KR20010074456A

KR20010074456A - 핵산 전달 벡터, 이를 함유한 조성물 및 용도

Info

Publication number: KR20010074456A
Application number: KR1020007010485A
Authority: KR
Inventors: 시올리나카롤; 쉐르망다니엘; 윌즈피에르
Original assignee: 추후제출; 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2001-08-04
Also published as: CN1292827A; WO1999049067A1; HUP0102413A3; AU3406200A; IL138624A0; NO20004648D0; CA2323831A1; BR9909044A; JP2002507429A; PL342944A1; AU758406B2; EP1066396A1; NO20004648L; HUP0102413A1

Abstract

본 발명은 신규 벡터 및 핵산 전달을 위한 이의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 특정 세포 또는 세포 구획으로 핵산을 향하게 할 수 있는 신규 벡터에 관한 것이다.

Description

핵산 전달 벡터, 이를 함유한 조성물 및 용도{NUCLEIC ACID TRANSFER VECTORS, COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND USES}

핵산 전달은 생물공학의 모든 주된 적용의 기초를 형성하는 기술이고, 핵산 전달 효율의 증가는 이들 적용의 개발에 있어 매우 중요한 도전 사항이다. 핵산 전달 효율은 다수의 인자에 좌우되며, 이들 중 원형질 막을 가로지르는 핵산의 능력과 세포내 핵으로 전달되는 능력이 있다.

핵산 전달 효율에 대한 주된 장애물 중 하나는 유전 정보가 종종 불량하거나 의도된 표적 기관으로 향하지 않는다는 사실에 기초한다. 또한, 일단 핵산이 표적 세포로 침투되면, 핵으로 향해 그 곳에서 발현될 수 있어야 한다. 또한, 분화 세포 또는 휴지 세포로 핵산을 전달하는 경우, 핵은 핵 엔벨로프에 의해 경계가 정해져 이들의 핵산 통과에 대해 부가적인 장벽을 이룬다..

벡터로서 사용된 재조합 바이러스는 핵산을 핵까지 인도하는 정교하면서도 효율적인 메카니즘을 가진다. 그러나, 바이러스 벡터는 불행하게도 완전히 배제될수 없는 그들 바이러스 성질의 고유 단점을 가진다. 또다른 방법은 네이키드 DNA를 형질 감염시키거나, 진핵생물 세포로 DNA 전달을 촉진할 수 있는 비바이러스 제제를 이용하는 데 있다. 그러나, 비바이러스 벡터는 아세포 또는 핵 표적화 시그널을 보유하고 있지 않다. 이에 따라 네이키드 DNA, 또는 이의 비바이러스 제제와의 조합물을 세포질에서 핵으로의 전달은 예를 들면 매우 낮은 효율을 지닌 단계이다(Zabner et al., 1995).

표적화 시그널을 부착하고자 하는 다수의 시도가 있어 왔다. 특히, 표적을 위한 펩티드 분획이 안티센스-올리고뉴클레오티드-표적화법으로 올리고뉴클레오티드에 공유적으로 부착되었다[Eritja et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, Vol. 47, No. 24, pp. 4113-4120, 1991]. 이렇게 형성된 복합체는 내인성 유전자 발현의 잠재적 저해제로서 우수한 후보자이다.

DNA 서열과 정전기 상호작용에 의해 커플링된 합성 폴리펩티드를 포함하는 형질 감염 벡터가 특허 출원 WO95/31557에 기재되어 있으며, 염기성 아미노산의 폴리머 체인, NLS 펩티드 및 힌지 영역으로 구성된 상기 폴리펩티드에서 NLS 펩티드가 폴리머 체인에 연결되어 입체 상호작용을 피할 수 있다. 그러나, 이러한 타입의 작제물은 DNA와 표적화 시그널간의 행위로 불리는 상호작용이 정전기성이기 때문에 안정성의 문제를 가진다.

또한, 특허 출원 WO 95/34664에 기재된 핵산-특이성 표적화 펩티드 키메라가 존재하며, 둘 사이의 결합은 화학적 성질이다. 그러나, 이러한 방법은 특히 통제가어렵고 다량의 핵산을 생성할 수 없는 효소적 단계를 수반한다.

마지막으로, 사이클로프로파피롤로인돌에 의해 NLS("핵 국지 시그널") 서열을 플라스미드 DNA에 부착시킬 수 있는 것으로 나타났다(Nature Biotechnology, Volume 16, pp. 80-85, January 1998). 그러나, 수 백개의 NLS 서열이 플라스미드상으로 랜덤하게 부착되기 때문에 관련 유전자의 형질 감염의 완전한 저해가 관찰되었다. 이를 개선시키기 위해 저자가 제안한 일 방법은 NLS 서열을 DNA의 선형 분획과 연결시킨 다음 이들 변형된 분획을 기타 변형되지 않은 분획과 커플링시키는 데 있다. 그러나, 상기 기술과 마찬가지로 이러한 기술은 적어도 하나의 효소적 단계를 수반하는 단점을 가진다.

이에 따라, 지금까지 제안된 모든 방법은 이중 가닥 DNA의 표적화와 연관된 어려움을 만족스럽게 해결할 수 없었다.

본 발명은 신규 벡터 및 핵산 전달을 위한 이의 용도에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 핵산을 세포 또는 특정 세포 구획으로 향하게 할 수 있는 신규 벡터에 관한 것이다.

도 1: 올리고뉴클레오티드(ODN)와 펩티드 말레이미드-NLS의 커플링도.

도 2: 15% 폴리아크릴아미드 겔상에서 트립신의 단백질 분해 작용에 의한 올리고뉴클레오티드-펩티드(Pso-GA₁₉-NLS) 키메라의 분석도.

1 = 올리고 Pso-GA₁₉-SH

2 = 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라

3 = 트립신에 의한 분해 후의 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라

도 3: 플라스미드 pXL2813의 개략도.

도 4: 플라스미드 pXL2652의 개략도.

도 5: 15% 폴리아크릴아미드 겔상에서 플라스미드 pXL2813과 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라 사이의 삼중 나선 형성 분석도. 올리고뉴클레오티드 pso-GA₁₉-NLS와 플라스미드를 100 mM MgCl₂를 함유한 완충액에서 혼합한다. 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량은 0 내지 200으로 달라진다. 혼합물을 광활성화시키고, 37℃에서 밤새 둔 다음, 삼중 나선 형성 영역 중 한쪽에서 플라스미드를 절단하는 두개의 제한 효소로 분쇄한다.

1 = 올리고뉴클레오티드 없음

2 = 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량 15

3 = 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량 50

4 = 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량 100

5 = 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량 200

6 = 광활성화된 올리고뉴클레오티드 단독

7 = 광활성화 되지 않은 올리고뉴클레오티드 단독

8 = 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량 30, 혼합물은 광활성화 되지 않음.

도 6 = 플라스미드 pXL2813 단독, 벡터 pXL2813-Pso-GA₁₉-NLS, 및 플라스미드 없이 수행된 시험에 대한 트랜스유전자(β-갈락토시다제)의 시험관내 발현도.

도 7: 임포틴 60-GST와의 상호작용에 의한 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라의 펩티드 부분의 특징 분석도(15% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석).

1 = 올리고 Pso-GA₁₉(1㎍)

2 = 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라(1 ㎍)

3 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후에 회수된 상등액, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호 작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

4 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후 회수된 펠릿, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

5 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후에 회수된 상등액, 및 상등액으로부터 (임포틴과 반응하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

6 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드-펩티드 Pso-GA₁₉-NLS 키메라로 코팅된글루타티온-비드의 배양 후 회수된 펠릿, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

도 8: 트립신의 단백질 분해 작용에 의한 올리고뉴클레오티드-펩티드 (GA₁₉-NLS) 키메라의 15% 폴리아크릴아미드 겔상 분석도.

1 = 올리고 GA₁₉-SH (200 ng)

2 = 고-해상 액체 크로마토그래피에 의한 정제 전 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라(1㎍)

3 = 정제 후 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라(1㎍)

4 = 트립신을 이용한 절단 후 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라 (1 ㎍)

도 9: 플라스미드 pXL2813과 키메라 GA₁₉-NLS간의 삼중 나선 형성(시간의 함수에 따라 차지된 삼중 나선 부위 %)의 동역학 그래프도.

도 10: 임포틴 60-GST와의 상호작용에 의한 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라의 펩티드 부분의 특징 분석도.

1 = 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라,

2 = 올리고 GA₁₉

3 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후 회수된 상등액, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

4 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉-NLS 키메라로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후 회수된 펠릿, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

5 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드-펩티드 GA₁₉로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후 회수된 상등액, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

6 = 임포틴 60과 올리고뉴클레오티드 GA₁₉로 코팅된 글루타티온-비드의 배양 후 회수된 펠릿, 및 상등액으로부터 (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿의 분리.

도 11: 플라스미드 pXL2997의 개략도.

도 12: 플라스미드 pXL2997과 키메라 pim-NLS 사이의 삼중 나선 형성(시간의 함수에 따라 차지된 삼중 나선 부위 %)의 동역학 그래프도.

도 13: 플라스미드 pXL2813(도면에서 Bgal로 표시) 및 pXL2813-Pso-GA₁₉-NLS(도면에서 NLS-Bgal로 표시)의 생체내 인간 폐 종양 H1299에서의 β-갈락토시다제 활성을 도시한 막대 그래프도(RLU(상대적 광 단위)/종양).

출원 WO 99/01157과 WO 99/01158에 기재된 전기전달 기술에 의해 형질 감염을 수행했다.

재료 및 방법

1. 올리고뉴클레오티드와 펩티드의 커플링

올리고뉴클레오티드

사용된 올리고뉴클레오티드는 19 염기 길이의 서열 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(서열 번호 4)(이하 "GA₁₉"로 언급함), 또는 13 염기 길이의 서열 5'-GGGGAGGGGGAGG-3'(서열 번호 15)(이하 "pim"으로 하며, 이는 프로토온코진 pim-1의 서열이기 때문)이다.

GA₁₉-SH 또는 pim-SH로 나타낸 올리고뉴클레오티드는 각각 GA₁₉및 pim과 동일한 서열, 및 티올과 5' 말단의 포스페이트 사이에 6개 탄소의 스페이서를 지닌 5' 말단에 티올 그룹을 가진다. Pso-GA₁₉-SH로 나타낸 올리고뉴클레오티드는 3' (SH) 말단에 티올 그룹과, 부가적으로는 5' (Pso) 말단에 소랄렌을 가지며, 소랄렌과 5' 말단의 포스페이트 사이에는 6 탄소 원자의 스페이서가 존재한다. Pso-GA₁₉로 나타낸 올리고뉴클레오티드는 티올 그룹을 가지지 않는다.

사용된 명명법은 하기 표 I에 요약되어 있다.:

올리고뉴클레오티드의 명칭	3' 말단의 변형	5' 말단의 변형
GA₁₉	없음	없음
pim	없음	없음
GA₁₉-SH	없음	티올 그룹
pim-SH	없음	티올 그룹
Psi-GA₁₉	없음	소랄렌
Pso-GA₁₉-SH	티올 그룹	소랄렌

이들 동결 건조 올리고뉴클레오티드를 100 mM 트리메틸암모늄 아세테이트 완충액, pH = 7에 취한다.

펩티드

커플링에 사용된 펩티드를 고체 상에서 자동기로 합성한다. 이는

- SV40 T 항원의 핵 국지 서열(PKKKRKV, 서열 번호 11),

- 또는 돌연변이된 동일한 서열(PK NKRKV, 서열 번호 14)[(돌연변이로 인해) 표적화도 핵 전달도 불가능함]을 함유한다.

이들 펩티드는 또한 N-말단에 4개의 아미노산:KGAG 스페이서를 운반한다. N-말단 라이신은 화학적으로 변형된다: 이는 말레이미드 그룹 및 ε 탄소 및 α 탄소의 아민상에 보호 그룹 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)을 함유한다. 이 Fmoc 그룹은 역상 고-해상 액체 크로마토그래피에 의해 펩티드를 모니터링할 수 있는 260 nm를 흡수한다. C-말단 그룹도 보호되고(CONH₂그룹), 이 보호는 펩티드 합성의 마지막에 첨가된다.

대표적인 펩티드가 하기 표 II에 나타나 있다:

펩티드의 명칭	서열 및 변형
말레이미드-NLS	말레이미드-KGAGPKKKRKV-CONH₂Fmoc
돌연변이된 말레이미드-NLS	말레이미드-KGAGPKNKRKV-CONH₂Fmoc

동결 건조 펩티드를 100 mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액, pH = 7에 넣는다. 농도는 0.4 mg/㎖이다.

커플링

올리고뉴클레오티드와의 커플링을 위해, 사용된 방법은 올리고뉴클레오티드에 의해 운반된 티올 그룹을 펩티드에 의해 운반된 말레이미드 그룹과 반응시키는 데 있다[Eritja, R., et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113-4120].

올리고뉴클레오티드를 등몰량으로 펩티드 용액에 첨가하고 반응 매질을 실온에서 2시간 동안 유지한다. 올리고뉴클레오티드-펩티드 키메라를 5 ㎛의 직경 및 300 Å의 다공성을 지닌 구형 실라카를 함유한 Vydac C8 컬럼상에서 역상 고압 액체 크로마토그래피로 정제한다. 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA) 완충액과 35분에 걸쳐 5%에서 50%에 이르는 아세토니트릴 구배를 이용한다. 산물은 260 nm에서 검출된다.

트립신으로 절단된 키메라의 분석

올리고뉴클레오티드-펩티드 접합체를 트립신의 단백질 분해 작용을 받게하여 키메라의 펩티드 부분을 드러낼 수 있다[Reed, M.W. et al., Synthesis and evaluation of nuclear targeting peptide-anti-sense oligodeoxynucleotide conjugates, Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, pp. 101-108]. 0.1 M 트리에틸암모늄(TEAA) 정제 완충액 7 ㎕내에 올리고뉴클레오티드-펩티드 1 ㎍을 함유한 용액을 트립신 용액(5 mg/㎖) 1 ㎕와 혼합한다. 100 mM Tris-HCl 완충액(pH = 9) 1 ㎕ 및 500 mM EDTA 1 ㎕를 여기에 첨가한다. 1시간 동안 절단한 후, 샘플을 15% 폴리아크릴아미드, 7 M 우레아, 겔의 웰로 침착시킨다. 90 mM 붕산 및 1 mM EDTA를 함유한 1 mM Tris 완충액, pH 8.3에서 전기영동을 수행한다. Biorad 키트를 이용한 은 염색으로 핵산을 확인한다.

2. 키메라와의 삼중 나선 형성

플라스미드

GA₁₉-펩티드 키메라와의 삼중 나선 형성 연구에 사용된 플라스미드는 pXL2813(7257 bp, 도 3 참조)으로 불린다. 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자, 및 앰피실린 내성 유전자의 강한 프로모터의 통제하에 β-갈락토시다제 유전자를 발현시킨다.

프로모터 상류, 위치 7238과 7256 사이의, GA₁₉서열(5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', 서열 번호 4)을 통상적인 분자 생물학 기술에 따라 클로닝한다.

이를 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자와 앰피실린 내성 유전자의 강한 프로모터의 통제하에 β-갈락토시다제 유전자를 발현시키는 플라스미드 pXL2652(7391 bp 및 도 4에서 개략적으로 도시됨)중으로 클로닝한다. 이 프로모터는 pCDNA3에서 유도되고, LacZ 및 이의 폴리A는 pCH110에서 유도되며, 나머지는 pGL2에서 유도된다.

서열을 효소 MunI와 XmaI의 유일한 절단 부위 사이의 프로모터의 상류에 클로닝한다. 이를 위해, 클로닝될 서열 6651(5'-AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3') 및6652(3'-CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5')를 함유한 두개의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 95 ℃에서 5분간 가열한 다음 온도를 서서히 내리면서 하이브리드화시킨다. 플라스미드 pXL2652를 37 ℃에서 효소 MunI와 XmaI을 이용하여 2 시간 동안 절단하고 이러한 이중 절단의 산물을 1% 아가로스 겔상에서 전기영동에 의해 분리한 다음 에티디움 브로마이드로 염색한다.

나머지 클로닝을 위한 관련 분획을 Jetsorb 프로토콜(Genomed)에 따라 용출하고 이 분획 200 ng을 16 ℃에서 16 시간 동안 T4 리가제에 의해 하이브리드화된 올리고뉴클레오티드의 혼합물 10 ng에 연결시킨다.

LB 배지 및 앰피실린을 함유한 페트리 디쉬상에 놓인 반응 산물을 전기천공시켜 DH5α 균주의 캄피턴트 이.콜라이 박테리아를 형질 전환시킨다. 앰피실린-내성 클론을 분리한 다음 DNA를 알칼리 용해로 추출하여 1% 아가로스 겔상에서 분석한다. 예상된 산물과 크기면에서 동일한 클론을 서열 분석한다.

올리고뉴클레오티드가 pim인 경우, 삼중 나선 형성 연구에 사용된 플라스미드는 도 11에 도시된 pXL2997이다. 이 플라스미드는 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 유전자, 및 앰피실린 내성 유전자의 강한 프로모터의 통제하에 β-갈락토시다제를 위한 유전자를 발현시킨다.

프로모터 상류의 서열 pim(서열 번호 15)을 통상적인 분자 생물학법에 따라 클로닝한다.

삼중 나선 형성

경우에 따라, 플라스미드 pXL2813(플라스미드 3 pmol, 즉 15 ㎍) 또는pXL2997을, 100 mM MgCl₂를 함유한 100 mM Tris-HCl 완충액(pH = 7.5)내의 다양한 양의 올리고뉴클레오티드 또는 키메라와 혼합하여 삼중 나선을 형성한다.

삼중 나선의 광활성화

밤새 배양한 후, 365 nm(Biorad)의 파장을 지닌 단일 파장 램프를 이용하여 아이스에서 15분간 혼합물을 비춘다. 광활성화한 산물을 제한 효소 MfeI과 SpeI으로 절단하고 90 mM 붕산과 1 mM EDTA를 함유한 100 mM Tris 이동 완충액(pH = 8.3)으로 15% 폴리아크릴아미드, 7 M 우레아, 겔상에서 분석한다. Biorad 키트를 이용하는 은 염색에 의해 핵산을 확인한다[Musso, M., J.C. Wang, and M.W.V.Dyke, In vivo persistence of DNA triple helices containing psoralen-conjugated oligodeoxyribonucleotides, Nucleic Acid Research, 1996, 24(24), pp. 4924-4932].

삼중 나선 연구법

이 방법은 삼중 나선을 형성할 수 있는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 함유한 용액의 배제 크로마토그래피의 원리에 기초한다. 사용된 배제 컬럼(컬럼, 링커 6, Boehringer Mannheim)은 세파로스 비드로 구성되고 194 염기쌍의 배제 한계를 가지고 있어, 플라스미드와 쌍을 이루지 않은 올리고뉴클레오티드를 컬럼에 보유할 수 있다.

첫번째 예에서, 올리고뉴클레오티드를 [α-³⁵S]dATP에 의해 말단 트랜스퍼라제를 이용하여 3' 말단에 올리고뉴클레오티드를 방사능 라벨링한다. 사용된 프로토콜은 Amersham의 것이다: 올리고뉴클레오티드 10 pmol을 37 ℃에서 2시간 동안 말단 트랜스퍼라제 10 단위의 존재하에 [α-³⁵S]dATP 50 μCi와 함께, 나트륨 카코딜레이트를 함유한 완충액 50 ㎕ 용적에서 배양한다. 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 퍼센티지를 하기의 방법에 따라 측정한다: 라벨링 후 용액의 샘플(1/100으로 희석됨) 1 ㎕를 두 개의 와트만 DE81 페이퍼상에 침착시킨다. 두 페이퍼 중 하나를 2xSSC로 5분, 물로 30초 및 에탄올로 2분간 2회 세척한다. 두 페이퍼의 방사능을 비교한다. 세척된 페이퍼의 방사능은 효과적으로 도입된³⁵S에 상응한다.

삼중 나선의 형성은 35 ㎕의 용적에서 일어난다. 플라스미드(40 nM)와 올리고뉴클레오티드(20 nM)의 농도, 사용된 완충액(100 mM Tris-HCl pH = 7.5, MgCl₂50 mM) 및 온도(37℃)는 고정하고 배양 시간을 1 내지 24시간으로 변화시킨다. 세파로스 컬럼을 사용전에 반응 완충액으로 평형화시키고 2200 rpm에서 4분간 원심분리시켜, 정치시킨다. 반응 매질 25 ㎕를 컬럼상에 침착시키고 후자를 상기와 동일한 조건하에 원심분리한다. 반응 완충액 25 ㎕를 컬럼상에 침착시키고 다시 원심분리한다. 용출물을 회수한다.

반응 매질 5 ㎕에 함유되고, cpm(침착)으로 표시되는 방사능과, 용출물에 함유되고, cpm(용출물)으로 표시되는 방사능을 평가하면, 용출된 올리고뉴클레오티드의 퍼센티지를 추정할 수 있다:

용출된 올리고뉴클레오티드% = cpm(용출물)/[5 x cpm(침착물)] x 100

실험동안 효과적으로 용출된 플라스미드의 퍼센티지는 260 nm에서의 용출물의 광학 밀도와 침착물의 광학 밀도를 측정하여 평가되는데, 이로 인해 총 플라스미드에 부착된 올리고뉴클레오티드의 퍼센티지를 계산할 수 있다.

부착된 올리고뉴클레오티드% = [용출된 올리고뉴클레오티드%/용출된 플라스미드%] x 100.

이러한 파라미터는 삼중 나선 형성 반응 동안 사용된 플라스미드의 농도([플라스미드]로 표시)와 올리고뉴클레오티드의 농도([올리고]로 표시)를 고려하여, 효과적으로 차지된 삼중 나선 형성 부위의 퍼센티지(1/플라스미드 pXL2813 또는 pXL2997)를 평가할 수 있다:

차지된 삼중 나선 부위% = 부착된 올리고뉴클레오티드% x [올리고]/[플라스미드].

3. 임포틴과의 상호작용

재조합 단백질

올리고뉴클레오티드-펩티드(NLS 또는 돌연 변이된 NLS) 접합체와의 상호작용 연구에 사용된 임포틴 60 서브유닛은 쥐 기원이고 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 융합한다. 임포틴 60의 서열을 벡터 pGEX-2T로 클로닝시켜 이를 GST와 융합시킨다. 재조합 단백질을 이 콜라이에서 생성시킨다[Imamoto, N. et al., In vivo evidence for involvement of a 58 kDa component of nuclearpore-targeting complex in nuclear protein import, The EMBO Journal, 1995, 14(15), pp. 3617-3626].

재조합 단백질과의 상호작용

모든 상호작용 실험을 결합 완충액(20 mM HEPES, pH = 6.8, 150 mM 칼륨 아세테이트, 2 mM 마그네슘 아세테이트, 2 mM DTT 및 100 ㎍/㎖ BSA)에서 수행한다.

초기 예에서, 재조합 단백질을 글루타티온(Pharmacia Biotech)으로 코팅된 세파로스 비드의 존재하에 배양하고, 재조합 단백질 1 ㎍을 비드 10 ㎕의 경우에 사용한다. 결합 완충액 500 ㎕에서 실온에서 30분간 배양한 후, 혼합물을 2000 g에서 30초간 원심분리하고, 상등액을 추출한다. 비드를 결합 완충액 500 ㎕에 재현탁시켜 5회 세척한 다음 앞서 기재된 바와 같이 원심분리한다. 비드를 결합 완충액에 재현탁시켜 재조합 단백질로 코팅된 비드 50%를 함유한 현탁물을 얻는다.

두번째 경우, 재조합 단백질로 코팅된 비드 50%를 함유한 현탁물 60 ㎕를 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드-펩티드 2 ㎍과 함께, 결합 완충액 500 ㎕ 용적에서 배양한다. 실온에서 30분간 배양한 후, 혼합물을 2000 g에서 30초간 원심분리하고, 상등액을 추출한다. 상등액 30 ㎕를 모아 비드에 부착되지 않은 분획을 분석한다. 비드를 결합 완충액 500 ㎕에서 재현탁시켜 5회 세척한 다음 앞서 기재된 바와 같이 원심분리한다. 비드를 로딩 완충액(0.05% 브로모페놀 블루, 40% 수크로스, 0.1 M EDTA, pH = 8, 0.5% 나트륨 라우릴 설페이트) 15 ㎕에 재현탁하고 90℃에서 10분간 가열한다. 상등액과 펠릿의 함량을 90 mM 붕산과 1 mM EDTA를 함유한 100 mM Tris 이동 완충액(pH = 8.3)으로 15% 폴리아크릴아미드, 7 M 우레아, 겔상에서 분석한다. 핵산은 Biorad 키트를 사용하여 은 염색에 의해 확인된다[Rexach, M. and G. Blobel, Protein import into nuclei: associationand dissociation reactions involving transport substrate, transport factors, and nucleoporins, Cell, 1995, 83, pp. 683-692].

4. 세포의 형질 감염

세포 배양

사용된 세포 타입은 NIH 3T3(ATCC CRL-1658)이다. 이는 마우스 섬유아세포로 구성된다. 이들 세포를 변형된 Dulbecco 배지에서 4.5 g/ℓ 글루코스(DMEM-Gibco), 2 mM 글루타민, 페니실린(100 U/㎖) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖), 및 10% 태 송아지 혈청(Gibco)과 함께 배양한다. 이를 37 ℃에서 5% CO₂를 함유한 배양기에서 배양한다.

형질 감염

형질 감염 하루 전, 24-웰 플레이트의 웰을 웰당 50,000 세포로 배양한다. 벡터를 150 mM NaCl에서 희석하고 150 mM NaCl로 희석된 양이온 지질(번호(6)하에 특허 출원 WO 97/18185에 기재된 간략화된 식 H₂N(CH₂)₃NH(CH₂)₄NH(CH₂)₃NHCH₂COGlyN[(CH₂)₁₇CH₃]₂를 가진 화합물)과 혼합한다. 이 혼합물을 플라스미드 1 마이크로그램당 6 nmol 지질이 되게한다. 이 혼합물을 무혈청 배양 배지에서 1/10으로 희석하고 이를 세포에 침착시킨다. 37℃에서 5% CO₂를 함유한 배양기에서 2시간 동안 배양한 후, 10% 태 송아지 혈청을 첨가한다.

β-갈락토시다제의 정량

48시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고 용해 완충액(Promega)250 ㎕로 용해시킨다. β-갈락토시다제를 프로토콜 "루미갈 β-갈락토시다제 유전자 리포터 시스템"(Clontech)에 따라 정량한다. 활성을 Lumat LB9501 루미노미터(Berthold)로 측정한다. 단백질의 양을 BCA 키트(Pierce)로 측정한다.

본 발명은 이들 문제점을 위한 유리한 해결책을 제공한다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 표적화 시그널과 접합되고 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 1 이상의 특정 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용한다.

이러한 벡터는 유전자 발현의 저해없이 표적화 시그널에 의해 세포 또는 특정 세포 분획으로 이중 가닥 DNA를 향하게 할 수 있는 이점을 가진다. 본 출원인은 안정한 부위-특이성 삼중 나선의 형성에 의해 부위 특이적인 방법으로 표적화 시그널을 이중 가닥 DNA에 연결할 수 있음을 실제로 보여주었다. 결과적으로, 유전자를 형질 감염시키기 위해 발현 카세트 외부에 표적화 시그널을 부착시킬 수 있다. 본출원인은 세포에서 유전자 발현이 DNA의 화학적 변형에도 불구하고 저해되지 않음을 보여주었다. 또한, 표적화 시그널을 DNA에 결합시키는 수단으로서 삼중 나선의 존재가 특히 유리한데 이는 이것이 형질 감염에 적절한 DNA 크기를 보존할 수 있기 때문이다.

또한, 얻어진 벡터는 특히 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 알킬화제의 존재하에 변형될 때 이중 가닥 DNA에 매우 안정하게 연결되는 표적화 시그널을 도입하는 이점을 가진다.

본 발명의 또다른 이점은 형질 감염될 DNA를 표적화 시그널(이의 수와 성질 모두 조절됨)에 커플링시킬 수 있다는 점이다. 실제로, 삼중 나선의 형성에 적절한 적당한 수의 특정 서열을 이중 가닥 DNA 분자에 도입시켜 각 이중 가닥 DNA 분자에 연결된 표적화 시그널의 수를 조절할 수 있다. 또한, 여러 표적화 시그널에 연결된 다수의 올리고뉴클레오티드를 동일한 이중 가닥 DNA 분자에 도입할 수 있고(세포내 및/또는 세포외), 이 경우 개개 비율을 미리 결정할 수도 있다. 부가적으로, 이들 각종 표적화 시그널은 삼중 나선이 공유 결합의 존재 또는 부재하에(즉 알킬화제의 사용 또는 비사용) 형성되는 지에 따른 보다 높거나 보다 낮은 정도의 안정한 방법으로 이중 가닥 DNA 분자에 부착될 수 있다.

결국, 얻어진 작용화된 삼중 나선은 화학 전환 단계에 의해서만 생성되며 이에 따라 단순한 방법, 재현가능하면서 매우 대규모로, 특히 산업적 규모로 얻어질 수 있다.

본 발명의 제 1 주제는 세포 및/또는 특정 세포 구획을 표적화할 수 있는 형질 감염에 유용한 벡터에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명에 따른 벡터는 이중 가닥 DNA 분자 및, 표적화 시그널에 커플링되고 하이브리드화에 의해 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 적어도 일 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 목적상, "이중 가닥 DNA"는 인간, 동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스 기원 등일 수 있는 이중 가닥 데옥시리보핵산을 의미하는 것으로 한다. 이는 업계의 숙련인에게 공지된 기술, 특히 라이브러리 선별, 라이브러리 선별에 의해 얻어진 서열의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 이는 화학적 또는 효소적으로 변형될 수 있다.

이러한 이중 가닥 DNA는 선형 또는 환형일 수 있다. 후자의 경우, 이중 가닥 DNA는 초나선 또는 이완 상태일 수 있다. 바람직하게는, DNA 분자는 환형 및 초나선 형태이다.

이중 가닥 DNA는 또한 표적 세포에서 기능적이거나 비기능적인 복제 기원, 1 이상의 마커 유전자, 전사 또는 복제 조절 서열, 관련 치료 유전자, 변형되거나 변형되지 않은 안티센스 서열, 기타 세포 성분과 결합하는 영역 등을 운반할 수 있다. 바람직하게는, 이중 가닥 DNA는 표적 세포에서 활성인 1 이상의 프로모터와 전사 종결자의 통제하에 1 이상의 관련 유전자로 구성된 발현 카세트를 포함한다.

본 발명의 목적상, "관련 유전자에 대한 발현 카세트"는 특정 제한 부위에서 벡터로 삽입될 수 있는 DNA 분획을 의미하는 것으로 이해한다. DNA 분획은 관련 RNA 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 부가적으로는 상기 서열의 발현 (인핸서(들), 프로모터(들), 폴리아데닐화 서열 등)에 필요한 서열을 포함한다. 카세트 및 제한 부위는 발현 카세트를 전사 및 해독에 적절한 개방 해독 프레임으로 삽입되도록 고안된다.

이는 일반적으로는 1 이상의 관련 치료 유전자를 운반하는 플라스미드 또는 에피솜이다. 예를 들자면, 본원에서 참고된 특허 출원 WO 96/26270 및 WO 97/10343에 기재된 플라스미드가 언급될 수 있다.

본 발명의 목적상, 관련 치료 유전자는 특히 치료 효과를 지닌 단백질 산물을 암호화하는 임의 유전자를 의미하는 것으로 한다. 이렇게 암호화된 치료 산물은 특히 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 이 단백질 산물은 표적 세포와 관련해 상동성일 수 있다(즉 후자가 병리 상태가 없을 때 표적 세포에서 보통 발현되는 산물임). 이 경우, 단백질의 발현은 예를 들면 세포에서의 불충분한 발현 또는, 변형으로 인해 불활성이거나 약하게 활성인 단백질의 발현을 약화시키거나, 상기 단백질을 과발현시킬 수 있다. 관련 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연 변이체를 암호화할 수도 있다. 단백질 산물은 또한 표적 세포에 대해 이종성일 수 있다. 이 경우, 발현된 단백질은 예를 들면 세포에서 결핍된 활성을 보충하거나 제공할 수 있어, 병리 상태를 퇴치하거나, 면역 반응을 자극할 수 있다.

본 발명의 목적상 치료 산물 중, 좀더 구체적으로는 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인[인터루킨, 인터페론, TNF 등 (FR 92/03120)], 생장 인자, 신경전달물질 또는 이들의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자[BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF,αFGF, βFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 91/11947)], 낭포성 섬유증과 관련된 CFTR 단백질, 종양 억제 유전자[p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745)], 응고 관여 인자를 암호화하는 유전자[인자 VII, VIII, IX], DNA 수선에 관여된 유전자, 자살 유전자[티미딘, 키나제, 사이토신 데아미나제], 헤모글로빈 또는 기타 단백질 운반자용 유전자, 아포리포프로테인 A-1, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 apo(a) 중에서 선택된 아포리포프로테인 타입의 지질 대사에 수반된 단백질, 대사 효소, 예를 들면, 리포프로테인 리파제, 간 리파제, 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라제, 7-알파 콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파티드산 포스파타제, 또는 지질 전달 단백질, 예를 들면 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 및 인지질 전달 단백질, HDL-결합 단백질 또는 LDL 수용체, 렘난트 킬로마이크론 수용체 및 스캐빈저 수용체 중에서 선택된 수용체 등이 언급될 수 있다.

관련 치료 DNA는 또한 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있고, 표적 세포에서 이의 발현은 유전자 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 통제할 수 있다. 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따르면, 이러한 서열은 예를 들면 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있어 단백질로의 전사를 차단할 수 있다. 관련 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 라이보자임을 암호화하는 서열(EP 321 201), 또는 예를 들어 ScFv와 같은 단일-쇄 세포내 항체를 암호화하는 서열을 포함한다.

앞서 지적했듯이, 데옥시리보핵산은 또한 인간 또는 동물에서 면역 반응을일으킬 수 있는 항원성 펩티드를 암호화하는 1 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 양태에서, 본 발명은 백신을 생성하거나, 특히 미생물, 바이러스 또는 암에 대항해 인간 또는 동물에 적용된 면역치료 요법을 수행할 수 있다. 이는 특히 엡스타인-바 바이러스, HIV 바이러스, 간염 B 바이러스(EP 185 573), 공수병 바이러스, 합포체 형성 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 기타 바이러스에 특이적이거나, 종양(EP 259 212)에 특이적인 항원성 펩티드일 수 있다.

바람직하게는, 데옥시리보핵산은 또한 관련 치료 유전자를 발현시키는 서열 및/또는 원하는 세포 또는 기관에서 항원성 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함한다. 이는 서열이 감염 세포에서 작용할 수 있을 때 관련 유전자의 발현을 본래 담당하는 서열일 수 있다. 이는 또한 (기타 단백질의 발현, 또는 심지어 합성까지도 담당하는) 식물 기원의 서열일 수도 있다. 특히, 이는 진핵생물 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 이는 감염시키길 원하는 세포의 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 또한, 이는 바이러스 게놈에서 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 이러한 관점에서, 예를 들면 E1A, MLP, CNV 및 RSV 유전자의 프로모터 등이 언급될 수 있다. 부가적으로, 이들 발현 서열은 활성 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 프로모터는 또한 유도성 또는 억제성일 수 있다.

삼중 나선은 세번째 가닥의 염기와 이중 나선을 형성하는 영역의 염기 사이의 소위 "후그스틴(Hoogsteen)" 수소 결합에 의해 이중 가닥 DNA에 변형되거나 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드의 부착에 상응한다. 이들 짝짓기는 이중 나선의 큰 나선에서 일어나고 관련 서열에 특이적이다[Frank-Kamenetski, M.D., Triplex DNA Structures, Ann. Rev. Biochem., 1995, 64, pp 65-95]. 이중 나선 형태의 특정 서열은 특히 호모퓨린-호모피리미딘 서열일 수 있다. 삼중 나선의 두 부류는 세번째 가닥의 염기 성질에 따라 구분될 수 있다[Sun, J. and C. Helene, Oligonucleotide-directed triple-helix formation, Curr. Opin. Struct. Biol., 1993, 3, pp. 345-356]: 퓨린 염기는 C-G^*G 및 T-A^*A 쌍을 얻을 수 있고, 피리미딘은 C-G^*G⁺및 T-A^*T 쌍을 얻을 수 있다(마크^*는 세번째 가닥과의 짝짓기를 말한다).

이들 구조는 다수의 NMR(핵 자기 공명), 하이브리드화 온도 또는 뉴클레아제 보호 연구(이들의 성질과 이들의 안정성 조건을 정의할 수 있음)에 의해 물리 화학적 관점에서 특징화되어 왔다. 세번째 퓨린 가닥을 지닌 삼중 나선의 경우, 이 가닥은 DNA의 퓨린 가닥에 대해 역평행이고 삼중 나선의 형성은 이가 이온: 세번째 가닥으로 형성된 구조를 안정화시키는 Mg²⁺와 같은 이온의 농도에 고도로 의존한다. 세번째 호모피리미딘 가닥을 지닌 삼중 나선의 경우, 전자는 퓨린 가닥에 대해 평행이고, 삼중 나선의 형성은 pH: 사이토신의 양성자화 및 트리플렛 C-G^*C⁺를 안정화시키는 부가적인 수소 결합의 형성을 가능케 하는 6 이하의 산성 pH에 좌우된다. "혼합" 삼중 나선도 또한 존재하며 이를 위해 세번째 가닥이 퓨린 및 피리미딘 염기를 운반한다. 이 경우, 이러한 세번째 가닥의 배향은 호모퓨린 영역의 염기 서열에좌우된다.

본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 DNA와 직접적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하기 염기를 함유할 수 있다:

- 티미딘(T), 이중 가닥 DNA의 더블렛 A.T와 트리플렛을 형성할 수 있음(Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859);

- 아데닌(A), 이중 가닥 DNA의 더블렛 A.T와 트리플렛을 형성할 수 있음;

- 구아닌(G), 이중 가닥 DNA의 더블렛 G.C와 트리플렛을 형성할 수 있음;

- 양성자화된 사이토신(C⁺), 이중 가닥 DNA의 더블렛 G.C와 트리플렛을 형성할 수 있음(앞서 인용된 Rajagopal et al.);

- 우라실(U), 염기쌍 A.U 또는 A.T와 트리플렛을 형성할 수 있음.

하이브리드화에 의해 삼중 나선을 형성하기 위해서는, 올리고뉴클레오티드와, DNA상에 존재하는 특정 서열이 상보적인 것이 중요하다. 이러한 관점에서, 최상의 부착력 및 최상의 선택성을 얻기 위해서는, 완벽하게 상보적인 올리고뉴클레오티드와 특정 서열이 본 발명에 따른 벡터를 위해 사용된다. 이는 특히 올리고뉴클레오티드 폴리-CTT 및 특정 서열 폴리-GAA일 수 있다. 예를 들면, 서열: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)₇, 서열 번호 1)을 지닌 올리고뉴클레오티드가 언급될 수 있으며, 여기서 염기 GAGG는 삼중 나선을 형성하지는 않지만 커플링 아암으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리할 수 있다. 서열(CTT)₇(서열 번호 2)도언급될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 상보적인 단위(GAA)를 포함하는 특정 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있다. 이들은 특히 7, 14 또는 17 GAA 단위를 포함하는 영역일 수 있다. 또다른 관련 특정 서열은 서열: 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'(서열 번호 3)이다. 이 서열은 올리고뉴클레오티드: 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(서열 번호 4) 또는 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(서열 번호 5)와 삼중 나선을 형성한다.

이 경우, 올리고뉴클레오티드는 폴리퓨린 가닥에 대해 역평행인 방향으로 결합한다. 이들 삼중 나선은 앞서 언급된 Mg²⁺의 존재하에 불안정하다(Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal and Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).

특정 서열은 이중 가닥 DNA에 본래 존재하는 서열, 또는 합성 서열 또는 이곳에 인공적으로 도입된 천연 기원의 서열일 수 있다. 이는 특히 이중 가닥 DNA상에 본래 존재하는 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 데 유리하다. 실제로, 이는 유리하게도 변형되지 않은 플라스미드, 특히 pUC, pBR322 및 pSV 타입 등의 시판용 플라스미드를 이용하여 본 발명에 따른 벡터를 얻을 수 있다. 이중 가닥 DNA에 존재하는 천연 호모퓨린-호모피리미딘 서열 중, 이. 콜라이(E. coli)의 복제 기원 ColE1에 존재하는 서열 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(서열 번호 6) 전부 또는 일부를 포함하는 서열이 언급될 수 있다. 이 경우에, 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드는 서열: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3'(서열번호 7)을 가지고 Beal 및 Dervan(J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982)에 의해 기재되고 Jayasena 및 Johnston(Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279-5288)에 의해 기재되어 있듯이 이중 나선의 두 가닥에 교대로 결합한다. 플라스미드 pBR322의 β-락타마제 유전자의 서열 5'-GAAAAAGGAAGAG-3'(서열 번호 8)이 언급될 수 있다(Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1922, 89, 504-508). 또다른 서열은 pCOR과 같은 조건부 복제 기원을 지닌 플라스미드의 복제 기원 γ에 존재하는 AAGAAAAAAAAGAA(서열 번호 9)이다.

완벽하게 상보적인 서열이 바람직하지만, 그러나 약간의 미스매치가 올리고뉴클레오티드의 서열과 DNA상에 존재하는 서열 사이에서 용인될 수 있는 것으로 해석되며, 단 이는 과도한 친화성 손실을 야기하지 않아야 한다. 이. 콜라이 β-락타마제 유전자에 존재하는 서열 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(서열 번호 10)이 언급될 수 있다. 이 경우, 폴리퓨린 서열을 방해하는 티미딘이 세번째 가닥의 구아닌에 의해 인식되어, 두 TAT 트리플렛에 의해 둘러싸이는 경우 안정한 트리플렛 ATG를 형성할 수 있다(Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829-2834).

사용된 올리고뉴클레오티드는 (변형되지 않거나 화학적으로 변형된 천연 염기로 구성된) 자연 그대로일 수 있다. 특히, 올리고뉴클레오티드는 유리하게도 뉴클레아제에 대한 내성 또는 보호, 또는 특정 서열에 대한 친화성을 증가시킬 수 있거나 기타 부가적인 성질을 제공할 수 있는 화학적 변형을 나타낼 수 있다(J. Goodchild, Conjugates of Oligonucleotides and Modified Oligonucleotides: A Review of their Synthesis and Properties, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1 No.3, 1990, pp. 165-187).

본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 또한 백본의 변형을 지닌 뉴클레오시드의 임의 연속물로 이해된다. 가능한 변형 중, DNA와 삼중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트(Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), 포름아세탈 또는 메틸포스포네이트 백본을 소유한 올리고뉴클레오티드(Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7766-7768)가 언급될 수 있다. DNA와 삼중 나선을 형성하는 뉴클레오티드의 α-아노머로 합성된 올리고뉴클레오티드를 이용할 수도 있다(Le Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). 백본의 또다른 변형은 포스포르아미데이트 결합이다. 예를 들면 Gryaznov와 Chen이 기재한 뉴클레오티드간 결합 N3'-P5' 포스포르아미데이트가 언급될 수 있으며, 이는 특히 DNA와 안정한 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다(J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). 백본의 기타 변형 중, 리보뉴클레오티드, 2'-O-메틸리보스, 포스포트리에스테르 등의 사용이 언급될 수 있다(Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). 인-함유 백본은 결국 삼중 나선을 형성할 수도 있는 PNA(펩티드 핵산)에서와 같이 폴리아미드 백본으로 교체되거나(Nielson et al., Science, 1991, 254, 1497-1500; Kim et al., J. Am Chem. Soc., 1993, 115, 6477-6481) DNG(데옥시리보핵산 구아니딘, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101)에서 처럼 구아니딘계 백본, 삼중 나선을 형성할 수 있는 DNA의 폴리캐티온 유사체로 교체될 수 있다.

세번째 가닥의 티미딘도 5-브로모우라실로 대체될 수 있으며, 이는 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시킨다(Povsic and Dervan, L. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). 세번째 가닥은 또한 비 천연 염기를 함유할 수 있는데, 이 중에서 7-데아자-2'-데옥시잔토신(Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), 1-(2-데옥시-β-D-리보푸라노실)-3-메틸-5-아미노-1H-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온(Koh and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), 8-옥소아데닌, 2-아미노퓨린, 2'-O-메틸슈도이소시티딘, 또는 업계의 숙련인에게 공지된 기타 변형체(Sun and Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345-356)가 언급될 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 또다른 타입의 변형 목적은 좀더 구체적으로는 올리고뉴클레오티드와 특정 서열간의 상호작용 및/또는 친화성을 개선시키는데 있다. 특히, 전적으로 유리한 변형은 알킬화제를 올리고뉴클레오티드에 커플링시키는 데 있다. 결합은 광반응성 작용 그룹에 의해 화학적 또는 광화학적으로 일어날 수 있다. 유리한 알킬화제는 특히 광활성 가능한 알킬화제, 예를 들면 소랄렌(psoralen)이다. 광 작용하에, 이는 DNA의 피리미딘 염기 수준에서 공유 결합을 형성한다. 이들 분자가 이중 가닥 DNA 분획에서 5'-ApT-3' 또는 5'-TpA-3' 서열 수준에서 삽입될 때, 이는 두 가닥 모두와 결합을 이룬다. 이러한 광-유도된 결합 반응은 플라스미드의 특정 부위에서 일어날 수 있다.

앞서 강조했듯이, 본 발명의 일 이점은 알킬화제에 의해 형성된 공유 결합에 의해 올리고뉴클레오티드와 이중 가닥 DNA의 특정 서열간에 매우 안정하면서 부위-특이적인 삼중 나선을 형성하는 가능성이다.

본 발명의 방법에 사용된 올리고뉴클레오티드의 길이는 최소 3 염기, 바람직하게는 5 내지 30 염기이다. 10 내지 30 염기의 길이를 지닌 올리고뉴클레오티드가 유리하게 사용된다. 길이는 물론 원하는 선택성과 상호작용의 안정성에 따라 업계의 숙련인에 의해 경우에 따라 조절될 수 있다.

본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다. 특히, 이는 핵산 합성기에 의해 제조될 수 있다. 업계의 숙련인에게 공지된 기타 방법도 물론 사용될 수 있다.

본 발명의 목적상, "표적화 시그널"은 다양한 성질의 표적화 분자를 의미하는 것으로 이해한다. 이는 대부분의 경우 표적화를 위해 알려진 펩티드를 나타낸다. 이는 세포외 매트릭스 성분, 원형질 막 수용체와 상호작용하는 데 사용되어, 유전자 요법에서 유전자의 비바이러스 전달 동안 세포내 구획을 표적화하거나 DNA의 세포내 흐름을 개선시킬 수 있다.

이들 표적화 시그널은 예를 들면 생장 인자(EGF, PDGF, TGFβ, NGF, IGF, I, FGF), 사이토킨(IL-1, IL-2, TNF, 인터페론, CSF), 호르몬(인슐린, 생장 호르몬, 프롤락틴, 글루카곤, 티로이드 호르몬, 스테로이드 호르몬), 렉틴을 인식하는 당, 면역글로불린, ScFv, 트랜스페린, 리포프로테인, 비타민 B12와 같은 비타민, 펩티드 또는 뉴로펩티드 호르몬(타키키닌, 뉴로텐신, VIP, 엔도텔린, CGRP, CCK 등), 또는 인테그린, 예를 들어 펩티드 RGD에 의해 인식되거나 세포막의 기타 외부 단백질에 의해 인식된 단위를 포함할 수 있다.

이는 또한 완전 단백질, 또는 이들 단백질에서 유도된 펩티드 서열, 또는 수용체에 결합하고 "파아지 디스플레이" 기술 또는 조합 합성에 의해 얻어진 펩티드를 사용할 수 있다.

세포간 표적화 시그널도 포함될 수 있다. 다양한 아미노산 조성물의 다수 핵 귀환 서열(NLS)이 동정되었고 이는 단백질 또는 핵산의 핵 전달에 수반된 여러 단백질을 가질 수 있다. 이들 중에는 특히 짧은 서열(SV40 T 항원의 NLS(PKKKRKV, 서열 번호 11)가 일례임), 두파트 서열(핵 전달을 위한 두개의 필수 도메인을 함유한 뉴클레오플라스민의 NLS: KRPAATKKAGQAKKKKLDK, 서열 번호 12), 또는 nhRNPA1 단백질의 M9 서열(NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, 서열 번호 13)이 있다. 이들 NLS 서열을 운반하는 단백질은 예를 들어 임포틴 또는 카리오페린 계통의 수용체와 같은 특정 수용체와 결합한다. 이들 서열의 역할은 전사 메카니즘에 즉시 활용되고, 발현될 수 있는 핵 내부로 DNA를 향하게 한다.

세포내 및 세포외 표적화 모두의 경우에 작용할 수 있는 "혼합" 표적화 시그널도 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들면 세포막상에 존재하는 렉틴을 핵공 수준으로 표적하는 당이 언급될 수 있다. 이들 당에 의한 표적화도 또한 세포외 표적화 및 핵 임포트 모두와 관련된다.

기타 시그널은 미토콘드리아 표적화(예, 래트 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC)의 N-말단부가 미토콘드리아를 표적화함) 또는 소포체상으로의 귀환시에 수반된다. 결국, 몇몇 시그널은 핵 보유 또는 (서열 KDEL과 같은) 소포체 수준에서 보유를 가능케 한다.

유리하게도, 본 발명에 따른 표적화 시그널은 특정 세포 또는 특정 세포 분획으로 이중 가닥 DNA를 명확하게 지시할 수 있다. 예를 들자면, 본 발명에 따른 표적화 시그널은 세포 표면에서 수용체 또는 리간드, 특히 인슐린, 트랜스페린, 폴산, 또는 기타 생장 인자, 사이토킨, 또는 비타민, 또는 세포 표면에서 또는 이웃한 세포외 매트릭스상의 특정 폴리사카라이드에 대한 수용체를 표적화할 수 있다.

올리고뉴클레오티드-표적화 시그널 키메라의 합성은 고체상 또는 용액에서 일어나며 올리고뉴클레오티드 및 표적화 시그널의 매우 다양한 안정성을 고려한다(Erijita, R. et al., Synthesis of defined peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113-4120). 용액에서, 일 단계 커플링을 고려할 수 있다: 표적화 시그널은 예를 들면 디설파이드, 말레이미드, 아민, 카복실, 에스테르, 에폭시드, 시아노겐 브로마이드 또는 알데히드 작용 그룹을 운반하는 그룹으로 합성될 수 있고, 3' 또는 5' 위치에서 티올, 아민 또는 카복실 말단 그룹에 의해 변형된 올리고뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 이들 커플링은 올리고뉴클레오티드와 표적화 시그널간에 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합을 형성함으로써 이루어진다. 업계의 숙련인에게 공지된 기타 방법, 예를 들면 이작용 커플링제가 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 주제는 앞서 정의된 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

유리하게도, 본 발명에 따른 벡터는 DNA를 형질 감염시키는 것으로 알려진 1 이상의 제제와 조합될 수 있다. 예를 들면 유리한 성질을 가진 양이온 지질이 언급될 수 있다. 이들 벡터는 실제로 DNA와 상호작용하는 양극부와, 세포 침투를 촉진하고 DNA와의 이온 작용을 외부 매질에 둔감하게 하는 소수성 지질부로 구성된다. 양이온 지질의 구체적인 예는 특히 1가 양이온 지질(DOTMA: Lipofectin), 몇몇 양이온 세제(DDAB), 리포폴리아민, 특히 디옥타데실아미도글리실 스퍼민(DOGS) 또는 팔미토일포스파티딜-에탄올아민의 5-카복시스퍼밀아미드(DPPES)(이의 제조는 예를 들면 특허 출원 EP 394 111에 기재되어 있음)이다. 또다른 유리한 리포폴리아민 계통은 본원에서 참고된 특허 출원 WO 97/18185에 기재된 화합물이 대표적이다. 다수의 기타 양이온 지질이 개발되었고 본 발명에 따른 벡터와 함께 사용될 수 있다.

개발된 합성 형질 감염제 중, 폴리라이신 및 DEAE-덱스트란 타입의 양이온 폴리머도 유리하다. 시판중이고 특허 출원 WO 96/02655에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있는 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리프로필렌이민(PPI) 폴리머를 사용할 수도 있다.

일반적으로, 핵산을 형질 감염시키기 위해 알려진 합성제가 본 발명에 따른 벡터와 조합될 수 있다.

조성물은 또한 본 발명에 따른 벡터/형질 감염제 복합체와 결합하여 이의 형질 감염력을 개선시킬 수 있는 보조제를 포함할 수 있다. 또다른 양태에서, 본 발명은 앞서 정의된 벡터, 앞서 정의된 1 이상의 형질 감염제 및 본 발명에 따른 벡터/형질 감염제(들) 복합체를 결합시켜 이의 형질 감염력을 개선시킬 수 있는 1 이상의 보조제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 타입의 보조제(예, 지질, 펩티드 또는 단백질)의 존재는 유리하게도 화합물의 형질 감염력을 증가시킬 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명의 조성물은 보조제로서 특히 사용이 유리한 1 이상의 중성 지질을 포함할 수 있다. 본 출원인은 중성 지질의 첨가가 핵지질 입자의 형성을 증진시키고 막을 동요시켜 세포내부로 입자의 침투를 촉진할 수 있음을 실제로 보여주었다.

좀더 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 중성 지질은 2개의 지방 체인을 함유한 지질이다. 특히 유리한 방법으로는, 생리 조건하에 양쪽성 이온이거나 이온 전하가 결핍된 천연 또는 합성 지질이 사용된다. 이는 좀더 구체적으로는 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예, 특히 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(예, 특히 스핑고마이엘린) 또는 아시알로갱글리오사이드(예, 특히 asialoGM1 및 GM2) 중에서 선택될 수 있다.

이들 여러 지질은 업계의 숙련인에게 익히 공지된 통상적인 기술에 의해 합성하거나 기관(예: 뇌) 또는 난으로부터 추출하여 얻을 수 있다. 특히, 중성 지질의 추출은 유기 용매에 의해 수행될 수 있다(Lehninger, Biochemistry 참조).

본 출원인은 보조제로서 DNA의 응축에 직접 수반되거나 수반되지 않는 화합물을 사용함이 특히 유리함을 입증해 보였다(WO 96/25508). 본 발명에 따른 조성물내에 이러한 화합물의 존재는 형질 감염 화합물의 양을 줄일 수 있어, 형질 감염활성에 악영향을 미침이 없이 독성학적 관점에서 유리하다. 핵산의 응축에 수반된 화합물은 직접 또는 간접적으로 DNA를 밀집시키는 화합물을 정의하는 것으로 한다. 좀더 정확히 말하면, 이 화합물은 형질 감염되는 DNA의 수준에 직접 작용하거나, 핵산의 응축에 직접 수반되는 부가적인 화합물의 수준에서 관여될 수 있다. 바람직하게는, DNA의 수준에서 직접 작용한다. 특히, DNA의 응축에 수반된 이러한 제제는 폴리캐티온, 예를 들면 폴리라이신일 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, 이러한 제제는 또한 전체적 또는 부분적으로 히스톤, 뉴클레올린, 프로타민 및/또는 전체적 또는 부분적으로 펩티드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)(단위의 수는 2 내지 10으로 변할 수 있음)의 유도체 중 하나에서 유도된 화합물일 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조에서, 이들 단위는 연속적 또는 불연속적으로 반복될 수 있다. 이는 생화학적 성질, 예를 들면 1 이상의 아미노산, 또는 화학적 성질의 링키지에 의해 분리될 수 있다.

본 발명의 주제는 또한 DNA를 1차 세포 또는 주화 세포주로 형질 감염시켜 질환을 치료하도록 의도된 약제의 제조를 위해 앞서 정의된 벡터의 사용이다. 이는 분화 형태 또는 다분화능 형태(전구체)의 섬유아세포, 근육 세포, 신경 세포(뉴런, 성상 세포, 신경교질 세포), 간 세포, 조혈 세포주(림프구, CD34, 수지상 세포 등), 내피 세포 등일 수 있다.

본 발명의 벡터는 예를 들어 설명해보면 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 형질 감염을 위해 사용될 수 있다.

생체내, 요법에 사용하거나 유전자의 조절 또는 병리 상태의 동물 모델의 창조를 연구하기 위해, 본 발명에 따른 조성물은 국소, 피부, 경구, 직장, 질, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피, 기관내 또는 복강내 경로 등에 의한 투여용으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 특히 원하는 기관으로의 직접 주사를 위한 주사 제형, 또는 (피부 및/또는 점막상) 국소 경로에 의한 투여를 위해 약학적으로 허용가능한 비히클을 함유한다. 이는 특히 등장성 멸균액, 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사 용액을 구성하는 건조, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 주사에 사용되는 핵산의 투여량 및 투여 횟수는 각종 파라미터, 특히 사용된 투여 양식, 관련 병리 상태, 발현되는 유전자 또는 원하는 치료 기간에 따라 조절될 수 있다. 좀더 구체적으로 투여 양식의 경우, 이는 조직 또는 순환계로 직접 주사, 또는 배양시 세포의 처리에 이은 생체내 주사 또는 이식에 의한 재이식일 수 있다.

본 발명은 부가적으로는 하기 단계를 포함하는 세포로의 DNA 형질 감염 방법에 관한 것이다:

(1) 앞서 기재된 방법에 따라 올리고뉴클레오티드-표적 시그널 키메라의 합성,

(2) (1)에서 합성된 키메라를 이중 가닥 DNA와 접촉시켜 삼중 나선 형성,

(3) 임의로는, (2)에서 얻어진 벡터를 1 이상의 형질 감염제 및/또는 1 이상의 보조제와 복합체 형성, 및

(4) (2) 또는, 적용 가능한 경우, (3)에서 형성된 복합체를 세포와 접촉시킴.

세포는 세포를 상기 복합체와 함께 배양하거나(시험관내 또는 생체내 사용을 위해), 복합체를 유기체로 주입시켜(생체내 사용을 위해) 복합체와 접촉될 수 있다.

본 발명은 질환을 치유할 수 있는 핵산을 함유한 본 발명에 따른 벡터의 투여에 의해 질환을 치료하는 특히 유리한 방법을 제공한다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 방법은 단백질 또는 펩티드 산물에서 단백질 또는 펩티드 산물을 암호화하는 투여되는 DNA가 결여되어 생긴 질환에 적용될 수 있다. 본 발명은 생체내, 생체외 또는 시험관내 세포 형질 감염을 위해 본 발명에 따른 벡터의 사용에까지 확장된다.

본 발명은 또한 앞서 정의된 벡터를 함유한 재조합 세포에 관한 것이다. 이는 바람직하게는 진핵 생물, 특히 효모, 동물 세포 등을 수반한다. 이들 세포는 DNA를 주어진 세포로 도입하는 업계의 숙련인에게 공지된 기술에 의해 얻어진다.

본 발명의 비제한적으로 설명하는 하기 실시예는 본 발명의 기타 특성 및 이점을 설명할 수 있다.

실시예 1

본 실시예는 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH와 펩티드 말레이미드-NLS의 커플링 가능성을 설명해 준다.

단락 "올리고뉴클레오티드와 펩티드의 커플링"하의 "재료 및 방법" 파트에서 앞서 기재된 방법에 따라 3' 말단에 티올 그룹을 지닌 서열 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'의 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH를 N-말단에 말레이미드 그룹을 운반하는 펩티드 NLS와 커플링시킨다.

커플링을 역상 고-해상 액체 크로마토그래피(HPLC)로 모니터링한다. 이는 등몰의 화학량론적 양으로 일어난다: 2시간 후에, 커플링이 완료되면 키메라를 HPLC로 정제한다.

커플링에 대한 반응 도표를 도 1에 나타내고 있다.

올리고뉴클레오티드-펩티드(Pso-GA₁₉-NLS) 키메라를 키메라의 펩티드 부분의 존재가 드러나도록 트립신의 단백질 분해 작용 후, 변성 폴리아미크릴아미드 겔상에서 이동 및 핵산의 은 염색 (단락 "트립신을 이용한 절단에 의한 키메라의 분석하에 "재료 및 방법" 파트에 기재된 바와 같음)후에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다.

키메라 Pso-GA₁₉-NLS는 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH와 비교하여 지연된 전기영동 이동을 나타내고, 단백질 분해 절단 산물은 도 2에서 보듯이 Pso-GA₁₉-NLS와 Pso-GA₁₉-SH의 이동 수준 간의 중간 수준에서 관찰된다.

키메라 Pso-GA₁₉-NLS는 트립신에 접근 가능한 펩티드 부위를 함유한다. 이들 결과는 올리고뉴클레오티드와 펩티드간의 커플링이 일어났으며, 커플링 수율이 높음을 명확히 보여준다.

실시예 2

본 실시예는 광활성화 가능한 알킬화제에 의해 변형된 플라스미드 pXL2813과 키메라 Pso-GA₁₉-NLS간의 삼중 나선 형성을 설명하고 있다. 본 실시예는 또한 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량에 따라 변형된 플라스미드의 비율을 나타낸다.

도 3에 나타낸 플라스미드 pXL2813은 올리고뉴클레오티드 GA₁₉, Pso-GA₁₉, Pso-GA₁₉-SH 또는 Pso-GA₁₉-NLS와 삼중 나선을 형성할 수 있는 GA₁₉에 상보적인 호모퓨린 서열을 포함한다. Mg²⁺와 같은 2가 양이온은 이들 삼중 나선을 안정화시킨다. 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS와 플라스미드를 MgCL₂100 mM를 함유한 완충액에서 혼합한다. 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량은 0 내지 200에서 달라진다.

37 ℃에서 12 시간 동안 배양한 후, 혼합물을 (단락 "삼중 나선의 광활성화"하에 "재료 및 방법" 파트에 나타남) 15분간 광활성화시킨 다음, 삼중 나선 형성 영역의 한쪽 말단상의 플라스미드를 절단하는 두 개의 제한 효소 MfeI과 SpeI으로 절단한다. 변형되지 않은 플라스미드 pXL2813의 절단 후 70 염기쌍을 함유한 핵산 분획을 방출시킨다. 이중 나선과 공유 결합된 삼중 나선을 형성하는 플라스미드와 올리고뉴클레오티드를 이용하여 얻어진 분획은 70 염기쌍 및 올리고뉴클레오티드 19 염기를 가진다. 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서의 이동에 의해, 여러 크기의 분획을 분리할 수 있다: 삼중 나선에 의해 변형된 플라스미드에서 유도된 분획은 변형되지 않은 플라스미드에서 유도된 분획보다 짧은 이동 거리를 가진다. 따라서 변성 폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동에 의해 플라스미드에 대한 올리고뉴클레오티드의 몰 과량에 따라 변형된 플라스미드의 비율을 정량할 수 있다.

결과는 도 5에 나타나 있다. 플라스미드에 대한 올리고뉴크레오티드의 몰 과량이 50 이상인 경우, 모든 플라스미드가 변형되고 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS와 결합된다. 광활성화 없이, 절단 분획의 지체는 변성 겔상에서 상실된다.

이는 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH 또는 Pso-GA₁₉-NLS로 형성된 삼중 나선이 광활성화 이후에 실제로 이중 나선과 공유 결합하는 것 같다.

또한, 플라스미드 백본의 나머지 절단 및 상술된 분석에 의해, 광활성이 삼중 나선을 형성할 수 있는 서열을 함유한 영역 밖의 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS의 비특이성 공유 결합을 야기하지 않음을 확인할 수 있다.

이들 결과는 플라스미드와 펩티드 서열을 보다 명확하면서도 공유적으로 결합시킬 수 있는 조건을 명확히 설명해 주며, 이는 트랜스유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 외부에 존재하여 트랜스유전자의 발현에 영향을 미치지 못한다.

실시예 3

본 실시예는 플라스미드가 변형되더라도 시험관내에서 트랜스유전자의 발현 능력을 설명해 준다.

변형되지 않거나 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS와 결합되는 플라스미드 pXL2813에 의한 β-갈락토시다제의 발현을 NIH3T3 세포의 형질 감염과 비교한다.

결과는 도 6에 보고되고 있고, 얻어진 평균값(±표준 편차)을 하기 표 III에 나타내고 있다.

플라스미드	트랜스유전자의 발현(RLU/단백질 ㎍)
pXL2813	253759±48545
pXL2813-Pso-GA₁₉-NLS	473984±111476
플라스미드 없이	129±85

트랜스유전자의 발현은 프로모터 상류의 삼중 나선의 공유 부착에 의해 제공된 변형에 따라 증가함을 관찰할 수 있다.

이들 결과는 삼중 나선 형성이 시험관내 트랜스유전자의 발현에 영향을 미치지 않음을 명확히 보여준다. 반면, 표적화 서열 NLS와의 커플링으로 인해 플라스미드의 핵 귀환에 의해, 좀더 많은 플라스미드가 핵에 도착하여, 형질 감염 효율이 증가된다.

실시예 4

본 실시예는 생체내 발현이 삼중 나선에 의해 플라스미드와 결합된 표적화 시그널의 존재에 의해 저해되지 않음을 입증하고자 한다.

실험은 출원 WO 99/01157과 WO 99/01158에 기재된 전기전달 기술을 사용하여 pXL2813과 pXL2813-Pso-GA₁₉-NLS를 인간 폐 종양 H1299로 형질 감염시키는 데 있다. 본 실험을 18 내지 20 g의 암컷 누드 마우스에서 수행한다.

마우스에 20 mm³H1299 종양 이식 조직을 단층 이식한다. 종양이 자라, 200 내지 300 mm³의 용적에 이른다. 마우스를 종양 크기에 따라 분리하고 상동성 그룹으로 나눈다. 마우스를 케타민/자일라진 혼합물(시판용)로 안락사시킨다. 플라스미드 용액(8 ㎍ DNA/40 ㎕의 150 mM 나트륨 클로라이드)을 해밀턴 시린지에 의해 종양 주위로 세로로 주사한다.

종양의 측면을 전도 겔로 덮고 종양을 0.45 내지 0.7 cm 떨어진 두개의 스테인레스 평면 전극 사이에 둔다. 주사 후 20 내지 30초 후에 시판용 스퀘어 펄스 발생기(Electro-pulsateur Ps 15, Jouan, France)로 전기 펄스를 가한다. 오실로스코프는 펄스의 세기(볼트), 지속 시간(밀리초) 및 진동수(펄스의 Hz)를 조절하여 1 헤르츠에서 20 밀리초 동안 500 V/cm에서 전달되도록 해야 한다.

종양 형질 감염 측정을 위해, 플라스미드를 주사한 지 2일 후에 각각 플라스미드 pXL2813과 pXL2818-Pso-GA₁₉-NLS에 대한 10 및 7 마리의 마우스를 인도적으로죽인다. 종양을 모아, 중량을 재고 안티프로테아제(Complete, Boehringer)로 보충된 용해 완충액(Promega)에서 그라운딩시킨다. 얻어진 현탁물을 원심분리시켜 맑은 상등액을 얻는다. 이 상등액 10 ㎕를 반응 완충액 250 ㎕(Clontech)와 암실에서 1시간 동안 배양한 후, 시판용 루미노미터를 이용하여 β-갈락토시다제를 측정한다. 결과는 총 RLC("상대적인 광 단위")/종양으로 표현된다.

플라스미드 pXL2813-Pso-GA₁₉-NLS가 변형되지 않은 플라스미드 pXL2813을 이용하여 얻어진 수준보다 크거나 동일한 수준으로 생체내 트랜스유전자를 발현시킴이 관찰된다(도 13 참조).

실시예 5

본 실시예는 Pso-GA₁₉-NLS 접합체의 펩티드 부위의 특징 분석, 즉 본 발명에 따른 작제물과 합쳐진 NLS 펩티드의 표적화 성질을 입증해 보인다.

사용된 펩티드 서열, SV40 T 항원의 NLS 시그널은 α-카리오페린 계통의 수용체에 의해 인식된다. 임포틴 60으로 불리는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 그룹과 융합된 쥐 등가물을 사용하여 올리고뉴클레오티드-펩티드 접합체를 특징 분석한다. 이는 단락 "임포틴과의 상호작용"하의 "재료 및 방법" 파트에 기재된 방법에 따라 수행된다.

임포틴 60과 올리고뉴클레오티드 GA₁₉-NLS 또는 Pso-GA₁₉-NLS로 코팅된 글루타티온-비드간의 상호작용을 연구한다. 실온에서 30분간 배양한 후, (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿을 상등액으로부터 분리한다.

이러한 특징 분석의 결과는 도 7에 나타나 있다. 이 도면은 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS가 글루타티온 비드와 결합하는 반면, 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉는 상등액에 남아 있음을 보여준다.

이는 α-임포틴과 상호작용하는 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-NLS의 능력을 보여준다. 올리고뉴클레오티드-펩티드 키메라의 펩티드 부위는 실제로 수용체에 의해 인식되며, 이는 펩티드가 표적화 시그널의 역할을 효과적으로 수행함을 의미한다.

실시예 6

본 실시예는 올리고뉴클레오티드 GA₁₉-SH와 펩티드 말레이미드-NLS의 커플링 가능성을 설명해 준다. 실시예 1과는 달리, 키메라는 광활성화 가능한 알킬화제에 의해 변형되지 않는다.

올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH(실시예 1 참조)와 동일한 조건하에 5' 말단에 티올 그룹을 지닌 서열 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(서열 번호 4)의 올리고뉴클레오티드 GA₁₉-SH를 N-말단에 말레이미드 그룹을 지닌 펩티드 말레이미드-NLS에 커플링시킨다.

커플링을 역상 고-해상 액체 크로마토그래피(HPLC)로 모니터링한다. 이는 등몰의 화학량론적 양으로 일어난다: 두 시간 후, 커플링이 완료된다. 키메라를 HPLC로 정제한다.

올리고뉴클레오티드-펩티드 키메라를 "재료 및 방법" 파트에 기재된 트립신의 단백질 분해 작용에 의해 분석한다.

결과는 도 8에 나타나 있다. 이는 올리고뉴클레오티드 Pso-GA₁₉-SH를 이용하여 얻어진 것에 필적할 만하다.

실시예 7

본 실시예는 알킬화제 부재하의 플라스미드 pXL2813과 GA-₁₉-NLS 키메라간의 삼중 나선 형성 가능성을 설명해준다.

실시예 5에 기재된 바와 같이 얻어진 플라스미드 pXK2813과 GA-₁₉-NLS 키메라간의 삼중 나선 형성 동역학을 수행하고 단락 "키메라와의 삼중 나선 형성"하에 "재료 및 방법" 파트에 기재된 기술에 따라 연구한다.

도 9는 삼중 나선 형성의 동역학을 나타낸다.

40 nM의 플라스미드 농도 및 20 nM의 올리고뉴클레오티드 농도의 조건하에 안정한 삼중 나선이 형성되는 것 같다.

실시예 8

본 실시예는 GA₁₉-NLS 키메라의 펩티드 부위의 특징 분석을 설명해 준다.

사용된 펩티드 서열, SV40 T 항원의 NLS 시그널은 실시예 4에서 이미 언급했듯이 α-카리오페린 계통의 수용체에 의해 인식된다. 임포틴 60으로 불리고, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 그룹과 융합된 쥐 등가물을 사용하여 올리고뉴클레오티드-펩티드 접합체를 특징 분석한다. 단락 "임포틴과의 상호작용"하에 "재료 및 방법"에 기재된 바와 같이 수행한다.

임포틴 60과 올리고뉴클레오티드 GA₁₉또는 GA-₁₉-NLS로 코팅된 글루타티온-비드간의 상호작용을 연구한다. 실온에서 30분간 배양 후, (임포틴과 상호작용하는 성분을 함유한) 비드의 펠릿을 상등액으로부터 분리한다.

결과는 도 10에 나타나 있다. 올리고뉴클레오티드 GA₁₉-NLS는 글루타티온 비드와 결합하는 반면, 올리고뉴클레오티드 GA₁₉는 상등액에 남아 있는 것 같다.

이는 α-임포틴과 상호작용하는 올리고뉴클레오티드 GA-₁₉-NLS의 능력을 명확히 보여준다. 올리고뉴클레오티드-펩티드 키메라의 펩티드 부위는 실제로 수용체에 의해 인식되며, 표적화 시그널로서의 역할을 수행한다.

실시예 9

본 실시예는 올리고뉴클레오티드 pim-SH와 펩티드 말레이미드-NLS의 커플링 가능성을 설명해 준다.

올리고뉴클레오티드 GA₁₉-SH의 경우와 동일한 조건하에(실시예 5 참조) 5' 말단에 티올 그룹을 지닌 서열 5'-GGGGAGGGGGAGG-3'(서열 번호 15)의 올리고뉴클레오티드 pim-SH를 N-말단에 말레이미드 그룹을 가진 펩티드 말레이미드-NLS와 커플링시킨다.

커플링을 역상 고-해상 액체 크로마토그래피(HPLC)로 모니터링한다. 이는 등몰의 화학량론적 양으로 일어난다: 2시간 후, 커플링이 완료된다. 키메라를 HPLC로정제한다.

실시예 10

본 실시예는 알킬화제 없이 플라스미드 pXL2997과 pim-NLS 키메라간의 삼중 나선 형성 가능성을 설명해 준다.

(실시예 8에 기재된 바와 같이 얻어진) 플라스미드 pXK2997과 pim-NLS 키메라간의 삼중 나선 형성 동역학을 수행하고 단락 "키메라와의 삼중 나선 형성"하에 "재료 및 방법" 파트에 기재된 기술에 따라 연구한다.

도 12는 삼중 나선 형성의 동역학을 나타낸다.

앞서 충분히 진술된 본 발명은 본 발명의 취지 및 하기의 청구항의 범위에서 벗어남이 없이 다수의 수정을 행할 수 있다.

서열 목록

(1) 유전 정보

(i) 출원인

(A) 성명: 로오느 푸우렌크 로레르

(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20

(C) 시: 앙토니 세덱스

(D) 국가: 프랑스

(E) 우편 번호: 92165

(G) 전화: 01.55.71.73.26

(H) 팩스: 01.55.71.72.91

(ii) 발명의 명칭: 핵산 전달 백터, 이를 함유한 조성물 및 용도.

(iii) 서열 갯수: 15

(iv) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체형: 테이프

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.30 (EPO)

(2) 서열 번호: 1에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 1:

(2) 서열 번호: 2에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 2:

(2) 서열 번호: 3에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 3:

(2) 서열 번호: 4에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 4:

(2) 서열 번호: 5에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 5:

(2) 서열 번호: 6에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 6:

(2) 서열 번호: 7에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 7:

(2) 서열 번호: 8에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 13 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 8:

(2) 서열 번호: 9에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 9:

(2) 서열 번호: 10에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 17 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 10:

(2) 서열 번호: 11에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 7 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 11:

(2) 서열 번호: 12에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 19 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 12:

(2) 서열 번호: 13에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 38 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 13:

(2) 서열 번호: 14에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 7 아미노산

(B) 타입: 아미노산

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: 펩티드

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 14:

(2) 서열 번호: 15에 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 13 염기쌍

(B) 타입: 뉴클레오티드

(C) 가닥: 단일 가닥

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 타입: cDNA

(xi) 서열 설명: 서열 번호: 15:

Claims

이중 가닥 DNA 분자 및 (표적화 시그널에 커플링되고 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열과 삼중 나선을 형성할 수 있는) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자가 플라스미드 또는 에피솜임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 2 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자가 원형 또는 초나선 상태의 플라스미드임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자가 포유동물 세포에서 활성인 1 이상의 프로모터 또는 전사 종결자의 통제하에 1 이상의 관련 유전자로 구성된 발현 카세트를 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 4 항에 있어서, 관련 유전자가 치료 산물을 암호화하는 핵산임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자에 존재하는 특정 서열이 호모퓨린-호모피리미딘 서열임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자에 존재하는 특정 서열이 이중 가닥 DNA상에 본래 존재하는 서열 또는 이중 가닥 DNA로 인공적으로 도입된 합성 또는 천연 서열임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열 폴리-CTT를 포함하고 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열이 서열 폴리-GAA임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 서열 GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (서열 번호 1) 또는 서열 (CTT)₇(서열 번호 2)을 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열이 서열 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (서열 번호 3)를 포함하고 올리고뉴클레오티드가 서열 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (서열 번호 4) 또는 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(서열 번호 5)를 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열이 이. 콜라이의 복제 기원에 존재하는 서열 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (서열 번호 6) 전부 또는 일부를 포함하고, 올리고뉴클레오티드가 서열 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (서열 번호 7)을 소유함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열이 각각 플라스미드 pBR32와 이.콜라이의 β-락타마제 유전자에 존재하는 서열 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (서열 번호 8) 또는 서열 5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (서열 번호 10)을 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열이 pCOR과 같은 조건부 복제 기원을 함유한 플라스미드의 복제 기원 γ에 존재하는 서열 5'-AAGAAAAAAAAGAA-3' (서열 번호 9)을 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 적어도 3개의 염기쌍을 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 14 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 5 내지 30개의 염기쌍을 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 대해 내성이거나 이로부터 보호하거나, 이중 가닥 DNA 분자상에 존재하는 특정 서열에 대해 친화성을 증가시키는 적어도 하나의 화학적 변형을 나타냄을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 백본에 변형이 행해진 뉴클레오시드의 연속물임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 이중 가닥 DNA의 염기 수준에서 공유 결합을 형성하는 알킬화제에 커플링됨을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 18 항에 있어서, 알킬화제가 광활성화 가능함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 알킬화제가 소랄렌임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 시그널이 세포외 매트릭스 성분, 원형질 막 수용체와 상호작용하고/상호작용하거나, 세포내 구획을 표적화하고/표적화하거나 이중 가닥 DNA의 세포내 흐름을 개선시킴을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 21 항에 있어서, 표적화 시그널이 생장 인자(EGF, PDGF, TGFβ, NGF, IGF, I, FGF), 사이토킨(IL-1, IL-2, TNF, 인터페론, CSF), 호르몬(인슐린, 생장 호르몬, 프롤락틴, 글루카곤, 티로이드 호르몬, 스테로이드 호르몬), 렉틴을 인식하는 당, 면역글로불린, 트랜스페린, 리포프로테인, 비타민 B12와 같은 비타민, 펩티드 또는 뉴로펩티드 호르몬(타키키닌, 뉴로텐신, VIP, 엔도텔린, CGRP, CCK 등), 또는 인테그린, 예를 들어 펩티드 RGD에 의해 인식되거나 세포막의 기타 외부 단백질에 의해 인식된 단위를 포함함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 21 항에 있어서, 표적화 시그널이 핵 귀환 서열(NLS)과 같은 세포내 표적화 시그널임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 23 항에 있어서, 핵 귀환 시그널이 SV40 T 항원의 NLS 서열임을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 21 항에 있어서, 표적화 시그널이 세포외 표적화 및 세포내 표적화 모두를 가능케 함을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 대한 표적화 시그널의 커플링이 특히 디설파이드, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 아민 결합을 이루어 고체상 또는 용액에서 합성에 의해 얻어짐을 특징으로 하는 핵산 전달용 벡터.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에서 정의된 벡터 중 적어도 하나를 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제 27 항에 있어서, 1 이상의 형질 감염제를 부가적으로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제 28 항에 있어서, 형질 감염제가 양이온 지질, 리포폴리아민 또는 양이온 폴리머임을 특징으로 하는 조성물.
제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에서 정의된 벡터/형질 감염 복합체를 결합시킬 수 있는 1 이상의 보조제를 부가적으로 함유함을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항에 있어서, 보조제가 생리학적 조건하에 양쪽성 이온이거나 이온 전하가 결핍된 천연 또는 합성 지질 중에서 선택된 1 이상의 중성 지질임을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 중성 지질(들)이 2 이상의 지방 체인을 함유한 지질 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질(들)이 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 올레오일팔미토일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디-스테아로일, -팔미토일, -미리스토일 포스파티딜에탄올아민 및 1 내지 3회 N-메틸화된 이들의 유도체, 포스파티딜글리세롤, 디아실글리세롤, 글리코실디아실글리세롤, 세레브로시드(예, 특히 갈락토세레브로시드), 스핑고리피드(예, 특히 스핑고마이엘린) 또는 아시알로갱글리오사이드(예, 특히 asialoGM1 및 GM2) 중에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
제 30 항에 있어서, 보조제가 DNA의 응축에 수반된 화합물이거나 이를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 34 항에 있어서, 화합물이 전체적 또는 부분적으로 히스톤, 뉴클레올린 및/또는 프로타민에서 유도되거나, 전체적 또는 부분적으로 연속 또는 불연속적으로 반복된 펩티드 단위(KTPKKAKKP) 및/또는 (ATPAKKAA)로 구성(단위의 수는 2 내지 10으로 달라질 수 있음)됨을 특징으로 하는 조성물.
제 27 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 주사 제형을 위해 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제 27 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 및/또는 점막으로 적용하기 위한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
질병 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에서 정의된 핵산 전달용 벡터의 용도.
(1) 올리고뉴클레오티드-표적화 시그널 키메라를 합성하고,

(2) (1)에서 합성된 키메라를 이중 가닥 DNA와 접촉시켜 삼중 나선을 형성하며,

(3) 임의로는, (2)에서 얻어진 벡터를 1 이상의 형질 감염제 및/또는 1 이상의 보조제와 복합체를 형성한 다음,

(4) (2) 또는, 적용 가능한 경우, (3)에서 형성된 복합체를 세포와 접촉시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 세포로 핵산의 형질 감염 방법.
질병을 치료할 수 있는 이중 가닥 DNA를 함유한 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에서 정의된 핵산 전달용 벡터를 투여하는 질병 치료방법.
제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에서 정의된 핵산 전달 벡터를 함유하는 재조합 세포.
제 41 항에 있어서, 진핵생물 세포임을 특징으로 하는 재조합 세포.