyseliny, proteiny, endotoxiny (jako jsou například lipopoiysacharidy), nukleázy apod. Použitý nosič může kromě toho být snadno recyklován a DNA získaná způsobem podle vynálezu vykazuje zlepšené vlastnosti z hlediska farmaceutické bezpečnosti. A nakonec, na rozdíl od způsobů ve stavu techniky, způsob podle vynálezu představuje pouze jediný krok.
První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu purifikace dvojřetězcové (tj. dvojšroubovicové) DNA, který spočívá v tom, že je roztok obsahující DNA smíchanou s dalšími složkami filtrován přes nosič, na který je kovalentně navázán (kondenzován) olígonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici pomocí hybridizace se specifickou sekvencí přítomnou v DNA. Přitom speci40 fleká sekvence může být sekvence přirozeně přítomná ve dvojřetězcové DNA nebo umělá sekvence vnesená do DNA umělým způsobem.
Oligonukleotidy použité v předkládaném vynálezu jsou oligonukleotidy, které hybrídizují přímo s dvoj řetězcovou DNA. Tyto oligonukleotidy mohou obsahovat následující báze:
- thymidin (T), který je schopen vytvářet triplety (trojice) s A.T dublety (dvojicemi, páry bází) ve dvojřetězcové DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859),
- adenin (A), který je schopen vytvářet triplety s A.T dublety ve dvojřetězcové DNA,
- guanin (G), který je schopen vytvářet triplety s G.C dublety ve dvojřetězcové DNA,
- protonovaný cytosin (C+), který je schopen vytvářet triplety s G.C dublety ve dvojřetězcové
DNA (Rajagopal et al., viz výše),
- uráčil (U), ktetý je schopen vytvářet triplety s A.U dublety nebo A.T dublety.
Výhodně, olígonukleotid podle předkládaného vynálezu obsahuje homopyrimidinovou sekvenci bohatou na cytosin a specifická sekvence přítomná v DNA je hornopurin-homopyrimidinová
sekvence. Přítomnost cytosinů umožňuje vytvořit trojšroubovici, která je stabilní v kyselém pH, kde jsou cytosiny protonovány, a je destabilizovaná v alkalickém pH, kde cytosiny jsou neutralizovány. Aby se mohla vytvořit trojšroubovice hybridizací, je důležité, aby oligonukleotid a specifická sekvence přítomná v DNA byly komplementární. Aby byl získán co nej lepší výtěžek a bylo dosaženo co nejlepší selektivity, oligonukleotid a specifická sekvence, které jsou použity ve způsobu podle předkládaného vynálezu, jsou plně komplementární. Mohou to být např. konkrétně oligonukleotid poly(CTT) a specifická sekvence poly(GAA). Jako příklad lze zmínit oligonukleotid mající sekvenci:
5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)7, SEKVENCE ID. Č. 1), io ve které báze GAGG netvoří trojšroubovici, ale umožňují, že oligonukleotid je vzdálen od spojovacího ramínka. Také lze uvést oligonukleotid mající sekvenci:
(CTT)7 (SEKVENCE ID. Č. 26).
Tyto oligonukleotidy jsou schopny vytvářet trojšroubovici se specifickou sekvencí obsahující komplementární jednotky (GAA). Požadovaná specifická sekvence pak může konkrétně být úsek obsahující 7, 14 nebo 17 GAA jednotek, jak je popsáno v příkladech.
Další sekvence, které jsou zajímavé z hlediska předkládaného vynálezu je specificky následující sekvence:
5'-Λ AGGG AGGG AGGAGAGG A A-3 (SEKVENCE ID. Č. 5). io Tato sekvence vytváří trojšroubovici s oligonukleotidy
5AAGGAGAGGAGGGAGGGAA3 (SEKVENCE ID. Č. 6) nebo 5 -TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 7).
V tomto případě se oligonukleotid váže v antiparalelní orientaci k polypurinovému řetězci. Tyto trojšroubovice jsou stabilní pouze v přítomnosti Mg2+ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34,
7243 až 725 í, Beal a Dervan, Science, 1991,251, 1360 až 1363).
Jak již bylo uvedeno výše, specifická sekvence může být sekvence přirozeně přítomná v dvojřetězcové DNA nebo umělá sekvence do DNA vnesená uměle. Zvláště výhodný je podle předklá30 daného vynálezu oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici se sekvencí přirozeně přítomnou v dvoj řetězcové DNA, například v replikačním počátku plazmidu nebo v markerovém genu.
V této souvislosti původce prováděl analýzy plazmidových sekvencí, a ukázal, že některé úseky těchto DNA, konkrétně v replikačním počátku, mohou obsahovat homopurin—homopyrimídinové úseky. Syntéza oligonukleotidu, které jsou schopné vytvářet trojšroubovici těmito přírodními homopurin—homopyrimidinovými úseky, výhodně umožňuje, aby byl způsob podle předkládaného vynálezu aplikován na nemodifikované plazmidy, konkrétně komerčně dostupné plazmidy typu pUC, pBR322, pSV apod. K homopurin-homopyrimidinovým sekvencím přirozeně přítomným v dvoj řetězcové DNA patří například sekvence obsahující celou nebo část sekvence: 5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEKVENCE ID. Č. 2), přítomné v replikačním počátku plazmidu E. coli ColEl. V tomto případě oligonukleotid vytvářející trojšroubovici má sekvenci:
-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (SEKVENCE ID. Č. 3) a váže se střídavě ke dvěma řetězcům dvoj šroubo vice, jak bylo popsáno v Beal and Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976 až 4982) a Jayasena and Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279 až 5288). Také lze uvést sekvenci:
-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEKVENCE ID. Č. 4) z genu β-laktamázy z plazmidu pBR322 (Duval-Valentin et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504 až 508).
Dvě další cílové sekvence, které mohou vytvářet trojšroubovicové struktury s konkrétními oligonukleotidy byly identifikovány v replikačních počátcích ColEl a pCOR. Plazmidy odvozené
- 3 CZ 303086 B6 z ColEl obsahují homopurinový 12-mer (mající sekvenci 5-AGAAAAAAAGGA-3' SEKVENCE ID. Č. 27) ležící v protisměru („upstream“) od RNA-Π transkriptu účastnícího se v replikaci plazmidu (Lacatena et al., 1981, Nátuře, 294, 623). Tato sekvence vytváří stabilní trojšroubovicovou strukturu s komplementárním 12-memím oligonukleotidem se sekvencí 5'5 TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28). Kostra pCOR obsahuje homopurinový úsek 14 nerepetitivních bází se sekvencí (5-AAGAAAAAAAAGAA-3) (SEKVENCE ID. Č. 29) lokalizovaný v A+T bohatém segmentu v počátku replikonu pCOR (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Tato sekvence vytváří stabilní trojšroubovicovou strukturu s komplementárním 14-merním oligonukleotidem sekvence 5-TTC TTTTTTTTCTT-3' (SEKto VENC E ID. Č. 30). Odpovídající oligonukíeotidy 5 -TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) a 5 -TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) účinně a specificky zacilují své odpovídající komplementární sekvence lokalizované v replikačním počátku ColEl ori nebo pCOR (oři γ). Skutečně jednoduchá nekanonická triáda (T*GC nebo C*AT) může vést k úplné destabilizaci trojšroubovicové struktury.
Použití oligonukleotidu schopného vytvořit trojšroubovici se sekvencí přítomnou v replikačním počátku nebo markerovém genu je obzvláště výhodné, jelikož to umožňuje pomocí stejného oligonukleotidu purifi kovat jakoukoliv DNA obsahující uvedený počátek replikace nebo uvedený mar keřový gen. Tudíž není nutné modifikovat plazmid nebo dvoj řetězcovou DNA, aby do ní byla
2o vložena umělá specifická sekvence.
Přestože plně komplementární sekvence jsou výhodné, je zřejmé, že některé neshody („mismatches“) mohou být tolerovány mezi sekvencí oligonukleotidu a sekvencí přítomnou v DNA, pokud nevedou k příliš velké ztrátě afinity. Např. lze uvést sekvenci 5-AAAAAAGG25 GAATAAGGG-3' (SEKVENCE ÍD. Č. 8) přítomnou v genu β-laktamázy v E. coli. V tomto případě thymin, který přerušuje polypurinovou sekvenci může být rozpoznáván guaninem třetího řetězce, čímž se vytvoří G*TA triplet, který je stabilní, když je obklopen dvěma triplety T*AT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829 až 2834).
V konkrétním výhodném provedení vynálezu oligonukíeotidy obsahují sekvence (CCT)n, sekvence (CT)n nebo sekvence (CTT)n, kde n je celé číslo 1 až 15, včetně. Zvláště výhodné je použití sekvence typu (CT)n nebo (CTT)n. Původce vynálezu ukázal, že výtěžek purifikace byl ovlivněn množstvím (počtem) C v oligonukleotidu. Konkrétně, jak je ukázáno v příkladu 7, výtěžek purifikace se zvyšuje, když oligonukleotid obsahuje méně cytosinů. Je jasné, že oligonukíeotidy podle vynálezu mohou také kombinovat (CCT), (CT) nebo (CTT) jednotky.
Oligonukíeotidy podle vynálezu mohou být přírodní (složené z nemodifikovaných přírodních bází) nebo chemicky modifikované. Zejména oligonukíeotidy mohou výhodně obsahovat určité chemické modifikace, které jim poskytují rezistenci k nukleázám nebo zesilují ochranu proti nukleázám nebo zvyšují afinitu pro specifickou sekvenci.
Oligonukleotid podle předkládaného vynálezu znamená také jakýkoliv sled nukleosidů, ve kterém byla modifikována kostra s cílem, aby byl odolnější vůči nukleázám. K takovým modifikovaným oligonukleotidům patří fosforothioátové oligonukíeotidy, které jsou schopné vytvářet trojšroubovice s DNA (Xodo et al., Nucleic Acids. Res., 1994, 22, 3322 až 3330), a také oligonukleotidy obsahující formacetálovou nebo methylfosfonátovou kostru (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 1 13, 7767 až 7768). Je také možné použít oligonukíeotidy syntetizované s aanomery nukleotidů, které také vytvářejí trojšroubovici s DNA (Le Doan et al, Nucleic Acids, Res., 1987, 15, 7749 až 7760). Další modifikací kostry je fosforamidátová vazba, kterou popsali
Gryaznov and Chen, poskytuje oligonukíeotidy vytvářející obzvláště stabilní trojšroubovici s DNA (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143 až 3144). K dalším modifikacím kostry patří použití ribonukleotidů, 2'-O-methylribózy, fosfod i esterů apod. (Sun and Héléne, Curr. Opin ion Struct. Biol., 116, 3143 až 3144). A nakonec lze uvést, že kostra založená na fosforu může být nahrazena polyamidovou kostrou, jako je tomu v případě PNA (peptidové nukleové kyseliny), které mohou také vytvářet trojšroubovici (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 až 1500, Kim et al.,
-4CZ 303086 B6
J. Am. Chem. Soc., 1993,115, 6477 až 6481), nebo kostrou založenou na guanidinu, jako je tomu u DNG (deoxyribonukleoguanidin, viz Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92. 6097 až 6101), nebo polykat iontový mi analogy DNA, které také mohou vytvářet trojšroubovici.
Thymin třetího řetězce může také být nahrazen 5-bromuracilem, který zvyšuje afinitu oligonukleotidu pro DNA (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059 až 3061). Třetí řetězec může také obsahovat jiné než přírodní báze, ke kterým patří například 7—deaza-2'-deoxyxanthosin (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327 až 333), l-(2-deoxy {p-D-ribofuranosyl)-3~methyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-on (Koh and Dervan. T. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470 až 1478), 8-oxoadenin, 2—aminopurin, 2'-O-methylpseudoisocytidin nebo jakékoliv další modifikace, které jsou odborníkům známy (pro přehled viz Sun and Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345 až 356).
Další typy modifikací oligonukleotidů mají za cíl zvláště zlepšení interakce a/nebo afinity mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. Nej výhodnější modifikací podle vynálezu je methylace cytosinového oligonukleotidů (viz Příklad 5). Oligonukleotidy takto methylované mají významnou vlastnost, a sice že vytvářejí stabilní troj Šrouboví co vou strukturu se specifickou sekvencí při pH blízkém neutrálnímu (> 5). To tedy umožňuje pracovat pri vyšších pH hodnotách, než co umožňovaly oligonukleotidy ze stavu techniky, jinými slovy při takových pH hodnotách, kdy riziko degradace plazmidové DNA je mnohem menší.
Délka oligonukleotidů výhodného pro použití ve způsobu podle vynálezu je alespoň 3 báze a výhodněji 5 až 30 bází. Výhodně se užívá oligonukíeotid délky větší než 10 bází. Délku si může odborník snadno upravit pro každý jednotlivý případ podle požadované selektivity a stability interakce.
Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány jakoukoliv známou technikou. Konkrétně mohou být připraveny užitím syntetizátorů nukleových kyselin. Ale samozřejmě mohou být užity jakékoliv další způsoby odborníkovi známé.
Aby byla možná kovalentní vazba na nosič, oligonukíeotid podle vynálezu je obecně funkctonalizován. Tedy je modifikován thiolovou, aminovou nebo karboxylovou terminální skupinou na 5' nebo 3' konci. Konkrétně přidání thiolové, aminové nebo karboxylové skupiny umožňuje například kondenzací oligonukleotidů na nosič nesoucí dtsulfidovou, maleimidovou, aminovou, karboxylovou, esterovou, epoxidovou, bromkyanovou nebo aldehydovou skupinu. Ke kondenzaci dochází tím, že se vytvářejí disulfidické, thioetherové, esterové, amidové nebo aminové vazby mezi oligonukleotidem a nosičem. Samozřejmě může být použit jakýkoliv další způsob odborníkovi známý, jako je například použití bifunkčního kondenzačního činidla.
Navíc, aby se zlepšila hybridizace s kondenzovaným oligonukleotidem, může být výhodně použit oligonukíeotid obsahující sekvenci bází zvanou „raménko“ („arm“) a „oddělovač“ („spacer). Použití raménka umožňuje, aby se oligonukíeotid navázal ve zvolené vzdálenosti na nosič, což zlepšuje podmínky interakce s DNA. Raménko výhodně sestává z lineárního uhlíkového řetězce, obsahujícího 1 až 18, a výhodně 6 nebo 12 skupin (CH2), a aminovou skupinu, která dovoluje vazbu na kolonu (nosič). Raménko je navázáno na fosfát oligonukleotidů nebo „spaceru“, který je složen z bází, které ne interferuj i s hybridizaci. Tedy „spacer“ může obsahovat purinové báze. Jako příklad lze uvést „spacer“ obsahující sekvenci GAGG. Raménko výhodně sestává z lineárního řetězce obsahujícího 6 nebo 12 atomů uhlíku.
Pro realizaci předkládaného vynálezu mohou být použity různé typy nosičů. Mohou to být funkcionalizované chromatografieké nosiče, volné nebo naplněné v koloně, funkcionalizované povrchy plastů nebo funkcionalizované chromatografické nosiče, volné nebo naplněné v koloně, funkcionalizované povrchy plastů nebo funkcionalizované latexové perličky, magnetické nebo jiné. Výhodně jsou použity chromatografické nosiče. Tak například jako chromatografické nosiče může být využita agaróza, akiylamid nebo dextran, a také jejich deriváty (jako je například
-5 CZ 303086 B6
Sephadex, Sepharose, Superose atd.), polymery jako je například poly(styren/divinylbenzen) nebo například „roubované“ nebo „neroubované“ křemičitany. Chromatografická kolona pak může pracovat difúzním nebo perfúzním způsobem.
Pro dosažení lepšího výtěžku purifikace je obzvláště výhodné použít na plazmidu sekvenci obsahující několik pozic hybridizujících s oligonukleotidem. Přítomnost několika hybridizujících pozic vede ke stimulaci interakce mezi danou sekvencí a oligonukleotidem, což vede ke zlepšení výtěžku purifikace. Tedy pro oligonukleotid obsahující n opakování (repetic) motivů (CCT), (CT) nebo (CTT), je výhodné použití DNA sekvence obsahující alespoň n komplementárních io motivů, a výhodně n+1 komplementárních motivů. Sekvence nesoucí n+1 komplementárních motivů umožňuje dvě pozice hybridízace s oligonukleotidem. Výhodně DNA sekvence obsahuje až 11 hybridizačních pozic, tedy n+10 komplementárních motivů.
Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit k purifikaci jakéhokoliv typu dvojřetěz15 cové DNA. Například kruhové DNA, jako je například plazmid, obecně nesoucí jeden nebo více genů, které mají terapeutický význam. Plazmid může také nést počátek replikace, markerový gen apod. Způsob podle vynálezu může být aplikován přímo na buněčný lyzát. V takovém provedení, plazmid amplifikovaný pomocí transformace a následně v buněčné kultuře, je purífikován přímo po lýze buněk. Způsob podle vynálezu může také být aplikován na čiré lyzáty, tedy na supema2o tant získaný po neutralizaci a centrifugací buněčného lyzátu. Může být také samozřejmě aplikován na roztok prepurifikovaný některou ze známých metod. Způsob podle předkládaného vynálezu také umožňuje, aby byla lineární nebo kruhová DNA nesoucí požadované sekvence purifikována ze směsi obsahující různé DNA s odlišnými sekvencemi. Způsob podle vynález může také být použit pro purifikaci dvoj řetězcové DNA.
Buněčný lyzát může být lyzát z prokaryotických nebo eukaryotických buněk.
Jako příklady vhodných prokaryotických buněk lze uvést bakterie E. coli, B. subtilis, S. typhimurium nebo Streptomyces. Pokud jde o eukaryotické buňky, jako příklady lze zmínit živočišné buňky, kvasinky, houby apod., obzvláště pak kvasinky Kluyveromyces nebo Sacharomyces nebo buňky COS, CHO, Cl27, NIH3T3, apod.
Způsob podle vynálezu je obzvláště výhodný, neboť umožňuje získat velmi rychle a velmi jednoduše plazmidovou DNA ve vysoké čistotě. Konkrétně, jak je ilustrováno v příkladech, způsob podle vynálezu umožňuje oddělit požadovanou plazmidovou DNA účinně od kontaminujících složek, jako jsou například fragmenty chromozomové DNA, endotoxiny, proteiny, nukleázy apod. Obzvláště pak způsob podle vynálezu umožňuje přípravu dvojřetězcové DNA, konkrétně DNA plazmidového původu, mající obsah chromozomové DNA nižší nebo nejvýše rovný 0,5 %. Ještě výhodněji DNA preparáty získané způsobem podle vynálezu měly obsah chromozomové
DNA nejvýše 0,2 %.
Tedy předkládaný vynález popisuje přípravky obsahující plazmidovou DNA, která může být použita farmaceuticky, konkrétně v genové nebo buněčné terapii. V této souvislosti předmětem vynálezu je i farmaceutický přípravek obsahující dvoj řetězcovou DNA, lineární nebo plazmido45 vého původu, připravenou způsobem popsaným výše.
Předkládaný vynález se tedy také týká preparátu plazmidové DNA mající obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,5 %, výhodně menší nebo rovný 0,2 %, a ještě výhodněji menší nebo rovný 0,1 %, a nejvýhodněji menší nebo rovný 0,01 %. Jak je podrobněji uvedeno v příkladech níže, krok trojšroubovicové afinitní interakce byl zaveden do puriflkačního procesu založeného na klasických chromatografických krocích. Tento afinitní krok významně zlepšuje čistotu takto získaných plazmidových preparátů, bez ohledu na jejich počáteční čistotu. Vytvoření trojšroubovicové struktury mezi oligonukleotidem (kovalentně navázaným na chromatografickém nosící) a požadovaným plazmidem, který má být purífikován, je založeno na přítomnosti sekvence v plazmidu, která může vytvářet s oligonukleotidem troj šrouboví co vou strukturu. Tato trojšrou-6CZ 303086 B6 bovicová struktura je stabilní pouze v kyselém pH, kde cytosinové oligonukleotidy jsou protonovány. Pak je plazmidová DNA eluována z kolony jednoduše zvýšením pH na neutrální hodnotu.
Přípravky mohou obsahovat plazmidovou DNA, která je bez jakéhokoliv nosiče, je tzv. „ nahá“, nebo je spojená s transportním nosičem, jako jsou například liposomy, nanočástice, kationtové lipidy, polymery, rekombinantní viry nebo proteiny apod.
V jednom provedení vynálezu byl být způsob podle vynálezu použit k purifi kován i jednoho typu dvoj řetězcové DNA ze směsi obsahující dva nebo více odlišných typů dvoj řetězcové DNA s odlišnými sekvencemi. Takový způsob může být aplikován přímo na buněčný lyzát, kdy plázni id amplifikovaný pomocí transformace a následně v buněčné kultuře, je purifikován přímo po lýze buněk. Způsob podle vynálezu může také být aplikován na čirý lyzáty, tedy na supematant získaný po neutralizaci a centrifugací buněčného lyzátu. Způsob podle vynálezu může být samozřejmě také užit na roztok, který byl prepuri ti kován.
Přesněji řečeno, způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první a druhou dvojřetčzcovou DNA, obsahuje (i) průchod roztoku přes první nosič obsahující kovalentně kondenzovaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetčzcovou DNA hybrid i žací se specifickou sekvencí v této DNA, (i i) získání roztoku, který prošel přes první nosič, a který je obohacen o nenávaznou první dvoj řetězcovou DNA, a (iii) průchod získaného roztoku přes druhý nosič obsahující kovalentně kondenzovaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici hybridi žací se specifickou sekvencí v první dvojřetězcové DNA. Po volitelném kroku promytí je první dvojřetězcová DNA eluována z druhého nosiče. Využitím tohoto způsobu dvojité purifikace může být získána první dvojřetězcová DNA z druhého nosiče bez jakékoliv detekovatelné hladiny druhé dvojřetězcové DNA.
Ve specifickém provedení předkládaného vynálezu je první dvojřetězcová DNA molekula plazmid pCOR mající specifickou sekvenci:
AAGAAAAAAAAGAA -3' (SEKVENCE ID. Č. 29), která tvoří stabilní trojšroubovicovou strukturu s oligonukleotidem majícím sekvenci:
-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30).
Druhá dvojřetězcová DNA molekula je plazmid odvozený z plazmidu ColEl obsahující specifickou sekvenci:
AGAAAAAAAGGA-3 (SEKVENCE ID. Č. 27), která tvoří trojšroubovicovou strukturu s oligonukleotidem majícím sekvenci:
5-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28).
Tudíž s využitím způsobu dvojité purifikace podle předkládaného vynálezu je plazmid pCOR výhodně purifikován z roztoku obsahujícího další plazmidy, jako jsou například plazmidy odvozené z plazmidy ColEl.
Předkládaný vynález bude ještě podrobněji popsán v následující části přihlášky, obsahující příklady, které je třeba považovat za ilustrativní a neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Obecné metody klonování a molekulární biologie použité v příkladech
Tradiční metody molekulární biologie, jako je například štěpení restrikčními enzymy, gelová elektroforéza, transformace E. coli, precipítace nukleových kyselin apod., jsou popsány v odborné literatuře (viz např. Maniatis et al., Τ., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular
-7CZ 303086 B6
Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecuiar biology 1987 až 1988. John Wiley and Sons, New York.). Nukleotidové sekvence byly stanoveny metodou termi5 nace prodlužování řetězce podle publikovaného protokolu (Ausubel et al., 1987).
Restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy New England Bioiabs, Beverly, MA (Biolabs).
K provedení ligace byly DNA fragmenty inkubovány v pufru obsahujícím 50 mM Tris-HCl, iu pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP, v přítomnosti DNA ligázy z fága T4 (Biolabs).
Oligonukleotidy byly syntetizovány chemickou syntézou s použitím fosforamiditů, kdy fosforamidity byly chráněny β poloze kyanoethylovou skupinou (Sínha, N. D., J. Biemat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethylN,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of
DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the finál product. Nucl. Acids Res., 12, 4539 až 4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.). Pro syntézu byl užit automatický DNA syntetizátor Biosearch 8600 podle návodu výrobce.
2o Ligo vaně DNA nebo DNA, které byly testovány na účinnost transformace, byly užity k transformaci následujícího kmene kompetentních buněk:
E. coli DH5a ÍF/endAl, hsdR17, supE44, thi—1, recA1, gyrA96, relAl, Δ (lacZYA-arqF)U169, deoR, O80dlac lacZAM15)] (projakýkoliv plazmid ColEl), nebo
E. coli XAC-pir (pro jakýkoliv plazmid odvozený z plazmidu pCor).
Minipreparace plazmidové DNA byla prováděna podle protokolu Kleina et al., 1980.
Pro kultivaci kmenů E, coli bylo užito médium LB (Maniatis et al., 1982). Kmeny byly inkubovány ve 37 °C. Bakterie byly naneseny na misky s LB médiem s přídavkem vhodného antibio30 tiká.
Příklad 1
1.1. Příprava kolony
Kolona, která byla použita, byla 1 ml HiTrap kolona aktivované NHS (N-hydroxysukinimidem, Pharmacia) připojená k peristaltické pumpě (výstup < 1 ml/min.). Použitý specifický oligonukleotid obsahoval NH2 skupinu na 5' konci, a měl následující sekvenci:
w 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 1)
V příkladu byly užity následující pufry:
Kondenzační (vazebný) pufr: 0,2 M NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3.
Pufr B: 0,1 M acetát, 0,5 M NaCl, pH 4.
Postup
Kolona byla promyta 6 ml 1 mM HCI a oligonukleotid naředěný kondenzačním pufřem (50 nmol v 1 ml) byl pak nanesen na kolonu a ponechán po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta třikrát 6 ml pufru A a pak 6 ml pufru B. Oligonukleotid byl takto navázán kovalentně na kolonu prostřednictvím CONH vazby. Kolona byla uložena ve 4 °C v PBS, 0,1 % NaN3 a může být použita alespoň čtyřikrát.
-8CZ 303086 B6
1.2. Konstrukce plazmidu
Následující dva oligonukleotidy byly syntetizovány. Oligonukleotid 4817 (SEKVENCE ID.
Č. 9):
5-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3' Oligonukleotid 4818 (SEKVENCE ID. Č. 10):
5-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG3' io
Tyto oligonukleotidy, když jsou hybridizovány a klonovány do plazmidu. vnášejí homopurin— homopyrimidinovou sekvenci (GAA)17 (SEKVENCE ID. Č. 33) do odpovídajícího plazmidu, jak bylo popsáno výše.
i5 Sekvence odpovídající těmto dvěma hybridizovaným oligonukleotidům byla klonována do víceěetného klonovacího místa plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), který nese gen rezistence k ampicilinu. Pro tento účel byly oligonukleotidy hybridizovány následujícím způsobem: jeden pg každého oligonukleotidů byl vnesen do 40 μί pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2. Tato směs byla zahřívána na 95 °C a pak byla přenesena do teploty místnosti, kdy teplota směsi pomalu klesala. Deset ng směsi hybridizovaných oligonukleotidů bylo ligováno s 200 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolia CA) naštěpeným BamHI a EcoRl v 30 μί objemu. Po ligací byl alikvot reakční směsi transformován do DH5ct. Transformační směs byla nanesena na misky s L médiem s přídavkem ampicilinu (50 mg/1) a X-gal (20 mg/1). Rekombinantní klony by měly projevit absenci modrého zabarvení na
2? tomto médiu, na rozdíl od rodičovského plazmidu (pBKS+). který dovoluje ct-komplementaci fragmentu ω z β—galaktozidázy E. coli. Po minipreparaci plazmidové DNA ze 6 klonů, všechny vykazovaly zmizení Pstl místa lokalizovaného mezi EcoRl a BamHI místy pBKS+ a zvýšení molekulární hmotnosti 448—bp Pvull pásu obsahující vícecetné klonovací místo. Jeden klon byl vybrán a odpovídající plazmid byl nazván pXL2563. Klonovaná sekvence byla verifikována sekw věncováním s použitím primeru -20 (5 -TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEKVENCE ID. Č. 11)) (Viera J. a J. Messing. 1982. pUC plasmids, M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259 až 268) pro plazmid pBKS+ (Stratagene Cloning Systeme, La Jolla CA). Plazmid pXL2563 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep Kit (Promega Corp. Madison, WT) podle protokolu výrobce. Tento preparát plazmidové DNA byl pak použit v následujících příkladech.
1.2. Purifikace plazmidu
Vybavení
Plazmid pXL2563 (popsaný v části 1.2) byl purifikován na HiTrap koloně s kondenzovaným oligonukleotidem, jak bylo popsáno v části 1.1., z roztoku, který také obsahoval plazmid pBKS+. Pufry použité při této purifíkaci byly následující:
Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.
Pufr Ε: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Postup
Kolona byla promyta 6 ml pufru F a plazmidy (20 pg pXL2563 a 20 pg pBKS+ ve 400 pl pufru F) byly naneseny na kolonu a inkubovány po dobu 2 hodin pří teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Plazmidy byly detekovány po elektroforéze na 1% agarózovém gelu po obarvení ethidiumbromidovém barvení. Podíl plazmidu v roztoku byl stanoven pomocí měření jejich transformační aktivity na E. coli.
-9CZ 303086 B6
Výsledky
Z výchozí směsi obsahující 30 % pXL2S63 a 70 % pBKS+ byl na výstupu z kolony získán roztok obsahující 100 % pXL2563. Čistota stanovená pomocí poměru OD pri 260 a 280 nm stoupla z hodnoty 1,9 na 2?5, což ukazuje, že kontaminující proteiny byly tímto způsobem odstraněny.
Příklad 2
2.1. Popis purifikace plazmidové DNA
Kondenzace oligonukleotidu (SEKVENCE ID. Č. 1: 5 -GAGGCTTCTFCTTCTTCTTCTTCTT-3' na kolonu byla provedena jak bylo popsáno v příkladu 1. Pro kondenzaci byl oligonukleotid modifikován na 5' konci aminoskupinou navázanou k fosfátovému spaceru pomocí raménka obsahujícího 6 atomů uhlíku (Modified Oligonucleotides Eurogentec SA, Belgium). Plazmid pXL2S63 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podle protokolu výrobce. Pufry použité v tomto příkladu byly následující:
Pufr F: 0 až 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.
Pufr E: 1 M TrisHCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolona byla promyta 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidů pXL25563 naředěného ve 400 μΐ pufru F bylo naneseno na kolonu a inkubováno po dobu l hodiny pri teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Byl měřen obsah genomové nebo chromozomové DNA E. coli přítomné ve vzorcích plazmidů před a po průchodu kolonou s oligonukleotidem. Plazmid byl kvantifikován měřením optické denzity při 260 nm.
V tomto příkladu bylo navázání provedeno v pufru, jehož molarita, pokud jde o NaCl, se měnila od 0 do 2 M (pufr F). Výtěžek purifikace se snižoval, když se snižovala molarita NaCl. pH vazebného pufru se může měnit v rozmezí 4,5 až 5, přičemž výtěžek purifikace je lepší pri 4,5. Je také možné použít jiný eluční pufr s bazickým pH: eluce v takovém případě byla provedena pufrem obsahujícím 50 mM borát, pH 9, a 0,5 mM EDTA.
2.2, Kondenzace oligonukleotidu
Kondenzace oligonukleotidu (SEKVENCE ID. Č. 1: 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3') na kolonu byla provedena jak bylo popsáno v příkladu 1. Plazmid pXL2S63 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podle protokolu výrobce. Pufry použité v tomto příkladu byly následující:
Pufr F: 0,1 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 5.
Pufr E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Kolona byla promyta 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidů pXL2563 naředěného ve 400 μΐ pufru F bylo naneseno na kolonu a inkubováno po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Byl měřen obsah genomové nebo chromozomové DNA £. coli přítomné ve vzorcích plazmidů před a po průchodu kolonou s oligonukleotidem. Genomová DNA byla kvantifikována pomocí PCR s použitím primerů pro gen galK z E. coli podle následujícího protokolu:
Sekvence primerů byly popsány v Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841 až 1853):
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEKVENCE ID. Č. 24), a 5-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEKVENCE ID. Č. 25).
- 10CZ 303086 B6
Reakční médium obsahovalo v 25 μΐ PCR pufru (Promega France, Charbonniéres): 1,5 mM MgCb, 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay), 0,5 μΜ primery, 20 U/ml Taq polymerázy (Promega). Reakce byla prováděna v následujících krocích:
- 5 minut v 95 °C
- 30 cyklů: 10 sekund v 95 °C, 30 sekund v 60 °C, 1 minuta v 78 °C
- 10 minut v 78 °C.
Amplifikovaný DNA fragment velikosti 124 párů bází byl separován elektroforézou na 3% agarózovém gelu v přítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) a pak kvantifikován vtažením k referenční čisté genomové DNA, Sigma, katalog. Č. D4889).
Ve vzorku nanášeném na kolonu byl obsah chromozomové DNA 1 %, zatímco ve vzorku po puriťikaci na oligonukleotidové koloně byl obsah chromozomové DNA 0,2 %.
Příklad 3
Purifikace z Čirého lyzátu
Tento příklad popisuje purifikaci plazmidové DNA z čirého lyzátu bakteriální kultury, a sice v tzv. „minipreparačním“ měřítku: 1,5 ml kultury kmenu DH5a obsahujícího plazmid pXL2563 po kultivaci přes byl stočen a pelet byl resuspendován ve 100 μΐ pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Bylo přidáno 200 μΐ 0,2 M NaOH, 1 % SDS, zkumavky pak byly promíchány obracením, pak bylo přidáno 150 μΙ 3 M acetátu draselného, pH 5, a zkumavky pak byly opět promíchány obracením. Po centrifugací byl odebrán supematant a nanesen na kolonu s oligonukleotidem připravenou jak bylo popsáno v příkladu 1 navázání, promývání a eluce byly shodné jako v příkladu 1. Přibližně 1 μg plazmidu byl izolován z 1,5 ml kultury. Získaný plazmid byl analyzován elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem, přičemž výsledkem byl jediný pás „nadšroubovicové“ kruhové DNA. Žádné stopy vysokomolekulární (chromozomové) DNA nebo RNA nebyl detekovatelné v plazmidu puntíkovaném tímto způsobem. Poměr optických denzit ve 260 a 280 nm byl vyšší než 2.
Příklad 4
4.1.
Tento příklad popisuje purifikaci plazmidové DNA prováděnou ve stejných podmínkách jako v příkladu 3, přičemž výchozím materiálem bylo 20 ml bakteriální kultury kmenu DH5a obsahujícího plazmid pXL2563. Buněčný pelet byl odebrán do 1,5 ml pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Lýze byla provedena 2 ml 0,2 M NaOH, 1 % SDS a následná neutralizace 1,5 ml 3 M acetátu draselného, pH 5. DNA pak byla precipitována 3 ml 2-propanolu a pelet byl pak rozpuštěn v 0,5 ml pufru: 0,2 M acetát sodný, pH 5, 0,1 M NaCl, a nanesen na kolonu s oligonukleotidem připravenou jak bylo popsáno v příkladu 1. Navázání, promytí kolony a eluce byla prováděny shodně jako v příkladu 1, s výjimkou toho, že promývací pufr měl molaritu, pokud jde o NaCl, 0,lM. Přibližně 16 pg plazmidové DNA bylo získáno. Získaný plazmid byl analyzován elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem, přičemž výsledkem byl jediný pás „nadšroubovicové“ kruhové DNA. Žádné stopy vysokomolekulámí (chromozomové) DNA nebo RNA nebyl detekovatelné v plazmidu puntíkovaném tímto způsobem. Štěpení plazmidu restrikčními enzymy poskytlo jediný pás odpovídající očekávané velikosti 3 kilobáze. Koncentrace proteinů ve vzorcích se snížila ze 125 pg/ml u čirého lyzátu na méně než l pg/ml v purifikovaném plazmidu (Micro-BCA test, Pierce). Koncentrace endotoxinu, stanovená pomocí testu LAL (Biosepra) byla až lOx nižší v purifikovaném plazmidu ve srovnání s čirým lyzátem.
- 11 CZ 303086 B6
4.2.
Použitý plazmid obsahuje kazetu obsahující cytomegalo virový promotor, gen kódující luciferázu a homopurinhomopyrimidinovou sekvenci (GAA)]7 (SEKVENCE ID. Č. 33) pocházející z plazmidu pXL2563. Kmen DH1 (Maniatis et al., 1989) obsahující tento plazmid byl kultivován 7 litrovém fermentoru. Čirý lyzát byl připraven z 200 gramů buněk: buněčný pelet byl resuspendován ve 2 litrech pufru: 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glukóza, 10 mM EDTA, ke kterému pak byly přidány 2 litry pufru: 0,2 M NaOH, 1 % SDS. Lyzát byl neutralizován přidáním 1 litru 3M acetátu draselného. Po diafiltraci byly 4 ml zahuštěného lyzátu naneseny na 5 ml HiTrap-NHS io kolonu s navázaným oligonukleotidem majícím sekvenci: 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' SEKVENCE [D. Č. 1), a sice způsobem popsaným v příkladu 1.1. pro mývání a eluce byly prováděny stejně jako v příkladu 1. Přibližně 400 mikrogramů plazmidu bylo získáno. Hladina genomové DNA v tomto vzorku, měřená technikou popsanou v příkladu 2.2, byla 0,1 %.
Příklad 5
Použití modifikovaného oligonukleotidu
2» Tento příklad popisuje použití oligonukleotidu nesoucího methylované cytosiny. Sekvence použitého oligonukleotidu byla následující:
5'-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMcCTTMeCTTMe-3ř (SEKVENCE ID. Č. 12)
Tento oligonukleotid má NH2 skupinu na 5' konci, MeC = 5-methylcytosin. Tento oligonukleotid umožňuje, že plazmid pXL2563 je purifikován v podmínkách příkladu 1 s vazebným pufrem pH 5 (riziko degradace plazmidu je tím sníženo).
Příklad 6
Ve výše uvedených příkladech použitý oligonukleotid je modifikován na 5'-konci aminoskupinou připojenou k fosfátu prostřednictvím raménka obsahujícího 6 atomů uhlíku: ΝΗ?-(Ε4Ε)ό V tomto příkladu je aminoskupina připojena k fosfátu 5-koncové části prostřednictvím raménka obsahujícího 12 atomů uhlíku: NH2-(CH2)i2.
Kondenzace oligonukleotidu a průchod kolonou jsou prováděny jak popsáno v příkladu 2 s pufrem F: 2M NaCI, 0,2M acetát, pH 4,5. Tento oligonukleotid umožňuje dosáhnout lepší výtěžky purifikace: je dosažen 53% výtěžek, zatímco s oligonukleotidem obsahujícím 6 atomů uhlíku je tento výtěžek 45 % za stejných podmínek.
Příklad 7
Při následování klonovací strategie popsané v příkladu 1.2, byly konstruovány další dva plazmidy 45 nesoucí homopurin-homopyrimidinové sekvence: plazmid pXL2725, který obsahuje sekvenci (GGA)|6, (sekvence id. č. 34) a plazmid pXL2726, který obsahuje sekvenci (GA)25 (sekvence id. Č. 35).
Příklad 7.1
Konstrukce plazmidu
Plazmidy pXL2725 a pXL2726, analogické k plazmidu pXL2563, byly konstruovány podle klo55 novací strategie popsané v příkladu 1.2, s použitím následujících párů oligonukleotidů:
- 12 CZ 303086 B6
5986: 5'-GATCC(GA)25GGG-3 5987: 5'-AATTCCC(TC)25G-3' 5981: 5'-GATCC(GGA)i7GG-3 5982: 5'-AATT(CCT)17CCG-3' (SEKVENCE ID. Č. 13) (SEKVENCE ID. Č. 14) (SEKVENCE ID. Č. 15) (SEKVENCE ID. Č. 16)
Pár oligonukleotidů 5986 a 5987 byl použit ke konstrukci plazmidu pXL2726 klonováním oligonukleotidů do míst BamHI a EcoRI z pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), zatímco oligonukleotidy 5981 a 5982 byl použity pro konstrukci plazmidu pXL2725. Byly použity stejné experimentální podmínky jako pro konstrukci plazmidu pXL2563 a byly změněny pouze páry oligonukleotidů. Podobně byly klonované sekvence ověřeny sekvencováním plazmidu. To umožnilo zjistit, že plazmid pXL2725 má modifikaci vzhledem k očekávané sekvenci: místo sekvence GGA opakované 17krát je zde GGAGA(GGA)15 (SEKVENCE ID. Č. 17).
Příklad 7.2
Příprava kolon a purifikace
Oligonukleotidy tvořící troj šroubovice s těmito ho mop uri novým i sekvencemi byly kondenzovány ke kolonám HiTrap podle techniky popsané v příkladu 1.1. Oligonukleotid sekvence 5 -AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 18) byl použit pro purifikaci plazmidu pXL2725 a oligonukleotid sekvence 5-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 19) byl použit pro purifikaci plazmidu pXL2726.
Dvě kolony takto získané umožnily, že odpovídající plazmidy byly purifikovany podle techniky popsané v příkladu 2 s následujícími pufry:
Pufr F: 2M NaCl, 0,2M acetát, pH 4,5.
Pufr Ε: 1M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.
Dosažené výtěžky byly 23 a 31 % pro pXL2725 a pXL2726, v daném pořadí.
Příklad 8
Tento příklad ilustruje vliv délky specifické sekvence přítomné v plazmidu na výtěžek purifikace.
Příklad 8.1
Konstrukce plazmidu
Reportérovy gen použitý v těchto experimentech k demonstraci aktivity přípravků podle vynálezu je gen kódující luciferázu (Luc).
Plazmid pXL2621 obsahuje kazetu obsahující cytomegalovirový (CMV) promotor o velikosti 661 bp, extrahovaný z pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) Štěpením restrikčními enzymy Mlul a Hindi11, klonovaným v protisměru od genu kódujícího luciferázu, do míst Mlul a HindlII, do základního vektoru pGL (Promega Corp., Madison, WI). Tento plazmid byl konstruován s použitím standardních technik molekulární biologie.
Plazmidy pXL2727-l a pXL2727-2 byly konstruovány následujícím způsobem:
- 13 CZ 303086 B6
Dva mikrogramy plazmid pXL2621 byly linearizovány s BamHI, enzym byl inaktivován ošetřením po dobu 10 minut v 65 °C, současně byly oligonukleotidy 6006 a 6008 hybridizovány, jak bylo popsáno pro konstrukci plazmidu pXL2563.
6006: 5-GATCT(GAA)|7CTGCAGATCT-3 (SEKVENCE ID. Č. 20)
6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC),7A-3' (SEKVENCE ID. Č. 21).
Tento hybridizační směs byla klonována na BamHI konce plazmidu pXL2621 a, po transformaci do DH5a, rekombinantní klony byly identifikovány Pstl enzymatickou restrikční analýzou, protože oligonukleotidy vnesly Pstl místo. Dva klony byly vybrány a nukleotidové sekvence klonovaného fragmentu byla ověřena s použitím primeru (6282, 5 -ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEKVENCE ID. Č. 22)) jako primeru pro sekvencování (Viera J. A J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259 až 268).
První klon (pXL2727-l) obsahuje sekvenci GAA opakovanou 1 Okřát. Druhý (pXL2727-2) obsahuje sekvenci 5—GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3 (SEKVENCE ID. Č. 23).
Příklad 8.2
Příprava kolon a purifikace
Byla použita kolona, jako je popsaná v příkladu 1 a byl kondenzován oligonukleotid 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 1).
Plazmid pXL2727-l nese 14 repetic sekvence GAA. Oligonukleotid popsaný výše, který obsahuje pouze 7 repetic odpovídající hybridizační sekvence CTT, může tudíž hybridizovat s plazmidem v 8 odlišných polohách. Plazmid pXL2727-2, na rozdíl od toho má hybridizující sekvenci (GAA)7 (SEKVENCE ID. Č. 36) stejné délky, jako je délka oligonukleotidu vázaného ke koloně. Tento oligonukleotid může tudíž hybridizovat pouze v jedné poloze na pXL2727-2.
Experiment je totožný s pokusem popsaným v příkladu 2, s následujícími pufry:
Pufr F: 2M NaCl, 0,2M acetát, pH 4,5.
Pufr E: IM Tris-HCl, pH 9, 0,5mM EDTA.
Výtěžek purifikace je 29 % s plazmidem pXL2727-l a 19 % s pXL2727-2.
Příklad 8.3
In vitro transfekce savčích buněk
Použité buňky byly NIH 3T3 buňky inokulované den před experimentem na 24—jamkové kultivační destičky v počtu 50 000 buněk/jamka. Plazmid je naředěn ve 150mM NaCl a smíchán s lipofektantem RPP115335. Byl použit poměr pozitivních nábojů lipofektantu/negativních nábojů DNA rovnající se 6. Směs byla vortexována, ponechána deset minut při teplotě místnosti, naředěna v médiu bez fetálního telecího séra, a pak přidána k buňkám v poměru 1 pg DNA na kultivační jamku. Po dvou hodinách ve 37 °C bylo přidáno 10% (objem/objem) fetální telecí sérum a buňky byly inkubovány po dobu 48 hodin ve 37 °C v přítomnosti 5% CO2. Buňky byly dvakrát promyty s PBS a luciferázová aktivita byla měřena podle popsaného protokolu (Promega kit, Promega Corp. Madison, WI) na luminometru Lumat LB9501 (EG a G Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-l, purifikovaný jak popsáno v příkladu 8.2, poskytl výtěžky transfekce dva- 14CZ 303086 B6 krát větší než byly výtěžky získané se stejným plazmidem purifíkovaným s použitím soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).
Příklad 9
Purifikace plazmidů odvozených z pCOR
Následující příklad ukazuje purifikaci plazmidů odvozených z pCOR s použitím trojšroubovicové io afinitní chromatografie. Bylo ukázáno, že tato technologie odstraňuje látky kontaminující nukleové kyseliny (konkrétně hostitelskou genomovou DNA a RNA) na stupeň, který by nebyl dosažen obvyklými chromatografickými metodami.
Trojšroubovicový afinitní gel byl syntetizován s použitím Sephacryl 5-1000 SF (Amersham15 Pharmacia Biotech) jako chromatografického nosiče (matrice). Sephacryl 5-1000 byl nejdříve aktivován jodistanem sodným (3mM, teplota místnosti, 1 hodina) v 0,2M acetátu sodném (pH 4,7). Pak byl oligonukleotid kondenzován přes svou 5'-NH2 koncovou skupinu k aldehydovým skupinám aktivovaného nosiče redukční aminaci v přítomnosti kyseliny askorbové (5 mM), jak bylo popsáno dříve pro kondenzaci proteinů (Homsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93,
83 až 88). Homopyrimidinový oligonukleotid použitý pro tyto experimenty (od firmy Eurogentec, purifikovaný HPLC) měl sekvenci, která byla komplementární ke krátké sekvenci 14-meru homopurinu (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3) (sekvence id. č. 29) přítomné v počátku replikace (oriy) plazmidu pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482 až 1488). Jak diskutováno výše, sekvence homopyrimidinového oligonukleotidu byla 5 '-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK25 VENCE ID. Č. 30).
Následující plazmidy byly podrobeny chromatografii: pXL3296 (pCOR bez transgenu, 2,0 kbp), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kbp), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ, 5,4 kbp) a pXL3397 (pCOR-Β delece FVIII, 6,6 kbp). Všechny io tyt plazmidy byly purifikovány dvěma kroky iontoměničové (aniontové) chromatografie z čirých lyzátů získaných jak bylo popsáno v příkladu 4. Plazmid pBKS+ (pBluescript II KS + od firmy
Stratagene), plazmid odvozený z ColEl, purifikovaný ultracentrífugac í v CsCl byl také studován. Všechny použité plazmidy byly v topologickém stavu nadšroubovice („supercoil“) (> 95 %).
V každém experimentu purifikace plazmidové DNA bylo 300 pg plazmidové DNA v 6 ml 2M NaCl, 0,2M acetátu draselném (pH 5,0) naneseno při průtokové rychlosti 30 cm/h na afinitní kolonu obsahující výše uvedený oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30). Po promytí kolony 5 objemy stejného pufru byl vázaný plazmid eluován s 1M Tris/HCl, 0,5mM EDTA (pH 9,0) a kvantifikován UV (260 nm) a iontoměničovou chromatografii s kolonou Millipore Gen-Pak (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26 až 37). Výtěžky plazmidů ve sbíraných frakcích byly 207 pg pro pXL3296. 196 pg pro pXL3179, 192 pg pro pXL3579, 139 pg pro pXL3678, 97 pg pro pXL 3227 a 79 pg pro pXL 3397.
Nebyla detekována žádná vazba plazmidu (< 3 pg), když pBKS byl podroben chromatografii na této koloně. To ukazuje, že oligonukleotid 5-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) vytváří stabilní trojšroubovicové struktury s komplementární 14-memí sekvenci 5-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEKVENCE ID. Č. 29) přítomnou v pCOR (oriy), ale ne s blízce příbuznou sekvencí 5 -AGAAAAAAAGGA-3' (SEKVENCE ID. Č. 27) přítomnou v pBKS. To ukazuje, že zavedení jedné nesouhlasné triády (T*GC v tomto případě) má za následek kompletní destabi50 lizací trojšroubovicové struktury.
Co se týče kontrol, nebyla pozorována žádná vazba plazmidu (< 1 pg), když byl pXL3179 podroben chromatografii na prázdné koloně syntetizované ve zcela obdobných podmínkách, ale bez oligonukleotidu.
- 15CZ 303086 B6
Provozováním této metody s afínitní purifikační kolonou v podmínkách zde uvedených byl stupeň kontaminace hostitelskou genomovou DNA redukován z 2,6 na 0,07 % při přípravě pXL3296. Podobně byl stupeň kontaminace hostitelskou DNA redukován z 0,5 na 0,008 % při přípravě pXL3179, když byl vzorek podroben ehromatografií na stejné afínitní koloně. Kromě toho, stupeň kontaminace RNA byl značně redukován z 43 % RNA na 0,2 % RNA v případě pXL3179 s použitím této afínitní purifikační kolony.
Kromě toho, výtěžek plazmidu PXL3579 byl menší než 8 %, když byl olígonukleotid 5-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) nahrazen oligonukleotidem 5'-TTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 31) na afínitní koloně. Zatímco olígonukleotid, jak uveden v sekvenci id. č. 31, byl komplementární k části VEGFB sekvence v pXL3579 (tj. nukleotidy 379 až 389 relativně k ATG), nenastala významná trojšroubovicová afinita. To ukazuje, že tato afínitní purifikace vyžaduje nenáhodnou homopurin-homopyrimidinovou DNA sekvencí.
Příklad 10
Purifikace plazmidu odvozeného z ColEl
Následující příklad ukazuje purifikaci plazmidů odvozených z ColEl s použitím trojšroubovicové afínitní chromatografie. Bylo ukázáno, že tato technologie odstraňuje látky znečišťující nukleové kyseliny (konkrétně hostitelskou genomovou DNA a RNA) na stupeň, kterého není možné dosáhnout obvyklými chromatografickými metodami.
Trojšroubovícový afínitní gel byl syntetizován kondenzací oligonukleotidu majícího sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 28): 5-TCTTTTTTTCCT-3' na jodistanem oxidovaný Sephacryl 5-1000 SF, jak bylo popsáno v příkladu 9.
Plazmidy pXL3296 (pCOR bez transgenu) a pBKS, plazmid odvozený z ColEl, byly podrobeny ehromatografií na 1 ml koloně obsahující olígonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) za podmínek popsaných v příkladu 9. Výtěžky plazmidů v sebrané frakci byly 175 pg pro pBKS a <1 pg pro PXL3296. To ukazuje, že olígonukleotid 5 -TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) vytváří stabilní trojšroubovicové struktury s komplementární 12-merní sekvencí (5-AGAAAAAAAGGA-3) (SEKVENCE ID. Č. 27) přítomnou v pBKS, ale ne s velmi blízce příbuznou 12-memí sekvencí (5'-AGA A AAA A AAG A-3') (SEKVENCE ID. Č. 32) přítomnou v pCOR. To ukazuje, že zavedení jedné nesouhlasné triády (C*AT v tomto případě) může mít za následek kompletní destabilizaci trojšroubovicové struktury.
Příklad 11
Metoda dvojité purifikace
Následující příklad ukazuje purifikaci molekuly nadšroubovicové dvojřetězcové DNA, jako je například pXL3296, ve směsi obsahující další nadšroubovicovou dvoj řetězcovou molekulu, jako je například pBSK, s použitím trojšroubovicové afínitní chromatografie. Obě dvojřetězcové DNA molekuly mohou mít podobnou velikost, ale každá DNA molekula obsahuje unikátní sekvenci, která je schopna vytvoření trojšroubovice s odlišnou cílovou sekvencí. Jak bylo již diskutováno drive, molekuly jako například pXL3296 obsahují sekvenci 5-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEKVENCE ID Č. 29), ale neobsahují sekvenci 5 AGAAAAAAAGGA-3' (SEKVENCE ID. Č. 27). Na rozdíl od toho molekuly, jako je například pBSK, obsahují sekvenci id. č. 27, ale neobsahují sekvenci id. č. 29.
- 16CZ 303086 B6
V prvním kroku směs obsahující pXL3296 a pBSK byla nanesena na první afínitní kolonu obsahující oligonukleotid 5-TC TTTTTTTCCTT-3 (SEKVENCE ID. Č. 28), jako je například kolona popsaná v příkladu 10. Roztok byl filtrován přes první kolonu, která zadržela navázané DNA molekuly. Ve druhém kroku byly nevázané DNA molekuly z prvního kroku naplněny na druhou afínitní kolonu obsahující oligonukleotid (SEKVENCE ID. Č. 30): 5-TTCTTTTTTTTCTT-3', jako je například kolona popsaná v příkladu 9. Druhá kolona pak byla promyta a vázané molekuly byly eluovány, jak bylo popsáno v příkladu 9. Z druhé kolony byly eluovány pouze pXL3296 molekuly. V eluátu (tj. roztoku, který byl eluován z kolony) nebyly z druhé kolony detekovány žádné molekuly pBSK.
Seznam sekvencí <140>
<141>
<150> 09/580,923 <151> 2000-05-26 <160> 36 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA *'213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 2 cttcccgaag ggagaaagg <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid
- 17 CZ 303086 B6 <400> 3 gaagggcttc cctctttcc <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 4 gaaaaaggaa gag <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 5 aagggaggga ggagaggaa <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 6 aaggagagga gggagggaa <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 7 ttggtgtggt gggtgggtt
- 18CZ 303086 B6 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 8 aaaaaaggga ataaggg 17 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 9 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 10 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 58 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 11 tgaccggcag caaaatg 17 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence
- 19CZ 303086 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <220>
<223> Všechny cytosiny (C) v sekvenci jsou methylované <400> 12 gaggcttctt cttcttcctc ttctt 25 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 13 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 14 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 15 gatccggagg aggagyagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58 <210> 16 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
-20CZ 303086 B6 syntetický oligonukleotid <400> 16 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 17 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50
| 20 | <210> <211> <212> <213> | 18 25 DNA Umělá sekvence |
| 25 | <220> <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| <400> 18 aatgcctcct cctcctcctc ctcct | ||
| 30 | <210> <211> <212> <213> | 19 26 DNA Umělá sekvence |
| 35 | <220> <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| 40 | <400> 19 agtgctctct ctctctctct ctctct | |
| 45 | <210> <211> <212> <213> | 20 66 DNA Umělá sekvence |
<220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid
-21 CZ 303086 B6 <400> 20 gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60 agatct 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 21 gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60 tcttca <210> 22 <21l> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 22 acagtcataa gtgcggcgac g <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 23 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 40 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid
-22CZ 303086 B6 <400> 24 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc· 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 25 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 26 cttcttctto ttcttcttct t 21 <210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 27 agaaaaaaag ga 12 <210> 28 <21l> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 28 tctttttttc ct 12
-23 CZ 303086 B6
| <210> | 29 |
| <211> | 14 |
| <212> | DNA |
| <213> | Umělá sekvence |
| <220> | |
| <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| <400> | 29 |
| aagaaaaaaa agaa | |
| <210> | 30 |
| <211> | 14 |
| <212> | DNA |
| <213> | Umělá sekvence |
| <220> | |
| <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| <400> | 30 |
| ttcttttttt tctt | |
| <210> | 31 |
| <211> | 11 |
| <212> | DNA |
| <213> | Umělá sekvence |
| <220> | |
| <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| <400> | 31 |
| ttttttttcc t | |
| <210> | 32 |
| <211> | 12 |
| <2Í2> | DNA |
| <213> | Umělá sekvence |
| <220> | |
| <223> | Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid |
| <400> | 32 |
| agaaaaaaaa ga | |
| <210> | 33 |
| <211> | 51 |
| <212> | DNA |
| <213> | Umělá sekvence |
-24CZ 303086 B6 <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 33 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 34 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48 <210> 35 <211> 50 <2I2> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 35 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence:
syntetický oligonukleotid <400> 36 gaagaagaag aagaagaaga a 21
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob purifikace dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou DNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvojřetězcové DNA, přičemž-25 CZ 303086 B6 kovalentně navázaný oligonukíeotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28) nebo TTCTTTTTTn CTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
- 2. Způsob purifikace dvoj řetězcové DNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou DNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvoj řetězcové DNA, přičemž specifická sekvence přítomná v dvoj řetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27) nebo AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č. 29).
- 3. Způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první dvoj řetězcovou DNA a druhou dvouřetězcovou DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (I) roztok prochází přes první nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této druhé DNA, (II) získá se roztok, který prošel přes první nosič, a (III) získaný roztok prochází přes druhý nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této první DNA, přičemž specifická sekvence přítomná v první dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č. 29) a specifická sekvence přítomná druhé dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27).
- 4. Způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první dvojřetězcovou DNA a druhou dvojřetězcovou DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (I) roztok prochází přes první nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této druhé DNA, (II) získá se roztok, který prošel přes první nosič, a (lil) získaný roztok prochází přes druhý nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této první DNA, přičemž oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA obsahuje sekvenci TTCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č, 30) a oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28).
- 5. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že roztok je buněčný lyzát.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že buněčný lyzát je čirý lyzát.
- 7. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že dvoj řetězcová DNA je prepurifikovaná.
- 8. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence byla uměle vložena do dvojřetězcové DNA.
- 9. Způsob podle nároků 1,2,3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence je přirozeně přítomna v dvojřetězcové DNA.
- 10. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že oligonukíeotid je navázán na nosič prostřednictvím disulfidické, thioetherové, esterové, amidové nebo aminové vazby.
- 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že oligonukíeotid je navázán na kolonu prostřednictvím raménka obsahujícího uhlíkový řetězec (CH2)n, kde n je celé číslo 1 až 18 včetně, přičemž raménko je navázáno k oligonukleotidů prostřednictvím fosfátu a na kolonu prostřednictvím amidové vazby.-26CZ 303086 B6
- 12. Způsob podle nároků 1, 2. 3 nebo 4, vyznačující se tím, že oligonukleotid obsahuje alespoň jednu chemickou modifikaci, která mu poskytuje rezistenci k nukleázám nebo ho chrání proti nukleázám nebo zvyšuje jeho afinitu ke specifické sekvenci.
- 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že alespoň jeden z cytosinů v oligonukleotidu je methylovaný.
- 14. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že dvojřetězcová DNA je kruhová DNA.
- 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že kruhová DNA je plazmid.
- 16. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvoj řetězcové DNA obsahuje několik pozic pro hybridizaci s oligonukleotidem.
- 17. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že nosič je funkcionalizovaný chromatografický nosič, funkcionalizovaný plastový povrch nebo jsou to funkcionalizované latexové perličky.
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že nosič je funkcionalizovaný chromatografický nosič.
- 19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že purifikovaná dvojřetězcová DNA má obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,5 %.
- 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že purifikovaná dvojřetězcová DNA má obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,01 %.
- 21. Způsob purifikace dvojřetězcové RNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou RNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou RNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvojřetězcové RNA, přičemž oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28) nebo sekvenci TTCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
- 22. Způsob podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že kovalentně navázaný oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28).
- 23. Způsob podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že kovalentně navázaný oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
- 24. Způsob podle nároku 2 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27).
- 25. Způsob podle nároku 2 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/580,923 US6319672B1 (en) | 1994-12-16 | 2000-05-26 | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20023865A3 CZ20023865A3 (cs) | 2003-04-16 |
| CZ303086B6 true CZ303086B6 (cs) | 2012-03-28 |
Family
ID=24323138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20023865A CZ303086B6 (cs) | 2000-05-26 | 2001-05-25 | Zpusob purifikace dvojretezcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1290156B1 (cs) |
| JP (1) | JP4803945B2 (cs) |
| KR (1) | KR100853040B1 (cs) |
| CN (1) | CN1446258B (cs) |
| AT (1) | ATE382688T1 (cs) |
| AU (3) | AU2001263459B2 (cs) |
| BR (1) | BR0111145B1 (cs) |
| CA (1) | CA2410263C (cs) |
| CZ (1) | CZ303086B6 (cs) |
| DE (1) | DE60132200T2 (cs) |
| DK (1) | DK1290156T3 (cs) |
| ES (1) | ES2298239T3 (cs) |
| HU (1) | HU228891B1 (cs) |
| IL (2) | IL152860A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02011463A (cs) |
| NO (1) | NO330571B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ522860A (cs) |
| PT (1) | PT1290156E (cs) |
| RU (1) | RU2315104C2 (cs) |
| SK (1) | SK287662B6 (cs) |
| WO (1) | WO2001092511A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200209579B (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2005233309B2 (en) * | 2004-04-19 | 2011-03-31 | Centelion | Method for purifying plasmid DNA |
| EP1737945B1 (en) * | 2004-04-19 | 2011-01-26 | Aventis Pharma S.A. | Method for purifying plasmid dna |
| WO2017186815A1 (en) * | 2016-04-26 | 2017-11-02 | Proqr Therapeutics Ii B.V. | Antisense oligonucleotides for enhanced expression of frataxin |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996018744A2 (fr) * | 1994-12-16 | 1996-06-20 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
| WO1996026270A1 (fr) * | 1995-02-23 | 1996-08-29 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique |
| WO1999049067A1 (fr) * | 1998-03-24 | 1999-09-30 | Aventis Pharma S.A. | Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5681940A (en) * | 1994-11-02 | 1997-10-28 | Icn Pharmaceuticals | Sugar modified nucleosides and oligonucleotides |
| FR2746412B1 (fr) * | 1996-03-21 | 1998-06-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Purification d'adn plasmidique de qualite pharmaceutique |
-
2001
- 2001-05-25 CZ CZ20023865A patent/CZ303086B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 JP JP2002500703A patent/JP4803945B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 MX MXPA02011463A patent/MXPA02011463A/es active IP Right Grant
- 2001-05-25 IL IL15286001A patent/IL152860A0/xx unknown
- 2001-05-25 KR KR1020027015971A patent/KR100853040B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 HU HU0302565A patent/HU228891B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 NZ NZ522860A patent/NZ522860A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 RU RU2002135091/13A patent/RU2315104C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 WO PCT/US2001/017122 patent/WO2001092511A2/en active IP Right Grant
- 2001-05-25 DE DE60132200T patent/DE60132200T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 CA CA2410263A patent/CA2410263C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 AU AU2001263459A patent/AU2001263459B2/en not_active Ceased
- 2001-05-25 SK SK1660-2002A patent/SK287662B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 EP EP01937755A patent/EP1290156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 DK DK01937755T patent/DK1290156T3/da active
- 2001-05-25 ES ES01937755T patent/ES2298239T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-25 AT AT01937755T patent/ATE382688T1/de active
- 2001-05-25 CN CN018101682A patent/CN1446258B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-25 PT PT01937755T patent/PT1290156E/pt unknown
- 2001-05-25 BR BRPI0111145-0A patent/BR0111145B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-05-25 AU AU6345901A patent/AU6345901A/xx active Pending
-
2002
- 2002-11-20 NO NO20025567A patent/NO330571B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-11-25 ZA ZA200209579A patent/ZA200209579B/en unknown
-
2007
- 2007-06-15 AU AU2007202804A patent/AU2007202804B8/en not_active Ceased
-
2009
- 2009-01-11 IL IL196444A patent/IL196444A/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996018744A2 (fr) * | 1994-12-16 | 1996-06-20 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
| WO1996026270A1 (fr) * | 1995-02-23 | 1996-08-29 | Rhone-Poulenc Rorer S.A. | Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique |
| WO1999049067A1 (fr) * | 1998-03-24 | 1999-09-30 | Aventis Pharma S.A. | Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2009045070A (ja) | 固定化させたオリゴヌクレオチドと三重らせんを形成させることによるｄｎａ精製 | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| AU2007202804B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| HK1059799A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| HK1059799B (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| PL206844B1 (pl) | Sposoby oczyszczania dwuniciowego DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20180525 |