WO1999049067A1 - Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations - Google Patents

Vecteurs de transfert d'acides nucleiques, compositions les contenant, et leurs utilisations Download PDF

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WO1999049067A1
WO1999049067A1 PCT/FR1999/000643 FR9900643W WO9949067A1 WO 1999049067 A1 WO1999049067 A1 WO 1999049067A1 FR 9900643 W FR9900643 W FR 9900643W WO 9949067 A1 WO9949067 A1 WO 9949067A1
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WO
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nucleic acid
acid transfer
transfer vector
oligonucleotide
sequence
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Application number
PCT/FR1999/000643
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Inventor
Carole Ciolina
Daniel Scherman
Pierre Wils
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Aventis Pharma S.A.
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs

Definitions

  • the present invention relates to new vectors and their use for the transfer of nucleic acids. More particularly, the invention relates to new vectors capable of directing nucleic acids towards specific cells or cell compartments.
  • nucleic acid transfer is a technique underlying all major biotechnology applications and increasing the efficiency of nucleic acid transfer is a very important issue for the development of these applications.
  • the efficiency of nucleic acid transfer depends on many factors including the ability of nucleic acids to reach the target cell, their ability to cross the plasma membrane and their ability to be transported within the cell to the nucleus.
  • nucleic acid transfer stems from the fact that genetic information is often little or not directed at the target organ for which it is intended. Furthermore, once the nucleic acid has entered the target cell, it must still be directed to the nucleus in order to be expressed there. In addition, in the case of transfer of nucleic acids into differentiated or quiescent cells, the nucleus is limited by a nuclear envelope which constitutes an additional barrier to the passage of these nucleic acids.
  • Recombinant viruses used as vectors have advanced and effective mechanisms to guide nucleic acids to the nucleus.
  • viral vectors have certain drawbacks inherent in their viral nature, which unfortunately cannot be totally excluded.
  • Another strategy therefore consists either in transfecting naked DNA, or in using non-viral agents capable of promoting the transfer of DNA into eukaryotic cells.
  • non-viral vectors do not have sub-cellular or nuclear targeting signals.
  • the passage of naked DNA, or in combination with a non-viral agent, from the cytoplasm to the nucleus is for example a step which has a very low efficiency (Zabner et al., 1995).
  • peptide fragments for targeting have been covalently attached to oligonucleotides in a strategy for targeting an antisense oligonucleotide [Eritja et al., Synlhesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, Vol. 47, No. 24, pp. 4113-4120, 1991].
  • the complexes thus formed are good candidates as potential inhibitors of the expression of endogenous genes.
  • Transfection vectors comprising a synthetic polypeptide coupled by electrostatic interactions to a DNA sequence have also been described in patent application WO 95/31557, said polypeptide consisting of a polymer chain of basic amino acids, an NLS peptide, and a hinge region which connects the NLS peptide to the polymer chain and makes it possible to avoid steric interactions.
  • this type of construction poses a stability problem because the interactions involved between DNA and the targeting signal are of an electrostatic nature.
  • NLS Nuclear Localization Signal
  • the present invention provides an advantageous solution to these problems. More particularly, the present invention uses oligonucleotides conjugated to targeting signals and capable of forming triple helices with a specific sequence (s) present on a double stranded DNA molecule.
  • Such a vector has the advantage of being able to direct double-stranded DNA to specific cells or cellular compartments by virtue of the targeting signal, without genetic expression being inhibited.
  • the Applicant has indeed shown that, thanks to the formation of stable site-specific triple helices, it is now possible to link a targeting signal to a double stranded DNA in a site-specific manner. Consequently, it is possible to fix the targeting signal outside the expression cassette for the gene to be transferred.
  • the Applicant has thus shown that genetic expression in the cell is not inhibited despite the chemical modification of DNA.
  • the presence of a triple helix as a means for binding the targeting signal to the DNA is particularly advantageous since it makes it possible to maintain a DNA size suitable for transfection.
  • the vector obtained also has the advantage of incorporating targeting signals which are very stably linked to the double stranded DNA, in particular when the oligonucleotide capable of forming the triple helix is modified by the presence of a alkylating agent.
  • Another advantage of the invention is that it makes it possible to couple the DNA to be transferred to targeting signals the number and nature of which are both controlled. Indeed, it is possible to control the number of targeting signals linked to each double-stranded DNA molecule by introducing an adapted number of specific sequences conducive to the formation of triple helices on said double-stranded DNA molecule. Of the Likewise, it is possible to introduce on the same double-stranded DNA molecule several oligonucleotides linked to different targeting signals (intracellular and / or extracellular), and in this case it is also possible to determine the proportions beforehand. respective. In addition, these different targeting signals can be fixed to the double-stranded DNA molecules in a more or less stable manner depending on whether the triple helix is formed with or without covalent bond (i.e. with or without the use of an alkylating agent).
  • a first object of the invention therefore relates to a vector useful in transfection capable of targeting a specific cell and / or cell compartment. More particularly, the vector according to the invention comprises a double-stranded DNA molecule and at least one oligonucleotide coupled to a targeting signal and capable of forming, by hybridization, a triple helix with a specific sequence present on said double-stranded DNA molecule .
  • double stranded DNA means a double stranded deoxyribonucleic acid which may be of human, animal, plant, bacterial, viral, etc. origin. It may be obtained by any technique known to man of the profession, and in particular by bank screening, by chemical or enzymatic synthesis of sequences obtained by screening of banks. It can be modified chemically or enzymatically.
  • This double stranded DNA can be in linear or circular form.
  • the double-stranded DNA may be in a supercoiled or relaxed state.
  • the DNA molecule is circular in shape and in a supercoiled conformation.
  • Double stranded DNA can also carry an origin of functional or non-functional replication in the target cell, one or more marker genes, transcription or replication regulatory sequences, genes of interest therapeutic, antisense sequences modified or not, regions of binding to other cellular components, etc.
  • the double-stranded DNA comprises an expression cassette consisting of one or more genes of interest under the control of one or more promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
  • the expression “gene expression cassette” means a DNA fragment which can be inserted into a vector at specific restriction sites.
  • the DNA fragment comprises a nucleic acid sequence coding for an RNA or a polypeptide of interest and further comprises the sequences necessary for expression (enhancer (s), promoter (s), polyadenylation sequences, etc.). ) of said sequence.
  • the cassette and restriction sites are designed to ensure insertion of the expression cassette into a reading frame suitable for transcription and translation.
  • plasmid or an episome carrying one or more genes of therapeutic interest.
  • the term “gene of therapeutic interest” in particular means any gene coding for a protein product having a therapeutic effect.
  • the therapeutic product thus coded can in particular be a protein or a peptide.
  • This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous with respect to the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell, allowing it to fight a pathology, or stimulate an immune response.
  • therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines [interleukins, interferons, TNF, etc. (FR 92/03120)], growth factors, neurotransmitters or their synthetic precursors or enzymes, trophic factors [BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc., dystrophin or a minidystrophin (FR 91/1 1947)] , the CFTR protein associated with cystic fibrosis, tumor suppressor genes [p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleiotrophin, etc., dystrophin or a minidystrophin (FR 91
  • FR 93/04745) the genes coding for factors involved in coagulation [Factors VII, VIII, IX], genes involved in DNA repair, suicide genes [thymidine kinase, cytosine deaminase], genes for hemoglobin or other protein transporters, genes corresponding to the proteins involved in the metabolism of lipids, apolipoprotein type chosen from the apolipoproteins AI, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J and apo (a), metabolism enzymes such as for example lipoprotein lipase, hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7 alpha cholesterol hydroxylase, phosphatidic acid phosphatase, or lipid transfer proteins such as cholesterol ester transfer protein and phospholipid transfer protein, a HDL binding protein or a receptor chosen for example from LDL receptors, chylomicron-remnant receptors and s
  • the DNA of therapeutic interest can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNA.
  • Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the genes of therapeutic interest also include the sequences encoding ribozymes, which are capable of selectively destroying Target RNAs (EP 321 201), or the sequences encoding single chain intracellular antibodies such as for example the ScFvs.
  • deoxyribonucleic acid may also contain one or more genes coding for an antigenic peptide, capable of generating an immune response in humans or animals.
  • the invention therefore makes it possible to produce either vaccines or immunotherapeutic treatments applied to humans or animals, in particular against microorganisms, viruses or cancers.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the Epstein Barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, the "syncitia forming virus", influenza virus, cytomegalovirus (CMV), other viruses or tumor-specific (EP 259 212).
  • the deoxyribonucleic acid also comprises sequences allowing the expression of the gene of therapeutic interest and / or of the gene coding for the antigenic peptide in the desired cell or organ.
  • sequences which are naturally responsible for the expression of the gene considered when these sequences are capable of functioning in the transfected cell. It can also be sequences of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be promoter sequences of eukaryotic or viral genes.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • they may be promoter sequences originating from the genome of a virus.
  • promoters of the El A, MLP, CMV, RSV, etc. genes can be modified by adding activation, regulation sequences, etc. It can also be a promoter, inducible or repressible.
  • a triple helix corresponds to the binding of an oligonucleotide modified or not on double stranded DNA by hydrogen bonds called "Hoogsteen" between the bases of the third strand and those of the double helix region. These pairings occur in the large groove of the double helix and are specific to the sequence considered [Frank-Kamenetski, MD, Triplex DNA Structures, Ann. Rev. Biochem., 1995, 64, pp. 65-95].
  • the specific double helix sequence may in particular be a hornopuric-homopyrimide sequence.
  • triple helices with a third homopyrimide strand this is parallel with respect to the purine strand, and the formation of the triple helix is dependent on the pH: an acid pH lower than six allows the protonation of the cytosines and the formation of a additional hydrogen bond stabilizing the CG * C + triplet.
  • the oligonucleotides used in the present invention are oligonucleotides which hybridize directly with double stranded DNA. These oligonucleotides can contain the following bases: - thymidine (T), which is capable of forming triplets with the A.T doublets of double stranded DNA (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859),
  • A - adenine
  • oligonucleotide and the specific sequence present on the DNA are complementary.
  • an oligonucleotide and a specific sequence which are perfectly complementary are used for the vector according to the invention. It may in particular be a poly-CTT oligonucleotide and a specific poly-GAA sequence.
  • This sequence forms a triple helix with the oligonucleotides: 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 '(SEQ LD N ° 4) or 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ LD N ° 5).
  • the oligonucleotide binds in an antiparallel orientation to the polypuric strand.
  • These triple helices are only stable in the presence of Mg2 + as has been specified previously (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
  • the specific sequence may be a sequence naturally occurring on double-stranded DNA, or a synthetic or naturally occurring sequence artificially introduced therein. It is particularly advantageous to use an oligonucleotide capable of forming a triple helix with a sequence present 10
  • the vectors according to the invention with unmodified plasmids, in particular commercial plasmids of the pUC, pBR322, pSV type, etc.
  • plasmids in particular commercial plasmids of the pUC, pBR322, pSV type, etc.
  • the natural homopuric-homopyrimide sequences present on the DNA double strand there may be mentioned a sequence comprising all or part of the sequence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3 '(SEQ LD No. 6) present in the origin of replication ColEl of E. coli.
  • the oligonucleotide forming the triple helix has the sequence: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3 '(SEQ LD No.
  • the oligonucleotide used can be natural (composed of natural bases, unmodified) or chemically modified.
  • the oligonucleotide can advantageously exhibit certain chemical modifications making it possible to increase its resistance, its protection with respect to nucleases, its affinity with respect to the specific sequence or still making it possible to bring other properties. Additional (J. Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A 11
  • oligonucleotide is also understood to mean any chain of nucleosides having undergone a modification of the skeleton.
  • oligonucleotides which are capable of forming triple helices with DNA (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), as well as oligonucleotides having formacetal or methylphosphonate skeletons (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113. 7767-7768).
  • oligonucleotides synthesized with nucleotide anomers which also form triple helices with DNA (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, L5, 7749-7760).
  • Another modification of the skeleton is the phosphoramidate bond.
  • ribonucleotides 2'-0-methylribose, phosphotriester, ... (Sun and Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1 16. 3143-3144 ).
  • the phosphorus backbone can finally be replaced by a polyamide backbone as in the PNA (Peptide Nucleic Acid), which can also form triple helices (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J . Am. Chem. Soc, 1993, 115.
  • the third strand thymine can also be replaced by a 5-bromouracil, which increases the affinity of the oligonucleotide for DNA (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 1 1 1, 3059- 3061).
  • the third strand may also contain non-natural bases, among which mention may be made of 7-daza-2'-deoxyxanthosine (Milligan et al., • Nucleic Acids Res., 1993, 2J, 327-333), 1 - ( 2-deoxy-bD-ribofuranosyl) -3-methyl-5-amino-1H-pyrazolo [4,3- ⁇ T
  • Another type of modification of the oligonucleotide more particularly aims to improve the interaction and / or the affinity between the oligonucleotide and the specific sequence.
  • an entirely advantageous modification consists in coupling an alkylating agent to the oligonucleotide.
  • the bond can be made either chemically or photochemically via a photoreactive functional group.
  • Advantageous alkylating agents are in particular photoactivatable alkylating agents, for example psoralens. Under the action of light, they form covalent bonds at the level of pyrimidine bases of DNA.
  • an advantage of the present invention is therefore the possibility of forming very stable and site-specific triple helices between the oligonucleotide and a specific sequence of double-stranded DNA thanks to a covalent bond formed via a alkylating agent.
  • the length of the oligonucleotide used in the process of the invention is at least 3 bases, and preferably between 5 and 30 bases.
  • An oligonucleotide with a length of between 10 and 30 bases is advantageously used.
  • the length can of course be adapted on a case-by-case basis by a person skilled in the art as a function of the selectivity and the stability of the interaction sought.
  • oligonucleotides according to the invention can be synthesized by any known technique. In particular, they can be prepared using nucleic acid synthesizers. Any other method known to those skilled in the art can also be used. 13
  • targeting signal is understood to mean targeting molecules of various kinds. In most cases these are known peptides for targeting. They can be used to interact with a component of the extracellular matrix, a receptor of the plasma membrane, to target an intracellular compartment or to improve the intracellular trafficking of DNA, during the non-viral transfer of genes in gene therapy.
  • targeting signals can include, for example, growth factors (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), cytokines (LL-1, LL-2, TNF, Interferon, CSF), hormones (insulin, growth hormone, prolactin, glucagon, thyroid hormone, steroid hormones), sugars that recognize lectins, immunoglobulins, ScFv, transferrin, lipoproteins, vitamins such as vitamin B12, peptide hormones or neuropeptides (tachykinins , neurotensin, VIP, endothelin, CGRP, CCK, ...), or any motif recognized by integrins, for example the RGD peptide, or by other proteins extrinsic from the cell membrane.
  • growth factors EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF
  • cytokines LL-1, LL-2, TNF, Interferon, CSF
  • hormones insulin, growth hormone, prolactin,
  • Whole proteins can be used, or peptide sequences derived from these proteins, or peptides which bind to their receptor and are obtained by the "phage display” technique or by combinatorial synthesis.
  • NLS nuclear targeting sequences
  • Many nuclear targeting sequences have been identified and allow targeting of different proteins involved in the nuclear transport of proteins or nucleic acids.
  • these sequences are notably short sequences (the NLS of the SV40 T antigen (PKKKRKV, SEQ LD No. 11) is an example), bipartite sequences (the NLS of nucleoplasmin which contains two essential domains for transport nuclear KRPAATKKAGQAKKKKLDK, SEQ LD No. 12), or the sequence M9 (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, SEQ LD No. 13) of the protein hnRNPAl.
  • the proteins carrying these NLS sequences bind to specific receptors, such as the receptors of the importin family or 14
  • karyopherins for example.
  • the role of these sequences is to direct DNA inside the nucleus, where it is then immediately available to the transcription machinery, and can be expressed.
  • “Mixed” targeting signals that is to say signals which can be used for both intracellular and extracellular targeting, also fall within the scope of the present invention. Mention may for example be made of sugars which target lectins which are located on the cell membrane but also at the level of the nuclear pores. Targeting with these sugars therefore concerns both extracellular targeting and nuclear import.
  • the targeting signals according to the invention make it possible to specifically direct the double-stranded DNA towards certain cells or certain cellular compartments.
  • the targeting signals according to the invention can target receptors or ligands on the surface of the cell, in particular receptors for insulin, transferrin, folic acid, or any other factor growth cells, cytokines, or vitamins, or particular polysaccharides on the cell surface or on the surrounding extracellular matrix.
  • oligonucleotide-targeting signal chimeras is carried out in solid phase or in solution and takes into account the very different chemical stability properties of oligonucleotides and targeting signals [Erijita, R. et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47 (24), pp. 4113-4120].
  • the targeting signal can for example be synthesized with a group carrying disulfide, maleimide, amino, carboxyl, ester, epoxide, cyanogen bromide, or aldehyde functions, and be coupled to a 15
  • oligonucleotide modified by a terminal thiol, amino or carboxyl group in the 3 ′ or 5 ′ position
  • These couplings are formed by establishment of disulfide, thioether, ester, amide, or amine bonds between the oligonucleotide and the targeting signal
  • Any other known method skilled in the art can be used, such as bifunctional coupling reagents for example
  • compositions comprising a vector as defined above
  • the vectors according to the invention can also be combined with one or more agents known to transfect DNA. Mention may be made, by way of example, of cationic lipids which have advantageous properties. These vectors indeed consist of a polar part , cationic, interacting with DNA, and of a lipid, hydrophobic part, promoting cell penetration and making ionic interaction with DNA insensitive to the external environment.
  • cationic lipids are in particular monocationic lipids (DOTMA Lipofectin®), certain cationic detergents (DDAB), lipopolyamines and in particular dioctadecylamidoglycyl spermine (DOGS) or 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine (DPPES)
  • DOTMA Lipofectin® monocationic lipids
  • DDAB certain cationic detergents
  • DOGS dioctadecylamidoglycyl spermine
  • DPES 5-carboxyspermylamide of palmitoylphosphatidylethanolamine
  • Another advantageous family of lipopolyamines is represented by the compounds described in patent application WO 97/18185 incorporated herein by reference, for example in patent application EP 394 1 1 1.
  • Many other cationic lipids have been developed and can be used with the vectors according to the invention
  • cationic polymers of the polylysine and DEAE dextran type are also advantageous. It is also possible to use the polymers of polyethylene imine (PEI) and of polypropylene imine (PPI) which are commercially accessible and can be prepared according to the process described in patent application WO 96/02655.
  • PEI polyethylene imine
  • PPI polypropylene imine
  • any synthetic agent known to transfect the nucleic acid can be associated with the vectors according to the invention 16
  • compositions can also comprise adjuvants capable of associating with the vector complexes according to the invention / transfection agent and of improving their transfecting power.
  • the present invention therefore relates to compositions comprising a vector as defined above, one or more transfection agents as defined above and one or more adjuvants capable of associating with the vector complexes according to The invention / transfection agent (s) and improve their transfection power.
  • This type of adjuvant lipids, peptides or proteins for example
  • compositions of the invention may comprise as adjuvant, one or more neutral lipids, the use of which is particularly advantageous.
  • the Applicant has indeed shown that the addition of a neutral lipid makes it possible to improve the formation of nucleolipid particles and to promote the penetration of the particle into the cell by destabilizing its membrane.
  • the neutral lipids used in the context of the present invention are lipids with 2 fatty chains.
  • natural or synthetic lipids are used, z itterionic or devoid of ionic charge under physiological conditions. They can be chosen more particularly from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), oleoyl-palmitoylphosphatidylethanolamine (POPE), di-stearoyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidylethanolamines as well as their N-methylated derivatives 1 to 3 times, phospol glycols , glycosyldiacylglycerols, cerebrosides (such as in particular galactocerebrosides), sphingolipids (such as in particular sphingo yelins) or alternatively asialogangliosides (such as in particular asialoGMl and GM2).
  • DOPE dioleoylphosphatidylethanolamine
  • lipids can be obtained either by synthesis or by extraction from organs (example: the brain) or eggs, by conventional techniques well known to those skilled in the art.
  • extraction of natural lipids can be carried out using organic solvents (see also Lehninger, Biochemistry). 17
  • a compound which may or may not intervene directly in the condensation of DNA (WO 96/25508).
  • the presence of such a compound, within a composition according to the invention makes it possible to reduce the amount of transfecting compound, with the beneficial consequences which result therefrom from the toxicological point of view, without causing any damage to the transfecting activity.
  • the term “compound involved in the condensation of the nucleic acid” is intended to define a compound compacting, directly or indirectly, DNA. More specifically, this compound can either act directly at the level of the DNA to be transfected or intervene at the level of an annex compound which is directly involved in the condensation of this nucleic acid.
  • this agent involved in the condensation of DNA can be any polycation, for example polylysine.
  • this agent can also be any compound deriving in whole or in part from a histone, a nucleolin, a protamine and / or one of their derivatives.
  • Such an agent can also consist, in whole or in part, of peptide units (KTPKKAKKP) and / or (ATPAKKAA), the number of units can vary between 2 and 10.
  • these units can be repeated continuously or not. Thus they can be separated by links of a biochemical nature, for example by one or more amino acids, or of a chemical nature.
  • a subject of the invention is also the use of the vectors as defined above for manufacturing a medicament intended to treat diseases by transfection of DNA in primary cells or in established cell lines.
  • They can be fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic lineage (lymphocytes, CD34, dendritics, etc.), epithelial, etc., in differentiated or pluripotent forms (precursors ).
  • the vectors of the invention may, by way of illustration, be used for the in vitro, ex vivo or in vivo transfection of DNA coding for proteins or polypeptides.
  • compositions according to the invention can be formulated for administration by topical, cutaneous, oral route, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal, intraperitoneal, etc.
  • the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for an injectable formulation, especially for a direct injection at the level of the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa).
  • nucleic acid used for the injection may in particular be sterile, isotonic solutions, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition as appropriate of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of nucleic acid used for the injection as well as the number of administrations can be adapted according to different parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the mode of administration it may be either a direct injection into the tissues or the circulatory pathways, or a treatment of cells in culture followed by their reimplantation in vivo, by injection or graft.
  • the invention further relates to a method for transfection of DNA into cells, comprising the following steps:
  • the contacting of the cells with the complex can be carried out by incubation of the cells with the said complex (for uses in vitro or ex vivo), or by injection of the complex into an organism (for uses in vivo).
  • the present invention thus provides a particularly advantageous method for the treatment of diseases by administration of a vector according to the invention containing a nucleic acid capable of correcting said disease. More particularly, this method is applicable to diseases resulting from a deficiency in a protein or peptide product, the administered DNA coding for said protein or peptide product.
  • the present invention extends to any use of a vector according to the invention for the in vivo, ex vivo or in vitro transfection of cells.
  • the invention also relates to any recombinant cell containing a vector as defined above.
  • a vector as defined above.
  • They are preferably eukaryotic cells, for example yeasts, animal cells, etc. These cells are obtained by any technique allowing the introduction of DNA into a given cell and known to those skilled in the art.
  • FIGURES Figure 1 Coupling of an oligonucleotide (ODN) and the maleimide-NLS peptide.
  • Figure 2 Analysis on 15% polyacrylamide gel of the oligonucleotide - peptide chimera (Pso-GA ⁇ 9 -NLS) by proteolytic action of trypsin.
  • Figure 3 schematic representation of the plasmid pXL2813. 20
  • Figure 4 schematic representation of the plasmid pXL2652.
  • Figure 5 Analysis on 15% polyacrylamide gel of the formation of triple helices between the plasmid pXL2813 and the oligonucleotide-peptide chimera Pso-GA ⁇ 9 -NLS.
  • the oligonucleotide pso-GA ⁇ 9 -NLS and the plasmid are mixed in a buffer containing 100 mM MgCl 2 .
  • the excess in molarity of the oligonucleotide relative to the plasmid varies from 0 to 200.
  • the mixture is photoactivated, after overnight at 37 ° C., then digested by two restriction enzymes which cut the plasmid on either side of the triple helix formation region.
  • Figure 6 In vitro expression of the transgene ( ⁇ -galactosidase) for tests carried out with the plasmid pXL2813 alone, the vector pXL2813-Pso-GA ⁇ 9 -NLS, and without plasmid.
  • Figure 7 Characterization of the peptide part of the Pso-GAi9-NLS oligonucleotide-peptide chimera by interaction with importine 60-GST (analysis on 15% polyacrylamide gel).
  • Figure 8 Analysis on 15% polyacrylamide gel of the oligonucleotide-peptide chimera (GA19-NLS) by proteolytic action of trypsin.
  • Figure 9 Graphical representation of the kinetics of formation of triple helices (% of triple helix sites occupied as a function of time) between the plasmid pXL2813 and the chimera GA ⁇ 9 -NLS.
  • Figure 10 Characterization of the peptide part of the oligonucleotide-peptide GA 19 -NLS chimera by interaction with importine 60-GST.
  • Figure 1 1 schematic representation of the plasmid pXL2997.
  • Figure 12 Graphic representation of the kinetics of triple helix formation (% of triple helix sites occupied as a function of time) between the plasmid pXL2997 and the chimera pim-NLS.
  • Figure 13 histogram representing the ⁇ -galactosidase activity in vivo in human lung tumors H 1299 of the plasmids pXL2813 (indicated Bgal in the figure) and ⁇ XL2813-Pso-GA ⁇ 9 -NLS (indicated NLS-Bgal in the figure) in RLU ("Relative Light Unit") per tumor.
  • the transfection was carried out using electrotransfer techniques as described in applications WO99 / 01157 and WO 99/01 158.
  • the oligonucleotides used are either the sequence 5'- AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 '(SEQ LD N ° 4) with a length of 19 bases and referred to as "GA ⁇ 9 " in the rest of the text, or sequence 5 '- GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ LD N ° 15) with a length of 13 bases and referenced under the name "pim" in the rest of the text (because it is the sequence of the protooncogene pim-1).
  • oligonucleotides noted GA1 9 -SH or pim-SH have the same sequences as GA19 and pim respectively and a thiol group at the 5 'end, with a six-carbon spacer between the thiol and the phosphate at the 5' end. Oligonucleotides noted 23
  • Pso-GA ⁇ 9 -SH have a thiol group at the 3 'end (SH), and in addition, a psoralen at the 5' end (Pso), with a spacer of six carbons between the psoralen and the phosphate of l 'end 5'.
  • the oligonucleotides noted Pso-GA ⁇ 9 do not have a thiol group.
  • Peptides The peptides used for the couplings are synthesized by a solid phase automaton. They contain :
  • N-terminal lysine is chemically modified: it contains a maleimide group on the ⁇ carbon and a protective group 9- 24
  • Fmoc fluorenylmethyloxycarbonyl
  • Couplings For coupling with oligonucleotides, the strategy used consists in reacting the thiol group carried by the oligonucleotide and the maleimide group carried by the peptide [Eritja, R., et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47 (24), pp. 4113- 4120]. The oligonucleotide is added to the peptide solution equimolarly and the reaction medium is left for two hours at room temperature.
  • the oligonucleotide-peptide chimera is purified by reverse-phase high pressure liquid chromatography on a Vydac C8 column containing spheroidal silica with a diameter of 5 ⁇ m and a porosity of 300 ⁇ . Using a 0.1 M triethylammonium acetate buffer (TEAA) and a gradient of acetonitrile passing from 5% to 50% in 35 minutes. The products are detected at 260 nm. 25
  • TEAA triethylammonium acetate buffer
  • oligonucleotide-peptide conjugates are subjected to the proteolytic action of trypsin which makes it possible to highlight the peptide part of the chimera [Reed, MW et al, Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-antisense oligodeoxynucleotide conjugates, Bioconjugate Chemistry, 1995 , 6, pp.101-108].
  • Solutions containing 1 ⁇ g of oligonucleotide-peptide in 7 ⁇ l of 0.1 M trethylammonium purification buffer (TEAA) are mixed with 1 ⁇ l of a trypsin solution (5 mg / ml).
  • the plasmid used to study the formation of triple helices with the chimeras GA ⁇ 9 - peptide is called pXL2813 (7257 bp, see FIG. 3).
  • This plasmid expresses the ⁇ -galactosidase gene under the control of the strong promoter of the early genes of Cytomegalovirus (CMV), as well as the gene for resistance to Ampicillin.
  • CMV Cytomegalovirus
  • pXL2652 (7391 bp and the representation of which is shown diagrammatically in FIG. 4) which expresses the gene for ⁇ -Galactosidase under the control of the strong promoter of the early genes of Cytomegalovirus (CMV), as well as the gene resistance to Ampicillin.
  • CMV Cytomegalovirus
  • This promoter comes from pCDNA3, the LacZ gene and its polyA come from pCHl 10, and the rest comes from pGL2.
  • sequences were cloned upstream of the promoter between the unique cleavage sites of the Muni and Xmal enzymes.
  • sequences were cloned upstream of the promoter between the unique cleavage sites of the Muni and Xmal enzymes.
  • the two complementary oligonucleotides containing the sequence to be cloned 6651 (5'- AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3 ') and 6652 (3'- 26
  • CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5 ' were heated for 5 minutes at 95 ° C, then hybridized, allowing the temperature to drop slowly.
  • the plasmid pXL2652 was then digested with the enzymes Muni and Xmal, for 2 hours at 37 ° C., and the products of this double digestion were separated by electrophoresis on 1% agarose gel and staining with ethidium bromide.
  • the fragment of interest for the following cloning was eluted according to the Jetsorb protocol (Genomed) and 200 ng of this fragment were linked to 10 ng of the mixture of oligonucleotides hybridized by T4 ligase, for 16 hours at 16 ° C. .
  • E.Coli competent bacteria of the DH5 ⁇ strain were transformed by electroporation with the reaction product, spread on Petri dishes containing LB medium and Ampicillin. The clones resistant to Ampicillin were selected and the DNA was extracted by alkaline lysis and analyzed on 1% agarose gel. A clone corresponding, in size, to the expected product was sequenced.
  • the plasmid used to study the formation of helical triple is pXL2997 shown in FIG. 11.
  • This plasmid expresses the ⁇ -galactosidase gene under the control of the strong promoter of the early genes of Cytomegalovirus (CMV ), as well as the Ampicillin resistance gene.
  • CMV Cytomegalovirus
  • the pim sequence SEQ LD No. 15 was cloned according to conventional methods of molecular biology.
  • This method is based on the principle of exclusion chromatography of solutions containing the plasmid and the oligonucleotide capable of forming a triple helix.
  • the exclusion columns used (Columns, Linkers 6, Boehringer Mannheim) are composed of sepharose beads and have 194 base pairs as exclusion limit, which makes it possible to retain in the column the oligonucleotides not paired with the plasmids.
  • the oligonucleotides are radioactively labeled at their 3 ′ end by the Terminal Transferase using dATP ⁇ - ⁇ S.
  • the protocol used comes from Amersham: 10 pmol of oligonucleotides are incubated for 2 hours at 37 ° C, with 50 ⁇ Ci of dATP ⁇ ⁇ S in the presence of 10 units of Terminal Transferase, in a volume of 50 ⁇ l of buffer containing cocodylate sodium.
  • the percentage of labeled oligonucleotides is evaluated according to the following method: l ⁇ l of a sample diluted to 1/100 of the solution after labeling is deposited on Whatman DE81 paper, in duplicate. One of the two papers is washed twice for 5 minutes with 2xSSC, for 30 seconds with water and for 2 minutes with ethanol. The radioactivities of the two papers are compared. The radioactivity of the washed paper corresponds to the 35s actually incorporated.
  • triple helices takes place in a volume of 35 ⁇ l.
  • the sepharose columns are balanced, before use, with the reaction buffer and centrifuged at 2200 rpm for 4 minutes, to compact them. 25 ⁇ l of the reaction medium are deposited on the columns and these are centrifuged under the same conditions as above. 25 ⁇ l of 28
  • reaction buffer are then deposited on the columns which are again centrifuged. The eluate is recovered.
  • cpm deposit
  • cpm eluate
  • % of oligonucleotides elected cpm (eluate) / [5 x cpm (deposit)] xl00.
  • the percentage of plasmids which are effectively eluted during the experiments is evaluated by estimating the optical density at 260 nm of the eluate and that of the deposit, which makes it possible to calculate the percentage of oligonucleotides attached to all of the plasmids:
  • % of fixed oligonucleotides [% eluted oligonucleotides /% eluted plasmids x 100.
  • the importin 60 subunit used to study the interaction with the oligonucleotide-peptide conjugates is of murine origin and fused with Glutathione S-Transferase (GST).
  • GST Glutathione S-Transferase
  • the sequence of importin 60 was cloned into a vector pGEX-2T to merge it with GST.
  • the recombinant protein was produced in Escherichia coli [Imamoto, N. et al., In vivo evidence for involvement ofa 58kDa component of nuclearpore-targeting complex in nuclear protein import, The EMBO Journal, 1995, 14 (15), pp. 3617-3626].
  • the recombinant proteins are incubated in the presence of sepharose beads covered with glutathione groups (Pharmacia Biotech) 1 ⁇ g of recombinant protein is used for 10 ⁇ l of beads. After an incubation of 30 minutes, at room temperature, in 500 ⁇ l of fixing buffer, the mixture is centrifuged at 2000 G for 30 seconds, and the supernatant is removed. The beads are washed five times by resuspension in 500 ⁇ l of fixing buffer and centrifugation, as described above. The beads are resuspended in fixing buffer to obtain a suspension containing 50% of beads coated with recombinant proteins.
  • oligonucleotide or oligonucleotide-peptide 60 ⁇ l of the suspension containing 50% of beads covered with recombinant proteins are incubated with 2 ⁇ g of oligonucleotide or oligonucleotide-peptide, in a volume of 500 ⁇ l of fixing buffer. After an incubation of 30 minutes, at room temperature, the mixture is centrifuged at 2000 G for 30 seconds, and the supernatant is removed. 30 ⁇ l of the supernatant are collected to analyze the fraction which is not fixed on the beads. The beads are washed five times by resuspension in 500 ⁇ l of fixing buffer and centrifugation, as described above.
  • the nucleic acids are revealed by silver staining using a Biorad kit [Rexach, M. and G. Blobel, Protein import into nuclei: association and dissociation reactions involving transport substrate, transport factors, and nucleoporins, Cell, 1995, 83, pp. 683-692].
  • the cell type used is NLH3T3 (ATCC CRL-1658). They are mouse fibroblasts. These cells are cultured in a modified Dulbecco medium, with glucose 4.5 g / 1 (DMEM - Gibco), glutamine 2 mM, penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / ml) , and 10% fetal calf serum (Gibco). They are incubated at 37 ° C in an oven with 5% C0 2 .
  • the wells of a 24-well plate are seeded with 50,000 cells per well.
  • the vectors are diluted in 150 mM NaCl and mixed with a cationic lipid (the compound of condensed formula H2N (CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3 NHCH 2 COGlyN [(CH 2 ) i7CH3] 2 described in the patent application WO 97/18185 under number (6)), diluted in 150 mM NaCl.
  • the mixture is made with 6 nmol of lipid per microgram of plasmid. This mixture is diluted 1/10 in culture medium without serum and deposited on the cells. After incubation at 37 ° C in an oven at 5% CO 2 for two hours, 10% fetal calf serum is added.
  • the cells are washed twice with PBS and lysed with 250 ⁇ l of lysis buffer (Promega).
  • the ⁇ -galactosidase is quantified according to the “Lumigal ⁇ -Galactosidase genetic reporter system” protocol (Clontech).
  • the activity is measured on a Lumat LB9501 luminometer (Berthold).
  • the amount of protein is measured with the BCA kit (Pierce).
  • This example illustrates the possibility of coupling the oligonucleotide Pso-GA ⁇ -SH to the maleimide-NLS peptide.
  • the oligonucleotide Pso-GA ⁇ 9 -SH of sequence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 ', with a thiol group at the 3' end, was coupled to the NLS peptide which carries a maleimide group at its N-terminal end according to the described method 31
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the oligonucleotide-peptide chimera (Pso-GA ⁇ 9 -NLS) was analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel after proteolytic action of trypsin which makes it possible to demonstrate the presence of the peptide part of the chimera, after migration on polyacrylamide gel denaturing and staining of nucleic acids with silver (as indicated in the section “Materials and methods” under the section “Analysis of chimeras by trypsin digestion”).
  • the chimera Pso-GA ⁇ 9 -NLS exhibits a delayed electrophoretic migration compared to the oligonucleotide Pso-GA ! 9 -SH, and the product of the proteolytic digestion is visualized at an intermediate level between the migration levels of Pso-GA ⁇ - NLS and Pso-GA ⁇ 9 -SH, as shown in Figure 2.
  • the chimera Pso-GAi 9 -NLS therefore contains a peptide part accessible to trypsin.
  • This example illustrates the formation of triple helices between the plasmid pXL2813 and the chimera Pso-GA ⁇ 9 -NLS which is modified by a photoactivatable alkylating agent.
  • This example also indicates what is the proportion of plasmids modified according to the excess in molarity of oligonucleotides relative to the plasmid.
  • the plasmid pXL2813 represented in FIG. 3, contains the complementary homopuric sequence of GA ⁇ 9 which is capable of forming a triple helix with the oligonucleotides GA ⁇ 9 , Pso-GA ⁇ 9 , Pso-GA ⁇ 9 -SH or Pso-GA] 9 - NLS. Divalent cations, such as Mg 2+ , stabilize these triple helices.
  • oligonucleotide and the plasmid are mixed in a buffer containing 100 mM MgCl 2 .
  • the excess in molarity of oligonucleotide relative to the plasmid varies from 0 to 200.
  • the mixture is photoactivated for 15 minutes (as indicated in the "materials and methods” section under the "Photoactivation of triple helices"), then digested with the two restriction enzymes Mfel and Spel which cut the plasmid on either side of the triple helix formation region.
  • a nucleic acid fragment which contains 70 base pairs is released after digestion of the unmodified plasmid pXL2813.
  • the fragment obtained with the plasmid and the oligonucleotide forming a triple helix covalently linked to the double helix has 70 base pairs plus 19 bases of the oligonucleotide.
  • This example illustrates the ability of the transgene to be expressed in vitro although the plasmid is modified.
  • the expression of the transgene increases following the modification made by the covalent attachment of a triple helix upstream of the promoter.
  • the purpose of this example is to verify that expression in vivo is not inhibited by the presence of a targeting signal associated with the plasmid via a triple helix.
  • the experiment consists in transfecting pXL2813 and pXL2813-Pso-GA ⁇ 9 -NLS in human lung tumors H1299 using the electrotransfer techniques described in applications WO 99/01157 and WO 99/01 158.
  • the experiment was carried out in female nude mice weighing 18 to 20 g.
  • the mice are implanted monolaterally with grafts of H 1299 tumors of 20 mm 3 . Tumors grow to reach a volume of 200 to 300 mm 3 .
  • the mice are sorted according to their tumor sizes and distributed into homogeneous batches. Then the mice are anesthetized with a Ketamine / Xylazine mixture (commercially available).
  • the plasmid solution (8 ⁇ g of DNA / 40 ⁇ l of 150 mM sodium chloride) is injected longitudinally at the periphery of the tumor using a Hamilton syringe.
  • the lateral faces of the tumor are coated with conductive gel and the tumor is placed between two flat stainless steel electrodes 0.45 to 0.7 cm apart.
  • the electrical pulses are applied using a commercial square pulse generator (Electro-pulsator PS 15, Jouan, France) 20 to 30 seconds after injection.
  • An oscilloscope makes it possible to control the intensity in volts, the duration in milliseconds and the frequency in hertz of the pulses which must be delivered at 500 V / cm for 20 milliseconds and at 1 hertz.
  • mice respectively for the plasmid pXL2813 and pXL2813-Pso-GA 19 -NLS are euthanized 2 days after the injection of the plasmid.
  • the tumors are removed, weighed and boyaged in a lysis buffer (Promega) supplemented with antiproteases (Complhang, Boehringer).
  • the suspension obtained is centrifuged in order to obtain a clear supernatant.
  • reaction buffer Clontech
  • the ⁇ -galactosidase activity is measured using a commercial luminometer. The results are expressed in total RLU (Relative Light Unit) per tumor.
  • the plasmid pXL2813-Pso-GA 19 -NLS expresses the transgene in vivo at a level greater than or equal to that obtained with the plasmid pXL2813 unmodified (see FIG. 13). 35
  • This example illustrates the characterization of the peptide part of the Pso-GA ⁇ 9 - NLS conjugates, that is to say the verification of the targeting properties of the NLS peptide associated with the constructions according to the invention.
  • the peptide sequence used is recognized by receptors of the ⁇ karyopherin family.
  • This example illustrates the possibility of coupling the oligonucleotide GA19-SH to the maleimide-NLS peptide.
  • the chimera is not modified by a photoactivatable alkylating agent.
  • the oligonucleotide GA 19 -SH of sequence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3 '(SEQ LD No. 4), with a thiol group at the 5' end, was coupled to the maleimide-NLS peptide which has a maleimide group with its N-terminal end under the same conditions as for the oligonucleotide Pso-GA ⁇ 9 -SH (see example 1).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • oligonucleotide-peptide chimera was analyzed by proteolytic action of trypsin as described in the section "Materials and methods”.
  • This example illustrates the possibility of forming triple helices between the plasmid pXL2813 and the chimera GA i9 -NLS in the absence of an alkylating agent.
  • FIG. 9 represents the kinetics of formation of the triple helices.
  • This example illustrates the characterization of the peptide part of the chimera GA19-NLS.
  • the peptide sequence used, the NLS signal of the SV40 T antigen, is recognized by receptors of the ⁇ karyopherin family, as already mentioned in example 4.
  • the raurin equivalent, called importin 60, fused to a glutathione S-transferase group, was used to characterize the oligonucleotide-peptide conjugates. It was operated as described in "Materials and Methods" under the section "Interactions with importines".
  • the pellet of beads (containing the elements interacting with the importins) is separated from the supernatant.
  • Example 9 This example illustrates the possibility of coupling the oligonucleotide 'pim-SH to the maleimide-NLS peptide.
  • the oligonucleotide pim-SH of sequence 5'-GGGGAGGGGGAGAG-3 '(SEQ LD No. 15), with a thiol group at the 5' end, was coupled to the maleimide-NLS peptide which has a maleimide group at its N-terminal end under the same conditions as for the oligonucleotide GA 19 -SH (see example 5).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • Example 10 This example illustrates the possibility of forming triple helices between the plasmid pXL2997 and the chimera pim-NLS in the absence of an alkylating agent.
  • FIG. 12 represents the kinetics of formation of the triple helices.

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux vecteurs capables de diriger des acides nucléiques vers des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques.

Description

VECTEURS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLEIQUES. COMPOSITIONS LES CONTENANT. ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs et leur utilisation pour le transfert d'acides nucléiques. Plus particulièrement, l'invention concerne de nouveaux vecteurs capables de diriger des acides nucléiques vers des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques.
Le transfert d'acides nucléiques est une technique à la base de toutes les applications majeures de la biotechnologie et l'augmentation de l'efficacité du transfert des acides nucléiques constitue un enjeu très important pour le développement de ces applications. L'efficacité du transfert des acides nucléiques dépend de nombreux facteurs parmi lesquels la capacité des acides nucléiques à atteindre la cellule cible, leur faculté à franchir la membrane plasmique et leur aptitude à être transportés au sein de la cellule jusqu'au noyau.
Un des obstacles majeurs à l'efficacité du transfert des acides nucléiques provient du fait que l'information génétique est souvent peu ou pas dirigée vers l'organe cible auquel elle est destinée. Par ailleurs, une fois que l'acide nucléique a pénétré dans la cellule cible, il doit encore être dirigé vers le noyau afin d'y être exprimé. De plus, dans le cas de transfert d'acides nucléiques dans des cellules différenciées ou quiescentes, le noyau est limité par une enveloppe nucléaire qui constitue une barrière supplémentaire au passage de ces acides nucléiques.
Les virus recombinants utilisés comme vecteurs possèdent des mécanismes évolués et efficaces pour guider les acides nucléiques jusqu'au noyau. Cependant, les vecteurs viraux présentent certains inconvénients inhérents à leur nature virale, qu'il n'est malheureusement pas possible d'exclure totalement. Une autre stratégie consiste donc soit à transfecter l'ADN nu, soit à utiliser des agents non viraux capables de promouvoir le transfert d'ADN dans des cellules eucaryotes. Mais les vecteurs non viraux ne possèdent pas de signaux de ciblage sub-cellulaires ou nucléaires. Ainsi, le passage de l'ADN nu, ou en combinaison avec un agent non-viral, du cytoplasme vers le noyau est par exemple une étape qui présente une efficacité très faible (Zabner et al., 1995).
Différentes tentatives d'attachement de signaux de ciblage ont ainsi été faites. Notamment, des fragments peptidiques pour le ciblage ont été attachés covalemment à des oligonucléotides dans une stratégie de ciblage d'un oligonucléotide antisense [Eritja et al., Synlhesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal séquence, Tetrahedron, Vol. 47, N° 24, pp. 4113-4120, 1991]. Les complexes ainsi formés sont de bons candidats comme inhibiteurs potentiels de l'expression de gènes endogènes.
Des vecteurs de transfection comprenant un polypeptide synthétique couplé par des interactions électrostatiques à une séquence d'ADN ont également été décrits dans la demande de brevet WO 95/31557, ledit polypeptide étant constitué d'une chaîne polymère d'acides aminés basiques, d'un peptide NLS, et d'une région charnière qui connecte le peptide NLS à la chaîne polymérique et permet d'éviter les interactions stériques. Mais ce genre de constructions pose un problème de stabilité car les interactions mises en jeu entre l'ADN et le signal de ciblage sont de nature électrostatique.
Il existe par ailleurs des chimères acide nucléique-peptide de ciblage spécifique décrites dans la demande de brevet WO 95/34664, la liaison entre les deux étant de nature chimique. Mais cette méthode passe notamment par des étapes enzymatiques difficilement contrôlables et ne permettant pas de produire de grandes quantités d'acides nucléiques.
Enfin, il a été montré qu'il est possible d'attacher une séquence NLS (« Nuclear Localisation Signal ») à un ADN plasmidique par l'intermédiaire d'un cyclopropapyrroloindole (Nature Biotechnology, Volume 16, pp. 80-85, janvier 1998). Mais une inhibition totale de la transcription du gène d'intérêt du fait de l'attachement au hasard de plusieurs centaines de séquences NLS sur le plasmide a été observée. Une solution proposée par les auteurs pour y remédier consiste à lier les séquences NLS sur des fragments linéaires d'ADN, puis à coupler ces fragments modifiés avec d'autres 3
fragments non-modifiés. Cependant, cette technique présente comme précédemment l'inconvénient de passer par au moins une étape enzymatique.
Ainsi, toutes les méthodes proposées jusqu'à présent ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au ciblage des ADN double brin.
La présente invention propose une solution avantageuse à ces problèmes. Plus particulièrement, la présente invention met en oeuvre des oligonucléotides conjugués à des signaux de ciblage et capables de former des triples hélices avec une/des séquence(s) spécifique(s) présente(s) sur une molécule d'ADN double brin.
Un tel vecteur présente l'avantage de pouvoir diriger un ADN double brin vers des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques grâce au signal de ciblage, sans que l'expression génétique ne soit inhibée. La demanderesse a en effet montré que, grâce à la formation de triples hélices site-spécifiques stables, il est désormais possible de lier un signal de ciblage à un ADN double brin de façon site-spécifique. En conséquence, il est possible de fixer le signal de ciblage en dehors de la cassette d'expression du gène à transférer. La demanderesse a ainsi montré que l'expression génétique dans la cellule n'est pas inhibée malgré la modification chimique de l'ADN. De plus, la présence d'une triple hélice comme moyen pour lier le signal de ciblage à l'ADN est particulièrement avantageuse car cela permet de conserver une taille d'ADN adaptée à la transfection.
Le vecteur obtenu présente de plus l'avantage d'incorporer des signaux de ciblage qui sont liés de façon très stable à l'ADN double brin, en particulier lorsque l'oligonucléotide susceptible de former la triple hélice est modifié par la présence d'un agent alkylant.
Un autre avantage de l'invention est de permettre de coupler l'ADN à transférer à des signaux de ciblage dont on contrôle à la fois le nombre et la nature. En effet, il est possible de contrôler le nombre de signaux de ciblage liés à chaque molécule d'ADN double brin en introduisant un nombre adapté de séquences spécifiques propices à la formation de triples hélices sur ladite molécule d'ADN double brin. De la même façon, il est possible d'introduire sur une même molécule d'ADN double brin plusieurs oligonucléotides liés à des signaux de ciblage différents (intracellulaires et/ou extracellulaires), et dans ce cas il est également possible d'en déterminer préalablement les proportions respectives. En outre, ces différents signaux de ciblage peuvent être fixés à la molécules d'ADN double brin de façon plus ou moins stable selon que la triple hélice est formée avec ou sans liaison covalente (c'est-à-dire avec ou sans l'utilisation d'un agent alkylant).
Enfin, la triple hélice fonctionnalisée obtenue ne résulte que d'étapes de transformations chimiques et peut donc être obtenue de façon simple, reproductible, et en très grandes quantités, notamment industrielles.
Un premier objet de l'invention concerne donc un vecteur utile en transfection capable de cibler une cellule et/ou un compartiment cellulaire spécifique. Plus particulièrement, le vecteur selon l'invention comprend une molécule d'ADN double brin et au moins un oligonucléotide couplé à un signal de ciblage et capable de former par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ladite molécule d'ADN double brin.
On entend au sens de l'invention par "ADN double brin" un acide désoxyribonucléique double brin qui peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, etc.. Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banque, par synthèse chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Il peut être modifié chimiquement ou enzymatiquement .
Cet ADN double brin peut être sous forme linéaire ou circulaire. Dans ce dernier cas, l'ADN double brin peut être dans un état superenroulé ou relâché. Préférentiellement, la molécule d'ADN est de forme circulaire et dans une conformation superenroulée.
L'ADN double brin peut également porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison à d'autres composants cellulaires, etc.. De préférence, l'ADN double brin comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
On entend au sens de l'invention par « cassette d'expression d'un gène d'intérêt » un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sîtes de restriction spécifiques. Le fragment d'ADN comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt et comprend en outre les séquences nécesaires à l'expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de polyadénylation...) de ladite séquence. La cassette et les sîtes de restriction sont conçus pour assurer une insertion de la cassette d'expression dans un cadre de lecture approprié pour la transcription et la traduction.
Il s'agit généralement d'un plasmide ou d'un épisome portant un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. A titre d'exemple on peut citer les plasmides décrits dans les demandes de brevet WO 96/26270 et WO 97/10343 incorporées à la présente par référence.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit thérapeutique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc.. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans le cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines [interleukines, interférons, TNF, etc (FR 92/03120)], les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques [BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pléiotrophine, etc, la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/1 1947)], la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs [p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93/04745)], les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation [Facteurs VII, VIII, IX], les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides [thymidine kinase, cytosine déaminase], les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes correspondant aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type apolipoprotéine choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-Il, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine lipase, la lipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha cholestérol hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de transfert de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la protéine de transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un récepteur choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-remnants et les récepteurs scavenger, etc...
L'ADN d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes d'intérêt thérapeutique comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201), ou les séquences codant des anticorps intracellulaires à simple chaîne comme par exemple les ScFv.
Comme indiqué plus haut, l'acide désoxyribonucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", du virus de la grippe, du cytomégalovirus (CMV), d'autres virus ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide désoxyribonucléique comprend également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule transfectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, etc... Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou répressible.
Une triple hélice correspond à la fixation d'un oligonucléotide modifié ou non sur de l'ADN double brin par des liaisons hydrogènes dites "de Hoogsteen" entre les bases du troisième brin et celles de la région en double hélice. Ces appariements se produisent dans le grand sillon de la double hélice et sont spécifiques de la séquence considérée [Frank-Kamenetski, M.D., Triplex DNA Structures, Ann. Rev. Biochem., 1995, 64, pp. 65-95]. La séquence spécifique en double hélice peut notamment être une séquence hornopurique-homopyrimidique. On distingue deux catégories de triples hélices suivant la nature des bases du troisième brin [Sun, J. and C. Hélène, Oligomicleotide-directed triple-helix formation, Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, 3, pp. 345-356] : les bases puriques permettent d'obtenir des appariements C-G*G et T-A*A, et les bases pyrimidiques permettent d'obtenir des appariements C-G*C+ et T-A*T (le symbole * correspond à l'appariement avec le troisième brin).
Ces structures ont été caractérisées du point de vue physico-chimique grâce à de nombreuses études de RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), de température d'hybridation ou de protection à des nucléases, ce qui a permis de définir leurs propriétés et leurs conditions de stabilité. Pour les triples hélices avec un troisième brin purique, ce brin est antiparallèle par rapport au brin purique de l'ADN et la formation de la triple hélice dépend fortement de la concentration en ions divalents : les ions tels que Mg2+ stabilisent la structure formée avec le troisième brin. Pour les triples hélices avec un troisième brin homopyrimidique, celui-ci est parallèle par rapport au brin purique, et la formation de la triple hélice est dépendante du pH : un pH acide inférieur à six permet la protonation des cytosines et la formation d'une liaison hydrogène supplémentaire stabilisant le triplet C-G*C+. Il existe également des triples hélices "mixtes" pour lesquelles le troisième brin porte des bases puriques et pyrimidiques. Dans ce cas, l'orientation du troisième brin dépend de la séquence de bases de la région homopurique.
Les oligonucléotides utilisés dans la présente invention sont des oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN double brin. Ces oligonucléotides peuvent contenir les bases suivantes : - thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T de l'ADN double brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859),
- adénine (A), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T de l'ADN double brin,
- guanine (G), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double brin. - cytosine protonée (C+), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double brin (Rajagopal et al précitée),
- uracile (U) qui est capable de former des triplets avec les paires de bases A.U ou AT.
Pour permettre la formation d'une triple hélice par hybridation, il est important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleures fixations et la meilleure sélectivité, on utilise pour le vecteur selon l'invention un oligonucléotide et une séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en particulier d'un oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA. A titre d'exemple, on peut citer l'oligonucléotide de séquence :
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT)7, SEQ LD N°l), dans lequel les bases GAGG ne forment pas de triples hélice mais permettent d'espacer l'oligonucléotide du bras de couplage. On peut également citer la séquence (CTT)7 (SEQ LD N°2). Ces oligonucléotides sont capables de former une triple hélice avec une séquence spécifique comportant des motifs complémentaires (GAA). Il peut s'agir en particulier d'une région comportant 7, 14, ou 17 motifs GAA. Une autre séquence d'intérêt spécifique est la séquence : 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ LD N°3). Cette séquence forme une triple hélice avec les oligonucléotides : 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ LD N°4) ou 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ LD N°5).
Dans ce cas, l'oligonucléotide se fixe dans une orientation antiparallèle au brin polypurique. Ces triples hélices ne sont stables qu'en présence de Mg2+ comme cela a été précisé précédemment (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251 ; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
La séquence spécifique peut être une séquence présente naturellement sur l'ADN double brin, ou une séquence synthétique ou d'origine naturelle introduite artificiellement dans celui-ci. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un oligonucléotide capable de former une triple hélice avec une séquence présente 10
naturellement sur l'ADN double brin. En effet, cela permet avantageusement d'obtenir les vecteurs selon l'invention avec des plasmides non-modifiés, notamment des plasmides commerciaux de type pUC, pBR322, pSV, etc... Parmi les séquences homopuriques-homopyrimidiques naturelles présentes sur l'ADN double brin, on peut citer une séquence comprenant tout ou partie de la séquence 5'- CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ LD N°6) présente dans l'origine de réplication ColEl de E. coli. Dans ce cas, l'oligonucléotide formant la triple hélice possède la séquence : 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ LD N°7) et se fixe alternativement sur les deux brins de la double hélice, comme décrit par Beal et Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 1 14, 4976-4982) et Jayasena et Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). On peut aussi citer- la séquence 5'- GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ LD N°8) du gène de la β-lactamase du plasmide pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508). Une autre séquence est AAGAAAAAAAAGAA (SEQ LD N° 9) présente dans l'origine de réplication γ des plasmides à origine de réplication conditionnelle tel que pCOR.
Bien que des séquences parfaitement complémentaires soient préférées, il est entendu toutefois que certains mésappariements peuvent être tolérés entre la séquence de l'oligonucléotide et la séquence présente sur l'ADN, dès lors qu'ils ne conduisent pas à une trop grande perte d'affinité. On peut citer la séquence 5'- AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ LD n°10) présente dans le gène de la β- lactamase de E. coli. Dans ce cas, la thymine interrompant la séquence polypurique peut être reconnue par une guanine du troisième brin, formant ainsi un triplet ATG qui est stable quand il est encadré par deux triplets TAT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 3 2829-2834). L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non modifiées) ou modifiées chimiquement. En particulier, l'oligonucléotide peut présenter avantageusement certaines modifications chimiques permettant d'augmenter sa résistance, sa protection vis-à-vis des nucléases, son affinité vis-à-vis de la séquence spécifique ou permettant encore d'apporter d'autres propriétés additionnelles (J. Goodchild, Conjugates of Oligonucléotides and Modified Oligonucléotides : A 11
Review of their Synthesis and Properties, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1 N°3, 1990, pp. 165-187).
Selon la présente invention on entend aussi par oligonucléotide tout enchaînement de nucléosides ayant subi une modification du squelette. Parmi les modifications possibles on peut citer, les oligonucléotides phosphorothioates qui sont capable de former des triples hélices avec l'ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), de même que les oligonucléotides possédant des squelettes formacétal ou méthylphosphonate (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113. 7767-7768). On peut également utiliser les oligonucléotides synthétisés avec des - anomères de nucléotides, qui forment également des triples hélices avec l'ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, L5, 7749-7760). Une autre modification du squelette est la liaison phosphoramidate. On peut citer par exemple la liaison internucléotidique N3'-P5' phosphoramidate décrite par Gryaznov et Chen, qui donne des oligonucléotides formant avec l'ADN des triples hélices particulièrement stables (J. Am. Chem. Soc, 1994, 1 16. 3143-3144). Parmi les autres modifications du squelette, on peut citer également l'utilisation de ribonucléotides, de 2'-0-méthylribose, de phosphotriester,...(Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1 16. 3143-3144). Le squelette phosphore peut enfin être remplacé par un squelette polyamide comme dans les PNA (Peptide Nucleic Acid), qui peuvent également former des triples hélices (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500 ; Kim et al., J. Am. Chem. Soc, 1993, 115. 6477-6481) ou par un squelette à base de guanidine, comme dans les DNG (déoxyribonucleic guanidine, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101), analogues polycationiques de l'ADN, qui forment également des triples hélices.
La thymine du troisième brin peut aussi être remplacée par une 5-bromouracile, ce qui augmente l'affinité de l'oligonucléotide pour l'ADN (Povsic et Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1989, 1 1 1, 3059-3061). Le troisième brin peut également contenir des bases non naturelles, parmi lesquelles on peut citer la 7-déaza-2'-déoxyxanthosine (Milligan et al., • Nucleic Acids Res., 1993, 2J, 327-333), la 1 -(2-déoxy-b-D- ribofuranosyl)-3-méthyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-βT|pyrimidine-7-one (Koh et Dervan, J. Am. Chem. Soc, 1992, LU, 1470-1478), la 8-oxoadénine, la 2- 12
aminopurine, la 2'-0-méthyl-pseudoisocytidine, ou toute autre modification connue de l'homme du métier (voir pour revue Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356).
Un autre type de modification de l'oligonucléotide a plus particulièrement pour objet d'améliorer l'interaction et/ou l'affinité entre l'oligonucléotide et la séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse consiste à coupler un agent alkylant à l'oligonucléotide. La liaison peut se faire soit chimiquement, soit photochimiquement par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel photoréactif. Des agents alkylants avantageux sont notamment les agents alkylants photoactivables, par exemple les psoralènes. Sous l'action de la lumière, ils forment des liaisons covalentes au niveau de bases pyrimidiques de l'ADN. Quand ces molécules sont intercalées au niveau de séquences 5'-ApT-3' ou 5'-TpA-3' dans un fragment d'ADN double brin, ils forment des liens avec les deux brins. Cette réaction de liaison induite par la lumière peut se produire sur un site spécifique du plasmide.
Comme cela a été souligné précédemment, un avantage de la présente invention est donc la possibilité de former des triples hélices très stables et site- spécifiques entre l'oligonucléotide et une séquence spécifique de l'ADN double brin grâce à une liaison covalente formée via un agent alkylant.
La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'au moins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30 bases. On utilise de manière avantageuse un oligonucléotide de longueur comprise entre 10 et 30 bases. La longueur peut bien entendu être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la stabilité de l'interaction recherchées.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synthétiseurs d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut également être utilisée. 13
Au sens de l'invention, on entend par « signal de ciblage » des molécules de ciblage de nature variée. Il s'agit dans la plupart des cas de peptides connus pour le ciblage. Ils peuvent être utilisés pour interagir avec un composant de la matrice extracellulaire, un récepteur de la membrane plasmique, pour cibler un compartiment intracellulaire ou pour améliorer le trafic intracellulaire d'ADN, lors du transfert non viral de gènes en thérapie génique.
Ces signaux de ciblage peuvent comprendre par exemple les facteurs de croissance (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), les cytokines (LL-1, LL-2, TNF, Interferon, CSF), les hormones (insuline, hormone de croissance, prolactine, glucagon, hormone thyroïdienne, hormones stéroidiennes), les sucres qui reconnaissent des lectines, les immunoglobulines, les ScFv, la transferrine, les lipoprotéines, les vitamines telles que la vitamine B12, les hormones peptidiques ou les neuropeptides (tachykinines, neurotensine, VIP, endothéline, CGRP, CCK, ...), ou tout motif reconnu par les intégrines, par exemple le peptide RGD, ou par d'autres protéines extrinsèques de la membrane cellulaire.
On peut utiliser des protéines entières, ou des séquences peptidiques dérivées de ces protéines, ou encore des peptides se fixant sur leur récepteur et obtenus par la technique de "phage display" ou par synthèse combinatoire.
Des signaux de ciblage intracellulaires peuvent être envisagés. Beaucoup de séquences d'adressage nucléaire (NLS) de composition en acides aminés variée ont été identifiées et permettent de cibler différentes protéines impliquées dans le transport nucléaire de protéines ou d'acides nucléiques. Parmi ces séquences figurent notamment des séquences courtes (le NLS de l'antigène T de SV40 (PKKKRKV, SEQ LD N°l 1) est un exemple), des séquences bipartites (le NLS de la nucléoplasmine qui contient deux domaines essentiels pour le transport nucléaire KRPAATKKAGQAKKKKLDK, SEQ LD N°12), ou la séquence M9 (NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, SEQ LD N°13) de la protéine hnRNPAl . Les protéines portant ces séquences NLS se fixent sur des récepteurs spécifiques, tels que les récepteurs de la famille des importines ou 14
karyophérines par exemple. Le rôle de ces séquence est de diriger l'ADN à l'intérieur du noyau, où il est alors immédiatement disponible pour la machinerie de transcription, et peut être exprimé.
Les signaux de ciblage "mixtes", c'est-à-dire qui peuvent à la fois servir pour le ciblage intracellulaire et extracellulaire, entrent également dans le cadre de la présente invention. On peut par exemple citer les sucres qui ciblent des lectines qui se situent sur la membrane cellulaire mais également au niveau des pores nucléaire. Le ciblage par ces sucres concerne donc aussi bien le ciblage extracellulaire que l'import nucléaire.
D'autres signaux sont impliqués dans le ciblage mitochondrial (par exemple, la partie N-terminale de l'ornithine transcarbamylase (OTC) de rat permet le ciblage des mitochondries) ou dans l'adressage vers le réticulum endoplasmique. Enfin, certains signaux permettent la rétention nucléaire ou au niveau du réticulum endoplasmique (tels que la séquence KDEL).
Avantageusement, les signaux de ciblage selon l'invention permettent de diriger spécifiquement l'ADN double brin vers certaines cellules ou certains compartiments cellulaires. A titre d'exemple, les signaux de ciblage selon l'invention peuvent cibler des récepteurs ou des ligands à la surface de la cellule, notamment les récepteurs de l'insuline, de la transferrine, de l'acide folique, ou tout autre facteur de croissance, cytokines, ou vitamines, ou des polysaccharides particuliers à la surface de la cellule ou sur la matrice extracellulaire avoisinante.
La synthèse de chimères oligonucléotide-signal de ciblage se fait en phase solide ou en solution et tient compte des propriétés de stabilité chimique très différentes des oligonucléotides et des signaux de ciblage [Erijita, R. et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal séquence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113-4120]. En solution, des couplages en une étape sont envisageables : le signal de ciblage peut par exemple être synthétisé avec un groupement portant des fonctions disulfure, maléimide, aminé, carboxyle, ester, époxyde, bromure de cyanogène, ou aldéhyde, et être couplé à un 15
oligonucléotide modifié par un groupement terminal thiol, aminé, ou carboxyle en position 3' ou 5' Ces couplages se forment par établissement de liaisons disulfure, thioéther, ester, amide, ou aminé entre l'oligonucléotide et le signal de ciblage Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que les réactifs de couplage bifonctionnel par exemple
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un vecteur tel que défini précédemment
Avantageusement, les vecteurs selon l'invention peuvent également être associés à un ou plusieurs agents connus pour transfecter l'ADN On peut citer à titre d'exemple les lipides cationiques qui possèdent des propriétés intéressantes Ces vecteurs sont en effet constitués d'une partie polaire, cationique, interagissant avec l'ADN, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration cellulaire et rendant l'interraction ionique avec l'ADN insensible au milieu externe. Des exemples particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques (DOTMA Lipofectin®), certains détergents cationiques (DDAB), les lipopolyamines et en particulier la dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5- carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidyléthanolamine (DPPES) dont la préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 1 1 1 Une autre famille intéressante de lipopolyamines est représentée par les composés décrits dans la demande de brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence. De nombreux autres lipides cationiques ont été développés et peuvent être utilisés avec les vecteurs selon l'invention
Parmi les agents de transfection synthétiques développés, les polymères cationiques de type polylysine et DEAE dextran sont également avantageux. Il est aussi possible d'utiliser les polymères de polyéthylène imine (PEI) et de polypropylene imine (PPI) qui sont accessibles commercialement et peuvent être préparés selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO 96/02655
D'une manière générale, tout agent synthétique connu pour transfecter l'acide nucléique peut être associé aux vecteurs selon l'invention 16
Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de s'associer aux complexes vecteur selon l'invention/agent de transfection et d'en améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la présente invention concerne donc des compositions comprenant un vecteur tel que défini précédemment, un ou plusieurs agents de transfection tels que définis ci-avant et un ou plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes vecteur selon Pinvention/agent(s) de transfection et d'en améliorer le pouvoir transfectant. La présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides ou protéines par exemple) peut permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés.
Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres dont l'utilisation est particulièrement avantageuse. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide neutre permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et de favoriser la pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la présente invention sont des lipides à 2 chaînes grasses. De manière particulièrement avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, z itterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. Il peuvent être choisis plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléoyl- palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingo yélines) ou encore les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des lipides naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également Lehninger, Biochemistry). 17
La demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non directement au niveau de la condensation de l'ADN (WO 96/25508). La présence d'un tel composé, au sein d'une composition selon l'invention permet de diminuer la quantité de composé transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante. Par composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on entend définir un composé compactant, directement ou non, l'ADN. Plus précisément, ce composé peut soit agir directement au niveau de l'ADN à transfecter soit intervenir au niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la condensation de cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au • niveau de l'ADN. Notamment, cet agent intervenant dans la condensation de l'ADN peut être tout polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation préféré, cet agent peut aussi être tout composé dérivant en tout ou partie d'une histone, d'une nucléoline, d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel agent peut également être constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la structure du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière continue ou non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature biochimique, par exemple par un ou plusieurs acides aminés, ou de nature chimique.
L'invention a également pour objet l'utilisation des vecteurs tels que définis ci- avant pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies par transfection d'ADN dans des cellules primaires ou dans des lignées cellulaires établies. Il peut s'agir de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, de la lignée hématopoiétique (lymphocytes, CD34, dendritiques, etc.), épithéliales, etc., sous formes différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Les vecteurs de l'invention peuvent à titre illustratif être utilisés pour la transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'ADN codant pour des protéines ou des polypeptides. 18
Pour des utilisations in vivo, soit en thérapie soit pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous- cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale, etc... De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit d'une injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou greffe.
L'invention concerne en outre une méthode de transfection d'ADN dans les cellules comprenant les étapes suivantes :
(1) synthèse de la chimère oligonucléotide - signal de ciblage selon le procédé décrit précédemment,
(2) mise en contact de la chimère synthétisée en (1) avec un ADN double brin pour former des triples hélices, (3) éventuellement, complexation du vecteur obtenu en (2) avec un ou plusieurs agents de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvant(s), et
(4) mise en contact des cellules avec le complexe formé en (2) ou le cas échéant en (3). 19
La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par incubation des cellules avec ledit complexe (pour de utilisations in vitro ou ex vivo), ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in vivo).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le traitement de maladies par administration d'un vecteur selon l'invention contenant un acide nucléique apte à corriger ladite maladie. Plus particulièrement, cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un produit protéique ou peptidique, l'ADN administré codant pour ledit produit protéique ou peptidique. La présente invention s'étend à toute utilisation d'un vecteur selon l'invention pour la transfection in vivo, ex vivo ou in vitro de cellules.
L'invention concerne également toute cellule recombinante contenant un vecteur tel que défini ci-avant. Il s'agit préférentiellement de cellules eucaryotes, par exemple des levures, des cellules animales, etc... Ces cellules sont obtenues par toute technique permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée et connue de l'homme du métier.
Les exemples suivants destinés à illustrer l'invention sans en limiter la portée,, permettent de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
FIGURES Figure 1 : Couplage d'un oligonucléotide (ODN) et du peptide maléimide-NLS.
Figure 2 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère oligonucléotide - peptide (Pso-GAι9-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo Pso-GAi9-SH
2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA]9-NLS 3 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA]9-NLS après digestion par la trypsine
Figure 3 : représentation schématique du plasmide pXL2813. 20
Figure 4 : représentation schématique du plasmide pXL2652.
Figure 5 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la formation de triples hélices entre le plasmide pXL2813 et la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAι9-NLS.
L'oligonucléotide pso-GAι9-NLS et le plasmide sont mélangés dans un tampon contenant 100 mM de MgCl2. L'excès en molarité de l'oligonucléotide par rapport au plasmide varie de 0 à 200. Le mélange est photoactivé, après une nuit à 37°C, puis digéré par deux enzymes de restriction qui coupent le plasmide de part et d'autre de la région de formation des triples hélices. 1 = pas d Oligonucléotide 2 = excès en molarité d Oligonucléotide par rapport au plasmide de 15
3 = excès en molarité d Oligonucléotide par rapport au plasmide de 50
4 = excès en molarité d' oligonucléotide par rapport au plasmide de 100
5 = excès en molarité d Oligonucléotide par rapport au plasmide de 200
6 = oligonucléotide seul photoactivé 7 = oligonucléotide seul non photoactivé
8 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 30, le mélange n'ayant pas été photoactivé.
Figure 6 : Expression in vitro du transgène (β-galactosidase) pour des essais effectués avec le plasmide pXL2813 seul, le vecteur pXL2813-Pso-GAι9-NLS, et sans plasmide.
Figure 7 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAi9-NLS par interaction avec l'importine 60-GST (analyse sur gel de polyacrylamide 15 %).
1 = oligo Pso-GAi9 (lμg)
2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAι9-NLS (lμg) 3 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'impor- tines 60 et de l'oligonucléotide Pso-GAι9, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant 21
4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de l'oligonucléotide Pso-GAι9, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant
5 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'impor- tines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAι9-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant
6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAι9-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant.
Figure 8 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère oligonucléotide- peptide (GA19-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo GA19-SH (200 ng)
2 = chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS (l μg) avant purification par chroma- tographie liquide à haute pression 3 = chimère oligonucléotide-peptide GAι9-NLS (l μg) après purification
4 = chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS après digestion par la trypsine (l μg).
Figure 9 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples hélices (% de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide pXL2813 et la chimère GAι9-NLS.
Figure 10 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère oligonucléotide- peptide GA19-NLS par interaction avec l'importine 60-GST.
1 = chimère oligonucléotide-peptide GA)9-NLS,
2 = oligo GAι9,
3 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide GAι9-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant,
4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant, 22
5 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de l'oligonucléotide GA19 et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant,
6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et de l'oligonucléotide GAJ9, et séparation du culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant.
Figure 1 1 : représentation schématique du plasmide pXL2997.
Figure 12 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples hélices (% de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide pXL2997 et la chimère pim-NLS.
Figure 13 : histogramme représentant l'activité β-galactosidase in vivo dans des tumeurs pulmonaires humaines H 1299 des plasmides pXL2813 (indiqué Bgal sur la figure) et ρXL2813-Pso-GAι9-NLS (indiqué NLS-Bgal sur la figure) en RLU (« Relative Light Unit ») par tumeur. La transfection a été faite en utilisant les techniques d'électrotransfert telles que décrites dans les demandes WO99/01157 et WO 99/01 158.
MATERIEL ET METHODES
1. Couplage des oligonucléotides et des peptides
Les oligonucléotides Les oligonucléotides utilisés sont soit la séquence 5'- AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ LD N°4) d'une longueur de 19 bases et référencée sous le nom de « GAι9 » dans la suite du texte, soit la séquence 5'- GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ LD N°15) d'une longueur de 13 bases et référencée sous le nom « pim » dans la suite du texte (car il s'agit de la séquence du protooncogène pim-1).
Les oligonucléotides notés GA19-SH ou pim-SH ont les mêmes séquences que GA19 et pim respectivement et un groupement thiol à l'extrémité 5', avec un espaceur de six carbones entre le thiol et le phosphate de l'extrémité 5'. Les oligonucléotides notés 23
Pso-GAι9-SH ont un groupement thiol à l'extrémité 3' (SH), et en plus, un psoralène à l'extrémité 5' (Pso), avec un espaceur de six carbones entre le psoralène et le phosphate de l'extrémité 5'. Les oligonucléotides notés Pso-GAι9 n'ont pas de groupement thiol.
La nomenclature utilisée est résumée dans le tableau I ci-dessous :
nom de l'oligonucléotide modification de l'extrémité 3 ' modification de l'extrémité 5 '
GA19 aucune aucune pim aucune aucune
*
GA19-SH aucune groupement thiol pi -SH aucune groupement thiol
Pso-GA)9 aucune psoralène
Pso-GA19-SH groupement thiol psoralène
Figure imgf000025_0001
Tableau I
Ces oligonucléotides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de triéthylammonium 100 mM, pH = 7.
Les peptides Les peptides utilisés pour les couplages sont synthétisés par un automate en phase solide. Ils contiennent :
- soit la séquence de localisation nucléaire de l'antigène T de SV40 (PKKKRKV, SEQ ID N°11),
- soit la même séquence mutée (PKNKRKV, SEQ LD N°14) qui ne permet ni le ciblage ni le transport nucléaire (du fait de la mutation).
Ces peptides portent également un espaceur de quatre acides aminés à l'extrémité N- terminale : KGAG. La lysine N-terminale est modifiée chimiquement: elle contient un groupement maléimide sur le carbone ε et un groupement protecteur 9- 24
fluorenylméthyloxycarbonyl (Fmoc) sur l'aminé du carbone α. Ce groupement Fmoc absorbe à 260 nm ce qui permet de suivre le peptide par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse. Le groupement C-terminal est également protégé (groupement CONH2), la protection étant ajoutée en fin de synthèse peptidique.
La représentation des peptides est indiquée dans le tableau II ci-dessous :
nom du peptide séquence et modifications maléimide KGAGPKKKRKV— CONH2 maléimide-NLS
Fmoc
maléimide KGAGPKNKRKV— CONH2 maléimide-NLSmuté
Fmoc
Figure imgf000026_0001
Tableau II
Les peptides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de triéthylammonium 100 mM, pH = 7. La concentration est de 0,4 mg/ml.
Les couplages Pour le couplage avec les oligonucléotides, la stratégie utilisée consiste à faire réagir le groupement thiol porté par l'oligonucléotide et le groupement maléimide porté par le peptide [Eritja, R., et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal séquence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113- 4120]. L'oligonucléotide est ajouté à la solution de peptide de façon équimolaire et le milieu réactionnel est laissé deux heures à température ambiante. La chimère oligonucléotide- peptide est purifiée par chromatographie liquide à haute pression en phase inverse, sur colonne Vydac C8 contenant de la silice sphéroïdale de diamètre 5 μm et de porosité 300 Â. On utilise un tampon acétate de triéthylammonium (TEAA) 0,1 M et un gradient d'acétonitrile passant de 5 % à 50 % en 35 minutes. Les produits sont détectés à 260 nm. 25
Analyse des chimères par digestion à la trypsine
Les conjugués oligonucléotide-peptide sont soumis à l'action protéolytique de la trypsine qui permet de mettre en évidence la partie peptidique de la chimère [Reed, M.W. et al, Synthesis and évaluation of nuclear targeting peptide-antisens oligodeoxynucleotide conjugates, Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, pp.101-108]. Des solutions contenant 1 μg d'oligonucléotide-peptide dans 7 μl de tampon de purification tréthylammonium (TEAA) 0, 1 M sont mélangés à 1 μl d'une solution de trypsine (5 mg/ml). On y ajoute 1 μl de tampon Tris 100 mM, HC1 pH = 9, et 1 μl d'EDTA 500 mM. Après une digestion d'une heure, les échantillons sont déposés dans les puits d'un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M. L' électrophorèse est faite en tampon Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,3. Les acides nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad.
2 . Formation de triples hélices avec les chimères
Le plasmide Le plasmide utilisé pour étudier la formation de triples hélices avec les chimères GAι9- peptide est appelé pXL2813 (7257 pb, voir figure 3). Ce plasmide exprime le gène de la β-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline. En amont du promoteur, entre les positions 7238 et 7256, la séquence GA19 (5'- AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', SEQ LD N°4) a été clonée selon les méthodes classiques de biologie moléculaire.
Elle a été clonée dans le plasmide pXL2652 (de 7391 pb et dont la représentation est schématisée dans la figure 4) qui exprime le gène de la β-Galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline. Ce promoteur provient de pCDNA3, le gène LacZ et son polyA proviennent de pCHl 10, et le reste provient de pGL2.
Les séquences ont été clonées en amont du promoteur entre les sites uniques de coupure des enzymes Muni et Xmal. Pour cela, les deux oligonucléotides complémentaires contenant la séquence à cloner 6651 (5'- AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3') et 6652 (3'- 26
CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5') ont été chauffés pendant 5 minutes à 95°C, puis hybrides en laissant la température redescendre lentement. Le plasmide pXL2652 a ensuite été digéré par les enzymes Muni et Xmal, pendant 2 heures à 37°C, et les produits de cette double digestion ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % et coloration au bromure d'éthidium.
Le fragment d'intérêt pour la suite du clonage a été élue selon le protocole Jetsorb (Genomed) et 200 ng de ce fragment ont été reliés à 10 ng du mélange d'oligonucléotides hybrides par la T4 ligase, pendant 16 heures à 16°C. Des bactéries E.Coli, compétentes, de souche DH5α ont été transformées par électroporation avec le produit de la réaction, étalées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu LB et de l'Ampicilline. Les clones résistants à l'Ampicilline ont été sélectionnés et l'ADN a été extrait par lyse alcaline et analysé sur gel d'agarose à 1 %. Un clone correspondant, en taille, au produit attendu a été séquence.
Dans les cas où l'oligonucléotide est pim, le plasmide utilisé pour étudier la formation de priple hélice est pXL2997 représenté à la figure 11. Ce plasmide exprime le gène de la β-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline. En amont du promoteur, la séquence pim (SEQ LD N°15) a été clonée selon les méthodes classiques de biologie moléculaire.
Formation des triples hélices
La formation des triples hélices s'effectue par mélange du plasmide pXL2813 (3 pmol de plasmide soit encore 15 μg) ou pXL2997 selon les cas et de quantités variables d'oligonucléotides ou de chimères dans un tampon Tris 100 mM, HC1 pH = 7,5 , et MgCl2 100 mM.
La photoactivation des triples hélices
Après une nuit d'incubation, le mélange est irradié, dans la glace, pendant 15 minutes, en utilisant une lampe monochromatique de longueur d'onde 365 nm (Biorad). Le produit de la photoactivation est digéré par les enzymes de restriction Mfel et Spel et analysé sur un gel de polyacrylamide 15 %, urée 7 M avec un tampon de migration Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, et pH = 8,3. Les acides nucléiques 27
sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Musso, M., J.C. Wang, and M.W.V.Dyke, In vivo persistence of DNA triple hélices containing psoralen-conjugated oligodeoxyribonucleotides, Nucleic Acid Research, 1996, 24(24), pp.4924-4932].
La méthode d'étude des triple hélices
Cette méthode est basée sur le principe de chromatographie d'exclusion de solutions contenant le plasmide et l'oligonucléotide susceptibles de former une triple hélice. Les colonnes d'exclusion utilisées (Columns, Linkers 6, Boehringer Mannheim) sont composées de billes de sépharose et ont pour limite d'exclusion 194 paires de bases ce qui permet de retenir dans la colonne les oligonucléotides non appariés aux plasmides.
Dans un premier temps, les oligonucléotides sont marqués radioactivement en leur extrémité 3' par la Terminal Transferase à l'aide de dATPα-^S. Le protocole utilisé provient d'Amersham : 10 pmol d'oligonucléotides sont incubés pendant 2 heures à 37°C, avec 50 μCi de dATPα^S en présence de 10 unités de Terminal Transferase, dans un volume de 50 μl de tampon contenant du cacodylate de sodium. Le pourcentage d'oligonucléotides marqués est évalué selon la méthode suivante : lμl d'un échantillon dilué au 1/100 de la solution après marquage est déposé sur papier Whatman DE81, en double. L'un des deux papiers est lavé deux fois pendant 5 minutes avec du 2xSSC, pendant 30 secondes avec de l'eau et pendant 2 minutes avec de l'éthanol. Les radioactivités des deux papiers sont comparées. La radioactivité du papier lavé correspond au 35s effectivement incorporé.
La formation des triple hélices se fait dans un volume de 35 μl. Les concentrations de plasmides (40 nM) et d'oligonucléotides (20 nM), le tampon utilisé (100 mM de Tris HC1 pH = 7,5, 50 mM de MgCl2) et la température (37°C) sont fixes tandis que le temps d'incubation varie de 1 à 24 heures. Les colonnes de sépharose sont équilibrées, avant utilisation, avec le tampon de réaction et centrifugées à 2200 tr/min pendant 4 minutes, pour les tasser. 25 μl du milieu réactionnel sont déposés sur les colonnes et celles-ci sont centrifugées dans les mêmes conditions que précédemment. 25 μl du 28
tampon de réaction sont ensuite déposés sur les colonnes qui sont à nouveau centrifugées. L'éluat est récupéré.
La radioactivité contenue dans 5 μl du milieu réactionnel, notée cpm(dépôt), et celle contenue dans l'éluat, notée cpm(éluat), sont évaluées ce qui permet d'estimer le pourcentage d'oligonucléotides élues :
% d'oligonucléotides élues = cpm(éluat) / [5 x cpm(dépôt)]xl00.
Le pourcentage de plasmides qui sont effectivement élues au cours des expériences est évalué en estimant la densité optique à 260 nm de l'éluat et celle du dépôt, ce qui permet de calculer le pourcentage d'oligonucléotides fixés sur la totalité des plasmides :
% d'oligonucléotides fixés = [% oligonucléotides élues / % plasmides éluésjxlOO.
Ce paramètre permet d'évaluer le pourcentage de sites de formation de triples hélices (il en existe un par plasmide pXL2813 ou pXL2997) qui sont effectivement occupés en tenant compte des concentrations de plasmides (notée [plasmide]) et d'oligonucléotides (notée [oligo]) utilisés lors de la réaction de formation des triple hélices : % sites triple hélice occupés = % d'oligonucléotides fixés x [oligo] / [plasmide].
3. Interaction avec les importines
Les protéines recombinantes La sous-unité importine 60 utilisée pour étudier l'interaction avec les conjugués oligonucléotide-peptide (NLS ou NLSmuté) est d'origine murine et fusionnée à la Glutathion S-Transferase (GST). La séquence de l'importine 60 a été clonée dans un vecteur pGEX-2T pour la fusionner à la GST. La protéine recombinante a été produite dans Escherichia coli [Imamoto, N. et al., In vivo évidence for involvement ofa 58kDa component of nuclearpore-targeting complex in nuclear protein import, The EMBO Journal, 1995, 14(15), pp. 3617-3626].
Les interactions avec les protéines recombinantes 29
Toutes les expériences d'interaction sont menées dans le tampon de fixation (HEPES 20 mM, pH = 6,8, acétate de potassium 150 mM, acétate de magnésium 2 mM, DTT 2 mM, et BSA 100 μg/ml).
Dans un premier temps, les protéines recombinantes sont incubées en présence de billes de sépharose recouvertes de groupements glutathion (Pharmacia Biotech) 1 μg de protéine recombinante est utilisé pour 10 μl de billes. Après une incubation de 30 minutes, à température ambiante, dans 500 μl de tampon de fixation, le mélange est centrifugé à 2000 G pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. Les billes sont lavées cinq fois par resuspension dans 500 μl de tampon de fixation et centrifugation, comme décrit ci-avant. Les billes sont resuspendues dans du tampon de fixation pour obtenir une suspension contenant 50 % de billes recouvertes de protéines recombinantes.
Dans un second temps, 60 μl de la suspension contenant 50 % de billes recouvertes de protéines recombinantes sont incubés avec 2 μg d' oligonucléotide ou d' oligonucléotide-peptide, dans un volume de 500 μl de tampon de fixation. Après une incubation de 30 minutes, à température ambiante, le mélange est centrifugé à 2000G pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. 30 μl du surnageant sont collectés pour analyser la fraction non fixée sur les billes. Les billes sont lavées cinq fois par resuspension dans 500 μl de tampon de fixation et centrifugation, comme décrit ci- avant. Les billes sont resuspendues dans 15 μl de tampon de charge (bleu de bromophénol 0,05 %, saccharose 40 %, EDTA 0,1 M, pH = 8, sodium lauryl sulfate 0,5 %) et chauffées 10 minutes à 90°C. Le contenu du surnageant et du culot est analysé sur un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M, avec un tampon de migration Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,3. Les acides nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Rexach, M. and G. Blobel, Protein import into nuclei : association and dissociation reactions involving transport substrate, transport factors, and nucleoporins, Cell, 1995, 83, pp. 683-692].
4. Transfection de cellules
Culture cellulaire 30
Le type cellulaire utilisé est NLH3T3 (ATCC CRL-1658). Il s'agit de fibroblastes de souris. Ces cellules sont cultivées dans un milieu Dulbecco modifié, avec du glucose 4,5 g/1 (DMEM - Gibco), de la glutamine 2 mM, de la pénicilline (100 U/ml) et de la streptomycine (100 μg/ml), et 10 % de sérum de veau foetal (Gibco). Elles sont incubées à 37°C dans une étuve à 5 % de C02.
La transfection
Un jour avant la transfection, les puits d'une plaque de 24 puits sont ensemencés avec 50000 cellules par puit. Les vecteurs sont dilués dans du NaCl 150 mM et mélangés à un lipide cationique (le composé de formule condensée H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)i7CH3]2 décrit dans la demande brevet WO 97/18185 sous le numéro (6)), dilué dans du NaCl 150 mM. Le mélange se fait avec 6 nmol de lipide par microgramme de plasmide. Ce mélange est dilué au 1/10 dans du milieu de culture sans sérum et déposé sur les cellules. Après une incubation à 37°C dans une étuve à 5 % de C02 pendant deux heures, on ajoute 10 % de sérum de veau foetal.
La quantification de la β-galactosidase
Après une incubation de 48 heures, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et lysées avec 250 μl de tampon de lyse (Promega). La β-galactosidase est quantifiée selon le protocole « Lumigal β-Galactosidase genetic reporter system » (Clontech). L'activité est mesurée sur un luminomètre Lumat LB9501 (Berthold). La quantité de protéines est mesurée avec le kit BCA (Pierce).
EXEMPLES
Exemple 1
Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide Pso-GAι -SH au peptide maléimide-NLS.
L'oligonucléotide Pso-GAι9-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', avec un groupement thiol à l'extrémité 3', a été couplé au peptide NLS qui porte un groupement maléimide à son extrémité N-terminale selon la méthode décrite 31
précédemment dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "couplage des oligonucléotides et des peptides".
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total, et la chimère est purifiée par CLHP.
Le schéma réactionnel du couplage est représenté à la figure 1.
La chimère oligonucléotide-peptide (Pso-GAι9-NLS) a été analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide après action protéolytique de la trypsine qui permet de mettre en évidence la présence de la partie peptidique de la chimère, après migration sur gel de polyacrylamide dénaturant et coloration des acides nucléiques par l'argent (comme indiqué dans la partie "Matériel et méthodes" sous la section "Analyse des chimères par digestion à la trypsine").
La chimère Pso-GAι9-NLS présente une migration électrophorétique retardée par rapport à l'oligonucléotide Pso-GA!9-SH, et le produit de la digestion protéolytique est visualisé à un niveau intermédiaire entre les niveaux de migration de Pso-GAι - NLS et de Pso-GAι9-SH, comme cela apparaît sur la figure 2.
La chimère Pso-GAi9-NLS contient donc une partie peptidique accessible à la trypsine. Ces résultats montrent clairement que le couplage entre l'oligonucléotide et le peptide s'est opéré, et le rendement du couplage est important.
Exemple 2
Cet exemple illustre la formation de triples hélices entre le plasmide pXL2813 et la chimère Pso-GAι9-NLS qui est modifiée par un agent alkylant photoactivable. Cet exemple indique également quelle est la proportion de plasmides modifiés selon l'excès en molarité d'oligonucléotides par rapport au plasmide. Le plasmide pXL2813, représenté à la figure 3, comporte la séquence homopurique complémentaire de GAι9 qui est susceptible de former une triple hélice avec les oligonucléotides GAι9, Pso-GAι9, Pso-GAι9-SH ou Pso-GA]9-NLS. Les cations divalents, tel que Mg2+, stabilisent ces triples hélices. L'oligonucléotide Pso-GAi9-NLS 32
et le plasmide sont mélangés dans un tampon contenant 100 mM de MgCl2. L'excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide varie de 0 à 200.
Après incubation pendant 12 heures à 37°C, le mélange est photoactivé pendant 15 minutes (comme indiqué dans la partie "matériel et méthodes" sous la section "Photoactivation des triples hélices"), puis digéré par les deux enzymes de restriction Mfel et Spel qui coupent le plasmide de part et d'autre de la région de formation des triples hélices. On libère ainsi un fragment d'acides nucléiques qui contient 70 paires de bases après digestion du plasmide pXL2813 non modifié. Le fragment obtenu avec le plasmide et l'oligonucléotide formant une triple hélice lié covalemment à la double hélice compte 70 paires de bases plus 19 bases de l'oligonucléotide. Par migration sur un gel de polyacrylamide dénaturant, on peut ainsi séparer ces fragments de taille différente: les fragments provenant de plasmides modifiés par une triple hélice ont une distance de migration plus courte que les fragments provenant de plasmides non modifiés. On peut donc, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant, quantifier la proportion de plasmides modifiés selon l'excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide.
Les résultats sont indiqués à la figure 5. Pour un excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide supérieur à 50, tous les plasmides sont modifiés et sont associés à un oligonucléotide Pso-GAι9-NLS. Sans photoactivation, on perd le retardement du fragment de digestion en gel dénaturant.
Il apparaît ainsi que les triples hélices formées avec les oligonucléotides Pso-GAι9-SH ou Pso-GAι9-NLS sont donc bien liées covalemment à la double hélice après photoactivation.
Par ailleurs, en digérant le reste du squelette plasmidique et en l'analysant comme précédemment, on peut vérifier que la photoactivation n'entraîne pas de liaison covalente non spécifique de l'oligonucléotide Pso-GAι9-NLS en dehors de la région contenant la séquence susceptible de former une triple hélice.
Ces résultats mettent clairement en évidence les conditions permettant d'associer spécifiquement et covalemment une séquence peptidique à un plasmide, et ce en 33
dehors du promoteur régulant l'expression du transgène, ce qui évite que l'expression du transgène n'en soit affectée.
Exemple 3
Cet exemple illustre la capacité du transgène à être exprimé in vitro bien que le plasmide soit modifié.
L'expression de la β-galactosidase par les plasmides pXL2813 non modifiés ou associés à un oligonucléotide Pso-GAi9-NLS a ainsi été comparée par transfection de cellules NLH3T3.
Les résultats sont reportés dans la figure 6, et les moyennes des valeurs obtenues (± écart type) sont rassemblées dans le tableau III suivant :
expression du transgène plasmide (en RLU/μg de protéine) pXL2813 253759 ± 48545 pXL2813-Pso-GAi9-NLS 473984 ± 111476
sans plasmide 129 ± 85
Figure imgf000035_0001
Tableau III
On constate que l'expression du transgène augmente suite à la modification apportée par la fixation covalente d'une triple hélice en amont du promoteur.
Ces résultats mettent clairement en évidence que la formation des triples hélices n'affecte pas l'expression du transgène in vitro. Au contraire, grâce à l'adressage nucléaire du plasmide du fait de son couplage à la séquence de ciblage NLS, davantage de plasmides ont atteint le noyau, et il en résulte une augmentation de l'efficacité de transfection.
Exemple 4
Cet exemple a pour but de vérifier que l'expression in vivo n'est pas inhibée par la présence d'un signal de ciblage associé au plasmide via une triple hélice. 34
L'expérience consiste à transfecter pXL2813 et pXL2813-Pso-GAι9-NLS dans des tumeurs pulmonaires humaines H1299 en utilisant les techniques d'électrotransfert décrites dans les demandes WO 99/01157 et WO 99/01 158. L'expérience a été réalisée chez la souris nude femelle de 18 à 20 g. Les souris sont implantées monolatéralement avec des greffons de tumeurs H 1299 de 20 mm3. Les tumeurs se développent pour atteindre un volume de 200 à 300 mm3. Les souris sont triées en fonction de leur tailles tumorales et réparties en lots homogènes. Puis les souris sont anesthésiées avec un mélange Kétamine/Xylazine (disponible commercialement). La solution de plasmide (8 μg d'ADN/40 μl de chlorure de sodium 150 mM) est injectée longitudinalement en périphérie de la tumeur à l'aide d'une seringue Hamilton.
Les faces latérales de la tumeur sont enduites de gel conducteur et la tumeur est placée entre deux électrodes plates en acier inoxydable distante de 0,45 à 0,7 cm. Les impulsions électriques sont appliquées à l'aide d'un générateur d'impulsions carrées du commerce (Electro-pulsateur PS 15, Jouan, France) 20 à 30 secondes après l'injection. Un oscilloscope permet de contrôler l'intensité en volts, la durée en millisecondes et la fréquence en hertz des impulsions qui doivent être délivrées à 500 V/cm pendant 20 millisecondes et à 1 hertz.
Pour l'évaluation de la transfection tumorale, 10 et 7 souris respectivement pour le plasmide pXL2813 et pXL2813-Pso-GA19-NLS sont euthanasiées 2 jours après l'injection du plasmide. Les tumeurs sont prélevées, pesées et boyées dans un tampon de lyse (Promega) additionné d'antiprotéases (Complète, Boehringer). La suspension obtenue est centrifugée afin d'obtenir un surnageant clair. Après avoir incubé 10 μl de ce surnageant avec 250 μl de tampon de réaction (Clontech) pendant 1 heure à l'obscurité, l'activité β-galactosidase est mesurée à l'aide d'un luminomètre du commerce. Les résultats sont exprimés en RLU (« Relative Light Unit ») totaux par tumeur.
On constate que le plasmide pXL2813-Pso- GA19-NLS exprime le transgène in vivo à un niveau supérieur ou égal à celui obtenu avec le plasmide pXL2813 non-modifié (voir figure 13). 35
Exemple 5
Cet exemple illustre la caractérisation de la partie peptidique des conjugués Pso-GAι9- NLS, c'est-à-dire la vérification des propriétés de ciblage du peptide NLS associé aux constructions selon l'invention. La séquence peptidique utilisée, le signal NLS de l'antigène T de SV40, est reconnue par des récepteurs de la famille des karyophérines α. L'équivalent murin, appelé importine 60, fusionné à un groupement glutathion S -transferase, a été utilisé pour caractériser les conjugués oligonucléotide-peptide. Il a été opéré selon la méthode décrite dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "Interactions avec les importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et les oligonucléotides GAι9-NLS ou Pso-GA19-NLS ont été étudiées. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant Le résultat de cette caractérisation est reporté à la figure 7. Cette figure indique que l'oligonucléotide Pso-GA]9-NLS est associé aux billes de glutathion, tandis que l'oligonucléotide Pso-GAι9 reste dans le surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide Pso-GAι9-NLS à interagir avec l'importine α. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est donc bien reconnue par son récepteur, ce qui signifie que le peptide remplit effectivement son rôle de signal de ciblage.
Exemple 6
Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide GA19-SH au peptide maléimide-NLS. Contrairement à l'exemple 1, la chimère n'est pas modifiée par un agent alkylant photoactivable.
L'oligonucléotide GA19-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ LD N° 4), avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé au peptide maléimide-NLS qui possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale dans les mêmes conditions que pour l'oligonucléotide Pso-GAι9-SH (voir exemple 1). 36
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
La chimère oligonucléotide-peptide a été analysée par action protéolytique de la trypsine comme décrit dans la partie "Matériel et méthodes".
Le résultat est représenté sur la Figure 8. Il est comparable à celui obtenu avec l'oligonucléotide Pso-GAι9-SH.
Exemple 7
Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le plasmide pXL2813 et la chimère GAi9-NLS en l'absence d'agent alkylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL2813 et la chimère GA19-NLS obtenue comme décrit dans l'exemple 5, a été menée et étudiée selon la technique décrite dans la partie"Matériel et Méthodes", sous la section "Formation des triples hélices avec la chimère". La figure 9 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et en oligonucléotide de 20 nM, on forme une triple hélice stable.
Exemple 8
Cet exemple illustre la caractérisation de la partie peptidique de la chimère GA19-NLS. La séquence peptidique utilisée, le signal NLS de l'antigène T de SV40, est reconnue par des récepteurs de la famille des karyophérines α, comme cela a déjà été mentionné à l'exemple 4. L'équivalent raurin, appelé importine 60, fusionné à un groupement glutathion S-transferase, a été utilisé pour caractériser les conjugués oligonucléotide- peptide. Il a été opéré comme décrit dans "Matériel et Méthodes" sous la section "Interactions avec les importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et les oligonucléotides GAι9 ou GA19-NLS ont été étudiées. Après une incubation de 30 37
minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du surnageant.
Les résultats sont indiqués sur la figure 10. Il aparait que l'oligonucléotide GA19-NLS est associé aux billes de glutathion, tandis que l'oligonucléotide GA19 reste dans le surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide GA19-NLS à interagir avec l'importine α. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est donc bien reconnue par son récepteur, et remplie là encore son rôle de signal de ciblage.
Exemple 9 Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide' pim-SH au peptide maléimide-NLS.
L'oligonucléotide pim-SH, de séquence 5'-GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ LD N°15), avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé au peptide maléimide-NLS qui possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale dans les mêmes conditions que pour l'oligonucléotide GA19-SH (voir exemple 5).
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en phase inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures, le couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
Exemple 10 Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le plasmide pXL2997 et la chimère pim-NLS en l'absence d'agent alkylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL2997 et la chimère pim-NLS (formation obtenue comme décrit dans l'exemple 8), a été menée et étudiée selon la technique décrite dans la partie "Matériel et Méthodes", sous la section "Formation des triples hélices avec la chimère".
La figure 12 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et en oligonucléotide de 20 nM, on forme une triple hélice stable. 38
L'invention étant à présent complètement décrite, il est évident que de nombreuses modifications peuvent être apportées à la présente invention sans pour autant s'écarter de l'esprit de l'invention et de la portée des revendications qui suivent.

Claims

39REVENDICATIONS
1. Vecteur de transfert d'acides nucléiques caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'ADN double brin et au moins un oligonucléotide couplé à un signal de ciblage et capable de former une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur ladite molécule d'ADN double brin.
2. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 1 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin est un plasmide ou un épisome.
3. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 2 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin est un plasmide sous forme circulaire et dans un état superenroulé.
4. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la molécule d'ADN double brin comprend une cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt sous contrôle d'un ou plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actif dans les cellules de mammifères.
5. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 4 caractérisé en ce que le gène d'intérêt est un acide nucléique codant pour un produit thérapeutique.
6. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin est une séquence homopurique-homopyrimidique.
7. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin est une séquence présente naturellement sur l'ADN double brin ou une séquence synthétique ou naturelle introduite artificiellement dans l'ADN double brin. 40
8. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend une séquence poly-CTT et la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin est une séquence poly-GAA.
9. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend la séquence GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID N° 1 ) ou bien la séquence (CTT)7 (SEQ LD N° 2).
10. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin comprend la séquence 5*-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ LD N°3) et l'oligonucléotide comprend la séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ D N°4) ou 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ LD N°5).
1 1. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin comprend tout ou partie de la séquence 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ ID N°6) comprise dans l'origine de réplication ColEl de E. coli, et l'oligonucléotide possède la séquence 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ LD N°7).
12. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin comprend la séquence 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEQ ID N°8) ou la séquence 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ LD N°10) comprises dans le gène β- lactamase du plasmide pBR322 et de E. Coli respectivement.
13. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin comprend la séquence 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEQ ID n°9) présente dans 41
l'origine de réplication γ des plasmides à origine de réplication conditionnelle tel que pCOR.
14. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend au moins 3 bases.
15. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 14 caractérisé en ce que l'oligonucléotide comprend 5 à 30 bases.
16. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 15 caractérisé en ce que l'oligonucléotide présente au moins une modification chimique le rendant résistant aux, ou protégé vis-à-vis des nucléases, ou augmentant son affinité vis-à-vis de la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN double brin.
17. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que l'oligonucléotide est un enchaînement de nucléosides ayant subi une modification du squelette.
18. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 16 caractérisé en ce que l'oligonucléotide est couplé à un agent alkylant formant une liaison covalente au niveau des bases de l'ADN double brin.
19. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 18 caractérisé en ce que ledit agent alkylant est photoactivable.
20. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 18 et 19 caractérisé en ce que ledit agent alkylant est un psoralène.
21. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 20 caractérisé en ce que le signal de ciblage interagit avec un composant de la matrice extracellulaire, un récepteur de la membrane plasmique, cible un compartiment intracellulaire, et/ou améliore le trafic intracellulaire de l'ADN double brin. 42
22. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisé en ce que ledit signal de ciblage comprend les facteurs de croissance (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), les cytokines (IL-1, LL-2, TNF, Interferon, CSF), les hormones (insuline, hormone de croissance, prolactine, glucagon, hormone thyroïdienne, hormones stéroidiennes), les sucres qui reconnaissent des lectines, les immunoglobulines, la transferrine, les lipoprotéines, les vitamines telles que la vitamine B12, les hormones peptidiques ou les neuropeptides (tachykinines, neurotensine, VIP, endothéline, CGRP, CCK, ...), ou tout motif reconnu par les intégrines, par exemple le peptide RGD, ou par d'autres protéines extrinsèques de la membrane cellulaire.
23. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisé en ce que le signal de ciblage est un signal de ciblage intracellulaire, tel qu'une séquence d'adressage nucléaire (NLS).
24. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 23 caractérisée en ce que ledit signal d'adressage nucléaire est la séquence NLS de l'antigène T de SV40.
25. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon la revendication 21 caractérisée en ce que le signal de ciblage permet à la fois le ciblage extracellulaire et le ciblage intracellulaire.
26. Vecteur de transfert d'acides nucléiques selon les revendications 1 à 25 caractérisé en ce que le couplage du signal de ciblage à l'oligonucléotide est obtenu par synthèse en phase solide ou en solution, notamment par l'établissement de liaisons disulfure, thioéther, ester, amide, ou aminé.
27. Composition caractérisée en ce qu'elle contient au moins un vecteur tel que défini dans l'une des revendication 1 à 26.
28. Composition selon la revendication 27 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs agents transfectant. 43
29. Composition selon la revendication 28 caractérisée en ce que l'agent transfectant est un lipide cationique, une lipopolyamine, ou un polymère cationique.
30. Composition selon les revendications 27 à 29 caractérisée en ce qu'elle contient en outre un ou plusieurs adjuvant(s) capable de s'associer aux complexes vecteur tel que défini dans l'une des revendications 1 à 25/agent transfectant.
31. Composition selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'adjuvant est un ou plusieurs lipides neutres choisis parmi les lipides synthétiques ou naturels, zwitterioniques ou dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologiques.
32. Composition selon l'une des revendications 30 ou 31 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les lipides à deux chaînes grasses.
33. Composition selon les revendications 30 à 32 caractérisée en ce que le ou les lipides neutres sont choisis parmi les dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE), l'oléylpalmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), le di-stéaroyl, -palmitoyl, -mirystoyl phosphatidyléthanolamine ainsi que leurs dérivés N-méthylés 1 à 3 fois, les phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les cérébrosides (tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que notamment les sphingomyélines), et les asialogangliosides (tels que notamment les asialoGMl et GM2).
34. Composition selon la revendication 30 caractérisée en ce que l'adjuvant est ou comprend un composé intervenant au niveau de la condensation de l'ADN.
35. Composition selon la revendication 34 caractérisée en ce que ledit composé dérive en tout ou en partie d'une histone, d'une nucléoline, et/ou d'une protamine, ou est constitué en tout ou en partie de motifs peptidiques (KTPKKAKKP) et/ou (ATPAKKAA) répétés de manière continue ou non, le nombre de motifs pouvant varier entre 2 et 10. 44
36. Composition selon l'une quelconque des revendications 27 à 35 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable.
37. Composition selon l'une quelconque des revendications 27 à 35 caractérisée en ce qu'elle comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une application sur la peau et/ou sur les muqueuses.
38. Utilisation d'un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26 pour la fabrication d'un médicament destiné à soigner les maladies.
39. Méthode de transfection d'acides nucléiques dans des cellules caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
(1) synthèse de la chimère oligonucléotide - signal de ciblage,
(2) mise en contact de la chimère synthétisée en (1) avec un ADN double brin pour former des triples hélices, (3) éventuellement, complexation du vecteur obtenu en (2) avec un ou plusieurs agent de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvant(s), et
(4) mise en contact des cellules avec le complexe formé en (2) ou le cas échéant en (3).
40. Méthode de traitement de maladies par administration d'un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26 contenant un
ADN double brin apte à corriger ladite maladie.
41. Cellule recombinante contenant un vecteur de transfert d'acides nucléiques tel que défini dans l'une des revendications 1 à 26.
42. Cellule recombinante selon la revendication 41 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule eucaryote.
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